KR20040078645A - 조직 및 혈관의 재생을 위한 의약 및 그의 방법 - Google Patents

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히구치도시오
야마사키요시키
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니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
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Abstract

간장증식인자(HGF)의 수용체가 신규 뮤신 유사 단백질과 결합함으로써 HGF/HGF 수용체의 기능발현이 억제되어, HGF 의존적인 세포증식, 조직 및 혈관의 재생/신생이 저해되는 것을 발견하였다. 더욱이, HGF 수용체와 상기 뮤신 유사 단백질의 결합을 저해함으로써 간장질환 등의 여러 질환의 치료가 가능해지는 것을 발견하였다.

Description

조직 및 혈관의 재생을 위한 의약 및 그의 방법{Drug for regenerating tissue and vessel and method therefor}
포유동물을 비롯한 생물의 생체는 조직이나 기관이 정상으로 기능하도록 생체의 조직이나 기관에 생긴 상해 또는 결손을 신속하게 수복 또는 신생하는 재생능력을 가지고 있다. 바꿔 말하자면, 생체의 질환상태에서 치료회복으로는 이 재생능력이 불가결하다.
이 조직이나 기관의 재생능력에 크게 공헌하는 인자의 하나로서 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor; HGF)가 매우 잘 연구되어 있어, 이 HGF는 재생의학요법의 분야에 있어서 여러 난치성 질환의 치료를 가능하게 하는 것으로서 커다란 기대가 모아지고 있어, 그 임상응용을 위한 연구개발이 매우 활발이 진행되고 있다.
HGF는 1984년에 나카무라 등에 의해 랫트 혈중으로부터 부분 정제된 초대배양 간세포의 강력한 증식인자로서 동정되어(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, Vol.122, p.1450-1459), 그 5년 후인 1989년에 인간 및 랫트의 HGF를 코드하는 cDNA가 클로닝되어 HGF의 일차구조가 명확해졌다(Nature, 1989, Vol.342, p.440-443).
인간의 HGF는 728 아미노산잔기로 된 단일가닥 불활성형 프레프로체로서 합성된 후, HGF 변환효소 또는 HGF 액티베이터라 불리는 세린프로테아제에 의해 프로세싱되어 α사슬(분자량 69 kDa)과 β사슬(분자량 34 kDa)로 된 헤테로 다이머의 활성형이 되어, 이 활성형 헤테로 다이머가 HGF 수용체에 결합함으로써 HGF의 여러 생물활성이 발휘된다.
한편, HGF의 수용체에 관해서는 당초 인간 골육종세포로부터 암유전자로서 동정된 c-Met 유전자의 산물인 수용체형 티로신키나아제 c-Met에 대한 리간드가 HGF인 것이 판명되어, c-Met가 HGF의 수용체인 것이 명확해졌다(Science, 1991, Vol.251, p.801-804; Oncogene, 1991, Vol.6, p.501-504).
HGF 수용체인 c-Met는 α사슬(분자량 50 kDa)과 β사슬(분자량 145 kDa)이 디설피드결합으로 결합한 헤테로 다이머이다. c-Met의 β사슬은 세포외영역, 세포막 관통영역 및 세포질영역으로 구성되고, 세포질영역에는 티로신키나아제 도메인이 존재한다. HGF가 수용체 c-Met에 결합함으로써 수용체의 이량체화가 일어나고, 계속해서 세포질영역에 존재하는 티로신잔기의 자기 인산화가 일어난다.
또한 이 c-Met β사슬의 C말단쪽에는 다기능 결합부위(multifunctional docking site)라 불리는 3개의 인산화 티로신잔기로 된 부위가 존재하고, 이 부위에 SH2 도메인을 갖는 PI3 키나아제, PLC-γ, SHC, Grb-1, Grb-2 및 pp60c-SRC등의 각종 시그날전달 분자가 결합함으로써, HGF의 다채로운 생물활성을 담당하는 시그날의 발신원이 되고 있다(예를 들면, Cell, 1994, Vol.77, p.261-271, 1994; 실험의학, 1997, Vol.15, p.1033-1039).
지금까지의 연구로부터 HGF는 그 수용체 c-Met로의 결합에 의한 세포내로의 시그날전달을 통해, 하기와 같이 매우 다채로운 생물활성 및 질환의 치료·개선효과를 발휘하는 것이 명확해져 있다.
(1) 간세포 뿐 아니라, 대부분의 상피계 세포(신뇨세관 상피세포, 피질 케라티노사이트, 멜라노사이트, 폐포II형 상피세포, 위점막 상피세포 등) 및 일부의 간엽계 세포(혈관 내피세포, 연골세포, 파골세포, 근위성세포 등)의 증식 촉진인자로서 작용한다(예를 들면, J. Biochem., 1996, Vol.119, p.591-600; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.239, p.639-644).
(2) 포유동물이나 양생류의 생체의 발생과정에 있어서의 상피계 세포 및 간엽계 조직 사이의 상호작용의 메디에이터 분자로서의 작용을 가져, 간장, 신장 및 폐 등의 내장 장기 및 지아(肢芽)나 체절 등의 여러 조직기관의 형성을유도한다(J. Biochem., 1996, Vol.119, p.591-600; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.239, p.639-644; J. Cell. Biol., 1993, Vol.123, p.223-236; Development, 1998, Vol.125, p.1315-1324; Nature, 1995, Vol.373, p.699-702; Nature, 1995, Vol.373, p.702-705; Nature, 1995, Vol.376, p.768-771; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.234, p.8-14).
(3) 한편, 성숙개체에 있어서는 HGF는 파라크린(paracrine) 및 엔도크린(endocrine)적으로 작용함으로써 간장, 신장 및 폐 등의 기관이나 그의 조직을 수복, 재생 및 신생을 촉진하는 인자로서 기능한다(예를 들면, J. Biochem., 1996, Vol.119, p.591-600; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.239, p.639-644; J. Cell. Biol., 1993, Vol.123, p.223-236; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, Vol.173, p.42-47; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, Vol.177, p.330-335; Hepatology, 1992, Vol.16, p.1227-1235; J. Biol. Chem., 1991, Vol.266, p.22781-22784; Am. J. Physiol., 1993, Vol.265, p.61-69; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, Vol.91, p.4357-4361; Am. J. Physiol., 1996, Vol.270, p.1031-1039; 단백질·핵산·효소, 2000, Vol.45, No.13, p.2100-2108).
(4) HGF는 상술한 상피세포나 일부의 간엽계 세포(혈관 내피세포, 근세포 등)의 증식 및 간장, 신장 및 폐 등의 장기손상의 수복 재생을 담당할 뿐 아니라, 그 이외의 세포, 예를 들면 위점막 상피세포, 심근세포, 골격근세포 및 신경세포 등의 증식 및 수복을 강력하게 촉진하여, 위점막, 심장, 골격계 및 신경계 조직의 파괴의 예방 및 조직의 재생 수복을 담당한다(예를 들면, 단백질·핵산·효소,2000, Vol.45, No.13, p.2100-2108).
(5) HGF는 고혈당이나 허혈 등의 원인에 의한 혈관 내피세포의 아포토시스를 억제한다(예를 들면, Diabetologia, 1997, Vol.40, p.1053-1061; Diabetes, 1997, Vol.46, p.138-142).
(6) 심근 선유아세포를 HGF로 자극함으로써 uPA, MMP-1 및 MMP-9 등의 발현이 유도되는 것으로부터, HGF는 여러 조직에 대한 항선유화작용을 가지고 있는 것이 시사되어 있다(예를 들면, 일본임상, 2000, Vol.58, Suppl. p.168-172).
(7) HGF 또는 HGF 유전자를 토끼나 랫트에 투여함으로써 HGF에 의한 혈관 신생작용이 확인되어 있다(예를 들면, 일본임상, 2000, Vol.58, Suppl. p.168-172; Hypertension, 1999, Vol.33, p.1379-1384).
(8) 상술한 바와 같은 HGF의 다채로운 생리활성에 의해 HGF는 현재도 근본적인 치료방법이 없는 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염, 급성간염, 만성신부전, 신선유증 및 폐선유증 등의 난치성 장기질환에 대해 극적인 치료효과를 발휘하는 것이 동물시험에서 나타나 있다(예를 들면, 실험의학, 1997, Vol.15, p.90-97; J. Biochem., 1995, Vol.118, p.643-649; Nature Med., 1999, Vol.5, p.226-230; Hepatology, 1997, Vol.26, p.81-89; Hepatology, 1999, Vol.30, p.151-159; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, Vol.244, p.683-690; J. Clin. Invest., 1999, Vol.103, p.313-320; Kidney Int., 2000, Vol.57, p.937-948; J. Clin. Invest., 1998, Vol.101, p.1827-1834; Am. J. Repair. Crit. Care Med., 1997, Vol.156, p.1937-1944).
더욱이, 최근에는 HGF 유전자를 사용한 유전자치료에 의한 폐색성 동맥경화증의 치료가 시도되고 있다.
상술한 바와 같은 여러 난치성 질환의 치료에 유효한 HGF의 다채로운 생물활성 및 그의 치료효과가 명확해지는 한편으로, HGF나 HGF 유전자를 사용하는 상기 질환의 치료에 있어서는, 환자의 체내로의 HGF의 과잉 공급에 기인하는 발암 가능성도 우려되고 있기 때문에, HGF나 HGF 유전자의 생체로의 투여에만 의지하지 않고 해당 질환의 치료 가능한 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
그러한 새로운 치료방법의 개발 중 하나의 접근으로서, HGF의 수용체인 c-Met와 상호작용함으로써 HGF/c-Met의 시그날전달을 제어하는 새로운 분자를 특정하여, 상기 새로운 분자와 c-Met의 상호작용 또는 상기 새로운 분자의 기능을 제어하는 방법이 유망시된다.
본 발명은 MERMUC(c-Met Regulatory Mucin)의 생물활성을 저해하는 활성을 갖는 물질, 구체적으로는 MERMUC와 c-Met의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질 또는 MERMUC의 발현을 저해하는 활성을 갖는 물질을 포함해서 되는 의약조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는 MERMUC와 c-Met의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질 또는 MERMUC의 발현을 저해하는 활성을 갖는 물질을 포함해서 되고, HGF에 의한 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용하기 위한 의약조성물에 관한 것이다.
발명의 개시
즉, 본 발명은 (1) HGF의 수용체인 c-Met와 상호작용함으로써 HGF/c-Met의 시그날전달을 제어하는 새로운 분자를 특정하고, (2) 상기 새로운 분자와 c-Met의 상호작용 또는 상기 새로운 분자의 기능을 제어함으로써 HGF/c-Met의 시그날전달을 제어하는 방법, 물질 및 의약조성물을 제공하여, (3) 해당 방법, 물질 및 의약조성물을 사용하여 HGF 의약(HGF 단백 의약, HGF 유전자치료 등)에 의한 치료가 적용되는 여러 질환, 특히 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염, 급성간염, 만성신부전, 신선유증 및 폐선유증 등의 난치성 장기질환을 치료하는 것을 목적으로한다.
본 발명자 등은 후술하는 최근 보고된 신염환자의 신장조직으로부터 클로닝된 뮤신 유사 단백질(국제출원공개: WO01/05803)에 관하여, 특히 상기 뮤신 유사 단백질과 결합하는 분자에 대해서 예의 연구를 행하였다.
그 결과, 본 발명자 등은 (1) HGF의 수용체인 c-Met가 해당 뮤신 유사 단백질에 결합하는 것, (2) 상기 양분자의 결합에 의해 HGF/c-Met를 매개로 하는 시그날전달에 의해 발휘되는 HGF의 생물활성이 억제적으로 제어되는 것(다운 레귤레이션), 더 나아가서는 (3) 해당 뮤신 유사 단백질의 c-Met로의 결합 친화성은 상기 뮤신 유사 단백질이 다량체화(자기회합)함으로써 증대되는 것을 발견하고 이하에 상세하게 기술하는 바와 같은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
한편, 본 발명자 등은 상기의 뮤신 유사 단백질의 그러한 특징을 토대로, 이 분자를 MERMUC(c-Met Regulatory Mucin)이라 명명하였다.
HGF의 생물활성의 발현이 그 수용체인 c-Met와 MERMUC(MERMUC 분자의 자기회합물을 포함한다)의 결합에 의해 다운 레귤레이트된다고 하는 이 새로운 사실은, 아직 전혀 보고되어 있지 않은 새로운 사실인 것은 말할 필요도 없지만, 특히 중요한 것은 이 전혀 새로운 사실을 토대로 이하에 기술하는 바와 같은 의약 및 제약업에 있어서 매우 유용한 본 발명이 완성된 것이다.
구체적으로는, 본 발명에 의해 여러 질환의 예방·치료에 필수인 조직 및 기관 등의 수복, 재생 또는 신생, 보다 구체적으로는 현재도 그 치료가 곤란해져 있는 여러 난치성 질환(예를 들면, 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염,급성간염, 만성신부전, 신선유증 및 폐선유증 등)의 치료가 필요 최소한 용량의 HGF 의약(HGF 단백이나 HGF 유전자 등)에 의해, 또는 상기 HGF 의약을 사용하지 않고 가능해지는 것이다.
이것은, 본 발명의 하나인 의약조성물, 즉 (1) HGF의 수용체인 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질로 된 의약조성물, (2) MERMUC 분자의 다량체화(자기회합)를 저해하는 활성을 갖는 물질로 된 의약조성물, 또는 (3) MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질로 된 의약조성물을 사용하여, c-Met와 MERMUC의 결합에 의해 일어나는 HGF 활성의 다운 레귤레이션을 제거함으로써, 환자의 생체에 내재하는 HGF 또는 상기 환자에게 외래적으로 공급된 HGF(HGF 단백제제 또는 HGF 유전자치료)가 잠재적으로 가지고 있는 생물활성을 최대한으로 이끌어내는 것이 가능해지는 것에 따른 것이다.
따라서, HGF 의약을 사용한 질환의 치료에 있어서는, 상술한 바와 같은 본 발명의 의약조성물을 병용함으로써, 환자에게 투여되는 HGF 의약의 용량, 투여빈도 및 투여기간 등을 대폭 감소시키는 것이 가능해진다. 또한, 이것에 의해 환자의 심신의 고통을 감소시키는 것이 가능한 동시에, 여러 비용(환자, 의료현장, 의약품 메이커, 정부기관 각각이 부담하는 비용)의 절감도 가능해진다.
본 발명은 상술한 의약조성물 뿐 아니라, 해당 의약조성물의 활성성분인 (1) c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질, (2) MERMUC의 다량체화(자기회합)를 저해하는 활성을 갖는 물질, (3) MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질을 동정하는 방법, 임의 물질의 각종 활성((1) c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성, (2) MERMUC의 다량체화(자기회합)를 저해하는 활성, MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 활성 등)을 시험하는 방법 및 해당 방법에 사용되는 각종 도구(각종 폴리펩티드나 융합 폴리펩티드 등)를 제공하는 것으로, 이들 방법이나 도구의 발명에 의해 상술한 본 발명의 의약조성물의 제공이 가능해진다.
본 발명은 즉 하기 (1)~(78)에 기재되는 바와 같은 발명이다.
(1) c-Met와 MERMUC의 결합 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용하기 위한 의약조성물.
(2) c-Met와 MERMUC의 결합 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, HGF에 의한 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용하기 위한 의약조성물.
(3) (2)에 있어서, 상기 HGF가 생체에 내재하는 HGF인 의약조성물.
(4) (2)에 있어서, 상기 HGF가 생체로 외래적으로 HGF를 공급 가능한 HGF 의약인 의약조성물.
(5) (4)에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 포함하는 단백 의약인 의약조성물.
(6) (4)에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA 의약인 의약조성물.
(7) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 의약조성물이 선유증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(8) (7)에 있어서, 상기 선유증이 간장, 신장 또는 폐에 있어서의 선유증인 의약조성물.
(9) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 의약조성물이 간경변, 간선유증 또는 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(10) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 간염이 극증간염, 급성간염 또는 바이러스성 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(11) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 의약조성물이 만성신부전의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(12) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 의약조성물이 폐색성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(13) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 물질이 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
(14) (13)에 있어서, 상기 물질이 c-Met β사슬의 C말단영역과 MERMUC C말단영역의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
(15) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
(16) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC에 결합하는 물질인 의약조성물.
(17) MERUMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용되기 위한 의약조성물.
(18) (17)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 저해하는 물질인 의약조성물.
(19) (17)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 물질인 의약조성물.
(20) MERUMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, HGF에 의한 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용되기 위한 의약조성물.
(21) (20)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 저해하는 물질인 의약조성물.
(22) (20)에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 물질인 의약조성물.
(23) (20)에 있어서, 상기 HGF가 생체에 내재하는 HGF인 의약조성물.
(24) (20)에 있어서, 상기 HGF가 생체로 외래적으로 HGF를 공급 가능한 HGF 의약인 의약조성물.
(25) (24)에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 포함하는 단백 의약인의약조성물.
(26) (24)에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA 의약인 의약조성물.
(27) (17) 또는 (20)에 있어서, 상기 의약조성물이 선유증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(28) (27)에 있어서, 상기 선유증이 간장, 신장 또는 폐에 있어서의 선유증인 의약조성물.
(29) (17) 또는 (20)에 있어서, 상기 의약조성물이 간경변, 간선유증 또는 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(30) (17) 또는 (20)에 있어서, 상기 간염이 극증간염, 급성간염 또는 바이러스성 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(31) (17) 또는 (20)에 있어서, 상기 의약조성물이 만성신부전의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(32) (17) 또는 (20)에 있어서, 상기 의약조성물이 폐색성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
(33) MERMUC의 전장(full-length) 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, c-Met와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(34) (33)에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
(35) (35)에 있어서, 상기 세포질영역의 전부 또는 일부가 MERMUC의 C말단영역의 류신 반복영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드.
(36) (33)에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 폴리펩티드.
(37) (33)에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 15에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
(38) c-Met의 전장 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(39) (38)에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 c-Met의 β사슬 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
(40) (39)에 있어서, 상기 세포질영역의 전부 또는 일부가 자기 인산화를 받는 하나 또는 복수의 티로신잔기를 포함하는 c-Met C말단영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드.
(41) (38)에 있어서, 상기 c-Met가 인간의 c-Met인 폴리펩티드.
(42) (38)에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 5에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
(43) MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(44) (43)에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
(45) (33)에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 폴리펩티드.
(46) 일반식 W-X-Y(W는 존재하지 않거나 또는 MERMUC 이외의 다른 단백질의전장 아미노산서열 또는 그의 일부, X는 MERMUC의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이고, Y는 MERMUC 이외의 다른 단백질의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이다.)로 표시되는 융합 폴리펩티드.
(47) (46)에 있어서, 상기 Y의 다른 단백질이 β-gal△α 또는 β-gal△ω인 융합 폴리펩티드.
(48) (47)에 있어서, 상기 β-gal△α가 서열번호 16에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
(49) (47)에 있어서, 상기 β-gal△ω가 서열번호 17에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
(50) (46)에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 c-Met와 결합하는 활성을 갖는 융합 폴리펩티드.
(51) (46)에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
(52) (51)에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC C말단영역의 류신 반복영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
(53) (46)에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 융합 폴리펩티드.
(54) (46)에 있어서, 상기 X가 서열번호 15에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
(55) (46)에 있어서, 상기 W의 다른 단백질이 Fas의 세포외영역을 포함하는 폴리펩티드.
(56) 일반식 Z-Y(Z는 c-Met의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이고, Y는 c-Met 이외의 다른 단백질의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이다.)로 표시되는 융합 폴리펩티드.
(57) (52)에 있어서, 상기 다른 단백질이 β-gal△α 또는 β-gal△ω인 융합 폴리펩티드.
(58) (57)에 있어서, 상기 β-gal△α가 서열번호 16에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
(59) (57)에 있어서, 상기 β-gal△ω가 서열번호 17에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
(60) (56)에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 융합 폴리펩티드.
(61) (56)에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 c-Met의 β사슬 세포질영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
(62) (56)에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 자기 인산화를 받는 하나 또는 복수의 티로신잔기를 포함하는 c-Met C말단영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
(63) (56)에 있어서, 상기 c-Met가 인간의 c-Met인 융합 폴리펩티드.
(64) (56)에 있어서, 상기 Z가 서열번호 5에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
(65) 어떤 물질의 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서, 실험 대상물질(test substance)의 존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
(66) c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
(67) 어떤 물질의 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서;
(a) c-Met 및 MERMUC를 함께 발현하고, 상기 c-Met 및 MERMUC가 결합한 경우에 상기 결합을 검출 가능하도록 설계된 세포를 조제하는 공정;
(b) 공정 (a)에서 얻은 세포를 HGF의 존재하에서 또한 실험 대상물질의 부존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(c) 공정 (b)에서 얻은 세포를 HGF 및 실험 대상물질의 존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(d) 공정 (b)의 측정결과와 공정 (c)의 측정결과를 비교하는 공정.
(68) (67)에 있어서, 상기 MERMUC가 상기 (46) 내지 (54) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(69) (67)에 있어서, 상기 MERMUC가 상기 (47) 내지 (49) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(70) (67)에 있어서, 상기 c-Met가 상기 (56) 내지 (64) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(71) (67)에 있어서, 상기 c-Met가 상기 (57) 내지 (59) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(72) c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서;
(a) c-Met 및 MERMUC를 함께 발현하고, 상기 c-Met 및 MERMUC가 결합한 경우에 상기 결합을 검출 가능하도록 설계된 세포를 조제하는 공정;
(b) 공정 (a)에서 얻은 세포를 HGF의 존재하에서 또한 실험 대상물질의 부존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(c) 공정 (b)에서 얻은 세포를 HGF 및 실험 대상물질의 존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(d) 공정 (b)의 측정결과와 공정 (c)의 측정결과를 비교하는 공정.
(73) (72)에 있어서, 상기 MERMUC가 상기 (46) 내지 (54) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(74) (72)에 있어서, 상기 MERMUC가 상기 (47) 내지 (49) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(75) (72)에 있어서, 상기 c-Met가 상기 (56) 내지 (64) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(76) (72)에 있어서, 상기 c-Met가 상기 (57) 내지 (59) 중 어느 하나의 융합 폴리펩티드인 방법.
(77) 어떤 물질의 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서 MERMUC 다량체화의 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 MERMUC의 다량체화 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
(78) MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서의 MERMUC 다량체화의 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 MERMUC의 다량체화 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
이하, 본 발명에서 사용되는 어구의 의미 및 물질의 제조방법을 명확하게 함으로써, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서 「포유동물」이란 인간, 소, 염소, 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터 및 모르모트 등을 의미하고, 바람직하게는 인간, 소, 랫트, 마우스 또는 햄스터이며, 특히 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 있어서 「c-Met」란 상기 포유동물의 c-Met로, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 랫트의 c-Met이고, 특히 바람직하게는 인간의 c-Met이다. 상기 c-Met는 이하에 정의하는 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor; HGF)의 수용체로, 상기 c-Met는 이미 보고된 바와 같은 구조 및 생물학적 기능을 갖는다.
상기 c-Met는 세포외영역만으로 된 α사슬(분자량: 약 50 kDa)과 세포막 관통단백인 β사슬(분자량: 약 145 kDa)이 디설피드결합으로 결합한 헤테로 다이머이다.
본 발명에 있어서의 바람직한 태양인 인간 c-Met에는 이성체(이성체 1, 이성체 2 등)가 존재하지만, 본 발명에 있어서의 인간 c-Met에는 그들 모두가 포함된다. 이성체 1 및 이성체 2는 서로 스프라이스 변이체인 것으로 생각되고 있다.
이성체 1 및 이성체 2로서 보고되어 있는 인간 c-Met의 일차구조(헤테로 다이머가 되기 전의 전구체)는, 각각 1390 아미노산잔기(서열번호 2 및 GenBank Accession Nos.:P08581, TVHUME, CAB56793. 대응하는 cDNA의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다.) 및 1408 아미노산잔기(GenBank Accession No.:4557747. 대응한다.)로 된다.
이성체 1 및 이성체 2의 차이는 이성체 1에 있어서의 아미노산번호 754(Ile)와 755(Ser) 사이에 존재하는 18 아미노산잔기 뿐으로 다른 부분의 아미노산서열은 동일하다.
이하, c-Met에 대해서 이성체 1을 예로 들어 설명 및 정의하지만, 본 발명에 있어서는 동일한 구조를 갖는 이성체 2도 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
인간 c-Met는 시그날펩티드(서열번호 2의 아미노산번호 1-24), α사슬(서열번호 2의 아미노산번호 25-303) 및 β사슬(서열번호 2의 아미노산번호 308-1390. 서열번호 4의 전장 서열과 동일. 서열번호 3은 대응하는 cDNA서열)로 구성된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.84, No.8, p.6379-6383, 1987;Oncogene, Vol.1, No.2, p.229-233, 1987; Oncogene, Vol.8, No.12, p.3403-3410, 1993; Nature, Vol.318, No.6044, p.385-388, 1985; Science, Vol.251, No.4995, p.802-804, 1991; J. Biol. Chem., Vol.266, No.29, p.19558-19564, 1991; Nature Genetics, Vol.16, No.1, p.68-73, 1997; Mol. Cell. Biol., Vol.7, No.2, p.921-924, 1987; J. Biol. Chem., Vol.269, No.17, p.12852-12857, 1994).
마우스 및 랫트의 각각의 c-Met의 구조 및 생물학적 성상도 인간 c-Met와 유사하다([마우스 c-Met] GenBank Accession Nos.:SO1254, NP 032617, P16056, CAA68680/Oncogene, Vol.2, No.6, p.593-599, 1988; Gene, Vol.85, No.1, p.67-74, 1989; J. Cell Biol., Vol.121, No.1, p.145-154, 1993; [랫트] GenBank Accession Nos.:NP 113705, AAB19189/Am. J. Physiol. Vol.271, No.3 Pt 2, p.F679-F688, 1996).
c-Met의 β사슬(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 308-1390. 서열번호 4의 전장 서열과 동일.)은 세포외영역(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 308-932. 서열번호 4의 아미노산번호 1-625와 동일.), 세포막 관통영역(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 933-955. 서열번호 4의 아미노산번호 626-648과 동일.) 및 세포질영역(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 956-1390. 서열번호 4의 아미노산번호 649-1083과 동일.)으로 구성되고, 세포질영역에는 티로신키나아제 도메인(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 1078-1345. 서열번호 4의 아미노산번호 771-1038과 동일)이 존재한다. HGF가 수용체 c-Met에 결합함으로써 수용체의 이량체화가 일어나고, 계속해서 세포질영역에 존재하는 티로신잔기의 자기 인산화가 일어난다(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 1349, 1356 및 1365의 티로신잔기. 서열번호 4의 아미노산번호 1042, 1049 및 1058과 동일.).
특히, c-Met β사슬의 C말단쪽에는 다기능 결합부위(multifunctional docking site)라 불리는 3개의 인산화 티로신잔기(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 1349, 1356 및 1365. 서열번호 4의 아미노산번호 1042, 1049 및 1058과 동일.)로 된 부위가 존재하고, 이 부위에 SH2 도메인을 갖는 PI3 키나아제, PLC-γ, SHC, Grb-1, Grb-2 및 pp60c-SRC등의 각종 시그날전달 분자가 결합함으로써, HGF의 다채로운 생물활성을 담당하는 시그날의 발신원이 되고 있다(Cell, Vol.77, p.261-271, 1994 및 실험의학, Vol.15, p.1033-1039, 1997).
본 발명에 있어서의 「c-Met의 β사슬의 세포질영역」이란 바람직하게는 인간, 마우스 또는 랫트의 c-Met β사슬의 세포질영역으로, 특히 바람직하게는 인간의 c-Met의 β사슬의 세포질영역(서열번호 2의 아미노산번호 956-1390. 서열번호 4의 아미노산번호 649-1083과 동일.)이다.
본 발명에 있어서의 「c-Met의 β사슬의 세포질영역의 일부」는 상기 세포질영역의 임의의 일부를 의미하지만, 바람직하게는 상기 β사슬의 C말단영역이고, 특히 바람직하게는 자기 인산화를 받는 티로신잔기(인간에게 있어서는 서열번호 2의 아미노산번호 1349, 1356 및 1365. 서열번호 4의 아미노산번호 1042, 1049 및 1058과 동일.)의 하나 또는 복수를 포함하고, 이하에 정의하는 MERMUC의 C말단영역과결합하는 영역이다. 더욱 구체적으로는, 후술하는 실시예에 있어서 나타내어지는 MERMUC와의 결합에 필요한 최소의 아미노산서열(서열번호 5)을 포함하는 영역이다. 다만, 상기 최소 아미노산서열이란 후술하는 실시예에 있어서 개시되는 한정된 실험결과만을 토대로 하는 경우의 최소서열로, 본원에 있어서의 최소 단위란 용어는 상기 서열(서열번호 5)보다도 더욱 짧은 아미노산서열도 의미한다.
본 발명의 인간 c-Met에는 상술한 일차구조를 갖는 인간 c-Met의 이성체(그 하나인 이성체 2는 1048 아미노산을 갖는다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.84, No.18, p.6379-6383, 1987; Nature, Vol.318, No.6044, p.385-388, 1985; Mol. Cell. Biol., Vol.7, No.2, p.921-924, 1987; Science, Vol.251, No.4995, p.802-804, 1991; Cytogenet. Cell Genet., Vol.60, No.2, p.114-116, 1992; Cell. Mol. Biol. Res., Vol.40, No.4, p.337-350, 1994; Cell. Mol. Biol. Res., Vol.40, No.7-8, p.7-7, 1994)가 포함되지만, 양자의 일차구조는 세포외영역 중간의 일부 아미노산서열 뿐으로, 세포외영역의 C말단쪽으로부터 세포질영역을 거친 C말단까지의 아미노산서열은 동일하다. 즉, 양 형태의 인간 c-Met의 β사슬 모두 후술하는 실시예에서 나타내어지는 MERMUC와의 결합에 필요한 영역의 구조는 보존되어 있는 것을 나타내는 것이다.
본 발명에 있어서 「HGF」란 상기에 정의한 c-Met의 리간드인 포유동물 유래의 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor; HGF)로, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 랫트의 HGF이며, 특히 바람직하게는 인간의 HGF이다.
HGF는 단일가닥 불활성형의 프레프로체로서 합성된 후, HGF 변환효소 또는HGF 액티베이터로 불리는 세린프로테아제에 의해 프로세싱되어 α사슬(분자량 69 kDa)과 β사슬(분자량 34 kDa)로 된 헤테로 다이머의 활성형이 되어, 이 활성형 헤테로 다이머가 HGF 수용체에 결합함으로써 HGF의 여러 생물활성이 발휘된다(상기의 이미 보고된 것과 동일).
인간 HGF의 프레프로체는 728 아미노산으로 구성된다(아미노산서열: 서열번호 7. 대응 cDNA서열: 서열번호 6)(GenBank Accession Nos.:JH0579, P14210, XP 052257, XP 052258, XP 052260, AAA52648, BAA14348, AAA52650, AAA64239/Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.163, No.2, p.967-973, 1989; Nature, Vol.342, No.6248, p.440-443, 1989; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.172, No.1, p.321-327, 1990; J. Cell Biol., Vol.111, No.5 Pt.1, p.2097-2108, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88, No.2, p.415-419, 1991; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.175, No.2, p.660-667, 1991; Eur. J. Biochem., Vol.197, No.1, p.15-22, 1991; Gene, Vol.102, No.2, p.213-219, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88, No.16, p.7001-7005, 1991; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.180, No.2, p.1151-1158, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.89, No.23, p.11574-11578, 1992; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.189, No.3, p.1329-1335, 1992; EMBO J., Vol.11, No.7, p.2503-2510, 1992; Structure, Vol.6, No.1, p.109-116, 1998; Structure, Vol.6, No.11, p.1383-1393, 1998).
랫트 HGF 및 마우스 HGF의 프레프로체도 인간 HGF와 마찬가지로 모두 728 아미노산으로 구성되어 이미 보고된 것과 같은 구조 및 생물학적 성상을 갖는다([랫트] GenBank Accession Nos.:NP 058713, P17945, A35644, BAA14133, CAA38266/Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.87, No.8, p.3200-3204, 1990; Eur. J. Biochem., Vol.193, No.2, p.375-381, 1990; [마우스] GenBank Accession Nos.:A60185, Q08048, BAA01064, CAA58865/Nature, Vol.346, No.6281, p.228, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.195, No.1, p.34-43, 1990; Biochem. J., Vol.278, Pt.1, p.35-41, 1991; Biochem. Biophys. Acta., Vol.1216, No.2, p.299-303, 1993; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.199, No.2, p.772-779, 1994; J. Biol. Chem., Vol.270, No.2, p.830-836, 1995; Cell Adhes. Commun., Vol.1, No.2, p.101-111, 1993).
본 발명에 있어서 「MERMUC」란 국제출원공개 WO01/05803에 기재된 신규한 포유동물의 뮤신 유사 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서는 해당 뮤신 유사 분자를 c-Met Regulatory Mucin(MERMUC)이라 부른다. 본 발명에 있어서 바람직한 태양은 인간, 마우스 또는 랫트의 MERMUC이고, 특히 바람직하게는 인간의 MERMUC이다.
본 발명자 등은 MERMUC에 대해 예의 연구하여, MERMUC가 적어도 하기 및 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같은 구조적 특징을 갖는 것을 특정하였다.
(1) 포유동물의 MERMUC의 일차구조는 세포외영역, 하나의 막관통영역 및 세포질영역으로 구성된다.
(2) 상기 세포외영역에는 잠재적인 O결합형 당쇄 부가부위(O-linked glycosylation site)로서 알려지는 뮤신 특이적 도메인이 존재하고, 상기 도메인은 당쇄 부가 가능한 세린/트레오닌잔기에 풍부한 특정 아미노산서열의 반복구조(인간MERMUC에 있어서는 서열번호 8의 19 아미노산잔기)로 된다.
(3) 상기 뮤신 특이적 도메인에 있어서의 반복단위의 수는 가변적이고, 상기 반복단위의 수에 의존하여 MERMUC에는 다형(polymorphism)이 존재한다.
(4) MERMUC의 세포질영역의 말단이기도 한 C말단영역에는 류신 반복영역이 존재하고, 이 반복구조는 인간, 마우스 및 랫트에 잘 보존되어 있다.
(5) MERMUC는 상기의 일차구조를 갖는 분자의 단량체(모노머)로서도, 또한 상기 분자의 2 이상의 회합 또는 결합해서 된 다량체(다이머나 트리머 등의 올리고머)로서도 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 MERMUC란 상술한 바와 같은 구조적 특징(국제출원공개 WO01/05803에 이미 보고된 특징도 포함한다)을 구비하는 분자를 의미하고, 임의의 다형 및 단량체(모노머) 및 다량체(다이머 및 올리고머 등)의 형태 모두 본 발명에 포함된다.
그러한 다형이 존재하는 본 발명에 있어서의 인간 MERMUC의 일차구조로서는, 예를 들면 서열번호 10(세포외영역: 아미노산번호 1-199; 막관통영역: 아미노산번호 200-220 또는 221; 세포질영역: 221 또는 222~503. cDNA서열: 서열번호 9)을 들 수 있다. 상술한 바와 같이 인간 MERMUC에는 세포외영역의 뮤신 특이적 도메인의 반복구조가 상이한 다형이 존재하지만 세포질영역은 동일한 구조이다.
마우스 MERMUC의 일차구조로서는 서열번호 12(cDNA서열: 서열번호 11)가 예시된다. 랫트 MERMUC의 일차구조(N말단 결실)로서는 서열번호 14(cDNA서열: 서열번호 13)가 예시된다.
본 발명에 있어서의 「MERMUC의 C말단영역」이란 MERMUC의 세포질영역의 카르복실말단쪽의 아미노산서열으로서, 바람직하게는 류신 반복구조를 포함하는 영역이다. 인간의 MERMUC에 있어서는 구체적으로는 C말단의 53 아미노산(서열번호 15)을 포함하는 영역을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「β-gal」, 「β-gal△α」및 「β-gal△ω」란 각각 하기에 정의하는 바와 같은 의미를 갖는다.
「β-gal」은 β-galactosidase(lactase)의 약칭으로, 젖당(락토오스; glucose-β-D-galactoside)의 분해 및 합성을 행하는 효소이다. 이 효소는 세균으로부터 고등동식물까지 폭넓게 분포하고 있지만, 구조 및 최적 pH 등은 종에 따라 다르다.
본 발명의 β-gal은 어떤 종의 β-gal도 포함하지만, 특히 바람직하게는 대장균의 β-gal이다.
대장균의 β-gal을 코드하는 구조유전자는 lacZ라 불리운다. 대장균 β-gal 전구체의 일차구조는 1024 아미노산으로 된다(GenBank Accession Nos.;P00722;GBEC/J. Biol. Chem., Vol.253, No.15, p.5521-5525, 1978; Bioorg. Khim., Vol.6, p.1735-1736, 1980; Nature, Vol.285, No.5759, p.38-41, 1980; EMBO J., Vol.2, No.4, p.593-597, 1983; J. Mol. Biol., Vol.208, No.1, p.23-43, 1989; Gene, Vol.122, No.1, p.231-232, 1992; Nature, Vol.369, No.6483, p.761-766, 1994, Science, Vol.277, No.5331, p.1453-1474, 1997).
상기 β-gal의 생물활성은 상기 일차구조를 갖는 단량체의 4분자가 모인 호모 4량체에 의해 발현된다(또한, 대장균 β-gal의 입체구조의 해석에 의해 각각의 모노머분자의 일차구조는, N말단의 3 아미노산이 결락(缺落)된 1021 아미노산으로 된 것이 보고되어 있다. GenBank Accession Nos.:13399708/Nature, Vol.369, No.6483, p.761-766, 1994; Protein Sci., Vol.8, No.1, p.122-136, 1999; Protein Sci., Vol.9, No.9, p.1685-1699, 2000).
한편, 대장균의 β-gal에 대해서는 어느 종의 대장균주에 있어서 3종류의 변이체, β-gal△α, β-gal△μ 및 β-gal△ω가 보고되어 있다(△는 결락을 의미한다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.93, p.12423-12427, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997). 상기 β-gal△α는 야생형 β-gal의 활성부위인 N말단서열의 일부(GenBank Accession Nos.:P00722의 아미노산번호 12-42)를 결락하고 있다. 상기 β-gal△μ는 야생형 β-gal의 중앙부서열의 일부(GenBank Accession Nos.:P00722의 아미노산번호 50-602)를 결락하고 있다. 또한, 상기 β-gal△ω는 야생형 β-gal의 모노머분자가 호모 4량체를 형성하기 위한 부위인 C말단서열의 일부(GenBank Accession Nos.:P00722의 아미노산번호 790-1024)가 결락되어 있다.
본 발명에 있어서의 「β-gal△α」란 야생형 β-gal(특히 바람직하게는 대장균의 β-gal)의 활성부위인 N말단서열의 일부를 결실하는 임의의 변이체(자연발생물 및 인공조제물을 포함한다)를 의미하고, 특히 바람직하게는 상술한 이미 보고된 변이체 β-gal△α(서열번호 16)이다.
본 발명에 있어서의 「β-gal△ω」란 야생형 β-gal의 모노머분자가 호모 4량체를 형성하기 위한 부위인 C말단서열의 일부를 결실하는 임의의 변이체(자연발생물 및 인공조제물을 포함한다)를 의미하고, 특히 바람직하게는 상술한 이미 보고된 변이체 β-gal△ω(서열번호 17)이다.
본 발명의 「일반식 W-X-Y로 표시되는 융합 폴리펩티드」의 정의에 있어서의 「c-Met」및「일반식 Z-Y로 표시되는 융합 폴리펩티드」의 정의에 있어서의 「MERMUC」는 각각 상술한 c-Met 및 MERMUC와 동일한 의미를 갖는다.
상기 일반식 W-X-Y로 표시되는 융합 폴리펩티드에 있어서의 Y는 MERMUC 이외의 다른 단백질의 전체 폴리펩티드의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부를 의미한다. 여기에서, 상기 「다른 단백질」이란 임의의 단백질을 포함하지만, 바람직하게는 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를 측정 가능하게 하는 특성을 갖는 단백질이고, 특히 바람직하게는 상술한 β-gal△α 또는 β-gal△ω를 들 수 있다.
상기 일반식 W-X-Y로 표시되는 융합 폴리펩티드에 있어서의 W는 MERMUC 이외의 다른 단백질의 전체 폴리펩티드의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부를 의미한다. 여기에서, 상기 「다른 단백질」이란 임의의 단백질을 포함하지만, 바람직하게는 MERMUC의 다량체화의 유무 또는 정도를 측정 가능하게 하는 특성을 갖는 단백질이고, 특히 바람직하게는 마우스, 랫트 또는 인간의 Fas를 들 수 있다(<마우스> GenBank Accession No. P25446 및 NP 032013; <인간> GenBank Accession No. P25445; NP 000034).
상기 일반식 Z-Y로 표시되는 융합 폴리펩티드에 있어서의 Y는 c-Met 이외의 다른 단백질의 전체 폴리펩티드의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부를 의미한다.여기에서, 상기 「다른 단백질」이란 임의의 단백질을 포함하지만, 바람직하게는 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를 측정 가능하게 하는 특성을 갖는 단백질이고, 특히 바람직하게는 상술한 β-gal△α 또는 β-gal△ω를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 있어서는, 목적으로 하는 성질을 갖거나 또는 목적으로 하는 목적을 달성하는 한, 아미노산서열 중의 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1~5개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있어도 되고, 또는 상기 아미노산서열에 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1~5개의 아미노산이 부가되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「HGF 의약」이란 상기에 정의한 간세포 증식인자(hepatocyto growth factor; HGF), 특히 바람직하게는 인간의 HGF를 생체(특히 바람직하게는 인간)에 공급하기 위한 의약으로서, 「단백 의약」또는「DNA 의약」을 들 수 있다.
상기 단백 의약이란 HGF(특히 바람직하게는 인간 HGF. 세포배양물로부터의 정제 HGF 또는 재조합 HGF 어느 것이어도 된다.)의 단백질과 약학상 허용되는 담체로 된 의약품이다.
상기 DNA 의약이란 HGF(특히 바람직하게는 인간 HGF)를 코드하는 유전자(cDNA 또는 genomic DNA)를 포함하는 「DNA 구조체」와 약학상 허용되는 담체로 된 의약품으로, 소위 유전자치료에 사용되는 의약을 의미한다.
여기에서, 상기 DNA 구조체는 상기 HGF를 코드하는 유전자가 숙주(즉, 본DNA 의약이 투여되는 생체.)의 세포내(특히 바람직하게는 근육세포)에 있어서 발현 가능하도록 삽입되어 있는 것을 의미하고, 예를 들면 상기 HGF 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 상기 벡터는 유전자치료의 분야에서 사용되고 있는 임의의 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명을 구성하는 「물질」또는 「실험 대상물질」이란 자연계에 존재하는 천연물질 또는 인공적으로 조제되는 임의의 물질을 의미하고, 구체적으로는 화학합성물(저분자화합물 등), 폴리펩티드(천연체, 재조합체, 배양물 등), 항체, DNA 및 RNA가 포함된다.
본 발명에 있어서의 「c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질」이란 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 한 임의의 물질이 포함된다. 따라서, 본 발명에 있어서는 상기 물질이 c-Met와 MERMUC의 결합의 저해활성을 발휘하기 위한 메커니즘(저해 메커니즘)도 조금도 한정되지 않는다. 구체적으로는 상기 물질에는 예를 들면 하기와 같은 저해 메커니즘에 의한 물질을 들 수 있다. 그러나 본 발명의 상기 물질이 하기와 같은 물질에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.
(1) c-Met 상의 MERMUC와의 결합부위 또는 그 근방(입체적인 공간을 포함한다)에 직접적으로 결합함으로써 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 물질.
(2) MERMUC 상의 c-Met와의 결합부위 또는 그 근방(입체적인 공간을 포함한다)에 직접적으로 결합함으로써 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 물질.
(3) MERMUC의 임의의 영역(예를 들면, 세포외영역)에 결합함으로써 MERMUC의 입체구조를 변화시키거나 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 결과로서 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 물질(예를 들면, MERMUC에 결합하는 항체.).
(4) 이미 결합되어 있는 c-Met와 MERMUC의 결합을 해리시킴으로써 결과적으로 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 물질.
본 발명에 있어서의 「MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질」이란 MERMUC 분자의 자기회합이나 결합에 의한 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질인 한 임의의 물질이 포함된다. 따라서, 본 발명에 있어서는 상기 물질이 MERMUC 분자의 다량체화의 저해활성을 발휘하기 위한 메커니즘(저해 메커니즘)도 조금도 한정되지 않는다. 구체적으로는 상기 물질에는 예를 들면 하기와 같은 저해 메커니즘에 의한 물질을 들 수 있다. 그러나 본 발명의 상기 물질이 하기와 같은 물질에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.
(1) 2 이상의 MERMUC 분자가 자기회합하기 위해 결합하는 부위(특히 세포질영역) 또는 그 근방(입체적인 공간을 포함한다)에 직접적으로 결합함으로써 MERMUC의 자기회합(다량체화)을 저해하는 물질.
(2) MERMUC의 임의의 영역(예를 들면, 세포외영역)에 결합함으로써 MERMUC의 입체구조를 변화시키거나 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 결과로서 2 이상의 MERMUC 분자의 자기회합(다량체화)을 저해하는 물질(예를 들면, MERMUC에 결합하는 항체.).
본 발명에 있어서의 「MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질」이란MERMUC 분자의 세포막 상에서의 발현을 억제 또는 저해하는 활성을 갖는 물질인 한 임의의 물질이 포함된다. 따라서, 본 발명에 있어서는 상기 물질이 상기 저해활성을 발휘하기 위한 메커니즘(저해 메커니즘)도 조금도 한정되지 않는다. 구체적으로는 상기 물질에는 예를 들면 하기와 같은 저해 메커니즘에 의한 물질을 들 수 있다. 그러나 본 발명의 상기 물질이 하기와 같은 물질에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.
(1) MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 억제 또는 저해하는 물질.
(2) MERMUC를 코드하는 mRNA의 단백질로의 번역을 저해 또는 억제하는 물질.
상기 (1)에는 후술하는 안티센스 DNA 뿐 아니라, MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 제어하는 프로모터 및/또는 전사인자의 활성을 제어하는 활성을 갖는 물질도 포함된다.
본 발명의 「의약조성물」을 구성하는 상술한 「물질」에 포함되는 화학합성물(저분자화합물 등), 폴리펩티드, 항체, DNA 및 RNA의 각각은 하기와 같이 정의된다.
상기 「항체」로서는 MERMUC(특히 바람직하게는 인간의 MERMUC)에 결합하는 다중클론항체, 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체의 일부를 들 수 있다. 바람직하게는 단일클론항체 또는 그의 일부이다. 상기 단일클론항체에는 비인간 포유동물 유래의 단일클론항체 뿐 아니라, 재조합 키메라 단일클론항체(실험의학(임시증간호), 제1.6권, 제10호, 1988년 및 일본국 특허공보 제(평)3-73280호 공보 등), 재조합 인간형 단일클론항체 및 인간 단일클론항체(Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 일본국 특허공표 제(평)4-504365호 공보; 일본국 특허공표 제(평)7-509137호 공보; 닛케이사이언스, 6월호, 제40~제50페이지, 1995년; 국제출원공개 WO94/25585호 공보; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 일본국 특허공표 제(평)6-500233호 공보; 닛케이사이언스, 1997년 4월호, 제78페이지~84페이지 등)이 포함된다.
상기 「폴리펩티드」(여기에서는, 본 발명의 의약조성물의 구성요소로서의 폴리펩티드를 의미하고, 다른 발명으로서의 폴리펩티드 자체를 의미하는 것은 아니다.)는 올리고펩티드, 융합 폴리펩티드 및 그들의 화학수식체가 포함된다. 올리고펩티드로서는 5~30개의 아미노산, 바람직하게는 5~20개의 아미노산으로 된 펩티드를 들 수 있다. 상기 화학수식은 생체에 투여된 경우의 혈중 반감기의 증대 또는 경구투여시에 있어서의 소화관에서의 분해에 대한 내성 또는 흡수성의 증대 목적 등의 여러 목적에 따라 설계할 수 있다.
상기 「DNA」란 MERMUC를 코드하는 DNA(cDNA 및 게노믹 DNA를 포함한다)의 염기서열을 토대로 설계되는 안티센스 DNA 의약으로서 유용한 「상기 DNA의 부분염기서열을 포함하는 DNA 또는 그들을 화학수식한 화학수식 DNA」를 의미한다. 즉, 상기 안티센스 DNA는 MERMUC를 코드하는 유전자 또는 RNA에 하이브리다이즈함으로써, 상기 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사 또는 상기 mRNA의 단백으로의 번역을 저해할 수 있다.
상기 「RNA」란 상술한 MERMUC를 코드하는 RNA의 염기서열을 토대로 설계되는 안티센스 RNA 의약으로서 유용한 「상기 RNA의 부분염기서열을 포함하는 RNA 또는 그들을 화학수식한 화학수식 RNA」를 의미한다. 상기 안티센스 RNA는 상기 MERMUC를 코드하는 유전자 또는 RNA에 하이브리다이즈함으로써 상기 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사 또는 상기 mRNA의 단백으로의 번역을 저해할 수 있다.
여기에서「부분염기서열」이란 임의의 부위에 있어서의 임의의 수의 염기로 된 부분염기서열을 의미한다. 상기 부분염기서열으로서는 연속된 5~100염기의 부분염기서열을 들 수 있고, 바람직하게는 연속된 5~70염기의 부분염기서열, 더욱 바람직하게는 연속된 5~50염기의 부분염기서열, 보다 바람직하게는 연속된 5~30염기의 부분염기서열을 들 수 있다.
또한, 상기 DNA 또는 RNA를 안티센스 의약으로서 사용하는 경우에는, 상기 DNA 또는 RNA가 환자의 체내에 투여된 경우의 혈중 반감기의 증대(안정성), 세포내막의 투과성의 증대, 또는 경구투여인 경우의 소화기간에서의 분해내성의 증대 또는 흡수의 증대 등의 목적을 위해, 상기 DNA 또는 RNA의 염기서열의 일부에 화학수식을 행하는 것이 가능하다. 화학수식으로서는 예를 들면 올리고뉴클레오티드의 구조 중의 인산결합, 리보오스, 핵산염기, 당부위, 3' 및/또는 5'말단 등의 화학수식을 들 수 있다.
인산결합의 수식으로서는 1 이상의 상기 결합을 포스포디에스테르결합(D-올리고), 포스포로티오에이트결합, 포스포로디티오에이트결합(S-올리고), 메틸포스포네이트결합(MP-올리고), 포스포로아미데이트결합, 비인산결합 및 메틸포스포노티오에이트결합 중 어느 하나 또는 그들의 조합으로의 변경을 들 수 있다. 리보오스의수식으로서는 2'-플루오로리보오스 또는 2'-O-메틸리보오스 등으로의 변경을 들 수 있다. 핵산염기의 수식으로서는 5'-프로피닐우라실 또는 2-아미노아데닌 등으로의 변경을 들 수 있다.
「화학합성물」또는「저분자화합물」이란 상술한 항체, 폴리펩티드, DNA 및 RNA를 제외한 임의의 화합물로서, 분자량 약 100~약 1000 이하의 화합물, 바람직하게는 분자량 약 100~약 800의 화합물이고, 보다 바람직하게는 분자량 약 100~약 600의 화합물을 들 수 있다.
상술한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 일부(단편) 및 융합 폴리펩티드는 후술하는 바와 같은 유전자 재조합기술 외에, 화학적 합성법, 세포배양방법 등과 같은 당해 기술분야에 있어서 알려지는 공지의 방법 또는 그의 수식방법을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「MERMUC에 결합하는 항체」는 MERMUC(특히 바람직하게는 인간 MERMUC)를 발현하는 세포(천연세포, 주화세포, 종양세포 등), MERMUC(특히 바람직하게는 인간 MERMUC)를 그 세포표면에 고발현하도록 유전자 재조합기술을 사용하여 제작된 형질전환체, MERMUC(특히 바람직하게는 인간 MERMUC)를 구성하는 폴리펩티드(특히 바람직하게는 세포외영역을 구성하는 폴리펩티드), 또는 상기 MERMUC의 세포외영역의 전부 또는 일부와 다른 단백질의 전부 또는 일부(인간 IgFc, 글루타티온-S-트랜스페라아제, His tag, β-galactosidase 등)로 된 융합 폴리펩티드를 항원으로서 사용하여, 상기 항원을 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼 등의 포유동물에 면역하여 얻어지는 천연형 항체, 유전자 재조합기술을 사용하여 제조될 수 있는 키메라항체 및 인간형 항체(CDR-grafted 항체) 및 인간 항체생산 트랜스제닉 동물 등을 사용하여 제조될 수 있는 인간 항체도 포함한다.
단일클론항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 중 어느 하나의 아이소타입을 갖는 단일클론항체도 포함된다. 바람직하게는 IgG 또는 IgM이다.
다중클론항체(항혈청) 또는 단일클론항체는 기존의 일반적인 제조방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면 상술한 바와 같은 항원을 필요에 따라 프로인드 애주번트(Freund's Adjuvant)와 함께 포유동물, 바람직하게는 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 말 또는 소, 보다 바람직하게는 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼에 면역한다.
다중클론항체는 상기 면역감작 동물로부터 얻은 혈청으로부터 취득할 수 있다. 또 단일클론항체는 상기 면역감작 동물로부터 얻은 상기 항체생산 세포와 자기항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마세포)로부터 하이브리도마를 조제하고, 상기 하이브리도마를 클론화하여 포유동물의 면역에 사용한 항원에 대해 특이적 친화성을 나타내는 단일클론항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조된다.
단일클론항체는 구체적으로는 하기와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 상술한 바와 같은 항원을 면역원으로 하여, 상기 면역원을 필요에 따라 프로인드 애주번트(Freund's Adjuvant)와 함께 비인간 포유동물, 구체적으로는 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼, 바람직하게는 마우스, 랫트 또는 햄스터(후술하는 인간항체생산 트랜스제닉 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 작출된 트랜스제닉 동물을 포함한다)의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드(footpad)내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사하거나 또는 이식함으로써 면역감작을 행한다. 통상, 초회면역으로부터 약 1~14일마다 1~4회 면역을 행하고, 최종면역으로부터 약 1~5일 후에 면역감작된 상기 포유동물로부터 항체생산 세포가 취득된다. 면역을 행하는 횟수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 성질 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마의 조제는 퀼러 및 밀스테인 등의 방법(Nature, 제256권, 제495~제497페이지, 1975년) 및 그에 준하는 수식방법에 따라 행할 수 있다. 즉, 상술하는 바와 같이 면역감작된 비인간 포유동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체생산 세포와, 바람직하게는 마우스, 랫트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 랫트 또는 인간 유래의 자기항체 생산능이 없는 미엘로마세포와 세포융합시킴으로써 조제된다.
세포융합에 사용되는 미엘로마세포로서는 예를 들면 마우스 유래 미엘로마 P3/X63-AG8.653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/0, Sp2), PAI, FO 또는 BW5147, 랫트 유래 미엘로마 210RCY3-Ag.2.3., 인간 유래 미엘로마 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15를 사용할 수 있다.
단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은 하이브리도마를 예를 들면 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 중에서 배양하여, 증식이 보인 웰의 배양상청의 상술한 면역감작에서 사용한 면역항원에 대한 반응성을, 예를 들면RIA나 ELISA 등의 효소면역측정법으로 측정함으로써 행할 수 있다.
하이브리도마로부터의 단일클론항체의 제조는 하이브리도마를 인 비트로(in vitro), 또는 마우스, 랫트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하게는 마우스 또는 랫트, 보다 바람직하게는 마우스의 복수(腹水) 중 등에서의 인 비보(in vivo)에서 행하여, 얻어진 배양상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리함으로써 행할 수 있다.
인 비트로에서 배양하는 경우에는 배양하는 세포종의 특성, 시험연구의 목적 및 배양방법 등의 여러 조건에 맞춰, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜 배양상청 중에 단일클론항체를 생산시키기 위해 사용되는 기지의 영양배지 또는 기지의 기본배지로부터 유도 조제되는 모든 영양배지를 사용하여 실시하는 것이 가능하다.
기본배지로서는 예를 들면 Ham'F12 배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘배지 및 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지 또는 RD 배지 등의 고칼슘배지 등을 들 수 있고, 상기 기본배지는 목적에 따라 예를 들면 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 여러 무기 또는 유기물질 등을 함유할 수 있다.
단일클론항체의 단리, 정제는 상술한 배양상청 또는 복수를 포화 황산암모늄, 유글로불린 침전법, 카프론산법, 카프릴산법, 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 이뮤노글로불린칼럼 또는 프로테인A칼럼 등의 친화성 칼럼크로마토그래피에 제공함으로써 행할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「항체의 일부」란 상술한 바와 같은 단일클론항체의 일부분의 영역을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), sFv, dsFv(disulphide stabilised Fv) 또는 dAb(single domain antibody) 등을 의미한다(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996).
본 발명에 있어서 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란 부형제, 희석제, 증량제, 붕해제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해보조제 또는 기타 첨가제 등이다.
그러한 담체의 하나 이상을 사용함으로써, 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 엘릭실제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 본 발명의 의약조성물을 조제할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구투여를 위한 기타 형태로서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하고, 일반적인 방법으로 처방되는 외용액제, 장용내 투여를 위한 좌제 및 페서리 등이 포함된다.
본 발명의 의약조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간, 또는 상기 의약조성물에 함유되는 활성성분(상기 본 발명의 「물질」등)의 종류에 따라 다르지만, 통상 성인 1인당 1회에 10 ㎍~1000 mg(또는 10 ㎍~500 mg)의 범위에서 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 조건에 따라 변동되기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또 상기 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.
특히 주사제의 경우에는, 예를 들면 생리식염수 또는 시판되고 있는 주사용 증류수 등의 비독성의 약학적으로 허용될 수 있는 담체 중에 0.1 ㎍ 항체/ml 담체~10 mg 항체/ml 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 주사제는 처치를 필요로 하는 인간 환자에 대해, 1회 투여에 있어서 1 kg 체중당 1 ㎍~100 mg의 비율로, 바람직하게는 50 ㎍~50 mg의 비율로, 1일당 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 투여의 형태로서는 정맥내주사, 피하주사, 피내주사, 근육내주사 또는 복강내주사와 같은 의약상 적당한 투여형태를 예시할 수 있다. 바람직하게는 정맥내주사이다.
또한, 주사제는 경우에 따라 비수성 희석제(예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로서 조제하는 것도 가능하다.
그러한 주사제의 무균화는 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과멸균, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 행할 수 있다. 주사제는 용시조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결건조 등으로 무균의 고체조성물로 하고, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 단독 또는 상술한 HGF 의약과의 병용에 의해 여러 질환의 예방·치료에 필수인 조직 및 기관 등의 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강을 달성하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 의약조성물을 단독 또는 상술한 HGF 의약과 병용함으로써, 현재도 그 치료가 곤란해져 있는 여러 난치성 질환(예를 들면, 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염, 급성간염, 만성신부전,신선유증 및 폐선유증 등)의 치료가 가능해진다.
본 발명의 의약조성물(의약 A)의 HGF 의약(의약 B)와의 병용에 있어서는, 치료의 목적에 따라 의약 A 및 의약 B를 임의의 순서로 또한 임의의 투여형태로 환자에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 의약조성물을 단독으로 사용하는 경우에는, 상기 의약조성물에 포함되는 활성성분이 HGF 수용체인 c-Met와 MERMUC의 결합에 의해 일어나는 HGF 활성의 다운 레귤레이션을 제거함으로써, 환자의 생체에 내재하는 HGF가 원래 갖는 생물활성이 나타남으로 인해 당해 치료효과가 달성될 수 있다.
한편, 본 발명의 의약조성물을 상술한 HGF 의약과 병용하는 경우에는, 상기 의약조성물에 포함되는 활성성분이 HGF 수용체인 c-Met와 MERMUC의 결합에 의해 일어나는 HGF 활성의 다운 레귤레이션을 제거함으로써, 상술한 바와 같은 질환의 치료에 사용되는 HGF 의약의 용량은 필요 최소한으로 억제하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서 「선유증」이란 임의의 기관에 있어서의 조직선유증이 포함되고, 특히 바람직하게는 예를 들면 폐선유증, 간선유증 또는 신선유증을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 간염이란 임의의 원인에 의해 야기되는 간장에 있어서의 임의의 염증이 포함되지만, 특히 바람직하게는 극증간염, 급성간염(바이러스나 약제에 의한 간장독 등에 의해 야기되는 염증) 또는 바이러스성 간염(여러 바이러스, 특히 C형 간염 등의 간염 바이러스에 의해 야기되는 염증)을 들 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 그 치료를 위해 조직의 재생이나 신생이 필요로 해지는 임의의 질환의 치료(예방을 포함한다)에 사용할 수 있지만, 특히 바람직하게는 여러 간장질환(예를 들면, 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염, 급성간염 등), 신장질환(예를 들면, 만성신부전, 신선유증 등) 및 폐질환(예를 들면, 폐선유증 등)이다. 이러한 질환은 모두 난치성 질환의 대표적인 것으로, 바꿔 말하자면 본 발명의 의약조성물은 그러한 난치성 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명은 또한 「c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질(상기 정의와 동일)을 동정하는 방법」및「어떤 물질의 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법」에 관한 것으로, 상기 방법은 예를 들면 하기의 공정을 포함한다.
(a) c-Met 및 MERMUC를 함께 발현하고, 상기 c-Met 및 MERMUC가 결합한 경우에 상기 결합을 검출 가능하도록 설계된 세포를 조제하는 공정;
(b) 공정 (a)에서 얻은 세포를 HGF의 존재하에서 또 실험 대상물질의 부존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(c) 공정 (b)에서 얻은 세포를 HGF 및 실험 대상물질의 존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
(d) 공정 (b)의 측정결과와 공정 (c)의 측정결과를 비교하는 공정.
여기에서 공정 (a)의 세포제작에 사용되는 숙주세포로서는 재조합단백질의 제조에 있어서 통상 사용되는 세포라면 특별히 한정되지 않고, 천연세포 또는 인공적으로 수립된 재조합 세포 등 여러 세포(예를 들면, 세균(에쉐리키아속균, 바실루스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물세포 또느 곤충세포 등의 모두를 포함한다. 더욱 구체적으로는 대장균(DH5α, TB1, HB101 등), 마우스 유래 세포(COP, L, C127, Sp2/0, NS-1 또는 NIH3T3 등), 랫트 유래 세포(PC12, PC12h), 햄스터 유래 세포(BHK 및 CHO 등), 원숭이 유래 세포(COS1, COS3, COS7, CV1 및 Velo 등) 및 인간 유래 세포(Hela, 2배체 선유아세포에 유래하는 세포, 미엘로마세포 및 HepG2 등) 등의 어느 것이어도 된다. 특히 바람직하게는 상기와 같은 동물세포이다.
공정 (a)의 c-Met(전장 또는 그의 일부)로서는 바람직한 예로서, 상기에 정의한 인간 c-Met의 전부 또는 일부(특히 바람직하게는 적어도 인간 MERMUC와의 결합부위를 포함한다)와 β-gal△α 또는 β-gal△ω와의 융합 폴리펩티드를 들 수 있다.
공정 (a)의 MERMUC(전장 또는 그의 일부)로서는 바람직한 예로서, 상기에 정의한 인간 MERMUC의 전부 또는 일부(특히 바람직하게는 적어도 인간 c-Met와의 결합부위를 포함한다)와 β-gal△α 또는 β-gal△ω와의 융합 폴리펩티드를 들 수 있다.
상기의 융합 폴리펩티드를 사용함으로써, MERMUC와의 결합 유무, 정도 또는 증감을 세포시료 중에서 발현되는 β-갈락토시다아제 활성으로서 검출 가능해진다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997).
상기 본 발명의 방법을 사용하는 화합물의 동정 또는 시험은 매뉴얼 작업으로도 가능하지만, 기계(로보트)를 사용하여 자동으로 행하는 소위 하이 쓰루풋 스크리닝(High Throughput Screening)(조직배양공학, Vol.23, No.13, p.521-524; 미국특허 제5,670, 113호)을 사용함으로써 신속하고 간편하게 행할 수 있다.
상기 본 발명의 방법에 의해 동정된 물질은 상술한 본 발명의 의약조성물의 활성성분으로서 사용된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 웨스턴 블로팅으로 해석한 재조합 인간 MERMUC 발현 HEK293 세포에서의 인간 MERMUC 및/또는 인간 c-Met의 생산을 나타내는 사진이다.
분도(分圖) A는 항MERMUC 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅으로 해석한 Dox의 존재하 및 비존재하의 각각에서 배양한 재조합 세포에서의 인간 MERMUC의 생산을 나타내는 사진이다.
분도 B는 항c-Met 항체 또는 항MERMUC 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅으로 해석한 Dox의 존재하 및 비존재하의 각각에서 배양한 재조합 세포에서의 인간 c-Met 및 MERMUC(상기 c-Met와 공침강하였다) 각각의 생산을 나타내는 사진이다.
분도 C는 대조 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅으로 해석한, Dox의 존재하 및 비존재하의 각각에서 배양한 재조합 세포에서의 인간 c-Met 및 MERMUC(상기 c-Met와 공침강하였다) 각각의 생산을 나타내는 사진이다.
도 2는 웨스턴 블로팅으로 해석한 재조합 인간 MERMUC 발현 HEK293 세포에서의 인간 MERMUC의 다량체에서의 생산을 나타내는 사진이다.
분도 A는 항FLAG-tag 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 해석한 각종 시료에서의 FLAG-tag 부가 인간 MERMUC의 생산을 나타내는 사진이다.
분도 B는 항polyHis-tag 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 해석한, 각종 시료에서의 polyHis-tag 부가 인간 MERMUC의 생산을 나타내는 사진이다.
도 3은 노던 블로팅으로 해석한 인간의 각종 조직에 있어서의 인간 MERMUC의 mRNA의 발현을 나타내는 사진이다.
도 4는 PCR로 해석한 인간의 각종 조직에 있어서의 인간 MERMUC 유전자의 발현을 나타내는 사진이다.
도 5는 인 시츄 하이브리다이제이션(in situ hybridization)으로 해석한 각종 마우스 신장조직에서의 마우스 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타내는 사진이다. 도면 중의 문자 G는 신사구체(glomerulus), PT는 근위 뇨세관(proximal tubule), DT는 원위 뇨세관(distal tubule)을 가리킨다.
분도 a는 안티센스 cRNA 프로브를 사용한 해석에 있어서의 MRL-lpr/lpr 마우스(5주령)의 신장조직에서의 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타낸다.
분도 b는 센스 cRNA 프로브를 사용한 해석에 있어서의 MRL-lpr/lpr 마우스(5주령)의 신장조직에서의 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타낸다.
분도 c는 안티센스 cRNA 프로브를 사용한 해석에 있어서의 MRL-lpr/lpr 마우스(23주령)의 신장조직에서의 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타낸다.
분도 d는 안티센스 cRNA 프로브를 사용한 해석에 있어서의 C57BL/6 마우스(23주령)의 신장조직에서의 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타낸다.
분도 e는 센스 cRNA 프로브를 사용한 해석에 있어서의 C57BL/6 마우스(23주령)의 신장조직에서의 MERMUC 유전자의 발현분포를 나타낸다.
도 6은 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met와의 결합을 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 MERMUC의 분자간의 결합을 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 웨스턴 블로팅으로 해석한, MERMUC의 생산량 증가에 의존한 HGF 유도성 세포내 MAP 키나아제 활성의 감약을 나타내는 사진이다.
도 9는 웨스턴 블로팅으로 해석한, HGF 자극을 부여한 MERMUC 생산 세포 또는 비생산 세포 각각에서의 인산화된 HGF 수용체 c-Met의 양적 차이를 나타내는 사진이다.
도 10은 웨스턴 블로팅으로 해석한, HGF 자극을 부여한 MERMUC 생산 세포 또는 비생산 세포 각각에서의 HGF 수용체 c-Met와 결합한 Grb2 및 Gab1 각각의 양적 차이를 나타내는 사진이다.
도 11은 RT-PCR로 해석한, HGF 자극을 부여한 MERMUC 생산 세포 또는 비생산 세포 각각에 있어서의 MMP-1 및 MMP-9 각각의 mRNA의 발현 차이를 나타내는 사진이다.
도 12는 MERMUC 과잉발현 트랜스제닉 마우스 및 정상 마우스 각각에 유래하는 간실질세포의 HGF 또는 EGF 응답성 세포증식의 정도를 나타내는 도면이다.
분도 A는 HGF 응답성 세포증식의 정도를 나타낸다.
분도 B는 EGF 응답성 세포증식의 정도를 나타낸다.
도 13은 웨스턴 블로팅으로 해석한, MERMUC 과잉발현 트랜스제닉 마우스 및 정상 마우스 각각의 간실질세포 내에서의 HGF 유도성 세포내 MAP 키나아제 활성의 강약을 나타내는 사진이다.
도 14는 mFas-MERMUC 융합단백의 MERMUC 영역에서의 자기회합의 유무를 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 웨스턴 블로팅으로 해석한 HGF 수용체와 함께 면역침강하는 자기회합한 MERMUC의 양을 나타내는 사진이다.
도 16은 각종 MERMUC 세포질영역 펩티드에 의한 MERMUC의 자기회합 억제의 정도를 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 각종 MERMUC 세포질영역 펩티드에 의한 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합 억제의 정도를 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 각종 농도의 MERMUC 세포질영역 펩티드(del-4)에 의한 MERMUC의 자기회합 및 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합 각각의 억제 정도를 β-gal 활성의 출현을 지표로서 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 웨스턴 블로팅으로 해석한, Dox의 존재여부에 의한 MERMUC의 발현 유무 및 MERMUC 세포질영역 펩티드(del-4)에 의한 MERMUC 자기회합 억제의 유무에 의존한 인산화 MAP 키나아제(p-Erk) 생산의 강약을 나타내는 사진이다.
도 20은 면역침강법으로 해석한, Dox의 존재여부에 의한 MERMUC의 발현 유무 및/또는 HGF 자극의 유무에 의한 인산화된 MERMUC 생산의 유무를 나타내는 사진이다.
도 21은 면역침강법으로 해석한, HGF의 유무 및/또는 HGF 시그날링 억제제의 유무에 의한 인산화된 MERMUC 생산의 차이를 나타내는 사진이다.
도 22는 마우스 MERMUC 과잉생산 Tg 및 정상 마우스에 있어서의 HGF 의존적인 간비대의 정도를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예로서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 상기 실시예에 기재되는 태양에만 한정되지 않는 것은 말할 것도 없다.
실시예 1 인간 MERMUC와 결합하는 분자의 동정
인간의 게놈을 해석한 결과, 인간 MERMUC를 코드하는 유전자는 제3 염색체 상에 존재하고, 3개의 엑손(Ex.-1, Ex.-2, Ex.-3)으로부터 구성되는 것이 명확해졌다.
인간 및 마우스 각각의 MERMUC 폴리펩티드의 일차구조(아미노산서열)를 상기 엑손마다 비교한 바, Ex.-1에 대응하는 영역에서의 상동성은 약 30%로 낮지만, Ex.-2 및 Ex.-3에 대응하는 영역(각각 약 50 아미노산으로 된다)에서는 각각 71% 및 60%로 매우 높은 상동성이 인정되었다. 이 사실로부터 MERMUC 폴리펩티드의 일차구조를 토대로 하는 한 MERMUC의 세포질영역의 C말단영역에 상당하는 이 영역에 MERMUC의 기능발현에 있어서의 약간의 중요성이 존재할 가능성이 추측되었다.
따라서, MERMUC의 기능을 명확하게 할 목적으로 MERMUC의 세포질영역내의 C말단영역에 결합하는 분자의 유무를 명확하게 하는 동시에 해당 분자의 동정을 시험해 보았다.
해당 시험은 효모 2-하이브리드법(yeast 2-hybrid system; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88, p.9578-9582, 1991)에 의해 베이트(bait; 즉, 미끼.)로서의 인간 MERMUC의 C말단영역에 대응하는 cDNA를 사용하여 인간 신장 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 행하였다.
Ex.-2 및 Ex.-3의 각각을 코어로서 2종류의 베이트(베이트-2 및 베이트-3)를 디자인하였다. 베이트-2는 C말단의 123 아미노산부분(베이트-2)에 대응하여 베이트-3은 C말단의 65 아미노산(베이트-3)에 대응한다.
양 베이트는 이들을 인간 MERMUC의 전장을 코드하는 cDNA(서열번호 9)를 주형으로서 일반적인 방법에 따라 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 조제하였다. 상기 PCR에 사용한 상기 2종류의 정방향(forward) 프라이머(<베이트-2> 서열번호 18; <베이트-3> 서열번호 19)는 모두 5'말단에 EcoRI 사이트를 가지고, 양 베이트에 공통인 역방향(reverse) 프라이머(서열번호 20)는 5'말단에 SalI 사이트를 갖는다.
각각의 PCR 산물을 제한효소 EcoRI와 SalI로 소화하여 얻어진 DNA 단편의 각각을 pGBKT7 벡터(류신 합성계 유전자를 마커로 한다. CLONTECH제)의 EcoRI/SalI 사이트로 삽입하여 베이트 벡터의 각각을 얻었다. 이들 베이트 벡터내의 유전자가 효모내에서 발현하여 생산되는 단백은 효모전사인자 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4-DB)과의 융합단백질(「융합단백질 A」)로서 생산된다.
한편, 상기 베이트 벡터에서 스크리닝하는 인간 신장 유래 cDNA 라이브러리(CLONTECH제) 각각의 cDNA는 pADK 벡터(트립토판 합성계 유전자를 마커로 한다)에 삽입되어 있어, 각 cDNA가 효모내에서 발현하여 생산되는 단백은 GAL4의 전사 활성화영역(GAL4-AD)과의 융합단백질(「융합단백질 B」)로서 생산된다.
숙주로서의 효모는 AH109주(류신, 트립토판, 히스티딘, 아데닌 요구성 효모; CLONTECH제)를 사용하였다. 상기 효모는 GAL 프로모터 제어하에 있는 3종류의 유전자, 즉 히스티딘 합성계 유전자, 아데닌 합성계 유전자 및 β-갈락토시다아제 유전자를 염색체 상에 갖는다.
베이트 단백질(상기 융합단백질 A) 프레이 단백질(prey protein)(상기 융합단백질 B)이 결합하는 결과, GAL4-DB와 GAL4-AD가 융합하여 전사인자로서의 기능을 회복한다. 이 결과, 3종류의 유전자의 발현이 유도되어 숙주효모에서는 히스티딘 및 아데닌 요구성이 해소되는 동시에, β-갈락토시다아제(β-galactosidase; β-gal) 활성이 출현한다.
상기 스크리닝을 위해서 각각의 베이트 벡터를 상기 cDNA 라이브러리 플라스미드(1풀 당, 50,000 클론.)와 함께 효모 AH109주로 폴리에틸렌글리콜/초산리튬법에 의해 도입하였다(J. Bacteriol., Vol.153, p.163-168, 1983; Curr, Genet., Vol.16, p.339-346, 1989; Nucleic Acids Res., Vol.19, p.5791, 1991; Nucleic Acids Res., Vol.20, p.1425, 1992).
본 스크리닝에 있어서는 목적으로 하는 형질전환이 된 효모의 제일차 선발지표를 히스티딘 합성계 유전자의 발현에 의한 히스티딘 비요구성 획득으로 하였다. 따라서, 플라스미드를 도입한 후의 효모는 류신, 트립토판 및 히스티딘을 제거시킨 형질전환체 선발용 효모 최소배지(SD/-Leu, -Trp, -His) 상에서 30℃에서 5일간 배양하였다.
상기 배양에 의해 플레이트 상에 생육한 형질전환 효모를 이쑤시개로 집어올려, 목적 클론의 제2차 선발을 행하기 위한 하기 3종류의 플레이트 각각에 접종하여 30℃에서 5일간 배양하였다.
<A> 류신, 트립토판 및 히스티딘을 제거시킨 효모 최소배지(SD/-Leu, -Trp, -His)를 포함하는 플레이트.
<B> 류신, 트립토판 및 아데닌을 제거시킨 효모 최소배지(SD/-Leu, -Trp, -Ade)를 포함하는 플레이트.
<c> 류신 및 트립토판을 제거시킨 α-X-gal(20 ㎍/ml)을 첨가한 효모 최소배지(SD/-Leu, -Trp, +X-gal)를 포함하는 플레이트.
상기 <A> 및 <B> 플레이트 모두에서 성육하고(히스티딘 및 아데닌 비요구성의 획득), 또한 <C>(α-X-gal 첨가분) 플레이트 상에서 콜로니가 청색을 나타내는 것(β-갈락토시다아제 활성이 출현)을 양성 클론으로 하고, 4개의 프레이 cDNA 클론(클론 No.3-309; No.3-312; No.2-22; 및 No.2-211)을 선출하였다. 상기 양성 효모클론이 갖는 프레이 cDNA 단편을 보유하는 플라스미드는 마실과 히긴스 등(Marcil, R. & Higgins, D.R.)의 방법(Nucleic Acids Res., Vol.20, p.917, 1992)으로 효모로부터 대장균으로 전이시켰다.
상기 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 회수 후 프레이 cDNA에 상당하는 부분의 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 의한 염기서열 결정작업으로 해독하였다. 결정된 프레이 cDNA의 염기서열을 토대로 범용되고 있는 유전자 데이터베이스를 사용하여 검색 및 데이터 해석을 행하였다.
그 결과, 상기 4개의 양성 클론내의 2개의 클론(No.3-309 및 3-312)에 유래하는 단백은 모두 베이트-2 및 베이트-3에 유래하는 단백 양쪽에 결합능을 가지고, 인간 HGF의 수용체인 c-Met의 β사슬의 C말단영역에 대응하는 것이었다. 클론 No.3-309는 인간 c-Met의 β사슬의 C말단의 91 아미노산(서열번호 4의 아미노산번호 993-1083)에 대응하고, 클론 No.3-312는 상기 C말단의 89 아미노산(서열번호 4의 아미노산번호 995-1083)에 대응한다.
또한 다른 2개의 양성 클론(No.2-22 및 2-211)에 유래하는 단백은 베이트-2에 유래하는 단백에 결합능을 가지고, 인간 MERMUC 자신의 C말단영역에 대응하는 것이었다. 클론 No.2-22는 인간 MERMUC의 C말단의 93 아미노산(서열번호 10의 아미노산번호 411-503)에 대응하고, 클론 No.2-211는 상기 C말단의 56 아미노산(서열번호 10의 아미노산번호 448-503)에 대응한다.
실시예 2 MERMUC 전장 단백과 HGF 수용체 c-Met 전장 단백의 결합
<2-1> 약제로 발현조절 가능한 MERMUC 발현 재조합 세포의 제작
이미 보고된 테트라사이클린 조절성 발현 시스템(Tetracycline-controllable expression system; Tet System)을 이용하여 독시사이클린(Dox; Doxicycline)에 의해 인간 MERMUC 유전자의 발현을 조절할 수 있는 재조합 세포를 조제하였다.구체적으로는 상기 재조합 세포는 MERMUC 유전자의 발현이 배양계에 존재하는 Dox의 농도에 의존하여 억제된다는 특징(Tet-Off 시스템)을 갖는 것이다.
상기 세포의 조제에는 시판의 pBI-L 벡터, pTK-Hyg 벡터 및 HEK293 Tet-Off 세포(모두 CLONTECH제)를 사용하고, 실험조작은 상기 실험도구에 첨부된 실험조작 설명서에 따라 행하였다.
즉, 인간 MERMUC의 전장을 코드하는 cDNA(서열번호 9)를 pBI-L 벡터의 멀티클로닝사이트에 삽입하여 MERMUC 발현벡터를 조제하였다. 이어서, 상기 MERMUC 발현벡터와 pTK-Hyg 벡터에 의해 HEK293 Tet-Off 세포를 공형질전환하였다(인간 신장 유래의 HEK293 세포주는 인간 HGF 수용체 c-Met를 발현하고 있다.). 세포의 하이그로마이신 내성의 유무를 지표로서 상기 MERMUC 발현벡터가 안정적으로 도입된 세포주를 선택하였다. 더욱이, 상기 선별세포군 중에서 MERMUC 유전자의 발현효율이 높고, 또한 상기 발현이 Dox에 의해 정확하게 제어 가능한 특성을 갖는 세포주(MERMUC/293 세포 명명.)를 선별하였다. 또한, 상기 선별은 발현된 MERMUC 단백을 항인간 MERMUC 다중클론항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 해석하여 행하였다.
<2-2> 면역침강 시험에 의한 인간 MERMUC와 인간 HGF 수용체 c-Met의 결합 해석
상기와 같이 제작한 MERMUC/293 세포로부터 조제되는 세포 가용화물(cell lysate)에 항인간 c-Met 항체를 가하여 면역침강 처리를 행하여, MERMUC 전장 단백이 HGF 수용체 c-Met 전장 단백과 함께 면역침강되는지의 여부로 양자의 결합을 평가하였다.
본 시험에서 사용하는 인간 MERMUC에 대한 다중클론항체는 일반적인 방법에 따라 N말단 근방의 17 아미노산(서열번호 21)에 상당하는 펩티드를 토끼에 면역하여 조제하였다. 한편, 인간 c-Met에 대한 항체는 시판의 다중클론항체 h-Met(C-28)(sc-161; Santa Cruz Biotechnology제)를 사용하였다.
MERMUC/293 세포로부터 조제되는 세포 가용화물에 상기 항인간 c-Met 다중클론항체를 가하여 반응시켰다. 상기 반응용액을 마이크로비즈를 결합시킨 프로테인-G 세파로오스(protein-G Sepharose)와 반응시킨 후 원심분리에 제공하여 c-Met와 항c-Met 다중클론항체와의 복합체를 면역침강시켰다.
이어서, 상기 침전물을 전기영동용 버퍼에 용해하고, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 상기 버퍼 중에 용해된 시료를 분리한 후, 일반적인 방법에 따라 항인간 MERMUC 다중클론항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다.
그 결과, 항인간 c-Met 다중클론항체로 면역침강한 단백질 중에 인간 MERMUC의 존재가 인정되었다(도 1). 이 결과는 MERMUC(전장)와 HGF 수용체 c-Met(전장)의 결합을 실제 세포에 있어서 재현하는 것으로, MERMUC가 c-Met와 결합함으로써 HGF/HGF 수용체를 매개로 한 시그날 전달을 제어하고 있을 가능성이 시사된다.
실시예 3 면역공침 시험에 의한 인간 MERMUC 분자간의 결합(다량체화)의 해석
실시예 1의 결과로부터 MERMUC 분자의 분자간에서의 결합활성이 추찰되기 때문에 MERMUC의 전장 단백의 분자간 결합의 유무를 해석하였다.
<3-1> 인간 MERMUC 전장 발현벡터의 구축
하기와 같이 하여 2종류의 태그(tag) 부가 인간 MERMUC 전장을 발현하는 발현벡터를 구축하였다. 한쪽은 MERMUC의 C말단에 FLAG-tag가 부가된 MERMUC의 발현용이고, 다른 쪽은 polyHis-tag가 부가된 MERMUC의 발현용이다.
각 태그(tag) 부가 MERMUC 단백의 전장을 코드하는 cDNA를 인간 MERMUC 전장을 코드하는 cDNA(서열번호 9) 주형으로 하여, 일반적인 방법에 따라 PCR에 의해 조제하였다. 상기 PCR에 사용하는 프라이머 세트는 하기를 사용하였다.
<FLAG-tag 부가 MERMUC>
정방향 프라이머: 서열번호 22
역방향 프라이머: 서열번호 23
<polyHIS-tag부가 MERMUC>
정방향 프라이머: 서열번호 22
역방향 프라이머: 서열번호 24
얻어진 각각의 PCR 산물은 제한효소 HindIII 및 XhoI로 소화 후, pcDNA3 벡터의 HindIII 및 XhoI 사이트에 삽입한 후 대장균으로 도입하였다. 본 시험에서 사용하는 동물세포 발현용 플라스미드의 각각을 이들 형질전환 대장균으로부터 조제하였다.
GeneJammer Transfection Reagent(STRATAGENE제)를 사용하여 상기 시약에 첨부된 실험조작 설명서에 따라, 상기에서 조제한 2종류의 발현 플라스미드 각각 등량의 혼합물을 HEK293 세포(인간 신장 유래 세포주)에 가하여 37℃에서 48시간 배양하여 공형질전환하였다..
얻어진 형질전환 세포로부터 조제한 세포 가용화물(cell lysate)을 항polyHIS 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology제), 항FLAG 단일클론항체(Anti-FLAG M2 monoclonal antibody; #F3165; Sigma제) 또는 대조 단일클론항체로 면역침강을 위한 처리를 행하였다.
이어서 면역침강한 단백 중에서의 FLAG-tag 부가 MERMUC 및 polyHIS-tag 부가 MERMUC 각각의 존재를 일반적인 방법에 따라, 항 FLAG 단일클론항체 및 항polyHIS 다중클론항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 해석하였다.
결과를 도 2에 나타낸다.
그 결과, 항FLAG 단일클론항체로 면역침강한 경우에는 FLAG-tag 부가 MERMUC 및 polyHIS-tag 부가 MERMUC의 양쪽이 동정되었다. 또한, 항polyHIS 다중클론항체로 면역침강한 경우에도 상기 양쪽의 태그 부가 MERMUC가 동정되었다.
이것으로 보아 MERMUC는 세포막 상에서 모노머 분자가 분자간 결합하여 다량체를 형성할 수 있는 것(다량체화)이 시사된다.
실시예 4 인간 MERMUC의 조직발현 분포
인간 HGF 수용체 c-Met의 발현은 간장, 신장 및 전립선 뿐만 아니라 소장 및 대장 등의 소화기관에서 특히 높은 것이 보고되어 있다(Int. J. Cancer, Vol.49,p.323-328, 1991; Oncogene, Vol.6, p.1997-2003, 1991).
<4-1> 노던 블로팅법에 의한 해석
따라서, MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합의 생리학적 의의를 해석하기 위해서, MERMUC의 조직발현 분포를 일반적인 방법에 따라 노던 블로팅에 의해 해석하였다.
본 시험에 있어서는, 인간조직 유래의 mRNA(2 ㎍/lane)를 블로팅한 시판의 3종류의 멤브레인(Human 12-lane MTN Blot, Human MTN Blot II 및 Human Digestive MTN Blot. 모두 CLONTECH제)을 사용하였다. 또한, 프로브에는 PCR로 증폭하여 조제한 인간 MERMUC의 전장을 코드하는 cDNA영역을 포함하는 DNA 단편(약 1.5 kpb)을 사용하였다. 하이브리다이제이션은 65℃에서 하룻밤 행하였다. 하이브리다이제이션 후의 멤브레인의 세정은 4×SSC(0.1% SDS)로 15분 및 2×SSC(0.1% SDS)로 15분간 행하였다.
결과를 도 3에 나타낸다.
MERMUC의 mRNA에 대응하는 약 2.4 kb의 밴드는 신장, 전립선, 간장, 폐, 태반, 소장 및 대장 등의 소화기관에서 인정되어, 이 발현분포는 HGF 수용체 c-Met의 발현분포와 일치하였다.
<4-2> PCR법에 의한 해석
더욱이, 일부 기관에서의 MERMUC 유전자의 발현에 대해서는 PCR을 사용하는방법으로도 해석하였다.
즉, 인간의 뇌, 심장, 간장, 신장, 폐, 췌장, 태반 및 골격근 각각에 유래하는 cDNA(각 0.2 ng; Human Multiple Tissue cDNA Panel I, CLONTECH제)를 주형으로 하여, 정방향 프라이머(서열번호 25; Ex.-2의 일부에 대응한다) 및 역방향 프라이머(서열번호 26; Ex.-3의 일부에 대응한다)를 사용한 PCR(어닐링 온도: 55℃에서 35사이클)에 의해 실시하였다.
결과를 도 4에 나타낸다. 그 결과, 신장, 간장, 폐, 태반 및 췌장에 있어서 MERMUC 유전자의 발현을 나타내는 약 400 bp의 증폭 DNA 밴드가 검출되고, 해당 장기에서 MERMUC 유전자의 유의한 발현이 확인되었다.
<4-3> in situ 하이브리다이제이션에 의한 해석
HGF 수용체 c-Met 유전자의 신장조직내에서의 발현에 대해서는 신뇨세관의 상피세포에 존재하고, 세포증식이나 관강형성에 관여하는 것이 보고되어 있다(Biochem. Biophys. Bres. Commun., Vol.174, p.831-838, 1991; Cell, Vol.67, p.901-908, 1991). 따라서, 마우스 MERMUC 유전자의 신장조직에서의 발현분포를 in situ 하이브리다이제이션에 의해 해석하였다.
시판의 MRL-lpr/lpr 마우스(5주령 또는 23주령) 및 C57BL/6 마우스(23주령) 각각의 신장조직으로부터 일반적인 방법에 따라 RNA 하이브리다이제이션용 조직절편을 제작하였다.
in situ 하이브리다이제이션에는 마우스 MERMUC의 전장(아미노산/서열번호11; cDNA/서열번호 12)의 N말단을 코드하는 약 500 bp를 주형으로 한 안티센스 cRNA 프로브 또는 센스 cRNA 프로브를 사용하였다.
결과를 도 5에 나타낸다.
그 결과, 마우스 MERMUC 유전자의 신장조직에서의 발현은 근위 뇨세관 및 원위 뇨세관의 상피세포에 국한하여 인정되어, 이미 보고된 HGF 수용체 c-Met의 신장조직내에서의 발현분포와 일치하는 것이 명확해졌다.
실시예 5 인간 HGF 수용체 c-Met 분자내의 인간 MERMUC 분자와의 결합영역의 동정
본 시험은 이미 보고된 효모 2-하이브리드법(yeast 2-hybrid system; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88, p.9578-9582, 1991)을 사용하여 일반적인 방법 및 시약에 첨부된 실험조작 설명서에 따라 행하였다.
상기 실시예에서 동정한 인간 MERMUC의 세포질영역과 결합능을 갖는 인간 HGF 수용체 c-Met의 β사슬 C말단영역의 91 아미노산(서열번호 4의 아미노산번호 993-1083)에 대응하는 DNA(클론 No.3-309)를 주형으로 한 PCR에 의해, 상기 91 아미노산의 N말단 또는 C말단의 아미노산이 여러 길이로 결실된 여러 길이의 c-Met β사슬의 C말단영역에 대응하는 하기 7종류의 DNA 단편을 일반적인 방법에 따라 제작하였다.
A. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 N말단의 10 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 1003-1083)에 대응하는 DNA.
B. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 N말단의 20 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 1013-1083)에 대응하는 DNA.
C. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 N말단의 30 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 1023-1083)에 대응하는 DNA.
D. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 C말단의 10 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 993-1073)에 대응하는 DNA.
E. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 C말단의 20 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 993-1063)에 대응하는 DNA.
F. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 C말단의 30 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 993-1053)에 대응하는 DNA.
G. 인간 c-Met의 β사슬 C말단의 91 아미노산 C말단의 40 아미노산이 결실된 영역(서열번호 4의 아미노산번호 993-1043)에 대응하는 DNA.
또한, 상기 PCR에 사용한 정방향쪽 프라이머의 5'말단에는 EcoRI 사이트를, 또한 역방향쪽 프라이머의 5'말단에는 SalI 사이트를 부가하도록 설계하였다. PCR에 의해 조제한 각 DNA 단편을, pADKT7 벡터(트립토판 합성계 유전자를 마커로서 갖는 프레이 단백용 벡터; CLONTECH제)의 EcoRI/SalI 사이트에 GAL4-AD와 in-frame이 되도록 삽입하여 상기 7종류에 DNA의 각각이 삽입된 프레이 벡터를 제작하였다.
상기 7종류의 프레이 벡터 각각을 실시예 1에서 조제한 인간 MERMUC 베이트-2 벡터와 함께 효모 AH109주에 도입하였다.
상기 7종류의 DNA 단편에 유래하는 c-Met 프레이 단백과 MERMUC 베이트 단백의 결합능은 실시예 1과 동일한 효모 2-하이브리드법으로 해석하였다. 즉, 상기 벡터를 도입한 효모의 2종류의 효모 최소배지, 즉, (1) SD/-Leu, -Trp, -His 배지 및 (2) SD/-Leu, -Trp, -Ade 배지 각각에서의 생육의 유무를 토대로 하여 판정하였다.
그 결과, 각 c-Met 프레이 단백(상기 A 내지 G의 DNA에 유래한다)은 하기와 같았다.
<프레이 DNA> <MERMUC 베이트 단백과의 결합능>
A + (결합한다)
B + (결합한다)
C - (결합하지 않는다)
D + (결합한다)
E + (결합한다)
F + (결합한다)
G - (결합하지 않는다)
상기는 즉, MERMUC의 C말단영역과 결합하는 것이 판명되어 있는 인간 c-Met β사슬 C말단의 91 아미노산(실시예 1)의 N말단으로부터 30 아미노산잔기 또는 C말단으로부터 40 아미노산잔기가 결실되면 MERMUC와의 결합능이 소실되는 것을 나타내고 있다.
이 결과로부터, MERMUC와의 결합능을 갖는 c-Met 분자 상의 영역(결합부위)은 상기 각 프레이 펩티드간의 공통부분인 c-Met의 C말단으로부터 약 30번째의 아미노산으로부터 추가로 N말단쪽의 약 40 아미노산으로 된 영역내(서열번호 4의 아미노산번호 약 1013-약 1052. 서열번호 5와 동일.)에 존재하는 것이 명확해졌다.
해당 영역에는 HGF가 HGF 수용체 c-Met 결합하여 활성화된 경우에 자기 인산화되는 티로신잔기가 2개소 포함되어 있다(서열번호 2의 아미노산번호 1349 및 1356. 서열번호 4의 아미노산번호 1042 및 1049.).
실시예 6 인간 MERMUC 분자내의 HGF 수용체 c-Met β사슬과의 결합영역의 동정(그 첫번째)
본 시험은 이미 보고된 효모 2-하이브리드법(상술한 문헌과 동일.)을 사용하여 일반적인 방법 및 시약에 첨부된 실험조작 설명서에 따라 행하였다.
인간 MERMUC의 세포질영역의 C말단쪽 영역이 인간 c-Met의 C말단영역과 결합한다는 새로운 사실(실시예 1)을 토대로 하여, 하기 3종류의 MERMUC 베이트 단백에 대응하는 DNA를 포함하는 베이트 벡터를 PCR에 의해 조제하였다.
A. 인간 MERMUC의 세포질영역의 전부, 정확하게는 인간 MERMUC의 세포질영역내에 존재하는 C말단으로부터 260 아미노산(「C260」이라 명명. 서열번호 10의 아미노산번호 244-503.)에 대응하는 DNA.
B. 상기 C260의 C말단의 53 아미노산이 결실된 영역(「C260Δ53」이라 명명. 서열번호 10의 아미노산번호 244-450.)에 대응하는 DNA.
C. 상기 C260의 C말단의 53 아미노산(「C53」이라 명명. 서열번호 10의 아미노산번호 451-503.)에 대응하는 DNA.
상기 PCR은 인간 MERMUC 전장을 코드하는 cDNA(서열번호 9)를 주형으로 하고, 하기 프라이머 세트를 사용하여 실시하였다.
C260용 프라이머 : 서열번호 27 및 서열번호 28의 각각에 기재된 DNA.
C260ΔC53용 프라이머 : 서열번호 29 및 서열번호 30의 각각에 기재된 DNA.
C53용 프라이머 : 서열번호 31 및 서열번호 32의 각각에 기재된 DNA.
얻어진 각각의 PCR 산물인 DNA를 플라스미드 pGBKT7로 삽입하여 베이트 벡터로 하였다.
각 베이트 벡터를 실시예 1에서 동정한 인간 HGF 수용체 c-Met 프레이 벡터(인간 c-Met C말단의 91 아미노산에 대응하는 DNA를 포함한다. 클론 No.3-309)와 함께 효모 AH109주로 도입하였다.
각 베이트 벡터 유래의 MERMUC 베이트 단백의 HGF 수용체 c-Met β사슬로의 결합능을 이미 기술한 효모 2-하이브리드 시험에 의해 해석하였다.
그 결과, C260(MERMUC의 세포질영역의 거의 전부를 포함한다) 및 C53(MERMUC의 세포질영역 C말단의 53 아미노산)이 함께 HGF 수용체 c-Met β사슬과의 결합활성을 가지고 있었다. 한편, C260으로부터는 C말단의 53 아미노산을 결실시킨 C260ΔC53에서는 HGF 수용체 c-Met β사슬과의 결합활성이 완전히 소실되었다.
이 결과로부터 MERMUC의 HGF 수용체 c-Met로의 결합에는 MERMUC의 C말단부분, 특히 C말단으로부터 약 53 아미노산을 포함하는 영역(서열번호 10의 아미노산번호 451-503.)이 기여하는 것이 명확해졌다.
상기와 동일하게 하여 효모 2-하이브리드법을 사용하여 마우스 MERMUC(아미노산/서열번호 12; cDNA/서열번호 11)와 마우스 HGF 수용체와의 결합의 유무 및 양자의 결합부위를 해석하였다.
마우스 MERMUC 및 마우스 HGF 수용체 각각을 코드하는 cDNA는 마우스 신장 유래 RNA로부터 RT-PCR법으로 클로닝하여 조제하였다.
그 결과, 인간 MERMUC와 인간 c-Met 사이의 결합과 동일하게, 마우스 MERMUC C말단의 약 53 아미노산을 포함하는 영역에서 마우스 HGF 수용체 β사슬의 C말단영역을 결합하는 것이 명확해졌다. 이 사실은 MERMUC C말단의 53 아미노산을 포함하는 영역의 아미노산서열이 인간 및 마우스 사이에서 높은 상동성을 갖는 것에 대한 이유를 설명하는 것으로, 또한 상기 C말단영역이 HGF 수용체와의 결합에 동물종을 넘어서 중요한 것을 나타내는 것이다.
실시예 7 인간 MERMUC 분자내의 HGF 수용체 c-Met β사슬과의 결합영역의 동정(그 두번째)
상기 실시예에서 명확해진 인간 MERMUC의 C말단영역에 존재하는 HGF 수용체 c-Met와의 결합영역(C말단으로부터 53 아미노산을 포함하는 영역)을 더욱 상세하게 해석하였다. 상기 해석은 상기 실시예와 동일하게 효모 2-하이브리드법을 사용하여 행하였다.
베이트 단백은 하기의 인간 MERMUC의 C말단영역의 일부(임의의 연속하는 10 아미노산)에 대응시켰다.
A. 서열번호 10의 아미노산번호 429-438(B와 5 아미노산 중복)
B. 서열번호 10의 아미노산번호 434-443(A 및 C와 각각 5 아미노산 중복)
C. 서열번호 10의 아미노산번호 439-448(B 및 D와 각각 5 아미노산 중복)
D. 서열번호 10의 아미노산번호 444-453(C 및 E와 각각 5 아미노산 중복)
E. 서열번호 10의 아미노산번호 449-458(D 및 F와 각각 5 아미노산 중복)
F. 서열번호 10의 아미노산번호 454-463(E 및 G와 각각 5 아미노산 중복)
G. 서열번호 10의 아미노산번호 459-468(F 및 H와 각각 5 아미노산 중복)
H. 서열번호 10의 아미노산번호 464-473(G 및 I와 각각 5 아미노산 중복)
I. 서열번호 10의 아미노산번호 469-478(H 및 J와 각각 5 아미노산 중복)
J. 서열번호 10의 아미노산번호 474-483(I 및 K와 각각 5 아미노산 중복)
K. 서열번호 10의 아미노산번호 479-488(J 및 L과 각각 5 아미노산 중복)
L. 서열번호 10의 아미노산번호 484-493(K 및 M과 각각 5 아미노산 중복)
M. 서열번호 10의 아미노산번호 489-498(L 및 N과 각각 5 아미노산 중복)
N. 서열번호 10의 아미노산번호 494-503(N과 5 아미노산 중복)
상기 각각의 베이트 단백(10 아미노산)에 대해서 상기 단백을 코드하는 센스쪽 DNA(5'말단에 EcoRI 사이트를 부가) 및 안티센스쪽 DNA(5'말단에 SalI 사이트를 부가)를 합성하여 어닐링한 후, 각각을 플라스미드 pGBKT7의 EcoRI/SalI 사이트로 삽입하여 베이트 벡터를 제작하였다.
각 베이트 벡터를 인간 HGF 수용체 c-Met 프레이 벡터(c-Met C말단의 91 아미노산을 코드하는 DNA를 포함한다. 실시예 1)와 함께 효모 AH109주에 도입하고, 상기 실시예와 동일하게 하여 효모 2-하이브리드 판정법으로 각 베이트 단백(인간 MERMUC의 C말단영역 임의의 10 아미노산)의 인간 c-Met의 β사슬 C말단영역으로의결합능을 해석하였다.
그 결과, 상기 실시예에서 명확해진 c-Met β사슬로의 결합활성에 중요한 영역인 C말단의 53 아미노산서열에 속하는 베이트 단백만 인간 c-Met β사슬의 C말단영역으로의 결합활성을 가지고 있었다.
이 시험결과로부터도 인간 MERMUC의 C말단의 53 아미노산영역이 인간 HGF 수용체 c-Met와의 결합에 있어서 매우 중요한 역할을 갖는 것이 나타났다.
더욱이, 해당 C말단영역의 아미노산서열내에서 인간/마우스/랫트 사이에서 잘 보존되어 있는 부분에는 4 아미노산잔기마다 류신이 반복하여 나타나는 류신 반복구조가 존재하여, 이 류신 반복구조가 MERMUC와 c-Met의 결합에 중요한 작용을 하고 있는 것이 추찰된다.
실시예 8 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합을 평가할 수 있는 어세이계(assay system)의 구축
β-갈락토시다아제(β-galactosidase; β-gal)는 세균부터 고등동식물까지 폭넓게 분포하는 젖당의 분해/합성효소이다. 상기 β-gal의 생물활성은 상기 일차구조를 갖는 단량체의 4분자가 모인 호모 4량체에 의해 발현된다.
특히, 대장균의 β-gal(유전자는 lacZ)은 자주 연구되는 동시에 시험연구의 도구로서 응용되고 있다.
어떤 종류의 대장균주에 있어서 3종류의 변이체, β-galΔα, β-galΔμ 및 β-galΔω가 보고되어 있다(Δ는 결실을 의미한다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,Vol.93, p.12423-12427, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997).
상기 β-galΔα는 야성형 β-gal의 활성부위인 N말단서열의 일부(GenBank Accession Nos.: P00722의 아미노산번호 12-42)를 결락하고 있다. 상기 β-galΔμ는 야성형 β-gal의 중앙부서열의 일부(GenBank Accession Nos.: P00722의 아미노산번호 50-602)를 결락하고 있다. 또한, 상기 β-galΔω는 야성형 β-gal의 모노머 분자가 호모 4량체를 형성하기 위한 부위인 C말단서열의 일부(GenBank Accession Nos.: P00722의 아미노산번호 790-1024)가 결락되어 있다.
따라서, β-galΔα 단독 또는 β-galΔω 단독으로는 효소활성이 발현되지 않는 것은 물론이지만, β-galΔα와 β-galΔω가 결합(접근을 포함한다)하지 않고 단순히 공존하고 있는 상태에서도 β-gal 활성을 출현시킬 수 없다.
그러나, 서로 친화성을 갖는 다른 2개의 단백, 「X」와「Y」의 각각에 β-galΔα 및 β-galΔω의 각각을 융합하여 된 「X-β-galΔα」 및 「Y-β-galΔω」를 공존시킨 경우에는 X와 Y의 친화력에 의해 상기 2개의 융합단백이 서로 접근하는 결과 β-gal 활성을 출현시킬 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997).
이 원리를 응용하여 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met와의 결합을 평가할 수 있는 어세이계를 구축하는 동시에 양 분자의 결합능을 평가하였다.
구체적으로는 융합단백 X-β-galΔα 및 Y-β-galΔω의 X 및 Y의 각각에 인간 HGF 수용체 c-Met의 전부 또는 그의 C말단영역, 인간 MERMUC의 전부 또는 그의C말단영역 등을 적용하고, 상기 2개의 융합단백을 유전자 재조합기술을 사용하여 예를 들면 CHO 세포 등의 동물세포내에서 공발현시켜, 상기 재조합 세포가 발현하는 β-갈락토시다아제 활성을 지표로 함으로써 MERMUC와 c-Met의 결합을 평가하는 것이다.
본 평가계의 구축을 위해 플라스미드 pcDNA3을 사용하여 하기의 융합 폴리펩티드(융합단백) 각각을 발현시키기 위한 발현벡터를 조제하였다. 각 벡터의 조제방법에 대해서는 이하에 상술한다.
A. 인간 MERMUC(전장; full)/β-galΔω
B. 인간 MERMUC(전장; full)/β-galΔα
C. 인간 MERMUC(C말단 53 아미노산결실; ΔC53)/β-galΔω
D. 인간 MERMUC(C말단 53 아미노산결실; ΔC53)/β-galΔα
E. 인간 c-Met(C말단 91 아미노산만; C91)/β-galΔα
<8-1> β-galΔα 유전자의 단리
β-galΔα는 야성형 β-gal의 N말단쪽의 아미노산(GenBank Accession Nos.: P00722의 아미노산번호 12-41)을 결락하고 있고, 대장균 DH5α주가 이 변이체를 생산하는 것이 알려져 있다(Gene, Vol.122, p.231-232, 1992).
따라서 야성형 β-gal의 N말단 메티오닌을 포함하는 영역과 C말단 종지코돈을 포함하는 영역에 대응하는 염기서열을 토대로 PCR용 정방향 프라이머(서열번호 33; 5'쪽에 XhoI 사이트를 부가.) 및 역방향 프라이머(서열번호 34; 5'쪽에는 SalI사이트를 부가.)를 설계하여 대장균 DH5α주의 DNA를 주형으로 하여 목적의 β-galΔα를 코드하는 DNA를 클로닝하였다.
PCR에 의해 증폭한 β-galΔα 유전자 단편을 제한효소 XhoI 및 SalI로 소화 후 pBluescript KS의 XhoI 및 SalI 사이트에 삽입하여 대장균으로 도입하였다. 이하의 시험에서 사용하는 β-galΔα 유전자를 포함하는 플라스미드를 이 형질전환주로부터 조제하였다.
또한, β-galΔα의 아미노산서열을 서열번호 16에 나타낸다.
<8-2> β-galΔω 유전자의 단리
β-galΔω는 야성형 β-gal의 모노머 분자가 호모 4량체를 형성하기 위한 부위인 C말단서열의 일부(GenBank Accession Nos.: P00722의 아미노산번호 790-1024)를 결락하고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.93, p.12423-12427, 1996).
따라서 대장균주 DH5의 야성형 β-gal 유전자를 주형으로 하고, N말단 메티오닌으로부터 789번째의 아미노산까지를 PCR로 증폭함으로써 β-galΔω를 코드하는 DNA를 제작하였다.
또한, PCR용 프라이머에는 하기를 사용하였다.
1. 정방향 프라이머: 서열번호 35(ATG의 5'쪽에 XhoI 사이트를 부가)
2. 역방향 프라이머: 서열번호 36(CGG의 5'쪽에 TAA와 SalI 사이트를 부가)
PCR 산물을 제한효소 XhoI 및 SalI로 소화하여 β-galΔω 유전자 단편을 조제하고, 이것을 pBluescript KS의 XhoI 및 SalI 사이트에 삽입하여 대장균으로 도입하였다. 이하에서 사용하는 β-galΔω 유전자를 포함하는 플라스미드는 이 형질전환주로부터 조제하였다.
<8-3> β-gal 변이체와의 융합용 MERMUC(full) 및 MERMUC(ΔC53)를 코드하는 DNA의 조제
상기의 인간 MERMUC(full) 또는 인간 MERMUC(ΔC53)를 코드하는 DNA에 β-gal 변이체를 코드하는 DNA를 in-frame으로 융합시키기 위해, 인간 MERMUC(full) DNA의 종지코돈 및 인간 MERMUC(ΔC53) DNA의 C말단 코돈 각각을 하기의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해 XhoI 사이트에 개변시켰다. 또한, 인간 MERMUC 전장을 코드하는 DNA를 주형으로 하였다.
<인간 MERMUC(full)> (N말단 Met로부터 503번째의 아미노산까지를 증폭)
정방향 프라이머: 서열번호 37(ATG의 5'쪽에 HindIII 사이트를 부가.)
역방향 프라이머: 서열번호 38(GCC의 5'쪽에 XhoI 사이트를 부가.)
<인간 MERMUC(ΔC53)> (N말단 Met로부터 450번째의 아미노산까지를 증폭)
정방향 프라이머: 서열번호 39(ATG의 5'쪽에 HindIII 사이트를 부가.)
역방향 프라이머: 서열번호 70(TGC의 5'쪽에 XhoI 사이트를 부가.)
각각의 PCR 산물을 제한효소 HindIII 및 XhoI로 소화 후 pBluescript KS의 HindIII 및 XhoI 사이트에 삽입하여 대장균으로 도입하였다. 상기 A 내지 D 중 어느 하나의 융합단백을 코드하는 DNA를 갖는 각 플라스미드는 해당 형질전환 대장균주로부터 조제하였다.
<8-4> 인간 c-Met(C91)를 코드하는 DNA의 조제
인간 c-Met(C91)를 코드하는 DNA에 β-galΔα를 코드하는 DNA를 in-frame으로 융합시키기 위해, 인간 HGF 수용체 c-Met의 C말단 91 아미노산서열(서열번호 4의 아미노산번호 993-1083)에 대응하는 DNA를 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다. 또한, 인간 HGF 수용체 c-Met의 전장을 코드하는 DNA를 주형으로 하였다.
정방향 프라이머: 서열번호 41(AGA의 5'쪽에 ATG와 HindIII 사이트를 부가.)
역방향 프라이머: 서열번호 42(TCA의 5'쪽에 XhoI 사이트 부가.)
얻어진 PCR 산물의 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI로 소화 후 pBluescript KS의 HindIII 및 XhoI 사이트에 삽입하여 대장균으로 도입하였다. 상기 E의 융합단백을 코드하는 DNA를 갖는 플라스미드는 해당 형질전환 대장균주로부터 조제하였다.
<8-5> 융합단백(A, B, C, D, E) 발현용 벡터의 제작;
A) 인간 MERMUC(full)/β-galΔω 발현용 벡터의 조제
상기에서 제작한 플라스미드 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI, 또는 XhoI 및 SalI로 소화하여 인간 MERMUC(full) 및 β-galΔω의 각각을 코드하는 DNA를 잘라냈다. 얻어진 2개의 DNA 단편을 XhoI 사이트에서 결합시킨 후, pcDNA3 벡터의HindIII/SalI 사이트로 삽입하여 목적으로 하는 인간 MERMUC(full)/β-galΔω 발현벡터를 구축하였다.
B) 인간 MERMUC(full)/β-galΔα 발현용 벡터의 조제
상기에서 제작한 플라스미드의 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI, 또는 XhoI 및 SalI로 소화하여 인간 MERMUC(full) 및 β-galΔα의 각각을 코드하는 DNA를 잘라냈다. 얻어진 2개의 DNA 단편을 XhoI 사이트에서 결합시킨 후, pcDNA3 벡터의 HindIII/SalI 사이트로 삽입하여 목적으로 하는 인간 MERMUC(full)/β-galΔα 발현벡터를 구축하였다.
C) 인간 MERMUC(ΔC53)/β-galΔω 발현용 벡터의 조제
상기에서 제작한 플라스미드의 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI, 또는 XhoI 및 SalI로 소화하여 인간 MERMUC(ΔC53) 및 β-galΔω의 각각을 코드하는 DNA를 잘라냈다. 얻어진 2개의 DNA 단편을 XhoI 사이트에서 결합시킨 후, pcDNA3 벡터의 HindIII/SalI 사이트로 삽입하여 목적으로 하는 인간 MERMUC(ΔC53)/β-galΔω 발현벡터를 구축하였다.
D) 인간 MERMUC(ΔC53)/β-galΔα 발현용 벡터의 조제
상기에서 제작한 플라스미드의 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI, 또는 XhoI 및 SalI로 소화하여 인간 MERMUC(ΔC53) 및 β-galΔα의 각각을 코드하는 DNA를 잘라냈다. 얻어진 2개의 DNA 단편을 XhoI 사이트에서 결합시킨 후, pcDNA3 벡터의 HindIII/SalI 사이트로 삽입하여 목적으로 하는 인간 MERMUC(ΔC53)/β-galΔα 발현벡터를 구축하였다.
E) 인간 c-Met(C91)/β-galΔα 발현용 벡터의 조제
상기에서 제작한 플라스미드의 각각을 제한효소 HindIII 및 XhoI, 또는 XhoI 및 SalI로 소화하여 인간 c-Met(C91) 및 β-galΔα의 각각을 코드하는 DNA를 잘라냈다. 얻어진 2개의 DNA 단편을 XhoI 사이트에서 결합시킨 후, pcDNA3 벡터의 HindIII/SalI 사이트로 삽입하여 목적으로 하는 인간 c-Met(C91)/β-galΔα 발현벡터를 구축하였다.
<8-6> MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합 평가를 위한 어세이
실험조작 설명서에 따라 시판의 형질전환 시약(GeneJammer Transfection Reagent; STRATAGENE제)을 사용하여, 이하의 조합에 의한 상기 5종류의 융합단백 발현벡터(A, B, C, D, E)의 등량 혼합으로 CHO 세포를 공형질전환하였다.
I) A + E
즉, MERMUC(full)/β-galΔω + c-Met(C91)/β-galΔα
II) A + B
즉, MERMUC(full)/β-galΔω + MERMUC(full)/β-galΔα
III) C + E
즉, MERMUC(ΔC53)/β-galΔω + c-Met(C91)/β-galΔα
IV) C + D
즉, MERMUC(ΔC53)/β-galΔω + MERMUC(ΔC53)/β-galΔα
세포를 37℃에서 48시간 배양 후 GAL-SCREEN SYSTEM(Applied Biosystems제)을 사용하고, 실험조작 설명서에 따라 각 세포내의 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다.
결과를 도 6 및 도 7에 나타낸다.
그 결과, (I), (II) 및 (IV)의 조합에서는 대조(mock-control) 벡터만으로 형질전환한 세포에 비교하여 현저하게 높은 값의 β-갈락토시다아제 활성이 검출되었다. 한편, (III)의 조합에서는 해당 활성은 발견되지 않았다.
이들 결과는 상술한 실시예에서 명확해진 하기의 사실을 실증하는 것이었다.
1. MERMUC와 HGF 수용체 c-Met가 결합한다.
2. MERMUC의 c-Met와의 결합영역은 MERMUC의 세포질영역 C말단의 약 53 아미노산을 포함하는 영역에 존재한다.
3. c-Met의 MERMUC와의 결합영역은 c-Met β사슬의 세포질영역 C말단의 약 91 아미노산의 내부에 존재한다.
또한, 상기 (IV)의 조합에 의한 시험결과로부터 MERMUC 분자끼리의 결합에 공헌하는 부위는 MERMUC의 c-Met와의 결합영역인 C말단 53 아미노산 보다도 더욱이 N말단쪽에 있는 것이 시사되었다.
더욱이, 상기 결과로부터 본 시험에서 구축된 어세이계를 사용하면 MERMUC와 c-Met의 결합을 저해하는 물질이나, MERMUC의 분자간 결합을 저해하는 물질을 동정하는 것이 가능한 것이 나타났다. 동일하게 또한, 상기 어세이계를 사용하면 어떤 물질의 MERMUC와 c-Met의 결합의 저해활성의 유무 또는 정도나, 어떤 물질의 MERMUC 분자간에서의 결합의 억제 또는 저해활성의 유무 또는 정도를 측정 평가할수 있는 것이 나타났다.
실시예 9 HGF 수용체 c-Met와 MERMUC의 결합의 생화학적 해석
MERMUC가 결합하는 HGF 수용체 c-Met β사슬의 C말단영역은 다기능 결합부위(multifunctional docking site)라고 불리우는 자기 인산화 티로신잔기를 포함하는 부분이다. 이 영역은 HGF가 HGF 수용체 c-Met에 결합하여 발생하는 시그날의 세포내로의 전달에 있어서 매우 중요한 영역이기 때문에, 상기 HGF 시그날링이 MERMUC 분자의 해당영역으로의 결합에 의해 생리학적으로 제어되어 있는 것으로 추찰되었다.
따라서, MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합의 생리학적 의의를 검증하기 위해, 상기 실시예에서 제작한 Dox에 의해 유전자 발현을 제어 가능하게 한 MERMUC 발현 재조합 세포: MERMUC/293 세포를 이용하여 이하의 시험을 행하였다.
<9-1> HGF 수용체를 매개로 하는 MAP 키나아제 활성화의 제어
지금까지의 연구로부터 HGF 시그날 전달에 의해 야기되는 MAP 키나아제 활성화는 다음과 같은 단계를 거쳐 달성되는 것이 명백해져 있다(Cell., Vol.77, p.261-271, 1994; 실험의학, Vol.15, p.1033-1039, 1997; Nature, Vol.391, p.285-288, 1998).
(1) HGF의 HGF 수용체 c-Met로의 결합에 따르는 HGF 수용체 c-Met의 호모 2량체화.
(2) c-Met β사슬의 C말단영역내의 티로신잔기의 자기 인산화.
(3) 상기 인산화 부위로의 Grb2(growth factor receptor-bound protein-2)의 리크루트.
(4) Ras 활성화.
(5) MAP(mitogen-activated protein) 키나아제 활성화.
따라서, HGF의 자극에 의해 유도되는 세포내 MAP 키나아제 활성화에 대해서 MERMUC의 발현이 부여하는 생리학적 영향의 유무를 해석하였다.
구체적으로는 상기 MERMUC/293 세포주를 Dox 존재하와 비존재하 각각에서 배양함으로써 MERMUC 비생산계와 MERMUC 생산계를 조제하고, 상기 각각의 세포계로의 HGF의 첨가 직후에 야기되는 MAP 키나아제의 활성화 정도를 비교하였다.
Dox 존재하에서 배양하여 MERMUC의 발현을 억제한 세포(MERMUC 비생산계) 및 Dox 비존재하에서 배양하여 MERMUC의 발현을 유도한 세포(MERMUC 생산계)의 각각을 인간 재조합 HGF(#375228, CALBIOCHEM제)로 자극한 직후에 세포 가용화물을 조제하여 MAP 키나아제 활성 평가에 제공하였다.
상기 세포 가용화물을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리 후, 일반적인 방법에 따라 항MAP 키나아제 다중클론항체(p44/42 MAP kinase antibody, #9102; Cell Signaling Technology제) 및 항인산화 MAP 키나아제 다중클론항체(Phospho-p44/42 MAP kinase(Thr202/Thr204) antibody, #9101L; Cell Signaling Technology제)를 사용한 웨스턴 블로팅을 행하였다.
전자의 항체에서 양 시료 각각의 MAP 키나아제 단백량에 차이가 없는 것을확인한 후, 후자의 항체에서 검출되는 인산화 MAP 키나아제의 시그날 강도를 비교하였다.
결과를 도 8에 나타낸다.
그 결과, MERMUC 생산 세포에서의 MAP 키나아제 활성은 MERMUC 비생산 세포의 그것에 비해 유의하게 저하되어 있었다.
또한, Dox 농도를 낮추고 MERMUC의 생산량을 증가시켜 가면 MAP 키나아제 활성이 점점 감소하였다.
이 결과로부터 MERMUC의 생산량에 의존하여 HGF의 시그날 전달이 억제되는 것, 및 MERMUC는 HGF 수용체와 결합함으로써 HGF 시그날 전달을 다운 레귤레이트하는 것이 명확해졌다.
<9-2> HGF 수용체 c-Met 세포질영역의 자기 인산화 제어
상기 실시예에서 명확해진 MERMUC 생산의존적인 MAP 키나아제 활성의 감약화는 HGF 시그날 전달 프로세스에 있어서의 HGF 수용체 c-Met 세포질영역의 자기 인산화 저하에 의한 것으로 추찰되었다.
따라서, MERMUC를 과잉생산 세포 및 MERMUC 비생산 세포에 HGF를 가하여 유도되는 HGF 수용체의 자기 인산화 정도를 해석함으로써 MERMUC의 생산이 부여하는 HGF 시그날 전달에 부여하는 영향을 검토하였다.
상기 실시예와 동일하게 하여 MERMUC/293 세포를 Dox 비존재하 또는 존재하에서 배양함으로써 얻은 MERMUC 과잉발현세포 및 MERMUC 비생산 세포 각각으로부터세포 가용화물을 조제하였다.
상기 각각의 세포 가용화물에 항HGF 수용체 다중클론항체를 가하여 면역침강 처리를 행하였다. 이어서, SDS-PAGE에 의해 상기 침강 단백을 분리한 후, 항인산화 티로신 단일클론항체(Phospho-Tyrosine monoclonal antibody(P-Tyr-100), #9411, Cell Signaling Technology제)를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다.
전자의 항체에 의해 양 세포 가용화물의 각각에 포함되는 HGF 수용체 단백량에 차이가 없는 것을 확인한 후, 후자의 항체에서 검출되는 시그날 강도를 비교함으로써 HGF 수용체 c-Met β사슬의 세포내영역 티로신잔기의 자기 인산화 정도를 해석하였다.
결과를 도 9에 나타낸다.
이 결과, 양 세포 사이에 상기 티로신잔기의 인산화 차이는 인정되지 않았다. 이 결과는 MERMUC의 생산 및 MERMUC의 HGF 수용체 c-Met로의 결합은 HGF 자극에 의해 유도되는 HGF 수용체 세포내영역의 티로신잔기의 자기 인산화에는 특별히 영향을 주는 것이 아닌 것을 시사하는 것이었다.
<9-3> Grb2의 HGF 수용체 세포질영역내 인산화 티로신으로의 결합 제어
HGF 시그날 전달의 프로세스에 있어서의 하나의 단계인 Grb2 분자의 HGF 수용체 c-Met β사슬의 세포질영역내의 인산화 티로신으로의 결합에 대한 MERMUC의 생산(즉, MERMUC와 c-Met의 결합)이 주는 영향의 유무를 검토하였다.
상기 인산화 티로신으로의 Grb2의 결합량은 Grb2를 항Grb2 항체로 면역침강시킴으로써 공침하는 HGF 수용체 단백의 양으로 평가하였다.
상기 실시예와 동일하게 하여 MERMUC/293 세포를 Dox 비존재하 또는 존재하에서 배양함으로써 얻은 MERMUC 과잉발현세포 및 MERMUC 비생산 세포 각각으로부터 세포 가용화물을 조제하였다.
상기 각각의 세포 가용화물에 항Grb2 다중클론항체(GRB2(C-23): sc-255, Santa Cruz Biotechnology제)를 가하여 일반적인 방법에 따라 Grb2 단백을 면역침강시켰다. 이어서, Grb2 단백과 공침강하는 HGF 수용체 단백을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 항HGF 수용체 다중클론항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다.
검출되는 HGF 수용체의 시그날 강도를 토대로 하여 Grb2와 공침한 HGF 수용체의 단백량을 평가하였다.
또한 대조실험으로서 Grb2와 동일하게 HGF 수용체 c-Met의 세포질영역의 인산화 티로신부위에 리크루트되는 것이 알려져 있는 Gab1에 관해서도 상기와 동일하게 하여 해석하였다. 또한, 상기 대조시험에서는 항Gab1 다중클론항체(Gab1(H-198): sc-9049, Santa Cruz Biotechnology제)를 사용하였다.
결과를 도 10에 나타낸다.
이 결과, MERMUC 생산 세포에 있어서 Grb2와 함께 면역침강하는 HGF 수용체 c-Met의 양은 MERMUC 비생산 세포에 있어서의 그것에 비하여 유의하게 감소하였다. 한편, Gab1과 함께 면역침강하는 c-Met의 양은 MERMUC 비생산 세포 및 MERMUC 생산 세포에 있어서 유의한 차는 인정되지 않았다.
이 결과는 MERMUC의 생산에 의해, HGF 수용체 c-Met β사슬의 세포질영역의인산화 티로신으로의 Grb2의 결합이 저해되는 것을 나타내는 것이다.
<9-4> MMP-1 유전자 및 MMP-9 유전자발현의 제어
매트릭스메탈로프로테아제-1(matrixmetalloprotease1; MMP-1) 및 매트릭스메탈로프로테아제-9(MMP-9)는 배양세포주나 신장조직에 있어서 HGF의 자극에 수반하여 발현 유도되는 것이 알려져 있다(Kidney Int. Vol.58, p.2028-2043, 2000; Carcinogenesis, Vol.21, p.1079-1085, 2000).
따라서, 인간신장 유래 세포로부터 수립한 HEK293 세포를 숙주로서 제작한 인간 MERMUC 발현 재조합 세포(MERMUC/293 세포; 상기 실시예와 같다)를 사용하여 HGF의 자극으로 유도되는 상기 세포에 있어서의 MMP-1 및 MMP-9의 발현에 대해서 MERMUC의 생산이 주는 영향의 유무를 RT-PCR에 의해 해석하였다.
상기 실시예와 동일하게 하여 MERMUC/293 세포를 Dox 비존재하 또는 존재하에서 배양함으로써 MERMUC 과잉발현세포 및 MERMUC 비생산 세포 각각을 조제하였다.
각각의 세포에 인간 HGF를 가하여 HGF 첨가 직후(0시간), 3, 6 및 24시간 후에 각각 세포로부터 일반적인 방법에 따라 RNA를 조제하였다. 각각의 RNA 시료를 주형으로 하고, 하기 프라이머 세트를 사용하여 일반적인 방법에 따라 RT-PCR을 행하여 각 시료 중에 있어서의 MMP-1, MMP-9 및 GAPDH(대조)의 mRNA의 발현량을 구하였다.
MMP-1용 프라이머: 서열번호 43 및 서열번호 44
MMP-9용 프라이머: 서열번호 45 및 서열번호 46
GAPDH용 프라이머: 서열번호 47 및 서열번호 47
결과를 도 11에 나타낸다.
MMP-1의 mRNA의 발현은 MERMUC 비생산 세포에 있어서는 경시적인 상승이 인정되었지만, MERMUC 생산 세포에서는 상기 발현 유도가 현저하게 억제되어 있었다.
또한, MMP-9의 mRNA의 발현은 MERMUC 비생산 세포에서는 HGF의 자극 후 3시간 후에 발현 유도의 피크가 관찰되었지만, MERMUC 생산 세포에서는 MMP-9의 mRNA의 발현 유도는 거의 인정되지 않았다.
이 결과로부터 HGF의 자극에 의해 유도되는 MMP-1 및 MMP-9 각 유전자의 발현은 MERMUC 단백의 과잉생산에 의해 저하되는 것, 및 상기 양 유전자의 발현 저하는 MERMUC 단백에 의한 HGF 시그날링의 다운 레귤레이션에 의해 일어나는 MAP 키나아제 활성화의 감약에 기인하는 것이 시사되었다.
이상의 시험결과로부터 MERMUC의 기능 및 HGF 시그날링의 다운 레귤레이션의 메카니즘에 관해서 하기의 내용이 명확해졌다.
1) MERMUC는 HGF 수용체 c-Met β사슬의 세포질영역의 자기 인산화 티로신의 부근에 결합함으로써, 이 부위에 리크루트되는 Grb2 단백의 결합을 저해한다.
2) 그 결과, HGF/HGF 수용체 c-Met에 결합에 의한 시그날 전달으로 야기되어야 할 MAP 키나아제 활성이 감약화된다.
3) MAP 키나아제 활성의 감약화 결과, 그 이후의 생물학적 반응(예를 들면, MMP-1이나 MMP-9 등의 발현)이 저해된다.
4) 이상의 결과, HGF/HGF 수용체 c-Met 시그날링이 다운 레귤레이션된다.
실시예 10 MERMUC 과잉발현 트랜스제닉 마우스의 제작 및 해석
<10-1> 마우스 MERMUC-Tg의 제작
간장으로부터 조제한 초대 배양세포는 HGF의 자극에 의해 증식이 촉진되는 것이 보고되어 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.83, p.6489-6493, 1986). 이 현상을 이용하여 간장세포내에서의 MERMUC 단백 생산의 증가가 HGF 자극의존적인 세포증식능에 영향을 미치는지의 여부를 MERMUC 과잉발현 트랜스제닉(Tg) 마우스(이하, 간단히 MERMUC-Tg 마우스, MERMUC-Tg 또는 Tg라고 한다)의 간장세포를 사용함으로써 해석하였다.
MERMUC-Tg 마우스는 일반적인 방법에 따라 제작하였다(「마우스 배의 조작 매뉴얼」, Chap.2-4, p.77-203, 1989, 긴다이 출판; 「최신 동물세포 실험 매뉴얼」, Chap.7, p.361-408, 1990; LIC Press.).
마우스 MERMUC 전장을 코드하는 cDNA(서열번호 11)를 닭 β 액틴 프로모터를 갖는 발현벡터 pCAGGS(Gene, Vol.108, p.193-200, 1991)에 DNA말단 평활화 키트(TAKARA제)를 사용하여 삽입하여 마우스 MERMUC 발현벡터를 얻었다. 이 벡터를 제한효소로 절단하여 선상화한 것을 Tg 제작용 마우스 MERMUC 유전자로서 사용하였다.
가친(假親) 마우스에는 백색 ICR 마우스(암컷, 일본 찰스리버제)와 정관결찰한 백색 ICR 마우스(수컷, 일본 찰스리버제)를 교배하여 얻어진 플러그(또는 질전(vaginal plug))를 갖는 암컷 ICR 마우스를 사용하였다. 또한, 마우스 MERMUC 발현벡터를 도입하기 위한 수정란을 얻기 위한 채란용 마우스는 PMS(5 유닛, Sigma제) 및 hCG(5 유닛, Sigma제)를 투여함으로써 과잉 배란시킨 ICR 마우스(암컷, 일본 찰스리버제)를 ICR 마우스(수컷, 일본 찰스리버제)와 교배시켜 제작하였다. 교배 후 ICR 마우스(암컷)로부터 난관부를 적출하여 히알루로니다제의 처리에 의해 수정란만을 얻어 배지 중에서 보존하였다.
수정란으로의 마우스 MERMUC 유전자의 도입은 현미경하에서 매니퓰레이터(manipulator)를 사용하여 일반적인 방법으로 행하였다. 수정란을 보정침(保定針)으로 고정하고, 37℃ 조건하에서 Tris-EDTA 완충액으로 희석한 마우스 MERMUC 유전자를 함유하는 용액을 DNA 도입침을 사용하여 수정란의 웅성 전핵내에 주입하였다.
유전자 도입 후 정상인 상태를 유지하는 수정란만을 선별하여, 가친 마우스(백색 ICR 마우스)의 난소내에 있는 난관채에 마우스 MERMUC 유전자 도입 수정란을 삽입하였다. 가친으로부터 태어난 어린 마우스(키메라마우스)를 MERMUC-Tg 마우스로서 얻었다.
제작한 MERMUC-Tg 및 정상 마우스(비Tg 마우스(non-Tg mouse); 상기의 가친으로부터 태어난 정상 마우스) 각각의 각종 장기(간장, 신장, 심장, 폐 및 뇌 등)로부터 추출한 mRNA를 사용하여 일반적인 방법에 따라 노던 블로팅을 행하여 마우스 MERMUC의 mRNA의 발현량을 해석하였다.
그 결과, Tg 마우스에서의 마우스 MERMUC mRNA의 발현은 어떤 장기에 있어서도 non-Tg 마우스의 그것보다도 유의하게 높은 것으로, 제작한 MERMUC-Tg 마우스가 마우스 MERMUC를 과잉발현하는 마우스인 것이 확인되었다.
<10-2> MERMUC 생산의 증가가 HGF 자극의존적인 간장세포의 증식에 주는 영향의 해석
베리 및 프렌드 등(Berry & Friend et al) 및 세글렌 등(Seglen et al)의 방법(J. Cell. Biol, Vol.43, p.506-520, 1969; Methods in Cell Biol., Vol.13, p.29-83, 1976)에 따라 콜라게나아제 처리에 의해 MERMUC-Tg 마우스(8주령, 4마리) 및 non-Tg 마우스(8주령, 4마리) 각각의 간장으로부터 취득한 간장세포로부터 간실질세포로부터 초대 배양을 조제하였다.
얻어진 간실질세포(2×103개) 각각을 무혈청배지에서 15시간 배양 후 HGF 의존적인 세포증식을 유도하기 위해 HGF(0, 1 또는 3 ng/ml)를 배지에 첨가하여 추가로 배양하였다. 또한, 대조로서 HGF 대신에 EGF(epidermal growth factor; 0, 1 또는 10 ng/ml)를 가하여 동일하게 하여 배양을 행하였다.
HGF 첨가로부터 24시간 후 생세포수 측정시약 SF(나카라이테스크제)를 사용하여 상기 시약에 첨부된 실험조작 매뉴얼에 따라 세포수를 계수하여 HGF(또는 EGF) 첨가 후의 상대적인 세포증식률을 구하였다. 시험은 각 3회 행하였다.
결과를 도 12에 나타낸다.
대조인 EGF 자극에 의한 간실질세포의 증식은 MERMUC-Tg 및 non-Tg 어느 것에 있어서도 차이는 없고 용량의존적인 세포증식을 나타냈다(도 12-B).
한편, HGF 자극에 의한 간실질세포의 증식은 MERMUC-Tg 마우스 유래 세포의 증식은 non-Tg 마우스의 그것과 비교하여 명확하게 유의한 증식(반응성)의 저하가 인정되었다(도 12-A).
<10-3> MERMUC의 생산증가가 세포내 MAP 키나아제 활성화에 주는 영향의 해석
실시예 9와 동일하게 하여 MERMUC-Tg 마우스 및 non-Tg 마우스의 각각에 유래하는 간실질세포의 HGF 자극 후의 세포내 MAP 키나아제 활성화의 변화를 해석하였다.
결과를 도 13에 나타낸다.
이 결과, MERMUC-Tg 유래 세포에 있어서 MAP 키나아제 활성화의 유의한 감약화가 인정되었다.
이 결과는 MERMUC가 HGF 수용체에 결합함으로써 HGF/HGF 수용체의 기능발현이 억제되고, 간장세포를 비롯한 여러 세포의 증식이 억제되는 것을 나타내는 동시에, MERMUC가 HGF/HGF 수용체의 기능발현을 억제함으로써 세포의 증식 및 조직, 기관 및 혈관 등의 재생 및 신생을 동일하게 다운 레귤레이트하고 있는 것을 나타내는 것이다.
실시예 11 MERMUC의 자기회합에 의한 MERMUC와 HGF 수용체와의 결합 친화성 증대의 해석
상기 효모 2-하이브리드법 및 면역침강법에 의해 MERMUC는 자신의 회합으로 다량체를 형성하는 것이 나타났다.
본 시험에서는 자극에 응한 MERMUC의 자기회합을 재현 가능한 평가계를 확립함으로써 MERMUC의 자기회합과 MERMUC와 HGF 수용체 결합과의 관련성을 해석하였다.
<11-1> 자극에 따른 MERMUC의 자기회합을 재현 가능한 평가계의 확립
후술하는 방법에 의해 이하의 3개의 발현벡터를 제작하였다.
(1) 마우스 Fas(CD95)의 일부(세포외영역 및 세포막 관통영역으로 된다) 및 인간의 MERMUC의 세포질영역으로 된 융합 키메라 단백을 발현하는 플라스미드(이하 「mFas-MERMUC」라고 칭한다.).
(2) 마우스 Fas의 일부(세포외영역 및 세포막 관통영역으로 된다), 인간의 MERMUC의 세포질영역 및 상술한 β-galΔω로 된 융합 키메라 단백을 발현 플라스미드(이하 「mFas-MERMUC-β-galΔω」라고 칭한다.).
(3) 마우스 Fas의 일부(세포외영역 및 세포막 관통영역으로 된다), 인간의 MERMUC의 세포질영역 및 상술한 β-galΔα로 된 융합 키메라 단백을 발현하는 플라스미드(이하 「mFas-MERMUC-β-galΔα」라고 칭한다.).
또한, 상술한 마우스의 Fas는 이미 보고된 바와 같다(GenBank Accession No.P25446 및 NP 032013; J. Immunol., Vol.148, No.4, p.1274-1279, 1992 등).
마우스 Fas의 일부(세포외영역 및 세포막 관통영역으로 된다)를 코드하는 cDNA는 마우스 비장 cDNA 라이브러리(Clontech제)를 주형으로 하고, 하기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다.
정방향 프라이머: 서열번호 49
역방향 프라이머: 서열번호 50
인간 MERMUC의 세포질영역을 코드하는 cDNA는 상술한 인간 MERMUC의 전장 cDNA(상기 서열번호 9)를 주형으로 하고, 하기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다.
정방향 프라이머: 서열번호 51
역방향 프라이머: 서열번호 52
얻어진 각각의 cDNA를 pTargeT 벡터(Promega제)에 서브클로닝한 후, 양 단편을 다시 제한효소 XbaI 및 NotI로 잘라내어 XbaI 사이트에서 라이게이션하고, 이 결합단편을 pcDNA3 벡터에 삽입하여 mFas-MERMUC 발현 플라스미드를 얻었다.
mFss-MERMUC-β-galΔω 발현 플라스미드 및 mFas-MERMUC-β-galΔα 발현 플라스미드는 이하와 같이 하여 제작하였다.
상기에서 제작한 인간 MERMUC(전장)/β-galΔα 및 인간 MERMUC(전장)/β-galΔω 각각을 ApaI로 소화하여 MERMUC(세포질영역)-β-galΔα 및 MERMUC(세포질영역)-β-galΔω 각각을 코드하는 cDNA를 조제하였다. 얻어진 각각의 cDNA를 상기에서 구축한 mFas-MERMUC의 ApaI 부위의 하류에 삽입하여 mFas-MERMUC-β-galΔω 발현 플라스미드 및 mFas-MERMUC-β-galΔα 발현 플라스미드를 얻었다.
이어서, GeneJammer Transfection Reagent(STRATAGENE사제)를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 mFas-MERMUC-β-galΔω 발현 플라스미드 및 mFas-MERMUC-β-galΔα 발현 플라스미드를 HEK293 세포에 가하고, 37℃에서 배양하여 공형질전환하여 mFas-MERMUC-β-galΔω 및 mFas-MERMUC-β-galΔα를 세포막 상에 공발현하는 재조합 세포를 얻었다.
이 재조합 세포를 Fas 분자의 회합을 유도하는 활성을 갖는 항Fas 항체 또는 회합유도 활성을 갖지 않는 항Fas 항체로 처리함으로써 세포외에 존재하는 Fas영역의 회합 및 비회합의 각각 상태를 만들어내는 것이 가능해진다. 더욱이, Fas영역의 회합에 따라 발생하는 세포내에 존재하는 MERMUC 단백부분의 회합(결합)을 β-갈락토시다아제 활성을 측정함으로써 평가 가능하다.
상기 재조합 세포를 양 발현 플라스미드 도입으로부터 48시간 후에 항Fas 항체 또는 음성대조 항체(각각 1 또는 10 ㎍/ml)로 3시간 처리한 후, Gal-Screen System(Applied Biosystems사제)을 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 각 세포내의 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다.
또한, 항Fas 항체로서 Fas 분자의 회합을 유도하는 활성을 갖는 햄스터 항마우스 Fas 항체(RK-8; 의학생물학 연구소제) 또는 상기 활성을 갖지 않는 랫트 항체 마우스 Fas 항체(RMF6; 의학생물학 연구소제)를 사용하였다. 한편, 음성대상 항체에는 mFas에 반응하지 않는 햄스터 항체 또는 랫트 항체를 사용하였다.
결과를 도 14에 나타낸다.
그 결과, mFas-MERMUC-β-galΔω 및 mFas-MERMUC-β-galΔα를 공발현하는재조합 세포를 Fas 분자회합 유도활성을 갖지 않는 항Fas 항체로 처리한 경우에는 β-갈락토시다아제 활성에 변동은 보이지 않지만, Fas 분자회합 유도활성을 갖는 항Fas 항체로 처리한 경우에는 항체농도에 의존한 β 갈락토시다아제 활성의 상승이 인정되었다.
이 결과로부터 본 시험에서 제작한 mFas-MERMUC-β-galΔω 및 mFas-MERMUC-β-galΔα를 공발현하는 재조합 세포를 사용하면, 항Fas 항체를 사용하여 세포외의 Fas 단백영역의 회합을 조절함으로써 세포내 MERMUC 영역의 회합을 재현하여 자유자재로 조절하는 것이 가능한 것이 나타났다.
<11-2> MERMUC의 자기회합이 MERMUC와 HGF 수용체와의 결합 친화성에 주는 영향의 해석
상기에서 제작한 재조합 세포를 사용하여 MERMUC 분자의 자기회합이 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met와의 결합 친화성에 주는 영향의 유무를 MERMUC와 HGF 수용체의 면역침강법(면역공침시험)에 의해 해석하였다.
상기에서 제작한 mFas-MERMUC 발현 플라스미드로 HEK293 세포를 형질전환함으로써 제작한 mFas-MERMUC 발현 재조합 세포를 상술한 각종 항Fas 항체로 처리한 후, 일반적인 방법에 따라 세포를 용해하여 세포 용해물을 조제하였다. 상기 세포 용해물에 상술한 시판의 항HGF 수용체 c-Met 다중클론항체 h-Met(C-28)(sc-161; Santa Cruz Biotechnology제)를 가하여 프로테인-G 세파로오스(protein-G Sepharose)와 반응 후 원심분리로 HGF 수용체 단백/항c-Met 항체와의 복합체 및 상기 복합체에 결합한 단백성분을 침강시켰다.
이 침강물을 전기영동용 버퍼에 용해하여 SDS-PAGE로 분리 후, 일반적인 방법에 따라 항마우스 Fas 항체(R&D사제)를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 mFas-MERMUC 단백의 공침량을 평가하였다.
결과를 도 15에 나타낸다.
그 결과, Fas 분자회합 유도활성을 갖는 항Fas 항체(RK-8)로 처리한 세포에서는 공침한 mFas-MERMUC의 양에 현저한 증가가 인정되었지만, 상기 회합 유도활성을 갖지 않는 항Fas 항체(RMF6)나 대조 항체(마우스 Fas에 반응하지 않는다. 상술.)로 처리한 세포에서는 mFas-MERMUC의 유의한 공침은 인정되지 않았다.
이 결과로부터 MERMUC의 자기회합(세포질영역내)은 MERMUC와 HGF 수용체와의 결합능을 항진하는 것이 나타났다.
실시예 12 MERMUC의 자기회합 억제에 의한 MERMUC와 HGF 수용체와의 결합 감약의 해석
상기 실시예에서 상술한 바와 같이, MERMUC의 자기회합능은 그 C말단의 53 아미노산을 결실한 경우에도 유지되어 있기 때문에, MERMUC의 자기회합의 책임영역은 MERMUC가 HGF 수용체 c-Met와 결합하는 영역(MERMUC의 C말단 53 아미노산잔기)보다도 N말단쪽에 존재한다고 예상되었다.
이것을 검증하는 동시에 MERMUC의 자기회합영역에 결합함으로써 MERMUC의 자기회합을 억제하는 것이 가능한 MERMUCMERMUC 펩티드를 작성하기 위해서, 후술하는방법에 의해 각각 MERMUC 세포질영역의 일부에 대응하는 이하의 4종류의 펩티드를 제작하였다.
del-1: 서열번호 10의 아미노산번호 244 내지 345번째의 아미노산서열
del-2: 서열번호 10의 아미노산번호 244 내지 380번째의 아미노산서열
del-3: 서열번호 10의 아미노산번호 244 내지 415번째의 아미노산서열
del-4: 서열번호 10의 아미노산번호 244 내지 450번째의 아미노산서열
인간 MERMUC 세포질영역 단편(del-1 내지 del-4) 각각을 코드하는 cDNA 단편은 인간 MERMUC 전장 cDNA(서열번호 9)를 주형으로 하고 이하의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다.
(1) del-1
정방향 프라이머: 서열번호 53
역방향 프라이머: 서열번호 54
(2) del-2
정방향 프라이머: 서열번호 53
역방향 프라이머: 서열번호 55
(3) del-3
정방향 프라이머: 서열번호 53
역방향 프라이머: 서열번호 56
(4) del-4
정방향 프라이머: 서열번호 53
역방향 프라이머: 서열번호 57
또한, 상기 정방향 프라이머(서열번호 53)의 5'쪽에는 메티오닌 코돈에 상당하는 ATG와, 추가로 그 5'쪽에는 HindIII 사이트를 디자인하였다. 또한, 각각의 역방향 프라이머의 5'쪽에는 종지코돈의 안티센스에 상당하는 TTA와, 추가로 그 5'쪽에는 XhoI 사이트를 디자인하였다.
PCR에 의해 얻은 각각의 cDNA를 HindIII 및 XhoI로 소화 후, pcDNA3 벡터의 HindIII/XhoI 사이트로 삽입하여 상술한 인간 MERMUC 세포질영역 단편(del-1~-4) 각각을 발현하는 발현벡터를 얻었다.
이어서, GeneJammer Transfection Reagent(STRATAGENE사제)를 사용하여 CHO-K1 세포에 하기 조합의 재조합 단백 발현벡터를 가하여 37℃에서 48시간 배양하여 공형질전환하였다.
1) MERMUC(full)/β-galΔω를 발현하는 벡터(실시예 8);
c-Met (C91)/β-galΔα를 발현하는 벡터(실시예 8); 및
del-1 내지 del-4 중 어느 하나를 발현하는 벡터(상기).
2) MERMUC(full)/β-galΔω를 발현하는 벡터(실시예 8);
MERMUC(full)/β-galΔα를 발현하는 벡터(실시예 8); 및
del-1 내지 del-4 중 어느 하나를 발현하는 벡터(상기).
플라스미드 도입으로부터 48시간 후, Gal-Screen System(Applied Biosystems사제)을 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 각 재조합 세포의 세포내의 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다.
또한, 대조에는 상기 (1) 및 (2)의 각각에 있어서 del-1 내지 del-4 발현벡터 대신에 pcDNA3 벡터(「mock」라고 칭한다.)로 형질전환하여 얻은 재조합 세포를 사용하였다.
결과를 도 16 및 도 18에 나타낸다.
도 16에 나타내어지는 바와 같이, del-4가 가장 강하게 MERMUC의 자기회합을 억제하였다. 또한, 도 17에 나타내어지는 바와 같이, MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합도 del-4에 의해 가장 큰 감약화가 인정되었다. 더욱이 도 18에 나타내어지는 바와 같이, del-4에 의한 MERMUC의 자기회합 억제 및 MERMUC와 HGF 수용체 c-Met의 결합 억제는 그 모두가 del-4의 용량에 의존하여 증대하였다.
실시예 13 MERMUC와 HGF 수용체의 결합 억제에 의한 MAP 키나아제 활성화 회복의 해석
상기 실시예에서 상술한 바와 같이, MERMUC의 HGF 수용체로의 결합에 의해 HGF 자극에 의한 HGF 수용체를 매개로 하는 MAP 키나아제 활성화가 감약하는 것이 나타났다.
따라서, 해당 MAP 키나아제 활성의 감약이 상술한 MERMUC 세포질영역 단편 del-4로 억제되는지 여부를 검토하였다.
상기에서 제작한 del-4 단백 발현벡터를 GeneJammer Transfection Reagent(STRATAGENE사제)를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 실시예 2에서 제작한 Tet-off/MERMUC 발현 재조합 세포(MERMUC/293 세포)에 가하여 37℃에서 48시간 배양함으로써 형질전환하였다.
또한, 대조로서 del-4 발현벡터 대신에 del-4를 코드하는 cDNA를 포함하지 않는 pcDNA 벡터(mock)를 사용하여 동일하게 하여 형질전환하였다.
이 세포를 인간 재조합 HGF(CALBIOCHEM사제)로 자극하고, 그 직후에 일반적인 방법에 따라 세포 용해물을 조제하여 MAP 키나아제(Erk라고도 칭한다) 활성화도의 평가에 제공하였다.
세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리 후, 일반적인 방법에 따라 항인산화 MAP 키나아제 다중클론항체(Phospho-p44/42 MAP kinase(Thr202/Th4204) antibody; Cell Signaling Technology사제)에서의 웨스턴 블로팅에 제공하여 얻어지는 시그날 강도를 토대로 MAK 키나아제 활성화도를 판단하였다.
결과를 도 19에 나타낸다.
그 결과, 기대했던 바와 같이 mock 벡터(pcDNA3)를 도입한 대조세포에서는 MERMUC 단백의 발현에 의해 HGF 자극 후의 인산화 MAP 키나아제 양은 감소하고 있었지만, del-4를 생산시킨 세포에서는 그 억제가 해제되어 유의한 인산화 MAP 키나아제 양이 인정되었다.
이상의 결과로부터 MERMUC의 자기회합(다량체화)과 MERMUC와 HGF 수용체의 결합능에는 치밀한 관계가 존재하여, MERMUC의 자기회합 증가가 MERMUC와 HGF 수용체의 결합능(결합 친화성)을 높여 결과적으로 HGF에 의한 HGF 수용체를 매개로 하는 MAP 키나아제 활성화의 억제능을 향상시키고 있는 것이 시사되었다.
실시예 14 HGF 자극에 의한 MERMUC 단백의 인산화 유도 해석
MERMUC가 HGF 수용체 c-Met와 결합하고, 이 결합에 의해 HGF 자극 후의 HGF 수용체를 매개로 하는 세포내 시그날 전달이 제어되어 있다는 사실로부터, MERMUC 자신도 HGF/HGF 수용체 시그날링의 하류에서 어떠한 수식/제어(예를 들면 피드백 제어)를 받고 있는 것도 예상되었다.
인간 MERMUC의 세포질영역에는 인산화 수식을 받을 수 있는 트레오닌, 세린 및 티로신잔기가 각각 45, 37 및 1잔기로 다수 존재하기 때문에 이들 중 어느 하나의 잔기의 인산화 유무를 이하와 같이 해석하였다.
상기에서 제작한 Tet-Off/MERMUC 발현 재조합 세포(MERMUC/293 세포)를 [32P]orthophosphate로 표지한 후, 인간 재조합 HGF(20 ng/ml; 5분간)로 자극하였다. 이어서, 세포를 일반적인 방법에 의해 용해하여 세포 용해물을 조제하였다. 얻어진 세포 용해물에 상기와 같이 조제한 항인간 MERMUC 다중클론항체(실시예 2)를 가하여 반응시키고, 프로테인-G 세파로오스(protein-G Sepharose)와 결합 후 원심분리하여 MERMUC 단백과 항MERMUC 다중클론항체의 복합체를 침강시켰다.
이 침강물을 1% SDS에서 용출하고, 백그랜드를 억제하기 위해 다시 동일한 면역침강 조작을 행하였다. 이 작업에서 조제한 샘플을 SDS-PAGE로 분리한 후 오토라디오그래피 해석에 제공하였다.
또한, 일반적인 방법에 따라 항인간 MERMUC 다중클론항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 행하여 상기 재조합 세포에서의 MERMUC 발현은 HGF 유무에 상관없이 일정한 것을 확인하였다.
결과를 도 20에 나타낸다.
그 결과, Dox를 가하지 않고 배양함으로써 MERMUC를 과잉발현시킨 세포에서는 HGF 자극에 의해 인산화 MERMUC 단백을 나타내는 강한 시그날 밴드가 검출되었다.
상술한 방법과 동일하게 하여 하기 시험을 행하였다.
1) HGF 대신에 EGF(Epidermal growth factor)를 사용.
2) MERMUC 발현세포를 HGF로 자극하기 전에 HGF 시그날링 억제제인 PI3 키나아제 저해제(LY294002; 10 μM; CALBIOCHEM제)로 처리.
3) MERMUC 발현세포를 HGF로 자극하기 전에 HGF 시그날링 억제제인 MEK 1/2 저해제(U0126; 10 μM; CALBIOCHEM제)로 처리.
4) MERMUC 발현세포를 EGF로 자극하기 전에 PI3 키나아제 저해제(LY294002; 10 μM)로 처리.
5) MERMUC 발현세포를 EGF로 자극하기 전에 MEK 1/2 저해제(U0126; 10 μM) 로 처리.
결과를 도 21에 나타낸다.
그 결과, MERMUC의 인산화 증강효과가 EGF 등의 다른 증식인자의 자극에서는 인정되지 않는 것, 또한 세포를 HGF로 자극하기 전에 PI3 키나아제 저해제 또는 MEK 1/2 저해제로 처리한 경우에는 PI3 키나아제 저해제로 처리한 경우만 MERMUC의 인산화 증강이 억제되었다.
이 결과로부터 MERMUC의 인산화는 PI3 키나아제 및 Akt 키나아제 경로를 매개로 하고 있는 것이 추찰되었다.
실시예 13 MERMUC 과잉발현 트랜스제닉 마우스에 있어서의 HGF 의존적인 간비대 억제의 해석
정상 마우스에 HGF 발현 플라스미드 DNA를 꼬리 정맥주사 투여하면 생체내에서 HGF가 일과적으로 과잉생산되고, 그것에 의한 간세포 증식촉진으로 결과적으로 간비대화가 일어나는 것이 보고되어 있다(Hepatology, Vol.33, p.848-859, 2001).
따라서 동일 보고의 방법을 상기 실시예에서 제작한 MERMUC를 과잉발현하는 트랜스제닉 마우스(MERMUC-Tg; 7주령; 수컷; 23 내지 33 g)에 적용하고, HGF 과잉생산이 유도하는 간비대에 대한 MERMUC 발현이 주는 영향 유무를 검토함으로써 MERMUC가 HGF 수용체를 매개로 하는 시그날링의 음의 제어활성을 갖는 것을 검증하였다.
MERMUC-Tg 마우스 및 동 복부 유래의 non-Tg 마우스 각각에 인간 HGF 발현 플라스미드(인간 HGF-cDNA in pcDNA3, Invitrogen사제) 또는 플라스미드 pcDNA3(mock)을 28 ㎍/마리의 농도(2.3 ml 생리식염수)로 5 내지 10초 이내에서 꼬리 정맥주사 투여하였다. 각 플라스미드 투여 2일 후에 각 마우스 혈청중의 HGF양을 human HGF ELISA Kit(Genzyme Techne사제)를 사용하여 측정하였다. 각 개체에 있어서의 투여 벡터 유래의 HGF 생산량을 평가하는 동시에 개복하여 간 중량변화를 조사하였다.
결과를 도 22에 나타낸다.
그 결과, non-Tg 마우스에 있어서는 HGF의 일과적 과잉생산에 의해 체중당 간 중량비가 약 1.6배로까지 증가하였지만, MERMUC-Tg 마우스에서는 그 증가는 1.2배 정도로 억제되고, HGF 의존적인 간비대화에 있어서 Tg/non-Tg 마우스간에 유의한 차가 인정되었다.
지금까지의 사실로부터 HGF 의존적인 간비대화는 간조직에서의 간세포 과증식에 기인하는 것이 예상되고, 이것에는 HGF-시그날링 경로 내, MAP 키나아제 경로의 활성화가 크게 기여하고 있는 것이 추찰되고 있다. 본 시험 결과는 in vivo에 있어서도 MERMUC가 HGF 수용체에 결합하여 HGF 자극 후의 MAP 키나아제 활성화를 감약하고 있는 것을 시사한다고 할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 c-Met와 MERMUC의 결합(MERMUC 분자의 다량체화를 포함한다)에 의해 일어나는 HGF 활성의 다운 레귤레이션을 제거함으로써, 환자의 생체에 내재하는 HGF 또는 상기 환자에게 외래적으로 공급된 HGF(HGF 단백제제 또는 HGF 유전자치료)가 잠재적으로 가지고 있는 생물활성을 최대한으로 이끌어내는 것이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 의약조성물은 이것을 단독으로 사용하거나, 또는 HGF 의약을 사용한 질환의 치료에 있어서 병용함으로써 여러 질환의 예방·치료에 필수인 조직 및 기관 등의 수복, 재생 또는 신생, 보다 구체적으로는 현재도 그 치료가 곤란해져 있는 여러 난치성 질환(예를 들면, 간선유증, 간경변, 극증간염, 바이러스성 간염, 급성간염, 만성신부전, 신선유증 및 폐선유증 등)의 치료가 필요 최소한 용량의 HGF 의약(HGF 단백이나 HGF 유전자 등)으로 가능해진다.
또한, 본 발명의 의약조성물을 HGF 의약과 병용하는 경우에는, 환자에게 투여되는 HGF 의약의 용량, 투여빈도 및 투여기간 등을 대폭 감소시키는 것이 가능해진다. 이것에 의해 환자의 심신의 고통을 감소시키는 것이 가능한 동시에, 여러 비용(환자, 의료현장, 의약품 메이커, 정부기관 각각이 부담하는 비용)의 삭감도 가능해진다.
본 발명은 또한, 해당 의약조성물의 활성성분인 (1) c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질, (2)MERMUC 분자의 다량체화(자기회합)를 저해하는 활성을 갖는 물질, 또는 (3) MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질을 동정하는 방법, 임의 물질의 각종 활성(c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성, MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성, MERMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 활성 등)을 시험하는 방법 및 해당 방법에 사용되는 각종 도구(각종 폴리펩티드나 융합 폴리펩티드 등)를 제공하는 것으로, 이들의 방법이나 도구를 사용하면 상술한 본 발명의 의약조성물을 간편하게 발견하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO, INC. <120> Pharmaceutical Composition For Tissue Regeneration And Vasculization <130> J1-A0205P <140> <141> <150> JP 2001-380158 <151> 2001-12-13 <150> JP 2002-352924 <151> 2002-12-04 <160> 57 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4173 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(4173) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> mat_peptide <222> (73)..(4170) <400> 1 atg aag gcc ccc gct gtg ctt gca cct ggc atc ctc gtg ctc ctg ttt 48 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe -20 -15 -10 acc ttg gtg cag agg agc aat ggg gag tgt aaa gag gca cta gca aag 96 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys -5 -1 1 5 tcc gag atg aat gtg aat atg aag tat cag ctt ccc aac ttc acc gcg 144 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala 10 15 20 gaa aca ccc atc cag aat gtc att cta cat gag cat cac att ttc ctt 192 Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 25 30 35 40 ggt gcc act aac tac att tat gtt tta aat gag gaa gac ctt cag aag 240 Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys 45 50 55 gtt gct gag tac aag act ggg cct gtg ctg gaa cac cca gat tgt ttc 288 Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 60 65 70 cca tgt cag gac tgc agc agc aaa gcc aat tta tca gga ggt gtt tgg 336 Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 75 80 85 aaa gat aac atc aac atg gct cta gtt gtc gac acc tac tat gat gat 384 Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 90 95 100 caa ctc att agc tgt ggc agc gtc aac aga ggg acc tgc cag cga cat 432 Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His 105 110 115 120 gtc ttt ccc cac aat cat act gct gac ata cag tcg gag gtt cac tgc 480 Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys 125 130 135 ata ttc tcc cca cag ata gaa gag ccc agc cag tgt cct gac tgt gtg 528 Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val 140 145 150 gtg 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255 260 cat tcc tac atg gaa atg cct ctg gag tgt att ctc aca gaa aag aga 912 His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg 265 270 275 280 aaa aag aga tcc aca aag aag gaa gtg ttt aat ata ctt cag gct gcg 960 Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala 285 290 295 tat gtc agc aag cct ggg gcc cag ctt gct aga caa ata gga gcc agc 1008 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser 300 305 310 ctg aat gat gac att ctt ttc ggg gtg ttc gca caa agc aag cca gat 1056 Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp 315 320 325 tct gcc gaa cca atg gat cga tct gcc atg tgt gca ttc cct atc aaa 1104 Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys 330 335 340 tat gtc aac gac ttc ttc aac aag atc gtc aac aaa aac aat gtg aga 1152 Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 345 350 355 360 tgt ctc cag cat ttt tac gga ccc aat cat gag cac tgc ttt aat agg 1200 Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His 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Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys 475 480 485 atc cca ttg aat ggc ttg ggc tgc aga cat ttc cag tcc tgc agt caa 1584 Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln 490 495 500 tgc ctc tct gcc cca ccc ttt gtt cag tgt ggc tgg tgc cac gac aaa 1632 Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys 505 510 515 520 tgt gtg cga tcg gag gaa tgc ctg agc ggg aca tgg act caa cag atc 1680 Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile 525 530 535 tgt ctg cct gca atc tac aag gtt ttc cca aat agt gca ccc ctt gaa 1728 Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu 540 545 550 gga ggg aca agg ctg acc ata tgt ggc tgg gac ttt gga ttt cgg agg 1776 Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg 555 560 565 aat aat aaa ttt gat tta aag aaa act aga gtt ctc ctt gga aat gag 1824 Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu 570 575 580 agc tgc acc ttg act tta agt gag agc acg atg aat aca ttg aaa tgc 1872 Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys 585 590 595 600 aca gtt ggt cct gcc atg aat aag cat ttc aat atg tcc ata att att 1920 Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile 605 610 615 tca aat ggc cac ggg aca aca caa tac agt aca ttc tcc tat gtg gat 1968 Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp 620 625 630 cct gta ata aca agt att tcg ccg aaa tac ggt cct atg gct ggt ggc 2016 Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly 635 640 645 act tta ctt act tta act gga aat tac cta aac agt ggg aat tct aga 2064 Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg 650 655 660 cac att tca att ggt gga aaa aca tgt act tta aaa agt gtg tca aac 2112 His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn 665 670 675 680 agt att ctt gaa tgt tat acc cca gcc caa acc att tca act gag ttt 2160 Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe 685 690 695 gct gtt aaa ttg aaa att gac tta gcc aac cga gag aca agc atc ttc 2208 Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe 700 705 710 agt tac cgt gaa gat ccc att gtc tat gaa att cat cca acc aaa tct 2256 Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser 715 720 725 ttt att agt ggt ggg agc aca ata aca ggt gtt ggg aaa aac ctg aat 2304 Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn 730 735 740 tca gtt agt gtc ccg aga atg gtc ata aat gtg cat gaa gca gga agg 2352 Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg 745 750 755 760 aac ttt aca gtg gca tgt caa cat cgc tct aat tca gag ata atc tgt 2400 Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys 765 770 775 tgt acc act cct tcc ctg caa cag ctg aat ctg caa ctc ccc ctg aaa 2448 Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys 780 785 790 acc aaa gcc ttt ttc atg tta gat ggg atc ctt tcc aaa tac ttt gat 2496 Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp 795 800 805 ctc att tat gta cat aat cct gtg 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Ser 1020 1025 1030 gct cta aat cca gag ctg gtc cag gca gtg cag cat gta gtg att ggg 3216 Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly 1035 1040 1045 ccc agt agc ctg att gtg cat ttc aat gaa gtc ata gga aga ggg cat 3264 Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His 1050 1055 1060 ttt ggt tgt gta tat cat ggg act ttg ttg gac aat gat ggc aag aaa 3312 Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys 1065 1070 1075 1080 att cac tgt gct gtg aaa tcc ttg aac aga atc act gac ata gga gaa 3360 Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu 1085 1090 1095 gtt tcc caa ttt ctg acc gag gga atc atc atg aaa gat ttt agt cat 3408 Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His 1100 1105 1110 ccc aat gtc ctc tcg ctc ctg gga atc tgc ctg cga agt gaa ggg tct 3456 Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser 1115 1120 1125 ccg ctg gtg gtc cta cca tac atg aaa cat gga gat ctt cga aat ttc 3504 Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe 1130 1135 1140 att cga aat gag act cat aat cca act gta aaa gat ctt att ggc ttt 3552 Ile Arg Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe 1145 1150 1155 1160 ggt ctt caa gta gcc aaa ggc atg aaa tat ctt gca agc aaa aag ttt 3600 Gly Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe 1165 1170 1175 gtc cac aga gac ttg gct gca aga aac tgt atg ctg gat gaa aaa ttc 3648 Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe 1180 1185 1190 aca gtc aag gtt gct gat ttt ggt ctt gcc aga gac atg tat gat aaa 3696 Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys 1195 1200 1205 gaa tac tat agt gta cac aac aaa aca ggt gca aag ctg cca gtg aag 3744 Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys 1210 1215 1220 tgg atg gct ttg gaa agt ctg caa act caa aag ttt acc acc aag tca 3792 Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser 1225 1230 1235 1240 gat gtg tgg tcc ttt ggc gtc gtc ctc tgg gag ctg atg aca aga gga 3840 Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly 1245 1250 1255 gcc cca cct tat cct gac gta aac acc ttt gat ata act gtt tac ttg 3888 Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu 1260 1265 1270 ttg caa ggg aga aga ctc cta caa ccc gaa tac tgc cca gac ccc tta 3936 Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu 1275 1280 1285 tat gaa gta atg cta aaa tgc tgg cac cct aaa gcc gaa atg cgc cca 3984 Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro 1290 1295 1300 tcc ttt tct gaa ctg gtg tcc cgg ata tca gcg atc ttc tct act ttc 4032 Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe 1305 1310 1315 1320 att ggg gag cac tat gtc cat gtg aac gct act tat gtg aac gta aaa 4080 Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1325 1330 1335 tgt gtc gct ccg tat cct tct ctg ttg tca tca gaa gat aac gct gat 4128 Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp 1340 1345 1350 gat gag gtg gac aca cga cca gcc tcc ttc tgg gag aca tca tag 4173 Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1355 1360 1365 <210> 2 <211> 1390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys 20 25 30 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala 35 40 45 Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 50 55 60 Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys 65 70 75 80 Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 85 90 95 Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 100 105 110 Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 115 120 125 Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His 130 135 140 Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys 145 150 155 160 Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val 165 170 175 Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 180 185 190 Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 195 200 205 His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp 210 215 220 Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu 225 230 235 240 Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn 245 250 255 Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln 260 265 270 Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu 275 280 285 His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg 290 295 300 Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser 325 330 335 Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp 340 345 350 Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys 355 360 365 Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 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(1)..(3252) <400> 3 tcc aca aag aag gaa gtg ttt aat ata ctt cag gct gcg tat gtc agc 48 Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser 1 5 10 15 aag cct ggg gcc cag ctt gct aga caa ata gga gcc agc ctg aat gat 96 Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp 20 25 30 gac att ctt ttc ggg gtg ttc gca caa agc aag cca gat tct gcc gaa 144 Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu 35 40 45 cca atg gat cga tct gcc atg tgt gca ttc cct atc aaa tat gtc aac 192 Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn 50 55 60 gac ttc ttc aac aag atc gtc aac aaa aac aat gtg aga tgt ctc cag 240 Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln 65 70 75 80 cat ttt tac gga ccc aat cat gag cac tgc ttt aat agg aca ctt ctg 288 His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu 85 90 95 aga aat tca tca ggc tgt gaa gcg cgc cgt gat gaa tat cga aca gag 336 Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu 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Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly 325 330 335 cac ggg aca aca caa tac agt aca ttc tcc tat gtg gat cct gta ata 1056 His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile 340 345 350 aca agt att tcg ccg aaa tac ggt cct atg gct ggt ggc act tta ctt 1104 Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu 355 360 365 act tta act gga aat tac cta aac agt ggg aat tct aga cac att tca 1152 Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser 370 375 380 att ggt gga aaa aca tgt act tta aaa agt gtg tca aac agt att ctt 1200 Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu 385 390 395 400 gaa tgt tat acc cca gcc caa acc att tca act gag ttt gct gtt aaa 1248 Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys 405 410 415 ttg aaa att gac tta gcc aac cga gag aca agc atc ttc agt tac cgt 1296 Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg 420 425 430 gaa gat ccc att gtc tat gaa att cat cca acc aaa tct ttt att agt 1344 Glu Asp Pro Ile 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1680 Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro 545 550 555 560 gaa gca gtt aaa ggt gaa gtg tta aaa gtt gga aat aag agc tgt gag 1728 Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu 565 570 575 aat ata cac tta cat tct gaa gcc gtt tta tgc acg gtc ccc aat gac 1776 Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp 580 585 590 ctg ctg aaa ttg aac agc gag cta aat ata gag tgg aag caa gca att 1824 Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile 595 600 605 tct tca acc gtc ctt gga aaa gta ata gtt caa cca gat cag aat ttc 1872 Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe 610 615 620 aca gga ttg att gct ggt gtt gtc tca ata tca aca gca ctg tta tta 1920 Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu 625 630 635 640 cta ctt ggg ttt ttc ctg tgg ctg aaa aag aga aag caa att aaa gat 1968 Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp 645 650 655 ctg ggc agt gaa tta gtt cgc tac gat gca aga gta cac act cct cat 2016 Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His 660 665 670 ttg gat agg ctt gta agt gcc cga agt gta agc cca act aca gaa atg 2064 Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met 675 680 685 gtt tca aat gaa tct gta gac tac cga gct act ttt cca gaa gat cag 2112 Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln 690 695 700 ttt cct aat tca tct cag aac ggt tca tgc cga caa gtg cag tat cct 2160 Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro 705 710 715 720 ctg aca gac atg tcc ccc atc cta act agt ggg gac tct gat ata tcc 2208 Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 agt cca tta ctg caa aat act gtc cac att gac ctc agt gct cta aat 2256 Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn 740 745 750 cca gag ctg gtc cag gca gtg cag cat gta gtg att ggg ccc agt agc 2304 Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser 755 760 765 ctg att gtg cat ttc aat gaa gtc ata gga aga ggg cat ttt ggt tgt 2352 Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys 770 775 780 gta tat cat ggg act ttg ttg gac aat gat ggc aag aaa att cac tgt 2400 Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys 785 790 795 800 gct gtg aaa tcc ttg aac aga atc act gac ata gga gaa gtt tcc caa 2448 Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln 805 810 815 ttt ctg acc gag gga atc atc atg aaa gat ttt agt cat ccc aat gtc 2496 Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val 820 825 830 ctc tcg ctc ctg gga atc tgc ctg cga agt gaa ggg tct ccg ctg gtg 2544 Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val 835 840 845 gtc cta cca tac atg aaa cat gga gat ctt cga aat ttc att cga aat 2592 Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn 850 855 860 gag act cat aat cca act gta aaa gat ctt att ggc ttt ggt ctt caa 2640 Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln 865 870 875 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Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser 435 440 445 Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser 450 455 460 Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr 465 470 475 480 Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr 485 490 495 Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala 500 505 510 Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr 515 520 525 Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser 530 535 540 Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro 545 550 555 560 Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu 565 570 575 Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp 580 585 590 Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile 595 600 605 Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe 610 615 620 Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu 625 630 635 640 Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp 645 650 655 Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His 660 665 670 Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met 675 680 685 Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln 690 695 700 Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro 705 710 715 720 Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn 740 745 750 Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser 755 760 765 Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys 770 775 780 Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys 785 790 795 800 Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln 805 810 815 Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val 820 825 830 Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val 835 840 845 Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn 850 855 860 Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln 865 870 875 880 Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg 885 890 895 Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys 900 905 910 Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr 915 920 925 Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 930 935 940 Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp 945 950 955 960 Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro 965 970 975 Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly 980 985 990 Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val 995 1000 1005 Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser 1010 1015 1020 Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu 1025 1030 1035 1040 His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala 1045 1050 1055 Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val 1060 1065 1070 Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1075 1080 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His 20 25 30 Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val 35 40 <210> 6 <211> 2187 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2187) <400> 6 atg tgg gtg acc aaa ctc ctg cca gcc ctg ctg ctg cag cat gtc ctc 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 ctg cat ctc ctc ctg ctc ccc atc gcc atc ccc tat gca gag gga caa 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 agg aaa aga aga aat aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag act 144 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa gtg 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga ctt 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa tgc 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa ttt 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac tgc 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 atc att ggt aaa gga cgc agc tac aag gga aca gta tct atc act aag 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 agt ggc atc aaa tgt cag ccc tgg agt tcc atg ata cca cac gaa cac 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 agc ttt ttg cct tcg agc tat cgg ggt aaa gac cta cag gaa aac tac 528 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 tgt cga aat cct cga ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt ttc aca agc 576 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 aat cca gag gta cgc tac gaa gtc tgt gac att cct cag tgt tca gaa 624 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 gtt gaa tgc atg acc tgc aat ggg gag agt tat cga ggt ctc atg gat 672 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 cat aca gaa tca ggc aag att tgt cag cgc tgg gat cat cag aca cca 720 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 cac cgg cac aaa ttc ttg cct gaa aga tat ccc gac aag ggc ttt gat 768 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 gat aat tat tgc cgc aat ccc gat ggc cag ccg agg cca tgg tgc tat 816 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 act ctt gac cct cac acc cgc tgg gag tac tgt gca att aaa aca tgc 864 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 gct gac aat act atg aat gac act gat gtt cct ttg gaa aca act gaa 912 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 tgc atc caa ggt caa gga gaa ggc tac agg ggc act gtc aat acc att 960 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac gag 1008 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa aat 1056 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 tac tgc cga aat cca gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt ttt acc act 1104 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 gat cca aac atc cga gtt ggc tac tgc tcc caa att cca aac tgt gat 1152 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 atg tca cat gga caa gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa aat tat atg 1200 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 ggc aac tta tcc caa aca aga tct gga cta aca tgt tca atg tgg gac 1248 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 aag aac atg gaa gac tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa cca gat gca 1296 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 agt aag ctg aat gag aat tac tgc cga aat cca gat gat gat gct cat 1344 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 gga ccc tgg tgc tac acg gga aat cca ctc att cct tgg gat tat tgc 1392 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 cct att tct cgt tgt gaa ggt gat acc aca cct aca ata gtc aat tta 1440 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 gac cat ccc gta ata tct tgt gcc aaa acg aaa caa ttg cga gtt gta 1488 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 aat ggg att cca aca cga aca aac ata gga tgg atg gtt agt ttg aga 1536 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 tac aga aat aaa cat atc tgc gga gga tca ttg ata aag gag agt tgg 1584 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 gtt ctt act gca cga cag tgt ttc cct tct cga gac ttg aaa gat tat 1632 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 gaa gct tgg ctt gga att cat gat gtc cac gga aga gga gat gag aaa 1680 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 tgc aaa cag gtt ctc aat gtt tcc cag ctg gta tat ggc cct gaa gga 1728 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 tca gat ctg gtt tta atg aag ctt gcc agg cct gct gtc ctg gat gat 1776 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 ttt gtt agt acg att gat tta cct aat tat gga tgc aca att cct gaa 1824 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 aag acc agt tgc agt gtt tat ggc tgg ggc tac act gga ttg atc aac 1872 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 tat gat ggc cta tta cga gtg gca cat ctc tat ata atg gga aat gag 1920 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 aaa tgc agc cag cat cat cga ggg aag gtg act ctg aat gag tct gaa 1968 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 ata tgt gct ggg gct gaa aag att gga tca gga cca tgt gag ggg gat 2016 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 tat ggt ggc cca ctt gtt tgt gag caa cat aaa atg aga atg gtt ctt 2064 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 ggt gtc att gtt cct ggt cgt gga tgt gcc att cca aat cgt cct ggt 2112 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 att ttt gtc cga gta gca tat tat gca aaa tgg ata cac aaa att att 2160 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 tta aca tat aag gta cca cag tca tag 2187 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 7 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro 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Val Ile Thr 1 5 10 15 Pro Ser Xaa <210> 9 <211> 1512 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1512) <400> 9 atg aca acg gac gac aca gaa gtg ccc gct atg act cta gca ccg ggc 48 Met Thr Thr Asp Asp Thr Glu Val Pro Ala Met Thr Leu Ala Pro Gly 1 5 10 15 cac gcc gct ctg gaa act caa acg ctg agc gct gag acc tct tct agg 96 His Ala Ala Leu Glu Thr Gln Thr Leu Ser Ala Glu Thr Ser Ser Arg 20 25 30 gcc tca acc cca gcc ggc ccc att cca gaa gca gag acc agg gga gcc 144 Ala Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ile Pro Glu Ala Glu Thr Arg Gly Ala 35 40 45 aag aga att tcc cct gca aga gag acc agg agt ttc aca aaa aca tct 192 Lys Arg Ile Ser Pro Ala Arg Glu Thr Arg Ser Phe Thr Lys Thr Ser 50 55 60 ccc aac ttc atg gtg ctg atc gcc acc tcc gtg gag aca tca gcc gcc 240 Pro Asn Phe Met Val Leu Ile Ala Thr Ser Val Glu Thr Ser Ala Ala 65 70 75 80 agt ggc agc ccc gag gga gct gga atg acc aca gtt cag acc atc aca 288 Ser Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly Met Thr Thr Val Gln Thr Ile Thr 85 90 95 ggc agt gat ccc gag gaa gcc atc ttt gac acc ctt tgc acc gat gac 336 Gly Ser Asp Pro Glu Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp 100 105 110 agc tct gaa gag gca aag aca ctc aca atg gac ata ttg aca ttg gct 384 Ser Ser Glu Glu Ala Lys Thr Leu Thr Met Asp Ile Leu Thr Leu Ala 115 120 125 cac acc tcc aca gaa gct aag ggc ctg tcc tca gag agc agt gcc tct 432 His Thr Ser Thr Glu Ala Lys Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 130 135 140 tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccg tca cgg gcc tca gag agc 480 Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala Ser Glu Ser 145 150 155 160 agc gcc tct tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccg tca cgg gcc 528 Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala 165 170 175 tca gag agc agc gcc tct tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccc 576 Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 180 185 190 tca tgg tcc ccg gga tct gat gtc act ctc ctc gct gaa gcc ctg gtg 624 Ser Trp Ser Pro Gly Ser Asp Val Thr Leu Leu Ala Glu Ala Leu Val 195 200 205 act gtc aca aac atc gag gtt att aat tgc agc atc aca gaa ata gaa 672 Thr Val Thr Asn Ile Glu Val Ile Asn Cys Ser Ile Thr Glu Ile Glu 210 215 220 aca aca act tcc agc atc cct ggg gcc tca gac ata gat ctc atc ccc 720 Thr Thr Thr Ser Ser Ile Pro Gly Ala Ser Asp Ile Asp Leu Ile Pro 225 230 235 240 acg gaa ggg gtg aag gcc tcg tcc acc tcc gat cca cca gct ctg cct 768 Thr Glu Gly Val Lys Ala Ser Ser Thr Ser Asp Pro Pro Ala Leu Pro 245 250 255 gac tcc act gaa gca aaa cca cac atc act gag gtc aca gcc tct gcc 816 Asp Ser Thr Glu Ala Lys Pro His Ile Thr Glu Val Thr Ala Ser Ala 260 265 270 gag acc ctg tcc aca gcc ggc acc aca gag tca gct gca cct cat gcc 864 Glu Thr Leu Ser Thr Ala Gly Thr Thr Glu Ser Ala Ala Pro His Ala 275 280 285 acg gtt ggg acc cca ctc ccc act aac agc gcc aca gaa aga gaa gtg 912 Thr Val Gly Thr Pro Leu Pro Thr Asn Ser Ala Thr Glu Arg Glu Val 290 295 300 aca gca ccc ggg gcc acg acc ctc agt gga gct ctg gtc aca gtt agc 960 Thr Ala Pro Gly Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Leu Val Thr Val Ser 305 310 315 320 agg aat ccc ctg gaa gaa acc tca gcc ctc tct gtt gag aca cca agt 1008 Arg Asn Pro Leu Glu Glu Thr Ser Ala Leu Ser Val Glu Thr Pro Ser 325 330 335 tac gtc aaa gtc tca gga gca gct ccg gtc tcc ata gag gct ggg tca 1056 Tyr Val Lys Val Ser Gly Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Ala Gly Ser 340 345 350 gca gtg ggc aaa aca act tcc ttt gct ggg agc tct gct tcc tcc tac 1104 Ala Val Gly Lys Thr Thr Ser Phe Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ser Tyr 355 360 365 agc ccc tcg gaa gcc gcc ctc aag aac ttc acc cct tca gag aca ccg 1152 Ser Pro Ser Glu Ala Ala Leu Lys Asn Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro 370 375 380 acc atg gac atc gca acc aag ggg ccc ttc ccc acc agc agg gac cct 1200 Thr Met Asp Ile Ala Thr Lys Gly Pro Phe Pro Thr Ser Arg Asp Pro 385 390 395 400 ctt cct tct gtc cct ccg act aca acc aac agc agc cga ggg acg aac 1248 Leu Pro Ser Val Pro Pro Thr Thr Thr Asn Ser Ser Arg Gly Thr Asn 405 410 415 agc acc tta gcc aag atc aca acc tca gcg aag acc acg atg aag ccc 1296 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Met Lys Pro 420 425 430 cca aca gcc acg ccc acg act gcc cgg acg agg ccg acc aca gac gtg 1344 Pro Thr Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Thr Arg Pro Thr Thr Asp Val 435 440 445 agt gca ggt gaa aat gga ggt ttc ctc ctc ctg cgg ctg agt gtg gct 1392 Ser Ala Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala 450 455 460 tcc ccg gaa gac ctc act gac ccc aga gtg gca gaa agg ctg atg cag 1440 Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln 465 470 475 480 cag ctc cac cgg gaa ctc cac gcc cac gcg cct cac ttc cag gtc tcc 1488 Gln Leu His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser 485 490 495 tta ctg cgt gtc agg aga ggc taa 1512 Leu Leu Arg Val Arg Arg Gly 500 <210> 10 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Thr Asp Asp Thr Glu Val Pro Ala Met Thr Leu Ala Pro Gly 1 5 10 15 His Ala Ala Leu Glu Thr Gln Thr Leu Ser Ala Glu Thr Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ile Pro Glu Ala Glu Thr Arg Gly Ala 35 40 45 Lys Arg Ile Ser Pro Ala Arg Glu Thr Arg Ser Phe Thr Lys Thr Ser 50 55 60 Pro Asn Phe Met Val Leu Ile Ala Thr Ser Val Glu Thr Ser Ala Ala 65 70 75 80 Ser Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly Met Thr Thr Val Gln Thr Ile Thr 85 90 95 Gly Ser Asp Pro Glu Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp 100 105 110 Ser Ser Glu Glu Ala Lys Thr Leu Thr Met Asp Ile Leu Thr Leu Ala 115 120 125 His Thr Ser Thr Glu Ala Lys Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala Ser Glu Ser 145 150 155 160 Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala 165 170 175 Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 180 185 190 Ser Trp Ser Pro Gly Ser Asp Val Thr Leu Leu Ala Glu Ala Leu Val 195 200 205 Thr Val Thr Asn Ile Glu Val Ile Asn Cys Ser Ile Thr Glu Ile Glu 210 215 220 Thr Thr Thr Ser Ser Ile Pro Gly Ala Ser Asp Ile Asp Leu Ile Pro 225 230 235 240 Thr Glu Gly Val Lys Ala Ser Ser Thr Ser Asp Pro Pro Ala Leu Pro 245 250 255 Asp Ser Thr Glu Ala Lys Pro His Ile Thr Glu Val Thr Ala Ser Ala 260 265 270 Glu Thr Leu Ser Thr Ala Gly Thr Thr Glu Ser Ala Ala Pro His Ala 275 280 285 Thr Val Gly Thr Pro Leu Pro Thr Asn Ser Ala Thr Glu Arg Glu Val 290 295 300 Thr Ala Pro Gly Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Leu Val Thr Val Ser 305 310 315 320 Arg Asn Pro Leu Glu Glu Thr Ser Ala Leu Ser Val Glu Thr Pro Ser 325 330 335 Tyr Val Lys Val Ser Gly Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Ala Gly Ser 340 345 350 Ala Val Gly Lys Thr Thr Ser Phe Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ser Tyr 355 360 365 Ser Pro Ser Glu Ala Ala Leu Lys Asn Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro 370 375 380 Thr Met Asp Ile Ala Thr Lys Gly Pro Phe Pro Thr Ser Arg Asp Pro 385 390 395 400 Leu Pro Ser Val Pro Pro Thr Thr Thr Asn Ser Ser Arg Gly Thr Asn 405 410 415 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Met Lys Pro 420 425 430 Pro Thr Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Thr Arg Pro Thr Thr Asp Val 435 440 445 Ser Ala Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala 450 455 460 Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln 465 470 475 480 Gln Leu His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser 485 490 495 Leu Leu Arg Val Arg Arg Gly 500 <210> 11 <211> 1971 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1971) <400> 11 atg ggc tct gtc tgg ggc ctg gct gtg ccc ctc ctt gtc ttc tgc tgg 48 Met Gly Ser Val Trp Gly Leu Ala Val Pro Leu Leu Val Phe Cys Trp 1 5 10 15 aag gtt ggc gtc agt gtg agc tct cca ggt ctc gac att agc aga tca 96 Lys Val Gly Val Ser Val Ser Ser Pro Gly Leu Asp Ile Ser Arg Ser 20 25 30 gtt cct ttg gtg aca acc aac aac atg gaa gtg tcc acc ttc act caa 144 Val Pro Leu Val Thr Thr Asn Asn Met Glu Val Ser Thr Phe Thr Gln 35 40 45 agg gac agg ccc agc tca gag aga gct ttc cag acc acc aac ctg att 192 Arg Asp Arg Pro Ser Ser Glu Arg Ala Phe Gln Thr Thr Asn Leu Ile 50 55 60 cag tat gta cct cta gac aca caa act ctc agc act gaa tct gct tct 240 Gln Tyr Val Pro Leu Asp Thr Gln Thr Leu Ser Thr Glu Ser Ala Ser 65 70 75 80 aat gct tta agt gca act agt atc agt tca gag gtc aat tcc aga gac 288 Asn Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ile Ser Ser Glu Val Asn Ser Arg Asp 85 90 95 act cag gcc acc tct ttt gta aca aag acc agg aag aca cat act acc 336 Thr Gln Ala Thr Ser Phe Val Thr Lys Thr Arg Lys Thr His Thr Thr 100 105 110 act cct gca gca tca tcc cta gag gcc cag acc acc tct cct aat ttg 384 Thr Pro Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ser Pro Asn Leu 115 120 125 tca acc ctg aat att cag att acc tcc cca ata gca tcg tcc ctg gat 432 Ser Thr Leu Asn Ile Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ala Ser Ser Leu Asp 130 135 140 gct cag acc att ttt cct gta tca tta tcc ctg agt acc cag acc act 480 Ala Gln Thr Ile Phe Pro Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gln Thr Thr 145 150 155 160 tct cct gca cca tca ttc ctg gat acc caa acc act tcc cct gaa cca 528 Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr Gln Thr Thr Ser Pro Glu Pro 165 170 175 tca tct ctg acc act tcc cct gca cca tca tct ctg atc act tct cct 576 Ser Ser Leu Thr Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ser Leu Ile Thr Ser Pro 180 185 190 act cca tca tct cta act ata tcc cct gca ccg tca ttc ctg gat acc 624 Thr Pro Ser Ser Leu Thr Ile Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr 195 200 205 cag acc act tcc cct gca cta tca tct ctg gct act tcc cct gca cca 672 Gln Thr Thr Ser Pro Ala Leu Ser Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Pro 210 215 220 tca tcc cta gat acc cag acc atc tcg cct att gaa ttg acc cta aag 720 Ser Ser Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ser Pro Ile Glu Leu Thr Leu Lys 225 230 235 240 acc caa acc att tcc act gta acg gag acc aga acg gtt tca ata aga 768 Thr Gln Thr Ile Ser Thr Val Thr Glu Thr Arg Thr Val Ser Ile Arg 245 250 255 ata cct tct gac ctc aag gtt atg cac acc atc cct aca gag aca ttg 816 Ile Pro Ser Asp Leu Lys Val Met His Thr Ile Pro Thr Glu Thr Leu 260 265 270 aca cca agc aac agc ccc aga act ggg atg agc act gtc caa act ggc 864 Thr Pro Ser Asn Ser Pro Arg Thr Gly Met Ser Thr Val Gln Thr Gly 275 280 285 aca gtg tgg gac ccc ata gaa gcc atc ttt gac acc ctt tgt acc gat 912 Thr Val Trp Asp Pro Ile Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp 290 295 300 gac agc tct gaa gag gca agg aag atc aca gtt gac ctc ctg acg ttg 960 Asp Ser Ser Glu Glu Ala Arg Lys Ile Thr Val Asp Leu Leu Thr Leu 305 310 315 320 gca cac acc tcc acg gaa gtg gag cac ctg tct tca gag agc agc tct 1008 Ala His Thr Ser Thr Glu Val Glu His Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ser 325 330 335 tcc tct gac agt tca gct ggg gtc ctc agc agc tca cga gtc ctg gga 1056 Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Val Leu Ser Ser Ser Arg Val Leu Gly 340 345 350 ccc gac agt gca act cca gcc aag ggg ttg gtt gcc ttc aac atc act 1104 Pro Asp Ser Ala Thr Pro Ala Lys Gly Leu Val Ala Phe Asn Ile Thr 355 360 365 cat att aaa ctc agc acc tgc atc aca gaa ata gaa aca acc atc acc 1152 His Ile Lys Leu Ser Thr Cys Ile Thr Glu Ile Glu Thr Thr Ile Thr 370 375 380 atc tct ggg gcc cca ggc gtg agc ctc agc cct aca gaa gcg acg gca 1200 Ile Ser Gly Ala Pro Gly Val Ser Leu Ser Pro Thr Glu Ala Thr Ala 385 390 395 400 gct ttg ttc act tct gag ata tta act ttg cct cca ccc act gag gca 1248 Ala Leu Phe Thr Ser Glu Ile Leu Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Ala 405 410 415 aaa cca att ttc ccc gag acc aca agc tta tct ggg atc ctg tca act 1296 Lys Pro Ile Phe Pro Glu Thr Thr Ser Leu Ser Gly Ile Leu Ser Thr 420 425 430 gcc ggc acc ccg gcc ctt gcc acc acc ctt gag ggg aca gtc tcc act 1344 Ala Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Thr Leu Glu Gly Thr Val Ser Thr 435 440 445 agt gca atc aca gaa agc gaa aca gca gtg gcc cag act ctt acc tct 1392 Ser Ala Ile Thr Glu Ser Glu Thr Ala Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser 450 455 460 gtt gga act tcg gtg aca gtt aga agg aac ccc ctg gaa aac act tca 1440 Val Gly Thr Ser Val Thr Val Arg Arg Asn Pro Leu Glu Asn Thr Ser 465 470 475 480 aca ctc tct att gag aca caa agc cac act gag gtc ttg ggc acc atc 1488 Thr Leu Ser Ile Glu Thr Gln Ser His Thr Glu Val Leu Gly Thr Ile 485 490 495 aca gtc ccc atg gtt gct gga tca aca atg gga gaa aca gcc tcc ttc 1536 Thr Val Pro Met Val Ala Gly Ser Thr Met Gly Glu Thr Ala Ser Phe 500 505 510 gtg agt ttc acg gct ctc gac agc agc agt ctc tca gtg gtg gtc acc 1584 Val Ser Phe Thr Ala Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Val Val Thr 515 520 525 acc gag agc tct gct acc tca gag act tta acc aca ggc aat aca acc 1632 Thr Glu Ser Ser Ala Thr Ser Glu Thr Leu Thr Thr Gly Asn Thr Thr 530 535 540 aac agc tcc ttc ctc aca gaa agc cac cct cct ttt tct atc tat tca 1680 Asn Ser Ser Phe Leu Thr Glu Ser His Pro Pro Phe Ser Ile Tyr Ser 545 550 555 560 act aca gct agc acc agc aaa aac cca aac atc acc tta acc aag acc 1728 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Lys Asn Pro Asn Ile Thr Leu Thr Lys Thr 565 570 575 aca gcc tca cca aag ccc ccg acg cat cct aca aca tct gca tcc act 1776 Thr Ala Ser Pro Lys Pro Pro Thr His Pro Thr Thr Ser Ala Ser Thr 580 585 590 gct tgg ata agg aaa acc aca aaa cat gat cca ggt gaa gat gga ggc 1824 Ala Trp Ile Arg Lys Thr Thr Lys His Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gly 595 600 605 ttc ctc ctt gta cgg ctg acc gtg gcc tcc cct aag gac ctc act gag 1872 Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu Thr Glu 610 615 620 cac aac gcc aga gag aag ctg atg aac cag ctc cgc cgt gaa ctg cac 1920 His Asn Ala Arg Glu Lys Leu Met Asn Gln Leu Arg Arg Glu Leu His 625 630 635 640 gcc cgc atg cca ctt gtc cac atg tcc ttc ctg agc atc agg agg ggt 1968 Ala Arg Met Pro Leu Val His Met Ser Phe Leu Ser Ile Arg Arg Gly 645 650 655 tga 1971 <210> 12 <211> 656 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gly Ser Val Trp Gly Leu Ala Val Pro Leu Leu Val Phe Cys Trp 1 5 10 15 Lys Val Gly Val Ser Val Ser Ser Pro Gly Leu Asp Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Val Pro Leu Val Thr Thr Asn Asn Met Glu Val Ser Thr Phe Thr Gln 35 40 45 Arg Asp Arg Pro Ser Ser Glu Arg Ala Phe Gln Thr Thr Asn Leu Ile 50 55 60 Gln Tyr Val Pro Leu Asp Thr Gln Thr Leu Ser Thr Glu Ser Ala Ser 65 70 75 80 Asn Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ile Ser Ser Glu Val Asn Ser Arg Asp 85 90 95 Thr Gln Ala Thr Ser Phe Val Thr Lys Thr Arg Lys Thr His Thr Thr 100 105 110 Thr Pro Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ser Pro Asn Leu 115 120 125 Ser Thr Leu Asn Ile Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ala Ser Ser Leu Asp 130 135 140 Ala Gln Thr Ile Phe Pro Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gln Thr Thr 145 150 155 160 Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr Gln Thr Thr Ser Pro Glu Pro 165 170 175 Ser Ser Leu Thr Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ser Leu Ile Thr Ser Pro 180 185 190 Thr Pro Ser Ser Leu Thr Ile Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr 195 200 205 Gln Thr Thr Ser Pro Ala Leu Ser Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Pro 210 215 220 Ser Ser Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ser Pro Ile Glu Leu Thr Leu Lys 225 230 235 240 Thr Gln Thr Ile Ser Thr Val Thr Glu Thr Arg Thr Val Ser Ile Arg 245 250 255 Ile Pro Ser Asp Leu Lys Val Met His Thr Ile Pro Thr Glu Thr Leu 260 265 270 Thr Pro Ser Asn Ser Pro Arg Thr Gly Met Ser Thr Val Gln Thr Gly 275 280 285 Thr Val Trp Asp Pro Ile Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp 290 295 300 Asp Ser Ser Glu Glu Ala Arg Lys Ile Thr Val Asp Leu Leu Thr Leu 305 310 315 320 Ala His Thr Ser Thr Glu Val Glu His Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ser 325 330 335 Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Val Leu Ser Ser Ser Arg Val Leu Gly 340 345 350 Pro Asp Ser Ala Thr Pro Ala Lys Gly Leu Val Ala Phe Asn Ile Thr 355 360 365 His Ile Lys Leu Ser Thr Cys Ile Thr Glu Ile Glu Thr Thr Ile Thr 370 375 380 Ile Ser Gly Ala Pro Gly Val Ser Leu Ser Pro Thr Glu Ala Thr Ala 385 390 395 400 Ala Leu Phe Thr Ser Glu Ile Leu Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Ala 405 410 415 Lys Pro Ile Phe Pro Glu Thr Thr Ser Leu Ser Gly Ile Leu Ser Thr 420 425 430 Ala Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Thr Leu Glu Gly Thr Val Ser Thr 435 440 445 Ser Ala Ile Thr Glu Ser Glu Thr Ala Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser 450 455 460 Val Gly Thr Ser Val Thr Val Arg Arg Asn Pro Leu Glu Asn Thr Ser 465 470 475 480 Thr Leu Ser Ile Glu Thr Gln Ser His Thr Glu Val Leu Gly Thr Ile 485 490 495 Thr Val Pro Met Val Ala Gly Ser Thr Met Gly Glu Thr Ala Ser Phe 500 505 510 Val Ser Phe Thr Ala Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Val Val Thr 515 520 525 Thr Glu Ser Ser Ala Thr Ser Glu Thr Leu Thr Thr Gly Asn Thr Thr 530 535 540 Asn Ser Ser Phe Leu Thr Glu Ser His Pro Pro Phe Ser Ile Tyr Ser 545 550 555 560 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Lys Asn Pro Asn Ile Thr Leu Thr Lys Thr 565 570 575 Thr Ala Ser Pro Lys Pro Pro Thr His Pro Thr Thr Ser Ala Ser Thr 580 585 590 Ala Trp Ile Arg Lys Thr Thr Lys His Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gly 595 600 605 Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu Thr Glu 610 615 620 His Asn Ala Arg Glu Lys Leu Met Asn Gln Leu Arg Arg Glu Leu His 625 630 635 640 Ala Arg Met Pro Leu Val His Met Ser Phe Leu Ser Ile Arg Arg Gly 645 650 655 <210> 13 <211> 491 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (3)..(491) <400> 13 ct gag gtt ttt ggt acc atc aca gtc ccc acg gtt gct gga tca aca 47 Glu Val Phe Gly Thr Ile Thr Val Pro Thr Val Ala Gly Ser Thr 1 5 10 15 gta gga gaa gca acc tct ctt gtg agt tcc aca gct cta gac agc agt 95 Val Gly Glu Ala Thr Ser Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Asp Ser Ser 20 25 30 ctc tca gca gtg gtc acc acc aag ggc tct gct tcc tca gag act tta 143 Leu Ser Ala Val Val Thr Thr Lys Gly Ser Ala Ser Ser Glu Thr Leu 35 40 45 acc aca gac aat aca acc aac agc tcc ttc ctc aca ggg agt cgc cct 191 Thr Thr Asp Asn Thr Thr Asn Ser Ser Phe Leu Thr Gly Ser Arg Pro 50 55 60 cct tct tta atc tat tcg aca aca gct agc acc agt gaa aga aca aac 239 Pro Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Glu Arg Thr Asn 65 70 75 gtc act tta acc aag acc aca gcc tca ccg aag acc ccg atg aat ccc 287 Val Thr Leu Thr Lys Thr Thr Ala Ser Pro Lys Thr Pro Met Asn Pro 80 85 90 95 gca ccc act gct tgg aca agg aaa acc aca gag cac gat cca ggt ata 335 Ala Pro Thr Ala Trp Thr Arg Lys Thr Thr Glu His Asp Pro Gly Ile 100 105 110 aat gga ggc ttc ctc ctt gta cgg ctg acc gtg gcc tcc cct aag gac 383 Asn Gly Gly Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp 115 120 125 ctc act gag cac gtc acc aga gag aag ctg atg cac cag ctc cgc cgt 431 Leu Thr Glu His Val Thr Arg Glu Lys Leu Met His Gln Leu Arg Arg 130 135 140 gaa ctg cac acc cat atg cca ctt gtc caa gtg tcc tta ctg agc atc 479 Glu Leu His Thr His Met Pro Leu Val Gln Val Ser Leu Leu Ser Ile 145 150 155 agg agg agc tga 491 Arg Arg Ser 160 <210> 14 <211> 162 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Glu Val Phe Gly Thr Ile Thr Val Pro Thr Val Ala Gly Ser Thr Val 1 5 10 15 Gly Glu Ala Thr Ser Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Val Val Thr Thr Lys Gly Ser Ala Ser Ser Glu Thr Leu Thr 35 40 45 Thr Asp Asn Thr Thr Asn Ser Ser Phe Leu Thr Gly Ser Arg Pro Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Glu Arg Thr Asn Val 65 70 75 80 Thr Leu Thr Lys Thr Thr Ala Ser Pro Lys Thr Pro Met Asn Pro Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Trp Thr Arg Lys Thr Thr Glu His Asp Pro Gly Ile Asn 100 105 110 Gly Gly Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu 115 120 125 Thr Glu His Val Thr Arg Glu Lys Leu Met His Gln Leu Arg Arg Glu 130 135 140 Leu His Thr His Met Pro Leu Val Gln Val Ser Leu Leu Ser Ile Arg 145 150 155 160 Arg Ser <210> 15 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro 1 5 10 15 Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln Gln Leu 20 25 30 His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser Leu Leu 35 40 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Pro Ala Met Ser Glu Arg Val Thr Arg Met Val Gln Arg 405 410 415 Asp Arg Asn His Pro Ser Val Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser 420 425 430 Gly His Gly Ala Asn His Asp Ala Leu Tyr Arg Trp Ile Lys Ser Val 435 440 445 Asp Pro Ser Arg Pro Val Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Thr Thr 450 455 460 Ala Thr Asp Ile Ile Cys Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Glu Asp Gln 465 470 475 480 Pro Phe Pro Ala Val Pro Lys Trp Ser Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu 485 490 495 Pro Gly Glu Thr Arg Pro Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met 500 505 510 Gly Asn Ser Leu Gly Gly Phe Ala Lys Tyr Trp Gln Ala Phe Arg Gln 515 520 525 Tyr Pro Arg Leu Gln Gly Gly Phe Val Trp Asp Trp Val Asp Gln Ser 530 535 540 Leu Ile Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Asn Pro Trp Ser Ala Tyr Gly Gly 545 550 555 560 Asp Phe Gly Asp Thr Pro Asn Asp Arg Gln Phe Cys Met Asn Gly Leu 565 570 575 Val Phe Ala Asp Arg Thr Pro His Pro Ala Leu Thr Glu Ala Lys His 580 585 590 Gln Gln Gln Phe Phe Gln Phe Arg Leu Ser Gly Gln Thr Ile Glu Val 595 600 605 Thr Ser Glu Tyr Leu Phe Arg His Ser Asp Asn Glu Leu Leu His Trp 610 615 620 Met Val Ala Leu Asp Gly Lys Pro Leu Ala Ser Gly Glu Val Pro Leu 625 630 635 640 Asp Val Ala Pro Gln Gly Lys Gln Leu Ile Glu Leu Pro Glu Leu Pro 645 650 655 Gln Pro Glu Ser Ala Gly Gln Leu Trp Leu Thr Val Arg Val Val Gln 660 665 670 Pro Asn Ala Thr Ala Trp Ser Glu Ala Gly His Ile Ser Ala Trp Gln 675 680 685 Gln Trp Arg Leu Ala Glu Asn Leu Ser Val Thr Leu Pro Ala Ala Ser 690 695 700 His Ala Ile Pro His Leu Thr Thr Ser Glu Met Asp Phe Cys Ile Glu 705 710 715 720 Leu Gly Asn Lys Arg Trp Gln Phe Asn Arg Gln Ser Gly Phe Leu Ser 725 730 735 Gln Met Trp Ile Gly Asp Lys Lys Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp 740 745 750 Gln Phe Thr Arg Ala Pro Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Ala 755 760 765 Thr Arg Ile Asp Pro Asn Ala Trp Val Glu Arg Trp Lys Ala Ala Gly 770 775 780 His Tyr Gln Ala Glu Ala Ala Leu Leu Gln Cys Thr Ala Asp Thr Leu 785 790 795 800 Ala Asp Ala Val Leu Ile Thr Thr Ala His Ala Trp Gln His Gln Gly 805 810 815 Lys Thr Leu Phe 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Arg Ala Val 225 230 235 240 Leu Glu Ala Glu Val Gln Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg 245 250 255 Val Thr Val Ser Leu Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr 260 265 270 Ala Pro Phe Gly Gly Glu Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp 275 280 285 Arg Val Thr Leu Arg Leu Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala 290 295 300 Glu Ile Pro Asn Leu Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp 305 310 315 320 Gly Thr Leu Ile Glu Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val 325 330 335 Arg Ile Glu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile 340 345 350 Arg Gly Val Asn Arg His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met 355 360 365 Asp Glu Gln Thr Met Val Gln Asp Ile Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn 370 375 380 Phe Asn Ala Val Arg Cys Ser His Tyr Pro Asn His Pro Leu Trp Tyr 385 390 395 400 Thr Leu Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile 405 410 415 Glu Thr His Gly Met Val Pro Met Asn Arg Leu Thr Asp Asp Pro Arg 420 425 430 Trp Leu Pro Ala Met Ser Glu Arg Val Thr Arg Met Val 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Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <400> 29 aaaagaattc gtgaaggcct cgtccacctc 30 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <400> 30 ctccgtcgac ttatgcactc acgtctgtgg tcg 33 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 31 aaaagaattc ggtgaaaatg gaggtttcct cc 32 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 32 aaaagtcgac ttagcctctc ctgacacgca g 31 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(37) <400> 33 ggggctcgag atgaccatga ttacggattc actggcc 37 <210> 34 <211> 35 <212> DNA 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sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <400> 43 catccaagcc atatatggac gttcc 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <400> 44 tctggagagt caaaattctc ttcgt 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <400> 45 ggcatccggc acctctatgg tcc 23 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <400> 46 gccacttgtc ggcgataagg aagg 24 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <400> 47 tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR 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primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(39) <400> 53 aaaaaagctt ggcaccatgc tgaaggcctc gtccacctc 39 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 54 aaaactcgag ttacggagct gctcctgaga c 31 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <400> 55 aaaactcgag ttaaggggtg aagttcttga ggg 33 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 56 aaaactcgag ttacgtccct cggctgctgt tg 32 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 57 aaaactcgag ttatgcactc acgtctgtgg tc 32

Claims (78)

  1. c-Met와 MERMUC의 결합 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용하기 위한 의약조성물.
  2. c-Met와 MERMUC의 결합 또는 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, HGF에 의한 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용하기 위한 의약조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 HGF가 생체에 내재하는 HGF인 의약조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 HGF가 생체로 외래적으로 HGF를 공급 가능한 HGF 의약인 의약조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 포함하는 단백 의약인 의약조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA 의약인 의약조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 의약조성물이 선유증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 선유증이 간장, 신장 또는 폐에 있어서의 선유증인 의약조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 의약조성물이 간경변, 간선유증 또는 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 간염이 극증간염, 급성간염 또는 바이러스성 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 의약조성물이 만성신부전의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 의약조성물이 폐색성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 물질이 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 물질이 c-Met β사슬의 C말단영역과 MERMUC C말단영역의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질인 의약조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC에 결합하는 물질인 의약조성물.
  17. MERUMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용되기 위한 의약조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 저해하는 물질인 의약조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 물질인 의약조성물.
  20. MERUMUC의 발현을 억제 또는 저해하는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함해서 되고, HGF에 의한 세포의 증식 또는 조직, 기관, 혈관, 점막, 골격 또는 신경의 형성, 수복, 재생 또는 신생의 유지 또는 증강에 사용되기 위한 의약조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 유전자의 mRNA로의 전사를 저해하는 물질인 의약조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 물질이 MERMUC를 코드하는 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 물질인 의약조성물.
  23. 제20항에 있어서, 상기 HGF가 생체에 내재하는 HGF인 의약조성물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 HGF가 생체로 외래적으로 HGF를 공급 가능한 HGF 의약인 의약조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 포함하는 단백 의약인 의약조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 HGF 의약이 HGF 단백질을 코드하는 DNA를 포함하는 DNA 의약인 의약조성물.
  27. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 의약조성물이 선유증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 선유증이 간장, 신장 또는 폐에 있어서의 선유증인 의약조성물.
  29. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 의약조성물이 간경변, 간선유증 또는 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  30. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 간염이 극증간염, 급성간염 또는 바이러스성 간염의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  31. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 의약조성물이 만성신부전의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  32. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 의약조성물이 폐색성 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 의약조성물.
  33. MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, c-Met와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세포질영역의 전부 또는 일부가 MERMUC의 C말단영역의 류신 반복영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드.
  36. 제33항에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 폴리펩티드.
  37. 제33항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 15에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
  38. c-Met의 전장 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 c-Met의 β사슬 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세포질영역의 전부 또는 일부가 자기 인산화를 받는 하나 또는 복수의 티로신잔기를 포함하는 c-Met C말단영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드.
  41. 제38항에 있어서, 상기 c-Met가 인간의 c-Met인 폴리펩티드.
  42. 제38항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 5에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
  43. MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부 아미노산서열을 가지고, MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 일부 아미노산서열이 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부에 대응하는 폴리펩티드.
  45. 제33항에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 폴리펩티드.
  46. 일반식 W-X-Y(W는 존재하지 않거나 또는 MERMUC 이외의 다른 단백질의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부, X는 MERMUC의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이고, Y는 MERMUC 이외의 다른 단백질의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이다.)로 표시되는 융합 폴리펩티드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 Y의 다른 단백질이 β-gal△α 또는 β-gal△ω인 융합 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, 상기 β-gal△α가 서열번호 16에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  49. 제47항에 있어서, 상기 β-gal△ω가 서열번호 17에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  50. 제46항에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 c-Met와 결합하는 활성을 갖는 융합 폴리펩티드.
  51. 제46항에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC의 세포질영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  52. 제51항에 있어서, 상기 MERMUC의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC C말단영역의 류신 반복영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  53. 제46항에 있어서, 상기 MERMUC가 인간의 MERMUC인 융합 폴리펩티드.
  54. 제46항에 있어서, 상기 X가 서열번호 15에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
  55. 제46항에 있어서, 상기 W의 다른 단백질이 Fas의 세포외영역을 포함하는 폴리펩티드.
  56. 일반식 Z-Y(Z는 c-Met의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이고, Y는 c-Met 이외의 다른 단백질의 전장 아미노산서열 또는 그의 일부이다.)로 표시되는 융합 폴리펩티드.
  57. 제52항에 있어서, 상기 다른 단백질이 β-gal△α 또는 β-gal△ω인 융합 폴리펩티드.
  58. 제57항에 있어서, 상기 β-gal△α가 서열번호 16에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  59. 제57항에 있어서, 상기 β-gal△ω가 서열번호 17에 나타내어지는 아미노산서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  60. 제56항에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 MERMUC와 결합하는 활성을 갖는 융합 폴리펩티드.
  61. 제56항에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 c-Met의 β사슬 세포질영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  62. 제56항에 있어서, 상기 c-Met의 전장 아미노산서열의 일부가 자기 인산화를 받는 하나 또는 복수의 티로신잔기를 포함하는 c-Met C말단영역의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  63. 제56항에 있어서, 상기 c-Met가 인간의 c-Met인 융합 폴리펩티드.
  64. 제56항에 있어서, 상기 Z가 서열번호 5에 나타내어지는 아미노산서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  65. 어떤 물질의 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
  66. c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 c-Met와 MERMUC의 결합 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
  67. 어떤 물질의 c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서;
    (a) c-Met 및 MERMUC를 함께 발현하고, 상기 c-Met 및 MERMUC가 결합한 경우에 상기 결합을 검출 가능하도록 설계된 세포를 조제하는 공정;
    (b) 공정 (a)에서 얻은 세포를 HGF의 존재하에서 또한 실험 대상물질의 부존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
    (c) 공정 (b)에서 얻은 세포를 HGF 및 실험 대상물질의 존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
    (d) 공정 (b)의 측정결과와 공정 (c)의 측정결과를 비교하는 공정.
  68. 제67항에 있어서, 상기 MERMUC가 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 MERMUC가 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 c-Met가 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  71. 제67항에 있어서, 상기 c-Met가 상기 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  72. c-Met와 MERMUC의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서;
    (a) c-Met 및 MERMUC를 함께 발현하고, 상기 c-Met 및 MERMUC가 결합한 경우에 상기 결합을 검출 가능하도록 설계된 세포를 조제하는 공정;
    (b) 공정 (a)에서 얻은 세포를 HGF의 존재하에서 또한 실험 대상물질의 부존재하에서 배양한 후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
    (c) 공정 (b)에서 얻은 세포를 HGF 및 실험 대상물질의 존재하에서 배양한후, 상기 세포에 있어서의 c-Met 및 MERMUC의 결합 정도를 측정하는 공정;
    (d) 공정 (b)의 측정결과와 공정 (c)의 측정결과를 비교하는 공정.
  73. 제72항에 있어서, 상기 MERMUC가 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 MERMUC가 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  75. 제72항에 있어서, 상기 c-Met가 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  76. 제72항에 있어서, 상기 c-Met가 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드인 방법.
  77. 어떤 물질의 MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성의 유무 또는 정도를 시험하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서 MERMUC 다량체화의 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 MERMUC의 다량체화 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
  78. MERMUC의 다량체화를 저해하는 활성을 갖는 물질을 동정하는 방법으로서, 실험 대상물질의 존재하에서의 MERMUC 다량체화의 유무 또는 정도를, 실험 대상물질의 부존재하에서의 MERMUC의 다량체화 정도와 비교하는 공정을 포함하는 방법.
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