JP3185221B2 - Ｆｋ５０６結合蛋白質を認識するモノクローナル抗体，ｆｋ５０６結合蛋白質の濃度測定法，および測定用キット - Google Patents

Ｆｋ５０６結合蛋白質を認識するモノクローナル抗体，ｆｋ５０６結合蛋白質の濃度測定法，および測定用キット

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正和 小林
一幸 大塚
洋和 田中
峰雄 丹羽
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藤沢薬品工業株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、免疫抑制活性を有するFK506に結合する蛋
白質（FK506結合蛋白質）を認識するモノクローナル抗
体、該FK506結合蛋白質の濃度測定法、およびその測定
用キットに関するものであり、医療の分野で利用でき
る。
「背景技術」 FK506もしくはFR−900506とも表記される化合物は、
強力な免疫抑制作用を有し、臓器移植時の拒絶反応や自
己免疫疾患の予防剤または治療薬として使用しうること
はよく知られている（例えば特開昭61−148181号）。
しかしながら、その作用は、非常に強力であるため、
最適投与量の決定は重要な問題であり、副作用等を発生
させることなく、効果的な免疫抑制活性を発揮させ得る
量を投与することが極めて重要である。
一方、その後の研究により、FK506の免疫抑制作用は
ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼと同様な
活性を有する、細胞内のFK506結合蛋白質（以下、FKBP
と表記）と結合することにより発揮すると考えられてい
る〔例えば、Nature,357,692−694および695−697（199
2）〕。
該FKBPは、その分子量の違いによって数種のタイプが
存在することが知られており、例えばFKBP−12（分子量
12KDa）、FKBP−13（分子量13KDa）、FKBP−25（分子量
25KDa）、FKBP−56（分子量56KDa）、FKBP−80（分子量
80KDa）等が報告され、それぞれの構造も既に決定され
ている。
たとえば、Nature,341,755−757および758−760（198
9）,J.Am.Chem.Soc.113,1409−1411（1991）,Proc.Nat
l.Acad.Sci.88,6229−6233（1991）等参照。
また、分子量11,819ダルトンで107個のアミノ酸から
なるFKBPは遺伝子工学技術を用いて製造する手段も既に
報告されている〔Nature,346,671−674（1990）〕。
一方、それら、FKBPの中でFK506が最も強く結合する
のは、FKBP−12であり、その親和性定数（Kd）は0.4nM
であること、更に、FKBP−12はリンパ球のみならず、赤
血球を含めたあらゆる組織に多く存在していることも報
告されている〔Trans.Proc.23（６）,2760−2762（199
1）〕。
ところで、マウスMLRの系で、FKBP−12を一定量のFK5
06と共に添加すると、添加するFKBP−12の量に比例し
て、FK506の免疫抑制効果が阻害されることにより、血
中にFKBP−12が存在すれば、FK506が血漿中のFKBP−12
に結合され、その免疫抑制効果が血漿中濃度から予想さ
れる程、得られないことになる。手術後などでは、患者
の赤血球が溶血し、赤血球のFKBP−12が血漿中に循環す
ること、及び、患者により感受性に差があることを考え
れば、患者のFK506感受性を推測し、より望ましいFK506
血漿中濃度を設定する為に、血漿中FKBP濃度を正確に測
定する技術の開発が望まれていた。
「発明の開示」 本発明の目的は、FKBPを認識するモノクローナル抗体
を提供すること、及び望ましいFK506血漿中濃度を設定
する為に、血漿中FKBP濃度を正確に測定する方法を提供
すること、さらには、その濃度測定に供する測定用キッ
トを提供することである。
本発明の発明者等は、鋭意研究の結果、FKBPの抗原決
定基を認識し、FKBPとFK506との結合を阻害することの
ないモノクローナル抗体を製造することに成功し、更に
血漿中FKBP濃度を正確に測定する方法、ならびに測定用
キットを確立した。
すなわち、本発明は、FKBP中の抗原決定基を認識し、
FKBPとFK506との結合を阻害することのないモノクロー
ナル抗体、また固定化された該モノクローナル抗体に、
酵素により標識されたFK506及び被験試料中のFKBPを反
応させることから成るFKBP濃度測定法、固定化されたFK
BPに、酵素により標識されたFK506及び被験試料中のFKB
Pを反応させることから成るFKBP濃度測定法、さらに
は、該モノクローナル抗体、FKBP、及び酵素により標識
されたFK506からなるFKBPの濃度を測定するためのキッ
トに関する。
FKBPの抗原決定基を認識し、FKBPとFK506との結合を
阻害することのないモノクローナル抗体（以下、抗FKBP
抗体と表記）は、例えば、ケーラーとミルスタイン（Ko
hler and Milstein）の基本方法〔Nature,256,495（1
975）〕のような常法の細胞融合法より製造することが
できる。
好ましくは、FKBPで免疫したマウスから得られた脾細
胞と、マウス骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドー
マを製造し、その中から後述の実施例１あるいは実施例
２のような方法で、FKBPを認識するがFKBPとFK506との
結合を阻害しないモノクローナル抗体を調製することが
できる。より好ましくは、IgGやIgMのクラスであり、最
も好ましくは、IgG1λやIgG1κのようなサブクラスであ
る。本発明の方法により、特に12kdのFKBPのみと反応す
るか、または12kd及び30〜35kdの両方のFKBPと反応する
抗FKBP抗体が得られる。
本発明におけるFKBP濃度測定法は、抗FKBP抗体を用
い、めざすFKBPのみを選択的に測定する２ステップ法
と、FK506が結合する全てのFKBPを非選択的に測定する
１ステップ法に大別することができる。
２ステップ法においては、１）まず、目的とする種類
のFKBP中の抗原決定基を認識するが、FKBPとFK506との
結合には影響を与えることのない抗FKBP抗体をイムノプ
レートのような固相に、抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）のよう
なIgGを用いて固定化し、２）そして、FKBPを含有する
被験試料（検量線作成の際には段階希釈したFKBP）及び
ペルオキシダーゼ（以下PODと表記）のような酵素で標
識されたFK506〔例えば、後述実施例１のようにして製
造したFK506−C32（LA）−POD〕とを反応させ、３）最
後に、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素水のような
酵素基質溶液を用い、抗FKBP抗体と結合しているFKBPに
促えられている酵素標識FK506の量に応じて観測される
基質の発色の度合いを吸光度測定することにより、FKBP
濃度を知ることが出来る。
一方、１ステップ法において、１）まず、イムノプレ
ートのような固相にFKBP−12のようなFKBPを固定化し、
２）そして、FKBPを含有する被験試料（検量線作成の際
には段階希釈したFKBP）及びFK506−C32（LA）−PODの
ような酵素標識FK506とを反応させ、３）被験試料中のF
KBPと固定化されたFKBPとの競合反応を行わせ、固定化
されたFKBPに促えられている酵素標識FK506が、被験試
料中のFKBPの量に応じて減少する度合いを２ステップ法
のような酵素基質溶液を用いて測定することにより、被
験試料中のFKBP濃度を知ることができる。
尚、この１ステップ法は、酵素標識したFK506が、試
料中の全てのFKBPと反応する為、FK506の活性に影響を
与える被験試料中の全てのFKBP濃度を測定することがで
きるという特徴がある。
また、本発明の抗FKBP抗体は、これとFKBP標準品、お
よび酵素標識したFK506とから成るFKBP濃度測定用キッ
トとし、上記２ステップ法による濃度測定に供すること
ができる。
本発明により、免疫抑制作用の効果に影響を与える血
漿中FKBP濃度を簡便に、より正確に測定することがで
き、FK506の最適投与量を決定する際の重要な判断材料
を提供することが可能となった。
そして、必要に応じ、ある特定のFKBP（例えば、FKBP
−12）のみの濃度を選択的に測定したり、全てのFKBPの
総濃度を測定出来るようになったため、実際の医療の場
で、個々の患者の状態に応じたFK506の投与量をきめこ
まかく設定できるようになった。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 抗FKBP抗体の製造 （１）FKBP−12の製造と特徴 Nature,346,671−674（1990）の中でHarvard大学S.L.
Schreiberらの報告しているDNA sequenceより、FKBP−1
2のＣ−末に相当するDNA 48merをApplied Biosystem社
のDNA synthesizerを使って合成した。
この48−merの末端を25Pでラベルし、プローブとして
CLONTECH社のヒトＴ−cell cDNAライブラリーHL1016b
50万プラークをスクリーニングしたところ、ポジティ
ブプラークを一つ得た。このプラークよりFKBP−12cDNA
を含む断片をサブクローニングした〔pUC−23（E
c）〕。このpUC−23（Ec）をシークエンスしたところ、
Ｎ−末DNAシークエンス１番から32番に相当する部分が
欠損していたので、この部分を補完すると共に、大腸菌
での発現を高くする為に合成したAT rich silent mutan
t N−末DNA約80b.p.とを利用し、EcoR I−BamH I site
として、tryptophan promotorの制御下で発現するプラ
スミドに組み込み、発現ベクターpFKBP333を得た。これ
を、E.coli HB101に形質転換し、発現菌HB101/pFKBP
（AT）311を得た。これを、Ｌ−amp.brothにて19時間培
養し、蛋白合成の誘発は、90μg/ml（final濃度）とな
る様にIAA（Indol−Acrylic acid）を添加することによ
り行った。E.coliを集菌し、50mM Tris−HCl,2mM β−M
E,2mM CaCl3,10mM MgCl2,5％ glycerol中でFrench Pre
ssにて細胞を粉砕し、遠心（４℃,6,000×g,30分）−上
清を60℃,15分間熱処理−遠心（４℃,6,000×g,45分＋
４℃,18,000×g,20分×２回）−透析〔20mM Tris−HCl
（pH7.4）,4℃終夜〕−DEAE−Toyo PEARL 650M−逆相
HPLC（C4）にてFKBP−12を精製した。
（２）FKBP−12のマウスへの免疫 FKBP−12のリン酸緩衝液（以下、PBSと表記）250μg/
ml 0.1mlと等量のFreund's Complete Adjuvant（FCA）
を混合し、マウスBALB/cの腹腔内に免疫した。同量のFK
BP−12をFreund's Incomplete Adjuvant（FIA）と混合
し、および10日毎に数回、腹腔内に免疫した。
（３）血中抗体価の測定 マウス尾静脈より10μｌを採血し、PBS 990μｌと混
合し、測定試料とした。測定に当たっては、10μg/mlの
FKBP−12 PBS溶液50μｌをイムノプレートウェルに加
え、室温３時間反応させ、表面に結合させる。その後、
ウェルを洗浄、0.2％ミルクブロッカーPBSで結合サイト
をブロックし、再び洗浄後、試料希釈血清を加え、室温
下１時間反応させる。anti−mouse IgG（Ｈ＋Ｌ）−POD
〔ベクター（Vector Lab.）社製〕100μl/ウェル添加
し、室温で更に１時間反応させる。洗浄後、常法により
ｏ−フェニレンジアミンの系で発色させた。
（４）抗FKBP−12抗体の産生 抗体価の上昇が見られたマウスに更に最終免疫として
FKBP−12 250μg/ml（PBS）0.2mlを尾静脈から注射し
た。４日後に脾臓を抽出し、脾臓細胞1.44×108cellsを
調整した。一方、マウス骨髄腫細胞P3X63Ag8U.1を2.9×
107cell調整し、50％PEG4000中（最終濃度）で細胞融合
を行った。その後、HAT培地にて24ウェルプレート上、1
06cells/ml×1ml/ウェルで融合細胞のスクリーニングを
行った。２週間後、HAT培地で細胞の成育が確認できた1
44ウェルについて、抗FKBP−12抗体の産生をスクリーニ
ングした。つまり、血中抗体価の測定法において、抗FK
BP−12抗体を含む試料を添加反応させる時に、final5μ
g/mlのFKBP−12を共存させ、FKBP−12存在下での発色が
消失するものを選択した。更にFKBP−12に対して抗体価
の高いクローン32クローンを選択した。
（５）FKBP−12を認識し、FK506,FK506−C32（LA）−PO
DとFKBP−12との結合を阻害しない抗FKBP−12抗体の選
択 固相に抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）を結合させ、更にスク
リーニングの抗体を結合させた後、１μg/mlのFKBP−12
50μｌと下記（６）で得られたFK506−C32（LA）−PO
D（1000倍希釈）50μｌとを共存させ、ｏ−フェニレン
ジアミンとの反応により生じた490nmでの吸光度の上昇
が見られたクローンを選択した。この時、10μg/mlのFK
506を共存させた時の発色の消失により、抗マウスIgG
（Ｈ＋Ｌ）により結合させたFKBP−12はFK506−C32（L
A）−PODのFK506を認識していることが分かる。その結
果、FKBP−12をそのまま抗原として用いた免疫法からは
５種類の抗体（５−１−A5,5−１−B3,5−１−C5,5−２
−D1（IgG1）,5−４−D2）、下記（７）にようにFKBP−
12を尿素で変性させたものを抗原として用いた免疫法か
らはIA4（IgM）,3A8（IgG2）、IF7、3B8、また、下記
（８）のようにFKBP−12をオブアルブミンと結合させた
ものを抗原として用いた免疫法からは4F8の合計７種の
モノクローナル抗体が得られた。
（６）FKBP506−C32（LA）−PODの製造法 特開平１−92659号の実施例１と同様にて得られたコ
ハク酸−FR−90056物質ハーフエステル（230mg）、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミド（35mg）及び１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩（43mg）の塩化メチレン溶液（10ml）を室温下５時間
攪拌した後、反応混合物を水洗し、さらに乾燥した。溶
媒を留去した後、得られた残渣（250mg）を11−アミノ
ウンデカン酸（120mg）及びトリエチルアミン（60mg）
とともにジメチルホルムアミド−水（1:1,20ml）溶媒中
で室温下６時間攪拌した。反応混合物は水洗後乾燥した
上で溶媒を留去し、得られた残渣をクロロホルムを展開
溶媒とするシリカゲルカラムに付し、17−アリル−1,14
−ジヒドロキシ−12−［２−（４−Ｎ−（10−カルボキ
デシル）−（４−アミノ−1,4−ジオキソ−１−ブチル
オキシ））−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチ
ルビニル］−23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラ
メチル−11,28−ジオキサ−４−アザトリシクロ［22.3.
1.04.9］オクタコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオ
ン（120mg）を得た。
NMR（CDCl2,δ）:1.2−1.4（ｍ）,5.9−6.1（1H,m） FAB MASS:1109（Ｍ＋Na）＋ 更に、上記異化合物を用い、特開平１−92659号の実
施例１の３）と同様にしてホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼを反応させることにより、FK506−C32（LA）
−POD溶液を得た。
（７）尿素変性FKBPP12の調製 FKBP−12の0.08％トリフルオロ酢酸含有水溶液（847
μg/ml）460μｌに尿素312mgを添加し、室温下、混合攪
拌し、FKBP−12（600μg/ml）の溶液650μｌを調製し
た。これを、このまま免疫に使用した。
（８）オブアルブミン結合FKBP−12の調製 FKBP−12 1032μｇ（1mg/mlを1032μｌ使用）とオブ
アルブミン（シグマ社、Lot No.76F−8040）のPBS溶液
（2mg/ml）1032μｌを混合する。これに、0.13Mグルタ
ルアルデヒド−PBS溶液0.62mlを滴下する。室温下、14
時間攪拌し、その後、PBS11に対し、３回透析し、これ
を免疫原として使用した。
FKBP−12とオブアルブミンとの混合比率は、FKBP−12
1032μg:オブアルブミン2064μｇで、溶液量は2.7ml
であった。
実施例２ 抗FKBP−12抗体の製造 （１）実施例１の（１）および（２）のようにしてマウ
スに免疫した。
（２）血中抗体価の測定 20μg/mlのFKBPP12のPBS溶液50μｌをELISA用96ウェ
ルプレートの各ウェルに分注し、４℃で一晩放置した。
ウェルのFKBP−12溶液を吸引除去し、0.05％Tween20/PB
S溶液で３回洗浄した。プレートの各ウェルに0.2％ミル
ク/PBS溶液250μｌを加え、室温で30分間放置した。ウ
ェルの0.2％ミルク/PBS溶液を吸引除去し、0.2％ミルク
/0.05％Tween20/PBS溶液で希釈した各抗血清を100μ
ｌ、ウェルに加え、室温で２時間放置した。次いで、ウ
ェルの抗血液希釈液を吸引除去し、0.05％Tween20/PBS
溶液で３回洗浄した。0.2％ミルク/0.05％Tween20/PBS
溶液で1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識
抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）溶液を各ウェルに100μｌ加え、
室温で２時間放置した。ウェルのアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）溶液を吸引除去し、0.0
5％Tween20/PBS溶液で５回洗浄した。その後、0.1mM 4
−methylumbelliferyl phosphate（4MU−P;シグマ社）
の緩衝液（10mMジエタノールアミン/0.5％ MgCl2/H2O）
溶液を各ウェルに100μｌ加え、室温で15分間放置し
た。各ウェルの蛍光強度（Exitation;360nm,Emission;4
60nm）を蛍光プレート・リーダーで測定した。
（３）抗体価の一番強いマウスを選択し、４回目注射の
10日後に最終免疫として、1.5mg/mlのFKBP−12のPBS溶
液0.2mlをマウスの尾静脈から注射した。
（４）細胞融合 実施例１−（４）と同じ方法で細胞融合を行い、ハイ
ブリドーマ（３−３−D4−C6,2C1−87及び3F4−70）を
得た。
（５）抗体の産生と精製 スクリーニング及びクローニングで得られたハイブリ
ドーマ（2C1−87、あるいはハイブリドーマ3F4−70を、
それぞれF75フラスコに５×104個/ml（50ml/F75）にな
るように播種し、４日間培養後、培養液を遠心し、血清
無添加培地で２回洗浄後、それぞれ0.5mlに浮遊させ
た。２週間前に、ブリスタン0.5mlを腹腔内に注射したB
ALB/Cマウス（BALB/C,♀,6週令）の腹腔内へハイブリド
ーマ浮遊液0.5mlを移植した。10日後、マウスを開腹
し、それぞれのマウスから腹水を5ml得た。それぞれの
腹水をアフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（バイ
オ−ラド）にて精製を行い、抗FKBP−12モノクローナル
抗体2C1−87（サブタイプ:IgG1λ）及び3F4−70（サブ
タイプ:IgG1κ）精製抗体を得た。また、ハイブリドー
マ３−３−D4−C6を同様に培養後、抗FKBP−12モノクロ
ーナル抗体３−３−D4−C6（サブタイプ:IgM）を得た。
実施例３ FKBP−12濃度の測定（２ステップ法） イムノプレートに抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）10μg/mlの
溶液をウェル当たり50μｌ加え、４℃で一晩放置した
後、0.05％Tween20−PBSで３回洗浄する。0.2％ミルク
プロッカー−PBS（200μl/ウェル）を室温下１時間作用
させ、結合部分をブロックした後、更に0.2％ミルクブ
ロッカー−0.05％Tween20−PBS（50μl/ウェル）及び実
施例１で得られた抗FKBP−12抗体（５−２−D1−）培養
液（50μl/ウェル）を加え４℃で１晩放置する。これを
0.05％Tween20−PBSで３回洗浄した後、0.05％Tween20
−PBSで段階希釈したFKBP−12（50μl/ウェル）を室温
下、2.5時間反応させる。0.05％Tween20−PBSで３回洗
浄した後、500倍PBSで希釈したFK506−C32（LA）−POD
溶液（50μl/ウェル）を添加し、室温で２時間放置す
る。0.05％Tween20−PBSで５回洗浄した後、常法によ
り、ｏ−ジフェニルアミン／過酸化水素水で発色させ、
FKBP−12の量に応じて、変化する発色の度合いを測定す
る。
上記方法を利用し、段階希釈したFKBP−12の代わりに
正常ヒト血漿を測定したところ、FKBP−12濃度は約100n
g/mlであった。
これは、正常ヒト血漿1mlにFKBP−12を１μｇ添加
し、その回収率を測定する試薬からも、正確であること
が確認された。
実施例４ FKBPの濃度の測定（１ステップ法） イムノプレートにFKBP−12 20μg/mlの溶液をウェル
当たり50μｌ加え、４℃で１晩放置した後、0.05％Twee
n20−PBSで３回洗浄する。１％ゼラチン−PBS 200μｌ
を加え、室温１時間放置した後、0.05％Tween20−PBS
で、１回洗浄する。その後、0.05％Tween20−PBSで段階
希釈したFKBP−12 50μｌと、1000倍PBSで希釈したFK5
06−C32（LA）−POD溶液50μｌを添加し、室温で４時間
反応させる。0.05％Tween20−PBSで５回洗浄した後、通
常のELISAと同様、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水
素水で発色する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/00 - 16/46 C12N 15/06 - 15/08 C12P 21/08 G01N 33/577 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】FK506結合蛋白質中の抗原決定基を認識
    し、FK506結合蛋白質とFK506との結合を阻害することの
    ないモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】FK506結合蛋白質がヒトFKBP−12である請
    求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】固定化された請求の範囲第１項記載のモノ
    クローナル抗体に、酵素により標識されたFK506及び被
    験試料中のFK506結合蛋白質を反応させることから成るF
    K506結合蛋白質濃度測定法。
  4. 【請求項４】請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗
    体、FK506結合蛋白質及び酵素により標識されたFK506か
    らなるFK506結合蛋白質の濃度を測定するためのキッ
    ト。
JP50610194A 1992-08-12 1993-08-11 Ｆｋ５０６結合蛋白質を認識するモノクローナル抗体，ｆｋ５０６結合蛋白質の濃度測定法，および測定用キット Expired - Fee Related JP3185221B2 (ja)

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