JP2564686B2 - 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 - Google Patents
心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、心筋トロポニンＴに対する特異的抗体、そ
の製造方法および心筋壊死判定用の免疫学的試薬に関す
る。
の製造方法および心筋壊死判定用の免疫学的試薬に関す
る。
（従来の技術） 横紋筋の筋原線維は、共同して作用する２種類のタン
パクフィラメントからなっており、厚いフィラメントは
主要成分としてミオシンを有しており、薄いフィラメン
トはアクチン、トロポミオシンおよびトロポニンを含有
している。調節構造タンパクであるトロポニンは、細胞
中で凝集して複合体を形成し、３種類の異なるタンパ
ク： カルシウムイオンと結合するトロポニンＣ（分子量18
000） アクチンと結合するサブ−ユニットである、トロポニ
ンＩ（分子量24000） トロポミオシンと複合するトロポニンＴ（分子量3700
0） からなっている。
パクフィラメントからなっており、厚いフィラメントは
主要成分としてミオシンを有しており、薄いフィラメン
トはアクチン、トロポミオシンおよびトロポニンを含有
している。調節構造タンパクであるトロポニンは、細胞
中で凝集して複合体を形成し、３種類の異なるタンパ
ク： カルシウムイオンと結合するトロポニンＣ（分子量18
000） アクチンと結合するサブ−ユニットである、トロポニ
ンＩ（分子量24000） トロポミオシンと複合するトロポニンＴ（分子量3700
0） からなっている。
この共通する命名は、複合物がそのようなものとして
始めて精製され、単一のタンパクとみなされ、トロポニ
ンと命名されて以来の歴史的な理由を有している。後
に、実際には、トロポニンが３種類の異なるタンパクか
らなっていることが証明されたが、収縮性器官の薄いフ
ィラメント上での各タンパク間の位置関係、および筋肉
収縮の調節に関するそれらの協調性の故に、この命名が
維持された。しかし、それらは、ミオシンまたはアクチ
ンのような収縮性器官の他のタンパクに機能的に関連し
ているが、異なるアミノ酸配列を有する３種類の異なる
タンパクである。
始めて精製され、単一のタンパクとみなされ、トロポニ
ンと命名されて以来の歴史的な理由を有している。後
に、実際には、トロポニンが３種類の異なるタンパクか
らなっていることが証明されたが、収縮性器官の薄いフ
ィラメント上での各タンパク間の位置関係、および筋肉
収縮の調節に関するそれらの協調性の故に、この命名が
維持された。しかし、それらは、ミオシンまたはアクチ
ンのような収縮性器官の他のタンパクに機能的に関連し
ているが、異なるアミノ酸配列を有する３種類の異なる
タンパクである。
重篤な虚血または筋肉細胞壊死が長く続くと、トロポ
ニンＩは血漿に達し、従って、トロポニンＩはそのよう
な疾患のパラメーターであり、既知の梗塞形成酵素CK、
CK−MB、GOTおよびLDHと同様に診断や、モニターに使用
することができる。
ニンＩは血漿に達し、従って、トロポニンＩはそのよう
な疾患のパラメーターであり、既知の梗塞形成酵素CK、
CK−MB、GOTおよびLDHと同様に診断や、モニターに使用
することができる。
しかし、CKおよびCK−MBの測定は梗塞に対して全く特
異的ではなく、梗塞の80〜90時間後に血清中で増加する
にすぎないことが証明されている。また、GOTおよびLDH
も、量の増加が多くの他の疾患においても血液中に見ら
れるが故に心筋に対して特異的ではない。
異的ではなく、梗塞の80〜90時間後に血清中で増加する
にすぎないことが証明されている。また、GOTおよびLDH
も、量の増加が多くの他の疾患においても血液中に見ら
れるが故に心筋に対して特異的ではない。
心臓トロポニンＩの測定の欠点は、通常、血清が既に
トロポニンＩを10ng/mlの濃度で含有していることであ
る［ビー・カミンズ（B.Cummins）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・アンド・セルーラー・カージオロジー
（J.Mol.Cell.Card.）19（1987）、999−1010およびビ
ー・カミンズ（B.Cummins）、クリニカル・アンド・イ
ンベスティゲイティブ・メディスン（Clin.Invest.）11
3（1987）1333−1344参照］。そのため、壁内梗塞にお
いて２相の血清濃度が生じる。平均すると、急性壁内梗
塞を有する37人の患者において、疼痛開始の後、４時間
目から168時間目までトロポニンＩが増加した。動物モ
デルにおいても、同様の結果が得られた。かくして、ト
ロポニンＩについて、梗塞発生の後の10時間目から50時
間目が絶対的診断感度（absolute diagnostic sensitiv
ity）の時間となると考えられる。すなわち、感度の制
約とは別に、トロポニンＩの血清レベルが変化するた
め、梗塞発生の後の10日間またはそれ以上の臨床上重要
なモニターはトロポニンＩの測定によって行うことはで
きない。
トロポニンＩを10ng/mlの濃度で含有していることであ
る［ビー・カミンズ（B.Cummins）、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・アンド・セルーラー・カージオロジー
（J.Mol.Cell.Card.）19（1987）、999−1010およびビ
ー・カミンズ（B.Cummins）、クリニカル・アンド・イ
ンベスティゲイティブ・メディスン（Clin.Invest.）11
3（1987）1333−1344参照］。そのため、壁内梗塞にお
いて２相の血清濃度が生じる。平均すると、急性壁内梗
塞を有する37人の患者において、疼痛開始の後、４時間
目から168時間目までトロポニンＩが増加した。動物モ
デルにおいても、同様の結果が得られた。かくして、ト
ロポニンＩについて、梗塞発生の後の10時間目から50時
間目が絶対的診断感度（absolute diagnostic sensitiv
ity）の時間となると考えられる。すなわち、感度の制
約とは別に、トロポニンＩの血清レベルが変化するた
め、梗塞発生の後の10日間またはそれ以上の臨床上重要
なモニターはトロポニンＩの測定によって行うことはで
きない。
（発明が解決しようとする課題） したがって、本発明の目的は、これらの欠点を解消
し、心筋梗塞および心筋に対する他の損傷において少な
くとも150時間（絶対的診断感度の持続）モニターが可
能な測定方法を提供することである。
し、心筋梗塞および心筋に対する他の損傷において少な
くとも150時間（絶対的診断感度の持続）モニターが可
能な測定方法を提供することである。
（課題を解決するための手段） この目的は心筋トロポニンＴ（以下、単にトロポニン
Ｔと称することもある）に対する少なくとも１つの抗体
およびトロポニンＴまたは該抗体の結合相手Ｂと一緒に
血清または血漿試料をインキュベートし、それによっ
て、トロポニンＴに対する抗体または結合相手Ｂのいず
れかを測定可能な基で標識し、こうして生成する測定可
能な基を含有する免疫学的複合体を単離し、単離した相
または残りの相中の該測定可能な基を試料由来のトロポ
ニンＴの尺度として測定することを特徴とする免疫検定
法による心筋壊死の判定方法によって達成される。
Ｔと称することもある）に対する少なくとも１つの抗体
およびトロポニンＴまたは該抗体の結合相手Ｂと一緒に
血清または血漿試料をインキュベートし、それによっ
て、トロポニンＴに対する抗体または結合相手Ｂのいず
れかを測定可能な基で標識し、こうして生成する測定可
能な基を含有する免疫学的複合体を単離し、単離した相
または残りの相中の該測定可能な基を試料由来のトロポ
ニンＴの尺度として測定することを特徴とする免疫検定
法による心筋壊死の判定方法によって達成される。
結合相手Ｂは、トロポニンＴに対する抗体またはトロ
ポニンＴと結合しなければならない。結合相手Ｂは、例
えば、トロポニンＴに対する第２の抗体またはヒトもし
くは動物由来のトロポニンＴ、または抗体によって結合
されるそれらの類似物であってもよい。
ポニンＴと結合しなければならない。結合相手Ｂは、例
えば、トロポニンＴに対する第２の抗体またはヒトもし
くは動物由来のトロポニンＴ、または抗体によって結合
されるそれらの類似物であってもよい。
試料は、トロポニンＴに対する抗体およびトロポニン
Ｔに対する別の抗体と測定可能な基とのコンジュゲート
（結合体）と一緒にインキュベートするのが好ましく、
形成された免疫学的複合体を相分離によって単離し、い
ずれか一方の相中の該測定可能な基を測定する。
Ｔに対する別の抗体と測定可能な基とのコンジュゲート
（結合体）と一緒にインキュベートするのが好ましく、
形成された免疫学的複合体を相分離によって単離し、い
ずれか一方の相中の該測定可能な基を測定する。
さらに、トロポニンＴに対する抗体およびトロポニン
Ｔと測定可能な基とのコンジュゲートと共に試料をイン
キュベートし、形成された免疫学的複合体を相の分離に
よって単離し、いずれか一方の相中の該測定可能な基を
測定することが好ましい。
Ｔと測定可能な基とのコンジュゲートと共に試料をイン
キュベートし、形成された免疫学的複合体を相の分離に
よって単離し、いずれか一方の相中の該測定可能な基を
測定することが好ましい。
驚くべきことに、心筋壊死（例えば、心筋梗塞、虚血
または狭心症などによる）の判定においては、トロポニ
ンＴ免疫検定法によるほうが、CK、CK−MB、GOT、LDHま
たはトロポニンＩのような他のパラメーターの測定によ
るよりも有意に高い感度が得られることがわかった。本
発明者らにより確証されたように、この理由は、収縮性
器官の他のタンパクとは異なり、試験の検出限界（0.25
ng/ml）までのトロポニンＴの血清濃度を測定するもの
ではないからである。
または狭心症などによる）の判定においては、トロポニ
ンＴ免疫検定法によるほうが、CK、CK−MB、GOT、LDHま
たはトロポニンＩのような他のパラメーターの測定によ
るよりも有意に高い感度が得られることがわかった。本
発明者らにより確証されたように、この理由は、収縮性
器官の他のタンパクとは異なり、試験の検出限界（0.25
ng/ml）までのトロポニンＴの血清濃度を測定するもの
ではないからである。
このことは、トロポニン類間の機能的な関係からトロ
ポニンＩの血清濃度と同様の血清濃度がトロポニンＴに
対して予想されているところからすれば、非常に驚くべ
きことである。さらに、トロポニンＴの血清濃度曲線
は、例えば、壁内梗塞において、トロポニンＩの曲線と
は有意に異なっている。トロポニンＩと異なり、経時変
化の曲線は、２相の代わりに３相となり、トロポニンＴ
は、疼痛開始の300時間後まで平均して増加することが
判明している。絶対的診断感度の時間は６時間目から19
5時間目まで持続する。かくして、絶対的診断感度の時
間は、トロポニンＩについて知られている時間のほぼ４
倍である。
ポニンＩの血清濃度と同様の血清濃度がトロポニンＴに
対して予想されているところからすれば、非常に驚くべ
きことである。さらに、トロポニンＴの血清濃度曲線
は、例えば、壁内梗塞において、トロポニンＩの曲線と
は有意に異なっている。トロポニンＩと異なり、経時変
化の曲線は、２相の代わりに３相となり、トロポニンＴ
は、疼痛開始の300時間後まで平均して増加することが
判明している。絶対的診断感度の時間は６時間目から19
5時間目まで持続する。かくして、絶対的診断感度の時
間は、トロポニンＩについて知られている時間のほぼ４
倍である。
ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、蛍光免疫検
定法等のような全ての通常の免疫検定法は、基本的にこ
のような免疫決定法に適している。さらに、これらの方
法の変法（例えば、競合免疫検定法、IEMA法等）の全て
が適用される。サンドウィッチ試験が、トロポニンＴの
測定に特に有効であることが証明された。この試験方法
では、トロポニンＴに対する固定化抗体およびトロポニ
ンＴに対する抗体と測定可能な基とのコンジュゲートを
使用する。この試験法の様々な変形およびこれらの方法
の実施に関する詳細は、文献に充分に記載されている。
しかし、例えば、ドイツ特許出願DE−A3834766および／
またはDE−A3822750に記載されているような他の免疫学
的測定法も本発明に係る抗体を用いることができる。
定法等のような全ての通常の免疫検定法は、基本的にこ
のような免疫決定法に適している。さらに、これらの方
法の変法（例えば、競合免疫検定法、IEMA法等）の全て
が適用される。サンドウィッチ試験が、トロポニンＴの
測定に特に有効であることが証明された。この試験方法
では、トロポニンＴに対する固定化抗体およびトロポニ
ンＴに対する抗体と測定可能な基とのコンジュゲートを
使用する。この試験法の様々な変形およびこれらの方法
の実施に関する詳細は、文献に充分に記載されている。
しかし、例えば、ドイツ特許出願DE−A3834766および／
またはDE−A3822750に記載されているような他の免疫学
的測定法も本発明に係る抗体を用いることができる。
本発明においては、抗体には、完全抗体、キメラ抗
体、二価抗体およびそれらのフラグメントが包含され
る。使用されるトロポニンＴに対する抗体は、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナルであってよい。好ましく
は、モノクローナル抗体が使用される。
体、二価抗体およびそれらのフラグメントが包含され
る。使用されるトロポニンＴに対する抗体は、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナルであってよい。好ましく
は、モノクローナル抗体が使用される。
サンドウイッチ試験において、好ましい具体例とし
て、トロポニンＴに対する少なくとも２つの抗体を試料
溶液と共にインキュベートする。これによって、第１の
抗体は固相との結合を仲介する。このために、この抗体
は、直接またはスペーサーを介して固相と結合するか、
または可溶性の形態で存在して免疫学的反応が行われた
後にだけ、固定化することができ得る。第２の抗体は、
ある種の基で直接標識化するか、または機能的結合によ
って測定可能な基と結合することができる。このため
に、該抗体は、特異的結合対の一方と結合することがで
き、該測定可能な基は特異的結合対の他方と結合するこ
とができる。第２の抗体および測定可能な基を含有する
複合体が、反応の間に形成される。第１の抗体の担体へ
の結合（固定化）は、公知の方法に従って、吸着、化学
結合または特異的結合対を介する機能的な結合によって
行われる。この場合、結合対の一方は固定化されるが、
他方は、抗体と化学的に結合する。次に、結合対を介し
て免疫学的測定反応の前またはその間に抗体を固定化す
ることができる。このような結合対の例としては、ビオ
チンストレプトアビジン／アビジン、ハプテン−抗体、
抗原−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結合タンパクが
挙げられる。
て、トロポニンＴに対する少なくとも２つの抗体を試料
溶液と共にインキュベートする。これによって、第１の
抗体は固相との結合を仲介する。このために、この抗体
は、直接またはスペーサーを介して固相と結合するか、
または可溶性の形態で存在して免疫学的反応が行われた
後にだけ、固定化することができ得る。第２の抗体は、
ある種の基で直接標識化するか、または機能的結合によ
って測定可能な基と結合することができる。このため
に、該抗体は、特異的結合対の一方と結合することがで
き、該測定可能な基は特異的結合対の他方と結合するこ
とができる。第２の抗体および測定可能な基を含有する
複合体が、反応の間に形成される。第１の抗体の担体へ
の結合（固定化）は、公知の方法に従って、吸着、化学
結合または特異的結合対を介する機能的な結合によって
行われる。この場合、結合対の一方は固定化されるが、
他方は、抗体と化学的に結合する。次に、結合対を介し
て免疫学的測定反応の前またはその間に抗体を固定化す
ることができる。このような結合対の例としては、ビオ
チンストレプトアビジン／アビジン、ハプテン−抗体、
抗原−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結合タンパクが
挙げられる。
競合試験は、該試験のさらに好ましい変形例である。
この場合、測定の前またはその間に固定化されるトロポ
ニンＴに対する抗体、およびトロポニンＴと測定可能な
基とのコンジュゲートが使用される。
この場合、測定の前またはその間に固定化されるトロポ
ニンＴに対する抗体、およびトロポニンＴと測定可能な
基とのコンジュゲートが使用される。
本発明に係る抗体の固定化またはトロポニンＴの固定
化のための担体、例えば、チューブ、プラスチック製キ
ュベット、微量滴定プレート、ビーズまたはプラスチッ
ク製微小担体の材料として、ポリスチレン、ビニルポリ
マー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、多糖類、シ
リコーン、ゴムもしくは処理ガラスのような材料を使用
することができる［例えば、イー・ティー・マギオ（E.
T.Maggio）、“エンザイム・イムノアッセイ”（Enzyme
Immunoassay）、シー・エー・シー・プレス、フロリダ
（1980）、特に第175−178頁;EP−Ａ−063064;バイオエ
ンジニアリング（Bioengineering）16（1974）、997−1
003;シー・ジェイ・センダーソン（C.J.Senderson）お
よびディー・ブイ・ウィルソン（D.V.Wilson）、イムノ
ロジー（Immunology）20（1971）、1061−1065参照］。
特に、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された
担体材料、とりわけポリスチレンが使用され、好ましく
は、EP−Ａ−0269092に記載された方法に従って調製さ
れる。同様に、結合相手ＢはトロポニンＴもしくはその
類似物またはトロポニンＴと特異的に結合できるモノク
ローナル抗体のいずれかを含んでおり、標識化される。
個々の測定方法のための通常の試薬が標識化に好適であ
る。すなわち、ラジオイムノアッセイでは、標識化のた
めに57Coのような放射性同位元素が使用される。酵素−
免疫検定法法に一般的に使用される全酵素が適してお
り、例えば、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダ
ーゼが適している。通常の蛍光性の基は、蛍光免疫検定
法のための標識として好適である。これら様々な試験法
の詳細および該方法の変法は公知である。トロポニンＴ
または抗体と標識との結合は、固相との結合と類似の方
法で、すなわち共有的にまたは特異的結合対を介して行
うことができる。
化のための担体、例えば、チューブ、プラスチック製キ
ュベット、微量滴定プレート、ビーズまたはプラスチッ
ク製微小担体の材料として、ポリスチレン、ビニルポリ
マー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、多糖類、シ
リコーン、ゴムもしくは処理ガラスのような材料を使用
することができる［例えば、イー・ティー・マギオ（E.
T.Maggio）、“エンザイム・イムノアッセイ”（Enzyme
Immunoassay）、シー・エー・シー・プレス、フロリダ
（1980）、特に第175−178頁;EP−Ａ−063064;バイオエ
ンジニアリング（Bioengineering）16（1974）、997−1
003;シー・ジェイ・センダーソン（C.J.Senderson）お
よびディー・ブイ・ウィルソン（D.V.Wilson）、イムノ
ロジー（Immunology）20（1971）、1061−1065参照］。
特に、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された
担体材料、とりわけポリスチレンが使用され、好ましく
は、EP−Ａ−0269092に記載された方法に従って調製さ
れる。同様に、結合相手ＢはトロポニンＴもしくはその
類似物またはトロポニンＴと特異的に結合できるモノク
ローナル抗体のいずれかを含んでおり、標識化される。
個々の測定方法のための通常の試薬が標識化に好適であ
る。すなわち、ラジオイムノアッセイでは、標識化のた
めに57Coのような放射性同位元素が使用される。酵素−
免疫検定法法に一般的に使用される全酵素が適してお
り、例えば、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダ
ーゼが適している。通常の蛍光性の基は、蛍光免疫検定
法のための標識として好適である。これら様々な試験法
の詳細および該方法の変法は公知である。トロポニンＴ
または抗体と標識との結合は、固相との結合と類似の方
法で、すなわち共有的にまたは特異的結合対を介して行
うことができる。
抗体またはトロポニンＴは、公知の方法に従って、前
記の結合相手のうちの一方と、例えば、カルボジイミド
およびヒドロキシスクシンイミドを介して、共有結合さ
せる。
記の結合相手のうちの一方と、例えば、カルボジイミド
およびヒドロキシスクシンイミドを介して、共有結合さ
せる。
酵素標識としてペルオキシダーゼ（POD）を用いるの
が好ましい。
が好ましい。
本発明の態様は、ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反
応が５％未満であり、トロポニンＩおよび他の筋原線維
タンパクとの交差反応が２％未満である、心筋トロポニ
ンＴと特異的に結合できるポリクローナル抗体の製造方
法を提供するものである。この方法は、試験動物、好ま
しくはヒツジを、数カ月（好ましくは４〜６カ月）かけ
て、４〜６週間おきに少なくとも４回ヒト心筋トロポニ
ンＴおよびアジュバントで免疫化し、生の血清を単離
し、それを免疫吸着的に精製することからなる。
応が５％未満であり、トロポニンＩおよび他の筋原線維
タンパクとの交差反応が２％未満である、心筋トロポニ
ンＴと特異的に結合できるポリクローナル抗体の製造方
法を提供するものである。この方法は、試験動物、好ま
しくはヒツジを、数カ月（好ましくは４〜６カ月）かけ
て、４〜６週間おきに少なくとも４回ヒト心筋トロポニ
ンＴおよびアジュバントで免疫化し、生の血清を単離
し、それを免疫吸着的に精製することからなる。
さらに、本発明のもう１つの態様は、ヒト骨格筋トロ
ポニンＴとの交差反応が５％未満であり、トロポニンＩ
および他の筋原線維との交差反応が２％未満である、心
筋トロポニンＴと特異的に結合できるモノクローナル抗
体の製造方法を提供するものである。この方法は、試験
動物、好ましくは近親交配させたマウスを、数カ月かけ
て、４〜６週間おきに少なくとも４回、ヒト心筋トロポ
ニンＴおよびアジュバントで腹腔内的に免疫化し、Ｂリ
ンパ球を単離し、永久骨髄腫セルライン（細胞系統）と
融合し、クローンを単離し、それらから抗体を単離する
ことを特徴とする。
ポニンＴとの交差反応が５％未満であり、トロポニンＩ
および他の筋原線維との交差反応が２％未満である、心
筋トロポニンＴと特異的に結合できるモノクローナル抗
体の製造方法を提供するものである。この方法は、試験
動物、好ましくは近親交配させたマウスを、数カ月かけ
て、４〜６週間おきに少なくとも４回、ヒト心筋トロポ
ニンＴおよびアジュバントで腹腔内的に免疫化し、Ｂリ
ンパ球を単離し、永久骨髄腫セルライン（細胞系統）と
融合し、クローンを単離し、それらから抗体を単離する
ことを特徴とする。
好ましくは、水酸化アルミニウムおよびボルダテラ・
ペルツシス（Bordatella pertussis）またはフロイント
アジュバントをアジュバントとして使用する。
ペルツシス（Bordatella pertussis）またはフロイント
アジュバントをアジュバントとして使用する。
よく知られたケーラー（Ｋhler）およびミルスタイ
ン（Milstein）［ネイチャー（Nature）256（1975）、4
95−497］の方法に従って、融合の間に得られるハイブ
リッド細胞の１次培養を、通常の方法で、例えば市販の
細胞ソーターを用いて、または“限界希釈（limiting d
ilution）”によって、クローンする。これらの培養を
さらに用いて、単離した心筋トロポニンＴおよび患者の
血清中の心筋トロポニンＴと陽性に反応させ、骨格筋か
ら得たトロポニンＴと陰性に反応させる。このようにし
て得られたハイブリドーマセルラインが本発明のモノク
ローナル抗体を生成する。公知の方法に従って、これら
のセルラインを培養することができ、それらから生成し
たモノクローナル抗体を単離することができる。
ン（Milstein）［ネイチャー（Nature）256（1975）、4
95−497］の方法に従って、融合の間に得られるハイブ
リッド細胞の１次培養を、通常の方法で、例えば市販の
細胞ソーターを用いて、または“限界希釈（limiting d
ilution）”によって、クローンする。これらの培養を
さらに用いて、単離した心筋トロポニンＴおよび患者の
血清中の心筋トロポニンＴと陽性に反応させ、骨格筋か
ら得たトロポニンＴと陰性に反応させる。このようにし
て得られたハイブリドーマセルラインが本発明のモノク
ローナル抗体を生成する。公知の方法に従って、これら
のセルラインを培養することができ、それらから生成し
たモノクローナル抗体を単離することができる。
この方法で得たハイブリドーマセルラインの例として
は、クローン7.1A12.2−22（ECACC89060901）およびク
ローン8.1F6.7−２（ECACC89030308）が挙げられる。該
セルラインは、ヨーロピアン・コレクション・オブ・ア
ニマル・セル・カルチャーズ（European Collection of
Animal Cell Cultures）（イギリス）に各々引用した
番号の下に寄託されている。
は、クローン7.1A12.2−22（ECACC89060901）およびク
ローン8.1F6.7−２（ECACC89030308）が挙げられる。該
セルラインは、ヨーロピアン・コレクション・オブ・ア
ニマル・セル・カルチャーズ（European Collection of
Animal Cell Cultures）（イギリス）に各々引用した
番号の下に寄託されている。
このようにして得たポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体は、ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差
反応性が低く、５％未満であり、好ましくは２％未満で
あること、およびトロポニンＩおよび他の筋原線維タン
パクとの交差反応性が２％未満であることによって区別
される。
ローナル抗体は、ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差
反応性が低く、５％未満であり、好ましくは２％未満で
あること、およびトロポニンＩおよび他の筋原線維タン
パクとの交差反応性が２％未満であることによって区別
される。
本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体は、血清または血漿のような試料において心筋壊死の
特異的測定に特に適している。抗体は、そのままでこれ
らの測定法用としては、またはキメラ抗体またはそのフ
ラグメント、例えば、対応する免疫学的性質を有するFa
bフラグメントとして用いることができる。かくして、
「抗体」なる用語は、完全抗体およびそのフラグメント
を包含する。
体は、血清または血漿のような試料において心筋壊死の
特異的測定に特に適している。抗体は、そのままでこれ
らの測定法用としては、またはキメラ抗体またはそのフ
ラグメント、例えば、対応する免疫学的性質を有するFa
bフラグメントとして用いることができる。かくして、
「抗体」なる用語は、完全抗体およびそのフラグメント
を包含する。
（実施例） 以下の実施例および添付の図面によって、本発明を説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。パ
ーセントは、重量％を意味する。
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。パ
ーセントは、重量％を意味する。
実施例１ トロポニンＴの単離 緩衝液1: 0.05モル／トリス（Tris）/HCl、pH7.0 0.05モル／KCl 10ml/トリトン（Triton）X100 ２ミリモル／EDTA 0.5ミリモル／DTT（ジチオトレイトール） 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） ２ミリモル／PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニ
ル） ５ミリモル／アミノカプロン酸 2.5ml/トラジロール（Trasylol）／ 0.2mgペプスタチン（Pepstatin） 緩衝液2: 0.05モル／トリス/HCl、pH7.0 １モル／KCl ５モル／尿素 ２ミリモル／EDTA 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 緩衝液3: ５ミリモル／リン酸カリウム、pH7.3 ２モル／尿素 0.6モル／KCl 0.5ミリモル／DTT 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 緩衝液4: 0.05モル／トリス/HCl、pH7.8 ６モル／尿素 0.01モル／NaCl ２ミリモル／EDTA 0.5ミリモル／DTT 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 組織（弁および血管を除いた左心室）300gを小片に切
り刻み、４℃で最高１分間、４容量倍の緩衝液１中にお
いてミキサーで断続的にホモジナイズした。４℃で15分
間、27500gで不溶性成分を遠心分離し、上清が完全に透
明になるまでペレットを１の緩衝液１で洗浄した。
ル） ５ミリモル／アミノカプロン酸 2.5ml/トラジロール（Trasylol）／ 0.2mgペプスタチン（Pepstatin） 緩衝液2: 0.05モル／トリス/HCl、pH7.0 １モル／KCl ５モル／尿素 ２ミリモル／EDTA 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 緩衝液3: ５ミリモル／リン酸カリウム、pH7.3 ２モル／尿素 0.6モル／KCl 0.5ミリモル／DTT 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 緩衝液4: 0.05モル／トリス/HCl、pH7.8 ６モル／尿素 0.01モル／NaCl ２ミリモル／EDTA 0.5ミリモル／DTT 0.02％アジ化ナトリウム（w/v） 組織（弁および血管を除いた左心室）300gを小片に切
り刻み、４℃で最高１分間、４容量倍の緩衝液１中にお
いてミキサーで断続的にホモジナイズした。４℃で15分
間、27500gで不溶性成分を遠心分離し、上清が完全に透
明になるまでペレットを１の緩衝液１で洗浄した。
このペレットを、５〜６容量倍の緩衝液２に取り、４
℃で３〜４時間攪拌した。これを４℃で15分間、27500g
で遠心分離した。
℃で３〜４時間攪拌した。これを４℃で15分間、27500g
で遠心分離した。
５ミリモル／ATPを上清に添加し（硫酸アンモニウ
ムの添加後の最終濃度）、４℃の硫酸アンモニウム飽和
水溶液/2ミリモル／EDTAの添加によって、35％硫酸ア
ンモニウムにした。硫酸アンモニウム溶液は予めKOHで
中和しておいた。ゆっくりと攪拌しながら、４℃で一晩
インキュベートした。その後、４℃で20分間、27500gで
沈澱物を遠心分離した。
ムの添加後の最終濃度）、４℃の硫酸アンモニウム飽和
水溶液/2ミリモル／EDTAの添加によって、35％硫酸ア
ンモニウムにした。硫酸アンモニウム溶液は予めKOHで
中和しておいた。ゆっくりと攪拌しながら、４℃で一晩
インキュベートした。その後、４℃で20分間、27500gで
沈澱物を遠心分離した。
上清に固形の硫酸アンモニウムを添加して硫酸アンモ
ニウム45％飽和にし、４℃で45分間攪拌し、遠心分離し
た。35〜45％硫酸アンモニウム沈澱物は、トロポニンＴ
を含有しており、さらに処理した。ペレットを25mlの緩
衝液３にとり（OD280nmは1.5〜２である）、４℃で緩衝
液３に対して透析し、その間に緩衝液を少なくとも２回
替えた。
ニウム45％飽和にし、４℃で45分間攪拌し、遠心分離し
た。35〜45％硫酸アンモニウム沈澱物は、トロポニンＴ
を含有しており、さらに処理した。ペレットを25mlの緩
衝液３にとり（OD280nmは1.5〜２である）、４℃で緩衝
液３に対して透析し、その間に緩衝液を少なくとも２回
替えた。
透析した溶液をヒドロキシルアパタイトカラムにかけ
［バイオゲル・エイチ・ティー・ピー（Biogel HTP）、
約25mgタンパク/50mlカラム容量、流速:1カラム容量／
時間で負荷した］、４〜５カラム容量倍の緩衝液３で再
洗浄し、緩衝液３中５ミリモル／〜55ミリモル／の
リン酸カリウム勾配液で、１カラム容量倍／時で20時間
以内に溶離した。トロポニンＴを含有する画分をSDS−P
AGE（ゲル勾配５〜25％）を用いて測定し、プールし、
緩衝液４に対して透析した。
［バイオゲル・エイチ・ティー・ピー（Biogel HTP）、
約25mgタンパク/50mlカラム容量、流速:1カラム容量／
時間で負荷した］、４〜５カラム容量倍の緩衝液３で再
洗浄し、緩衝液３中５ミリモル／〜55ミリモル／の
リン酸カリウム勾配液で、１カラム容量倍／時で20時間
以内に溶離した。トロポニンＴを含有する画分をSDS−P
AGE（ゲル勾配５〜25％）を用いて測定し、プールし、
緩衝液４に対して透析した。
透析した溶液をカラムにかけ［デイ・イー・エー・イ
ー−サーバセル（DEAE−Servacel）SS23、カラム容量20
〜30ml、流速:1カラム容量／時］、３カラム容量倍の緩
衝液４で再洗浄し、緩衝液４中0.01モル／〜0.25モル
／のNaCl勾配液で、１カラム容量倍／時で20時間以内
に溶離した。溶出液中にトロポニンＩが見られた。トロ
ポニンＴおよびトロポニンＣは別々に溶出した。SDS−P
AGEに従って、トロポニンＴを含有する画分を集め、緩
衝液４に対して再透析し、後の使用のために−20℃で凍
結させた。筋肉300gからトロポニンＴ約６〜8mgが得ら
れた。
ー−サーバセル（DEAE−Servacel）SS23、カラム容量20
〜30ml、流速:1カラム容量／時］、３カラム容量倍の緩
衝液４で再洗浄し、緩衝液４中0.01モル／〜0.25モル
／のNaCl勾配液で、１カラム容量倍／時で20時間以内
に溶離した。溶出液中にトロポニンＩが見られた。トロ
ポニンＴおよびトロポニンＣは別々に溶出した。SDS−P
AGEに従って、トロポニンＴを含有する画分を集め、緩
衝液４に対して再透析し、後の使用のために−20℃で凍
結させた。筋肉300gからトロポニンＴ約６〜8mgが得ら
れた。
実施例２ ヒトトロポニンＴに対するモノクローナル抗体の単離 ８〜12週齢のBalb/cマウスを、フロイント安全アジュ
バントと一緒にトロポニンＴ（実施例１に従ってヒト心
筋から単離した）100μｇで腹腔内投与により免疫し
た。６週間後、４週間おきにさらに３回、各50μｇのト
ロポニンＴで免疫し、水酸化アルミニウムに吸着させ、
ボルダテラ・ペルツシスを腹腔内投与した。
バントと一緒にトロポニンＴ（実施例１に従ってヒト心
筋から単離した）100μｇで腹腔内投与により免疫し
た。６週間後、４週間おきにさらに３回、各50μｇのト
ロポニンＴで免疫し、水酸化アルミニウムに吸着させ、
ボルダテラ・ペルツシスを腹腔内投与した。
最後の免疫の１週間後に、血液試料を採取し、試験動
物の血清中の抗体力価を測定した。
物の血清中の抗体力価を測定した。
免疫が陽性であれば、融合を行う。融合の４日、３日
および２日前に、それらを、各々、PBS（リン酸塩緩衝
化食塩水）中トロポニンT100μｇで静脈内投与により再
度免疫した。
および２日前に、それらを、各々、PBS（リン酸塩緩衝
化食塩水）中トロポニンT100μｇで静脈内投与により再
度免疫した。
融合のために、免疫したマウスの１×108脾臓細胞
を、ガルフレ（Galfre）［エンザイモロジー（Enzymolo
gy）、73、1981、p.3の方法］に従って２×107骨髄腫細
胞（P3x63Ag8−653、ATCC−CRL8375）と混合し、その
後、10分間遠心分離した（300g、４℃）。細胞を血清不
含培地で洗浄し、400gで再度遠心分離した。上清を吸引
し、細胞沈殿物に50％PEG溶液［分子量4000、メルク・
カンパニー（Merck Company）］1mlを添加した。その
後、室温で15分間のうちに、胎児ウシ血清（FCS）を含
まないRPMI1640培地［RPMI＝ローズウェル・パーカー・
メモリー・インスティチュート（Rosewell Parker Memo
ry Institute）］を用いて、ゆっくりと20mlに希釈し
た。その後、細胞懸濁液を400gで10分間遠心分離し、細
胞沈降物を選択培地（RPMI1640、10％FCS、100ミリモル
／ヒポキサンチン、1mg/mlアザセリン）に取った。成
長因子に関しては、供給細胞の代わりとしてHECS［ヒト
内皮培養上清（Human Endothelial Culture Supernatan
t）］［コウスター、カンパニー（Costar Company）、N
o.6110］を用いた。
を、ガルフレ（Galfre）［エンザイモロジー（Enzymolo
gy）、73、1981、p.3の方法］に従って２×107骨髄腫細
胞（P3x63Ag8−653、ATCC−CRL8375）と混合し、その
後、10分間遠心分離した（300g、４℃）。細胞を血清不
含培地で洗浄し、400gで再度遠心分離した。上清を吸引
し、細胞沈殿物に50％PEG溶液［分子量4000、メルク・
カンパニー（Merck Company）］1mlを添加した。その
後、室温で15分間のうちに、胎児ウシ血清（FCS）を含
まないRPMI1640培地［RPMI＝ローズウェル・パーカー・
メモリー・インスティチュート（Rosewell Parker Memo
ry Institute）］を用いて、ゆっくりと20mlに希釈し
た。その後、細胞懸濁液を400gで10分間遠心分離し、細
胞沈降物を選択培地（RPMI1640、10％FCS、100ミリモル
／ヒポキサンチン、1mg/mlアザセリン）に取った。成
長因子に関しては、供給細胞の代わりとしてHECS［ヒト
内皮培養上清（Human Endothelial Culture Supernatan
t）］［コウスター、カンパニー（Costar Company）、N
o.6110］を用いた。
ウエル当たり５×104細胞で24ウエルプレート［ナン
ク・カンパニー（Nunc Company）］上に融合細胞を撒い
た。７〜10日後にクローンの成長が肉眼で見られた。実
施例３に記載のELISA法によって、１次培養の培養上澄
液を試験した。抗原−特異的な抗体を含有する１次培養
を、96ウエル細胞培養プレート（ナンク・カンパニー）
上で蛍光活性化細胞ソーターを用いてさらにクローンし
た。供給細胞の代わりとしてHECSを用いた（前記参
照）。
ク・カンパニー（Nunc Company）］上に融合細胞を撒い
た。７〜10日後にクローンの成長が肉眼で見られた。実
施例３に記載のELISA法によって、１次培養の培養上澄
液を試験した。抗原−特異的な抗体を含有する１次培養
を、96ウエル細胞培養プレート（ナンク・カンパニー）
上で蛍光活性化細胞ソーターを用いてさらにクローンし
た。供給細胞の代わりとしてHECSを用いた（前記参
照）。
このようにして、ハイブリドーマセルラインクローン
7.1A12.2−22および8.1F6.7−２の両者を単離すること
ができた。これらは受託機関ECACC［ヨーロッピアン・
コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ
（European Collection of Animal Cell Cultures）］
に、下記受託番号の下で寄託されている： ECACC89060901（＝クローン7.1A12.2−22）および ECACC89030308（＝クローン8.1F6.7−２）。
7.1A12.2−22および8.1F6.7−２の両者を単離すること
ができた。これらは受託機関ECACC［ヨーロッピアン・
コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ
（European Collection of Animal Cell Cultures）］
に、下記受託番号の下で寄託されている： ECACC89060901（＝クローン7.1A12.2−22）および ECACC89030308（＝クローン8.1F6.7−２）。
腹水を得るため、プリスタン（Pristan）0.5mlで１回
または２回前処置をしたBalb/cマウスに５×106バイブ
リドーマ細胞を腹腔内注射した。２〜３週間後、マウス
の腹から腹水を得ることができた。通常の方法でこの腹
水から抗体を単離することができた。これらモノクロー
ナル抗体はヒト心筋トロポニンＴに対して特異的に指向
し、骨格筋から得たトロポニンＴとの交差反応性は全く
示さないか、または僅かしか示さなかった。次に、これ
らをMAB7.1A12.2−22（クローン7.1A12.2−22由来）ま
たはMAB8.1F6.7−２（クローン8.1F6.7−２由来）と命
名した。
または２回前処置をしたBalb/cマウスに５×106バイブ
リドーマ細胞を腹腔内注射した。２〜３週間後、マウス
の腹から腹水を得ることができた。通常の方法でこの腹
水から抗体を単離することができた。これらモノクロー
ナル抗体はヒト心筋トロポニンＴに対して特異的に指向
し、骨格筋から得たトロポニンＴとの交差反応性は全く
示さないか、または僅かしか示さなかった。次に、これ
らをMAB7.1A12.2−22（クローン7.1A12.2−22由来）ま
たはMAB8.1F6.7−２（クローン8.1F6.7−２由来）と命
名した。
両モノクローナル抗体は、サブクラスIgG1/カッパに
属する。
属する。
実施例３ ヒト心筋トロポニンＴに対する抗体のスクリーニング試
験 免疫したマウスの血清中のトロポニンＴに対する抗体
の存在および特異的を測定するために、ハイブリッド細
胞の培養懸濁液または腹水において、試験の基本として
ELISA法を用いた。すなわち、被覆緩衝剤（0.2モル／
炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pH9.3〜9.5）中、
室温で１時間、ヒツジ由来のヒトトロポニンＴに対する
10μg/mlポリクローナル抗体（IgG）（免疫吸着的に精
製；骨格筋トロポニンＴと交差反応せず、心筋トロポニ
ンＴと交差反応する；実施例６に従って調製）で微量滴
定プレートを被覆した。0.9％塩化ナトリウム溶液およ
び１％ウシ血清アルブミンで20分間再被覆した。その
後、洗浄緩衝液（0.9％塩化ナトリウム溶液）で洗浄し
た。室温で１時間、振盪しながら、ウエル当たり100μ
を用いて、抗原、精製した１μg/mlヒトトロポニンＴ
または「天然（native）」トロポニンＴ、すなわち梗塞
血清（1:2に希釈）のインキュベーションを行った。次
いで、洗浄緩衝液で再度２回洗浄した。室温で１時間、
振盪しながら、ウエル当たり100μを用いて、試料を
インキュベートした。次いで、洗浄液で再度２回洗浄し
た。次に、さらに、室温で１時間、振盪しながら、ウエ
ル当たり25mUのPAB＜Ｍ−Fcg＞Ｓ−Fab（IS）−ペルオ
キシダーゼコンジュゲート100μと一緒にインキュベ
ートした。ここで、PAB＜Ｍ−Fcg＞Ｓ−Fab（IS）は、
免疫吸着によって精製したヒツジ由来のポリクローナル
抗−マウスFcγ抗体のFabフラグメントである。洗浄緩
衝液を用いた洗浄工程の後、通常の方法（例えば、室温
で30分間、ABTSを用いて、405nmでの吸光度の差をmAで
測定した）で、ペルオキシダーゼ活性を測定した。
験 免疫したマウスの血清中のトロポニンＴに対する抗体
の存在および特異的を測定するために、ハイブリッド細
胞の培養懸濁液または腹水において、試験の基本として
ELISA法を用いた。すなわち、被覆緩衝剤（0.2モル／
炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pH9.3〜9.5）中、
室温で１時間、ヒツジ由来のヒトトロポニンＴに対する
10μg/mlポリクローナル抗体（IgG）（免疫吸着的に精
製；骨格筋トロポニンＴと交差反応せず、心筋トロポニ
ンＴと交差反応する；実施例６に従って調製）で微量滴
定プレートを被覆した。0.9％塩化ナトリウム溶液およ
び１％ウシ血清アルブミンで20分間再被覆した。その
後、洗浄緩衝液（0.9％塩化ナトリウム溶液）で洗浄し
た。室温で１時間、振盪しながら、ウエル当たり100μ
を用いて、抗原、精製した１μg/mlヒトトロポニンＴ
または「天然（native）」トロポニンＴ、すなわち梗塞
血清（1:2に希釈）のインキュベーションを行った。次
いで、洗浄緩衝液で再度２回洗浄した。室温で１時間、
振盪しながら、ウエル当たり100μを用いて、試料を
インキュベートした。次いで、洗浄液で再度２回洗浄し
た。次に、さらに、室温で１時間、振盪しながら、ウエ
ル当たり25mUのPAB＜Ｍ−Fcg＞Ｓ−Fab（IS）−ペルオ
キシダーゼコンジュゲート100μと一緒にインキュベ
ートした。ここで、PAB＜Ｍ−Fcg＞Ｓ−Fab（IS）は、
免疫吸着によって精製したヒツジ由来のポリクローナル
抗−マウスFcγ抗体のFabフラグメントである。洗浄緩
衝液を用いた洗浄工程の後、通常の方法（例えば、室温
で30分間、ABTSを用いて、405nmでの吸光度の差をmAで
測定した）で、ペルオキシダーゼ活性を測定した。
実施例４ ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応性の測定 実施例３の記載に従って、本発明の方法を行った。最
初に、心筋トロポニンＴの反応性を測定した。次に、交
差反応を試験する抗原（骨格筋トロポニンＴ）を各モノ
クローナル抗体に、濃度を増加させながら添加した。
初に、心筋トロポニンＴの反応性を測定した。次に、交
差反応を試験する抗原（骨格筋トロポニンＴ）を各モノ
クローナル抗体に、濃度を増加させながら添加した。
その後、交差反応を下記式に従って算出した。
Ｃ＝最大シグナルの50％に達するために必要な抗原の濃
度。
度。
実施例５ エピトープ特異性の測定 室温で１時間、または４℃で一晩、0.2ミリモル／
炭酸塩緩衝液（pH9.6）に入れたマウス抗体のFcg領域に
対する10μg/mlヒツジポリクローナル抗体で、微量滴定
プレートを被覆した。その後、20分間、インキュベーシ
ョン緩衝液（0.9％塩化ナトリウム溶液および１％ウシ
血清アルブミン）で再被覆し、次いで、洗浄緩衝液［0.
9％塩化ナトリウム溶液、0.05％トゥイーン（Tween）2
0］で洗浄した。その後、インキュベーション緩衝液
（１％ウシ血清アルブミン含有0.9％塩化ナトリウム溶
液）中10μg/mlモノクローナル抗体（MAB7.1A12.2−2
2、MAB1100μを添加し、室温で１時間、振盪しながら
インキュベートした。
炭酸塩緩衝液（pH9.6）に入れたマウス抗体のFcg領域に
対する10μg/mlヒツジポリクローナル抗体で、微量滴定
プレートを被覆した。その後、20分間、インキュベーシ
ョン緩衝液（0.9％塩化ナトリウム溶液および１％ウシ
血清アルブミン）で再被覆し、次いで、洗浄緩衝液［0.
9％塩化ナトリウム溶液、0.05％トゥイーン（Tween）2
0］で洗浄した。その後、インキュベーション緩衝液
（１％ウシ血清アルブミン含有0.9％塩化ナトリウム溶
液）中10μg/mlモノクローナル抗体（MAB7.1A12.2−2
2、MAB1100μを添加し、室温で１時間、振盪しながら
インキュベートした。
ペルオキシダーゼコンジュゲートとして存在する第２
のモノクローナル抗体（MAB8.1F6.7−２、MAB2）を、室
温で、溶液（100mU/ml）中、抗原（１μg/ml心筋トロポ
ニンＴ）と一緒に予備インキュベートした。
のモノクローナル抗体（MAB8.1F6.7−２、MAB2）を、室
温で、溶液（100mU/ml）中、抗原（１μg/ml心筋トロポ
ニンＴ）と一緒に予備インキュベートした。
MAB1と一緒にプレートをインキュベートした後、過剰
の抗体を洗浄によって除去した。その後、インキュベー
ション緩衝液中１％マウス正常血清でプレートを再被覆
した。予備インキュベートしたトロポニンT/MAB2ペルオ
キシダーゼ複合体100μをプレート上に置き、室温で
１時間、振盪しながらインキュベートした。結合したペ
ルオキシダーゼ活性を、基質としてABTSを用いて肉眼で
観察できるようにした。MAB2がMAB1と同一であるかまた
は重複したエピトープであると認識すると、MAB1/トロ
ポニンT/MAB2の間にペアが形成されず、その結果、基質
反応がは起こらない。得られた結果は、モノクローナル
抗体7.1A12.2−22および8.1F6.7−２の両者が心筋トロ
ポニンＴ抗原の異なるエピトープに指向していることを
示した。
の抗体を洗浄によって除去した。その後、インキュベー
ション緩衝液中１％マウス正常血清でプレートを再被覆
した。予備インキュベートしたトロポニンT/MAB2ペルオ
キシダーゼ複合体100μをプレート上に置き、室温で
１時間、振盪しながらインキュベートした。結合したペ
ルオキシダーゼ活性を、基質としてABTSを用いて肉眼で
観察できるようにした。MAB2がMAB1と同一であるかまた
は重複したエピトープであると認識すると、MAB1/トロ
ポニンT/MAB2の間にペアが形成されず、その結果、基質
反応がは起こらない。得られた結果は、モノクローナル
抗体7.1A12.2−22および8.1F6.7−２の両者が心筋トロ
ポニンＴ抗原の異なるエピトープに指向していることを
示した。
参考例１ ELISA法によるトロポニンＴの測定のための酵素−免疫
検定法 試薬１ 1.25μg/mlビオチニル化MAB7.1A12.2−22［ジェイ・
エイチ・ピーターズ等（J.H.Peters et al.）、モノク
ローナル・アンチケルペル（Monoklonale Antikrpe
r）、スプリンゲル・ベルラグ（Springer Verlag）、ベ
ルリン、1985、第209頁〜第212頁］ 10ミリモル／クエン酸塩緩衝剤 47ミリモル／リン酸塩緩衝剤、pH6.3 50mU/mlペルオキシダーゼとモノクローナル抗体8.1F
6.7−２とのコンジューゲート［ダブリュ・ナップ（W.K
napp）、ケイ・コルーバー（K.Kolubar）、ジー・ウィ
ック（G.Wick）の編集によるイムノフルオレセンス・ア
ンド・リレイテッド・ステイニング・テクニクス（Immu
nofluorescence and Related Staining Technigues）
（第215頁〜第224頁、エルスヴァイア（Elsevier）／ノ
ース・ホランド（North Holland）、アムステルダム）
におけるエム・ビー・ウイルソン（M.B.Wilson）、ピー
・ケイ・ナカネ（P.K.Nakane）（1987）の方法と類似の
方法で調製した、活性の値はペルオキシダーゼに関係す
る］。
検定法 試薬１ 1.25μg/mlビオチニル化MAB7.1A12.2−22［ジェイ・
エイチ・ピーターズ等（J.H.Peters et al.）、モノク
ローナル・アンチケルペル（Monoklonale Antikrpe
r）、スプリンゲル・ベルラグ（Springer Verlag）、ベ
ルリン、1985、第209頁〜第212頁］ 10ミリモル／クエン酸塩緩衝剤 47ミリモル／リン酸塩緩衝剤、pH6.3 50mU/mlペルオキシダーゼとモノクローナル抗体8.1F
6.7−２とのコンジューゲート［ダブリュ・ナップ（W.K
napp）、ケイ・コルーバー（K.Kolubar）、ジー・ウィ
ック（G.Wick）の編集によるイムノフルオレセンス・ア
ンド・リレイテッド・ステイニング・テクニクス（Immu
nofluorescence and Related Staining Technigues）
（第215頁〜第224頁、エルスヴァイア（Elsevier）／ノ
ース・ホランド（North Holland）、アムステルダム）
におけるエム・ビー・ウイルソン（M.B.Wilson）、ピー
・ケイ・ナカネ（P.K.Nakane）（1987）の方法と類似の
方法で調製した、活性の値はペルオキシダーゼに関係す
る］。
試薬２ 100ミリモル／リン酸塩−クエン酸塩緩衝剤、pH4.4 3.2ミリモル／過ホウ素酸ナトリウム 1.9ミリモル／ABTS（2,2′−アジノ−ジ−［エチル
ベンゾチアゾリン−スルホネート（６）］）。
ベンゾチアゾリン−スルホネート（６）］）。
試料として、３、５、10または25ng/mlトロポニンＴ
を追加したヒト血清を用いた。
を追加したヒト血清を用いた。
ストレプトアビジンで被覆したポリスチレン管（EP−
Ａ−0269092に従って調製）を用いて反応を行った。
Ａ−0269092に従って調製）を用いて反応を行った。
測定法： 20〜25℃で60分間、管中で、1mlの試薬１と一緒に試
料0.2mlをインキュベートした。吸引し、水道水で２回
洗浄した。次に、試薬２を添加し、20〜25℃で30分間イ
ンキュベートし、光度計で420nmでの吸光度を測定し
た。
料0.2mlをインキュベートした。吸引し、水道水で２回
洗浄した。次に、試薬２を添加し、20〜25℃で30分間イ
ンキュベートし、光度計で420nmでの吸光度を測定し
た。
この方法で、標準曲線（第１図）が得られ、これによ
って、患者試料のトロポニンＴ濃度を測定することがで
きる。
って、患者試料のトロポニンＴ濃度を測定することがで
きる。
実施例６ トロポニンＴに対するポリクローナル抗体の単離および
精製 最初に、フロイント完全アジュバント（CFA）中0.1mg
/mlヒトトロポニンＴの溶液55μでヒツジを免疫し
た。さらに、７日目、14日目および30日目に免疫を行っ
た。次に、30日毎に免疫した。これらの後の免疫には、
各々、CFA中0.05mg/mlトロポニンＴ溶液28μを用い
た。６か月後、生の血清が得られた。
精製 最初に、フロイント完全アジュバント（CFA）中0.1mg
/mlヒトトロポニンＴの溶液55μでヒツジを免疫し
た。さらに、７日目、14日目および30日目に免疫を行っ
た。次に、30日毎に免疫した。これらの後の免疫には、
各々、CFA中0.05mg/mlトロポニンＴ溶液28μを用い
た。６か月後、生の血清が得られた。
生の血清１にエアロジル（Aerosil）［製造元：デ
グッサ（Degussa）］15gを添加し、室温で１時間攪拌
し、遠心分離した。その後、上清に1.7モル／硫酸ア
ンモニウムを添加し、室温で２時間ゆっくりと攪拌し
た。その後、沈殿物を遠心分離し、透析緩衝液（15ミリ
モル／リン酸カリウム、50ミリモル／塩化ナトリウ
ム、pH7.0）0.2中でホモジナイズし、透析緩衝液10
に対して４℃で４回透析した。遠心分離の後、透析した
生成物を、溶離液として透析緩衝液を用いて、DE52セル
ロースによって精製した。
グッサ（Degussa）］15gを添加し、室温で１時間攪拌
し、遠心分離した。その後、上清に1.7モル／硫酸ア
ンモニウムを添加し、室温で２時間ゆっくりと攪拌し
た。その後、沈殿物を遠心分離し、透析緩衝液（15ミリ
モル／リン酸カリウム、50ミリモル／塩化ナトリウ
ム、pH7.0）0.2中でホモジナイズし、透析緩衝液10
に対して４℃で４回透析した。遠心分離の後、透析した
生成物を、溶離液として透析緩衝液を用いて、DE52セル
ロースによって精製した。
溶出液を補足し、15mg/mlのタンパク濃度で、50ミリ
モル／リン酸カリウム、pH7.5、150ミリモル／塩化
ナトリウム（PBS）、0.1％ナトリウムアジドの最終濃度
にし、室温で骨格筋トロポニンＴ免疫吸着剤充填カラム
を通過させて骨格筋トロポニンＴと交差反応をする抗体
を除去した。抗体画分中の骨格筋トロポニンＴ吸着剤と
結合しない抗体の骨格筋トロポニンＴに対する交差反応
性を実施例４のELISA法によりチェックし、所望の交差
反応性を有する抗体画分が得られるまでこの操作を繰り
返した。次いで、得られた抗体画分を室温で心筋トロポ
ニンＴ免疫吸着剤カラムにのせ、PBS/1％アジドで洗浄
し、タンパク質を除去した。次いで、１モル／プロピ
オン酸で溶離した。溶出液を15ミリモル／リン酸カリ
ウム、50ミリモル／塩化ナトリウム（pH7.0）に対し
て透析した。
モル／リン酸カリウム、pH7.5、150ミリモル／塩化
ナトリウム（PBS）、0.1％ナトリウムアジドの最終濃度
にし、室温で骨格筋トロポニンＴ免疫吸着剤充填カラム
を通過させて骨格筋トロポニンＴと交差反応をする抗体
を除去した。抗体画分中の骨格筋トロポニンＴ吸着剤と
結合しない抗体の骨格筋トロポニンＴに対する交差反応
性を実施例４のELISA法によりチェックし、所望の交差
反応性を有する抗体画分が得られるまでこの操作を繰り
返した。次いで、得られた抗体画分を室温で心筋トロポ
ニンＴ免疫吸着剤カラムにのせ、PBS/1％アジドで洗浄
し、タンパク質を除去した。次いで、１モル／プロピ
オン酸で溶離した。溶出液を15ミリモル／リン酸カリ
ウム、50ミリモル／塩化ナトリウム（pH7.0）に対し
て透析した。
スフェロジル（Spherosil）［ローン・プーラン（Rho
ne Poulenc）XOC005］を15％硝酸および水で洗浄し、乾
燥した後、85℃で一夜、DMSO中10％（v/v）３−（トリ
エトキシシリル）プロピルアミンを用いてスフェロジル
−NH2に転換して、トロポニンＴ免疫吸着剤を調製し
た。反応後、この吸着剤をDMSOおよびイソプロパノール
で洗浄し、50℃で乾燥した。
ne Poulenc）XOC005］を15％硝酸および水で洗浄し、乾
燥した後、85℃で一夜、DMSO中10％（v/v）３−（トリ
エトキシシリル）プロピルアミンを用いてスフェロジル
−NH2に転換して、トロポニンＴ免疫吸着剤を調製し
た。反応後、この吸着剤をDMSOおよびイソプロパノール
で洗浄し、50℃で乾燥した。
スフェロジル−NH2を10％グルタルジアルデヒド溶液
（pH3.7）と混合し、55℃で２時間加熱した。その後、
真空下、ガラスフィルターによって懸濁液を濾過した。
ついで、スフェロジルの７容量倍の再蒸留水で洗浄し、
５容量倍の10ミリモル／リン酸カリウム、pH8.0/0.1
モル／塩化ナトリウムで再度洗浄した。次いで、用い
たスフェロジルの約50％の容量の10ミリモル／リン酸
カリウム、pH8/0.1モル／塩化ナトリウム中、スフェ
ロジル1ml当たりトロポニンT10mgを丸底フラスコに入れ
た。フラスコを、室温で一晩、回転エバポレーター上で
回転させた。
（pH3.7）と混合し、55℃で２時間加熱した。その後、
真空下、ガラスフィルターによって懸濁液を濾過した。
ついで、スフェロジルの７容量倍の再蒸留水で洗浄し、
５容量倍の10ミリモル／リン酸カリウム、pH8.0/0.1
モル／塩化ナトリウムで再度洗浄した。次いで、用い
たスフェロジルの約50％の容量の10ミリモル／リン酸
カリウム、pH8/0.1モル／塩化ナトリウム中、スフェ
ロジル1ml当たりトロポニンT10mgを丸底フラスコに入れ
た。フラスコを、室温で一晩、回転エバポレーター上で
回転させた。
濾過の後、スフェロジルを0.9％NaCl溶液およびエタ
ノールアミン溶液で、再度、数回洗浄した。その後、３
容量部のエタノールアミン溶液を添加し、室温で１時間
インキュベートした。濾過を再開した後、再度NaCl溶液
で洗浄した。その後、PBSで免疫吸着剤をpH7.5に調節
し、PBS/アジ化ナトリウムで平衡化した。４℃で貯蔵し
た。得られたポリクローナル抗体の交差反応性は、ヒト
心筋トロポニンＴに対して100％、ヒト骨格筋トロポニ
ンＴに対して＜0.2％、ウシ心筋トロポニンＴに対して1
43％、ヒト心筋ミオシン軽鎖１に対して《0.1％であっ
た。
ノールアミン溶液で、再度、数回洗浄した。その後、３
容量部のエタノールアミン溶液を添加し、室温で１時間
インキュベートした。濾過を再開した後、再度NaCl溶液
で洗浄した。その後、PBSで免疫吸着剤をpH7.5に調節
し、PBS/アジ化ナトリウムで平衡化した。４℃で貯蔵し
た。得られたポリクローナル抗体の交差反応性は、ヒト
心筋トロポニンＴに対して100％、ヒト骨格筋トロポニ
ンＴに対して＜0.2％、ウシ心筋トロポニンＴに対して1
43％、ヒト心筋ミオシン軽鎖１に対して《0.1％であっ
た。
参考例２ 心筋壊死の判定 参考例１に従って、不安定な狭心症の症状を有する37
体の患者の血清において、トロポニンＴ測定の酵素−免
疫検定法を行った。
体の患者の血清において、トロポニンＴ測定の酵素−免
疫検定法を行った。
これらの患者のうち13人（30％）においてトロポニン
Ｔの有意な増加が見られた。これは、トロポニンＴの測
定が、トロポニンＩ試験と比較して小さい梗塞の検出に
対して明らかに高い感度を有することを示した。
Ｔの有意な増加が見られた。これは、トロポニンＴの測
定が、トロポニンＩ試験と比較して小さい梗塞の検出に
対して明らかに高い感度を有することを示した。
壁内梗塞において、トロポニンＴの血清濃度血線は、
トロポニンＩのそれとは有意に異なる。これは第２図に
示されているが、該第２図は、壁内筋梗塞を有する52人
の患者の平均血清濃度曲線を示す。この梗塞グループに
おいて、平均としてのトロポニンＴが、疼痛開始の後、
＞300時間増加することがわかった。このグループの患
者における絶対的診断感度の時間は、６時間目〜195時
間目までである。
トロポニンＩのそれとは有意に異なる。これは第２図に
示されているが、該第２図は、壁内筋梗塞を有する52人
の患者の平均血清濃度曲線を示す。この梗塞グループに
おいて、平均としてのトロポニンＴが、疼痛開始の後、
＞300時間増加することがわかった。このグループの患
者における絶対的診断感度の時間は、６時間目〜195時
間目までである。
梗塞のサイズが大きく異なっている（Ｑ−波および非
−Ｑ−波AMI）比較的大きい患者のグループにおいて、
トロポニンＴの絶対的診断感度の時間は、疼痛開始の
後、12〜140時間目であった。
−Ｑ−波AMI）比較的大きい患者のグループにおいて、
トロポニンＴの絶対的診断感度の時間は、疼痛開始の
後、12〜140時間目であった。
トロポニンＴ放出は、サイトゾルのおよび構造的に結
合したマーカータンパクの特性を示す。再潅流したAMI
において、顕著なトロポニンＴピークが１日目に見ら
れ、これは非−再潅流AMIには存在しなかった（第３
図）。初期のトロポニンＴ放出による潅流依存性の変化
を用いて、血栓崩壊療法の効果を浸潤せずに予測するこ
とができる。トロポニンＩを含む他のマーカータンパク
については、同様の結果が全く見られなかった。
合したマーカータンパクの特性を示す。再潅流したAMI
において、顕著なトロポニンＴピークが１日目に見ら
れ、これは非−再潅流AMIには存在しなかった（第３
図）。初期のトロポニンＴ放出による潅流依存性の変化
を用いて、血栓崩壊療法の効果を浸潤せずに予測するこ
とができる。トロポニンＩを含む他のマーカータンパク
については、同様の結果が全く見られなかった。
第１図は、トロポニンＴアッセイの標準曲線を示すグラ
フである。 第２図は、壁内心筋梗塞を有する52人の患者のトロポニ
ンＴの平均血清濃度を示すグラフである。 第３図は、疼痛開始の後、＜3.5時間の梗塞再潅流した
患者20人（ER）、疼痛開始の＞3.5時間の再潅流をした
患者20人（LR）、および非−再潅流の梗塞を有する患者
24人（PO）における血清中のトロポニンＴ濃度の相対的
な増加の局所的に加重価を与えた回帰線による滑らかな
走査プロットを示すグラフである。成功裏に再潅流した
梗塞における顕著な初期トロポニンＴ放出に注意すべき
である。
フである。 第２図は、壁内心筋梗塞を有する52人の患者のトロポニ
ンＴの平均血清濃度を示すグラフである。 第３図は、疼痛開始の後、＜3.5時間の梗塞再潅流した
患者20人（ER）、疼痛開始の＞3.5時間の再潅流をした
患者20人（LR）、および非−再潅流の梗塞を有する患者
24人（PO）における血清中のトロポニンＴ濃度の相対的
な増加の局所的に加重価を与えた回帰線による滑らかな
走査プロットを示すグラフである。成功裏に再潅流した
梗塞における顕著な初期トロポニンＴ放出に注意すべき
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クラウス・ハレルマイヤー ドイツ連邦共和国8000ミュンヘン‐２、 バルスストラッセ31番 (72)発明者 ジークフリード・ローゼル ドイツ連邦共和国8120バイルハイム、ア ンメルストラッセ27番 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，263［34］（1988）Ｐ．18488− 18492 北川常廣他編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎ ｏ．31酵素免疫測定法」（1987−９− 10）共立出版株式会社Ｐ．13−26
Claims (4)
- 【請求項１】トロポニンＩおよび他の筋原線維タンパク
に対する交差反応性が＜２％であり、骨格筋トロポニン
Ｔに対する交差反応性が＜５％であるヒト心筋トロポニ
ンＴに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体。 - 【請求項２】数カ月間かけて、４〜６週間おきに少なく
とも４回、ヒト心筋トロポニンＴおよびアジュバントで
被験動物を免疫し、生の血清を単離し、ついで、免疫吸
着的に精製することを特徴とするトロポニンＩおよび他
の筋原線維タンパクに対する交差反応性が＜２％であ
り、骨格筋トロポニンＴに対する交差反応性が＜５％で
あるヒト心筋トロポニンＴに対するポリクローナル抗体
の製造方法。 - 【請求項３】数カ月間かけて、４〜６週間おきに少なく
とも４回、ヒト心筋トロポニンＴおよびアジュバントで
被験動物を免疫し、Ｂリンパ球を単離し、これらを永久
骨髄腫セルラインと融合し、抗体を単離すべきクローン
を単離することを特徴とするトロポニンＩおよび他の筋
原線維タンパクに対する交差反応性が＜２％であり、骨
格筋トロポニンＴに対する交差反応性が＜５％であるヒ
ト心筋トロポニンＴに対するモノクローナル抗体の製造
方法。 - 【請求項４】トロポニンＩおよび他の筋原線維タンパク
に対する交差反応性が＜２％であり、骨格筋トロポニン
Ｔに対する交差反応性が＜５％であるヒト心筋トロポニ
ンＴに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体と、 該抗体またはヒト心筋トロポニンＴに結合する結合相手
Ｂとからなり、 該結合相手Ｂまたは抗体の一方が測定可能な基により標
識されている心筋壊死判定用の免疫検定用キット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3913568 | 1989-04-25 | ||
| DE3913568.3 | 1989-04-25 | ||
| DE3922873.8 | 1989-07-12 | ||
| DE3922873A DE3922873A1 (de) | 1989-04-25 | 1989-07-12 | Spezifische antikoerper gegen troponin t, ihre herstellung und verwendung in einem reagenz zur bestimmung von hermuskelnekrosen |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6249289A Division JP2818116B2 (ja) | 1989-04-25 | 1994-10-14 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037597A JPH037597A (ja) | 1991-01-14 |
| JP2564686B2 true JP2564686B2 (ja) | 1996-12-18 |
Family
ID=25880249
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2109946A Expired - Lifetime JP2564686B2 (ja) | 1989-04-25 | 1990-04-24 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 |
| JP6249289A Expired - Lifetime JP2818116B2 (ja) | 1989-04-25 | 1994-10-14 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6249289A Expired - Lifetime JP2818116B2 (ja) | 1989-04-25 | 1994-10-14 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6376206B1 (ja) |
| EP (1) | EP0394819B1 (ja) |
| JP (2) | JP2564686B2 (ja) |
| AT (1) | ATE117435T1 (ja) |
| DE (2) | DE3922873A1 (ja) |
| DK (1) | DK0394819T3 (ja) |
| ES (1) | ES2068937T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015224T3 (ja) |
| HK (1) | HK1002814A1 (ja) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4243648A1 (de) * | 1992-12-23 | 1994-07-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid |
| FR2701954B1 (fr) * | 1993-02-23 | 1995-07-07 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Composition stabilisée de troponine pour immunoessais et procédé de stabilisation de troponine pour immunoessais. |
| ATE184400T1 (de) * | 1993-05-17 | 1999-09-15 | Fortron Bioscience Inc | Assay für troponin i aus dem herzmuskel |
| CA2130280C (en) * | 1993-08-24 | 1999-08-31 | Lilian Lee | Method for purification of cardiac troponin i |
| DE4420742A1 (de) * | 1993-10-20 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetischer Standard für Immunoassays |
| US6991907B1 (en) * | 1995-04-18 | 2006-01-31 | Biosite, Inc. | Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| DE69633780T3 (de) | 1995-04-18 | 2011-05-05 | Biosite Incorporated, San Diego | Verfahren zum assay von troponin i und t und komplexen von troponin i und t und auswahl von antikörpern zur verwendung in immunoassays |
| US6627404B1 (en) | 1995-04-18 | 2003-09-30 | Biosite, Inc. | Methods for improving the recovery of troponin I and T in membranes, filters and vessels |
| US5795725A (en) * | 1995-04-18 | 1998-08-18 | Biosite Diagnostics Incorporated | Methods for the assay of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| US6072040A (en) * | 1996-10-15 | 2000-06-06 | Medical Analysis Systems, Inc. | Stabilized conjugates of uncomplexed subunits of multimeric proteins |
| US6156521A (en) * | 1997-12-19 | 2000-12-05 | Biosite Diagnostics, Inc. | Methods for the recovery and measurement of troponin complexes |
| US7384751B1 (en) * | 1997-07-16 | 2008-06-10 | Queen's University At Kingston | Methods of diagnosing muscle damage |
| EP1283255A4 (en) * | 2000-04-27 | 2004-12-29 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | GENES ASSOCIATED WITH THE PROLIFERATION OF MYOCARDIAL CELLS |
| MXPA03004105A (es) | 2002-05-14 | 2004-10-15 | Hoffmann La Roche | Elaboracion de una prognosis en casos de enfermedad cardiaca usando una combinacion de marcadores. |
| US8409815B2 (en) | 2002-11-16 | 2013-04-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | sCD40L and placental growth factor (PLGF) used as a biochemical marker combination in cardiovascular diseases |
| DE10351238A1 (de) * | 2003-11-03 | 2005-06-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Diagnosestellung von akuten myokardialen, ischämischen Erkrankungen durch Kombination von Markern |
| AU2007313488A1 (en) | 2006-04-04 | 2008-04-24 | Singulex, Inc. | Methods and compositions for highly sensitive analysis of markers and detection of molecules |
| US7838250B1 (en) | 2006-04-04 | 2010-11-23 | Singulex, Inc. | Highly sensitive system and methods for analysis of troponin |
| DK2115477T3 (en) | 2007-01-25 | 2015-08-10 | Hoffmann La Roche | USE OF IGFBP-7 IN THE EVIDENCE OF HEART FAILURE |
| EP2145184B1 (en) | 2007-03-08 | 2013-10-02 | Roche Diagnostics GmbH | Use of slim-1 in the assessment of heart failure |
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