JP2818116B2 - 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法 - Google Patents
心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、心筋トロポニンＴに対
する特異的抗体を用いる心筋トロポニンＴの測定方法、
特に、心筋壊死判定における該方法の利用に関する。
する特異的抗体を用いる心筋トロポニンＴの測定方法、
特に、心筋壊死判定における該方法の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】横紋筋の筋原線維は、共同して作用する
２種類のタンパクフィラメントからなっており、厚いフ
ィラメントは主要成分としてミオシンを有しており、薄
いフィラメントはアクチン、トロポミオシンおよびトロ
ポニンを含有している。調節構造タンパクであるトロポ
ニンは、細胞中で凝集して複合体を形成し、３種類の異
なるタンパク：カルシウムイオンと結合するトロポニン
Ｃ(分子量１８０００)、アクチンと結合するサブ−ユニ
ットであるトロポニンＩ(分子量２４０００)、トロポミ
オシンと複合するトロポニンＴ(分子量３７０００)から
なっている。この共通する命名は、複合物がそのような
ものとして始めて精製され、単一のタンパクとみなさ
れ、トロポニンと命名されて以来の歴史的な理由を有し
ている。後に、実際には、トロポニンが３種類の異なる
タンパクからなっていることが証明されたが、収縮性器
官の薄いフィラメント上での各タンパク間の位置関係、
および筋肉収縮の調節に関するそれらの協調性の故に、
この命名が維持された。しかし、それらは、ミオシンま
たはアクチンのような収縮性器官の他のタンパクに機能
的に関連しているが、異なるアミノ酸配列を有する３種
類の異なるタンパクである。
２種類のタンパクフィラメントからなっており、厚いフ
ィラメントは主要成分としてミオシンを有しており、薄
いフィラメントはアクチン、トロポミオシンおよびトロ
ポニンを含有している。調節構造タンパクであるトロポ
ニンは、細胞中で凝集して複合体を形成し、３種類の異
なるタンパク：カルシウムイオンと結合するトロポニン
Ｃ(分子量１８０００)、アクチンと結合するサブ−ユニ
ットであるトロポニンＩ(分子量２４０００)、トロポミ
オシンと複合するトロポニンＴ(分子量３７０００)から
なっている。この共通する命名は、複合物がそのような
ものとして始めて精製され、単一のタンパクとみなさ
れ、トロポニンと命名されて以来の歴史的な理由を有し
ている。後に、実際には、トロポニンが３種類の異なる
タンパクからなっていることが証明されたが、収縮性器
官の薄いフィラメント上での各タンパク間の位置関係、
および筋肉収縮の調節に関するそれらの協調性の故に、
この命名が維持された。しかし、それらは、ミオシンま
たはアクチンのような収縮性器官の他のタンパクに機能
的に関連しているが、異なるアミノ酸配列を有する３種
類の異なるタンパクである。
【０００３】重篤な虚血または筋肉細胞壊死が長く続く
と、トロポニンＩは血漿に達し、従って、トロポニンＩ
はそのような疾患のパラメーターであり、既知の梗塞形
成酵素ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＧＯＴおよびＬＤＨと同様に
診断や、モニターに使用することができる。
と、トロポニンＩは血漿に達し、従って、トロポニンＩ
はそのような疾患のパラメーターであり、既知の梗塞形
成酵素ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＧＯＴおよびＬＤＨと同様に
診断や、モニターに使用することができる。
【０００４】しかし、ＣＫおよびＣＫ−ＭＢの測定は梗
塞に対して全く特異的ではなく、梗塞の８０〜９０時間
後に血清中で増加するにすぎないことが証明されてい
る。また、ＧＯＴおよびＬＤＨも、量の増加が多くの他
の疾患においても血液中に見られるが故に心筋に対して
特異的ではない。
塞に対して全く特異的ではなく、梗塞の８０〜９０時間
後に血清中で増加するにすぎないことが証明されてい
る。また、ＧＯＴおよびＬＤＨも、量の増加が多くの他
の疾患においても血液中に見られるが故に心筋に対して
特異的ではない。
【０００５】心臓トロポニンＩの測定の欠点は、通常、
血清が既にトロポニンＩを１０ng／mlの濃度で含有して
いることである[ビー・カミンズ(Ｂ.Ｃummins)、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルーラー・カー
ジオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｃell.Ｃard.)１９(１９８７)、９
９９−１０１０およびビー・カミンズ(Ｂ.Ｃummins)、
クリニカル・アンド・インベスティゲイティブ・メディ
スン(Ｃlin.Ｉnvest.)１１３(１９８７)１３３３−１３
４４参照]。そのため、壁内梗塞において２相の血清濃
度が生じる。平均すると、急性壁内梗塞を有する３７人
の患者において、疼痛開始の後、４時間目から１６８時
間目までトロポニンＩが増加した。動物モデルにおいて
も、同様の結果が得られた。かくして、トロポニンＩに
ついて、梗塞発生の後の１０時間目から５０時間目が絶
対的診断感度(absolute diagnostic sensitivity)の時
間となると考えられる。すなわち、感度の制約とは別
に、トロポニンＩの血清レベルが変化するため、梗塞発
生の後の１０日間またはそれ以上の臨床上重要なモニタ
ーはトロポニンＩの測定によって行うことはできない。
血清が既にトロポニンＩを１０ng／mlの濃度で含有して
いることである[ビー・カミンズ(Ｂ.Ｃummins)、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルーラー・カー
ジオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｃell.Ｃard.)１９(１９８７)、９
９９−１０１０およびビー・カミンズ(Ｂ.Ｃummins)、
クリニカル・アンド・インベスティゲイティブ・メディ
スン(Ｃlin.Ｉnvest.)１１３(１９８７)１３３３−１３
４４参照]。そのため、壁内梗塞において２相の血清濃
度が生じる。平均すると、急性壁内梗塞を有する３７人
の患者において、疼痛開始の後、４時間目から１６８時
間目までトロポニンＩが増加した。動物モデルにおいて
も、同様の結果が得られた。かくして、トロポニンＩに
ついて、梗塞発生の後の１０時間目から５０時間目が絶
対的診断感度(absolute diagnostic sensitivity)の時
間となると考えられる。すなわち、感度の制約とは別
に、トロポニンＩの血清レベルが変化するため、梗塞発
生の後の１０日間またはそれ以上の臨床上重要なモニタ
ーはトロポニンＩの測定によって行うことはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、これらの欠点を解消し、心筋梗塞および心筋に
対する他の損傷において少なくとも１５０時間(絶対的
診断感度の持続)モニターが可能な測定方法を提供する
ことである。
目的は、これらの欠点を解消し、心筋梗塞および心筋に
対する他の損傷において少なくとも１５０時間(絶対的
診断感度の持続)モニターが可能な測定方法を提供する
ことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は心筋トロポニ
ンＴ（以下、単にトロポニンＴと称することもある）に
対する少なくとも１つの抗体およびトロポニンＴまたは
該抗体の結合相手Ｂと一緒に血清または血漿試料をイン
キュベートし、それによって、トロポニンＴに対する抗
体または結合相手Ｂのいずれかを測定可能な基で標識
し、こうして生成する測定可能な基を含有する免疫学的
複合体を単離し、単離した相または残りの相中の該測定
可能な基を測定することを特徴とする心筋トロポニンＴ
の測定方法によって達成され、該試料由来のトロポニン
Ｔを心筋壊死の尺度とすることにより、免疫検定法によ
り心筋壊死の判定を行うことができる。
ンＴ（以下、単にトロポニンＴと称することもある）に
対する少なくとも１つの抗体およびトロポニンＴまたは
該抗体の結合相手Ｂと一緒に血清または血漿試料をイン
キュベートし、それによって、トロポニンＴに対する抗
体または結合相手Ｂのいずれかを測定可能な基で標識
し、こうして生成する測定可能な基を含有する免疫学的
複合体を単離し、単離した相または残りの相中の該測定
可能な基を測定することを特徴とする心筋トロポニンＴ
の測定方法によって達成され、該試料由来のトロポニン
Ｔを心筋壊死の尺度とすることにより、免疫検定法によ
り心筋壊死の判定を行うことができる。
【０００８】結合相手Ｂは、トロポニンＴに対する抗体
またはトロポニンＴと結合しなければならない。結合相
手Ｂは、例えば、トロポニンＴに対する第２の抗体また
はヒトもしくは動物由来のトロポニンＴ、または抗体に
よって結合されるそれらの類似物であってもよい。
またはトロポニンＴと結合しなければならない。結合相
手Ｂは、例えば、トロポニンＴに対する第２の抗体また
はヒトもしくは動物由来のトロポニンＴ、または抗体に
よって結合されるそれらの類似物であってもよい。
【０００９】試料は、トロポニンＴに対する抗体および
トロポニンＴに対する別の抗体と測定可能な基とのコン
ジュゲート(結合体)と一緒にインキュベートするのが好
ましく、形成された免疫学的複合体を相分離によって単
離し、いずれか一方の相中の該測定可能な基を測定す
る。
トロポニンＴに対する別の抗体と測定可能な基とのコン
ジュゲート(結合体)と一緒にインキュベートするのが好
ましく、形成された免疫学的複合体を相分離によって単
離し、いずれか一方の相中の該測定可能な基を測定す
る。
【００１０】さらに、トロポニンＴに対する抗体および
トロポニンＴと測定可能な基とのコンジュゲートと共に
試料をインキュベートし、形成された免疫学的複合体を
相の分離によって単離し、いずれか一方の相中の該測定
可能な基を測定することが好ましい。
トロポニンＴと測定可能な基とのコンジュゲートと共に
試料をインキュベートし、形成された免疫学的複合体を
相の分離によって単離し、いずれか一方の相中の該測定
可能な基を測定することが好ましい。
【００１１】驚くべきことに、心筋壊死(例えば、心筋
梗塞、虚血または狭心症などによる)の測定において
は、トロポニンＴ免疫検定法によるほうが、ＣＫ、ＣＫ
−ＭＢ、ＧＯＴ、ＬＤＨまたはトロポニンＩのような他
のパラメーターの測定によるよりも有意に高い感度が得
られることがわかった。本発明者らにより確証されたよ
うに、この理由は、収縮性器官の他のタンパクとは異な
り、試験の検出限界(０.２５ng／ml)までのトロポニン
Ｔの血清濃度を測定するものではないからである。
梗塞、虚血または狭心症などによる)の測定において
は、トロポニンＴ免疫検定法によるほうが、ＣＫ、ＣＫ
−ＭＢ、ＧＯＴ、ＬＤＨまたはトロポニンＩのような他
のパラメーターの測定によるよりも有意に高い感度が得
られることがわかった。本発明者らにより確証されたよ
うに、この理由は、収縮性器官の他のタンパクとは異な
り、試験の検出限界(０.２５ng／ml)までのトロポニン
Ｔの血清濃度を測定するものではないからである。
【００１２】このことは、トロポニン類間の機能的な関
係からトロポニンＩの血清濃度と同様の血清濃度がトロ
ポニンＴに対して予想されているところからすれば、非
常に驚くべきことである。さらに、トロポニンＴの血清
濃度曲線は、例えば、壁内梗塞において、トロポニンＩ
の曲線とは有意に異なっている。トロポニンＩと異な
り、経時変化の曲線は、２相の代わりに３相となり、ト
ロポニンＴは、疼痛開始の３００時間後まで平均して増
加することが判明している。絶対的診断感度の時間は６
時間目から１９５時間目まで持続する。かくして、絶対
的診断感度の時間は、トロポニンＩについて知られてい
る時間のほぼ４倍である。
係からトロポニンＩの血清濃度と同様の血清濃度がトロ
ポニンＴに対して予想されているところからすれば、非
常に驚くべきことである。さらに、トロポニンＴの血清
濃度曲線は、例えば、壁内梗塞において、トロポニンＩ
の曲線とは有意に異なっている。トロポニンＩと異な
り、経時変化の曲線は、２相の代わりに３相となり、ト
ロポニンＴは、疼痛開始の３００時間後まで平均して増
加することが判明している。絶対的診断感度の時間は６
時間目から１９５時間目まで持続する。かくして、絶対
的診断感度の時間は、トロポニンＩについて知られてい
る時間のほぼ４倍である。
【００１３】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、
蛍光免疫検定法等のような全ての通常の免疫検定法は、
基本的に本発明における免疫検定法に適している。さら
に、これらの方法の変法(例えば、競合免疫検定法、Ｉ
ＥＭＡ法等)の全てが適用される。サンドウィッチ試験
が、トロポニンＴの測定に特に有効であることが証明さ
れた。この試験方法では、トロポニンＴに対する固定化
抗体およびトロポニンＴに対する抗体と測定可能な基と
のコンジュゲートを使用する。この試験法の様々な変形
およびこれらの方法の実施に関する詳細は、文献に充分
に記載されている。しかし、例えば、ドイツ特許出願Ｄ
Ｅ−Ａ３８３４７６６および／またはＤＥ−Ａ３８２２
７５０に記載されているような他の免疫学的測定法も本
発明に係る抗体を用いることができる。
蛍光免疫検定法等のような全ての通常の免疫検定法は、
基本的に本発明における免疫検定法に適している。さら
に、これらの方法の変法(例えば、競合免疫検定法、Ｉ
ＥＭＡ法等)の全てが適用される。サンドウィッチ試験
が、トロポニンＴの測定に特に有効であることが証明さ
れた。この試験方法では、トロポニンＴに対する固定化
抗体およびトロポニンＴに対する抗体と測定可能な基と
のコンジュゲートを使用する。この試験法の様々な変形
およびこれらの方法の実施に関する詳細は、文献に充分
に記載されている。しかし、例えば、ドイツ特許出願Ｄ
Ｅ−Ａ３８３４７６６および／またはＤＥ−Ａ３８２２
７５０に記載されているような他の免疫学的測定法も本
発明に係る抗体を用いることができる。
【００１４】本発明においては、抗体には、完全抗体、
キメラ抗体、二価抗体およびそれらのフラグメントが包
含される。使用されるトロポニンＴに対する抗体は、ポ
リクローナルまたはモノクローナルであってよい。好ま
しくは、モノクローナル抗体が使用される。
キメラ抗体、二価抗体およびそれらのフラグメントが包
含される。使用されるトロポニンＴに対する抗体は、ポ
リクローナルまたはモノクローナルであってよい。好ま
しくは、モノクローナル抗体が使用される。
【００１５】サンドイッチ試験において、好ましい具体
例として、トロポニンＴに対する少なくとも２つの抗体
を試料溶液と共にインキュベートする。これによって、
第１の抗体は固相との結合を仲介する。このために、こ
の抗体は、直接またはスペーサーを介して固相と結合す
るか、または可溶性の形態で存在して免疫学的反応が行
われた後にだけ、固定化することができ得る。第２の抗
体は、ある種の基で直接標識化するか、または機能的結
合によって測定可能な基と結合することができる。この
ために、該抗体は、特異的結合対の一方と結合すること
ができ、該測定可能な基は特異的結合対の他方と結合す
ることができる。第２の抗体および測定可能な基を含有
する複合体が、反応の間に形成される。第１の抗体の担
体への結合(固定化)は、公知の方法に従って、吸着、化
学結合または特異的結合対を介する機能的な結合によっ
て行われる。この場合、結合対の一方は固定化される
が、他方は、抗体と化学的に結合する。次に、この結合
対を介して免疫学的測定反応の前またはその間に抗体を
固定化することができる。このような結合対の例として
は、ビオチンストレプトアビジン／アビジン、ハプテン
−抗体、抗原−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結合タ
ンパクが挙げられる。
例として、トロポニンＴに対する少なくとも２つの抗体
を試料溶液と共にインキュベートする。これによって、
第１の抗体は固相との結合を仲介する。このために、こ
の抗体は、直接またはスペーサーを介して固相と結合す
るか、または可溶性の形態で存在して免疫学的反応が行
われた後にだけ、固定化することができ得る。第２の抗
体は、ある種の基で直接標識化するか、または機能的結
合によって測定可能な基と結合することができる。この
ために、該抗体は、特異的結合対の一方と結合すること
ができ、該測定可能な基は特異的結合対の他方と結合す
ることができる。第２の抗体および測定可能な基を含有
する複合体が、反応の間に形成される。第１の抗体の担
体への結合(固定化)は、公知の方法に従って、吸着、化
学結合または特異的結合対を介する機能的な結合によっ
て行われる。この場合、結合対の一方は固定化される
が、他方は、抗体と化学的に結合する。次に、この結合
対を介して免疫学的測定反応の前またはその間に抗体を
固定化することができる。このような結合対の例として
は、ビオチンストレプトアビジン／アビジン、ハプテン
−抗体、抗原−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結合タ
ンパクが挙げられる。
【００１６】競合試験は、該試験のさらに好ましい変形
例である。この場合、測定の前またはその間に固定化さ
れるトロポニンＴに対する抗体、およびトロポニンＴと
測定可能な基とのコンジュゲートが使用される。
例である。この場合、測定の前またはその間に固定化さ
れるトロポニンＴに対する抗体、およびトロポニンＴと
測定可能な基とのコンジュゲートが使用される。
【００１７】本発明に係る抗体の固定化またはトロポニ
ンＴの固定化のための担体、例えば、チューブ、プラス
チック製キュベット、微量滴定プレート、ビーズまたは
プラスチック製微小担体の材料として、ポリスチレン、
ビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
多糖類、シリコーン、ゴムもしくは処理ガラスのような
材料を使用することができる[例えば、イー・ティー・
マギオ(Ｅ.Ｔ.Ｍaggio)、“エンザイム・イムノアッセ
イ"(Ｅnzyme Ｉmmunoassay)、シー・エー・シー・プレ
ス、フロリダ(１９８０)、特に第１７５−１７８頁；Ｅ
Ｐ−Ａ−０６３０６４；バイオエンジニアリング(Ｂioe
ngineering)１６(１９７４)、９９７−１００３；シー
・ジェイ・センダーソン(Ｃ.Ｊ.Ｓenderson)およびディ
ー・ブイ・ウィルソン(Ｄ.Ｖ.Ｗilson)、イムノロジー
(Ｉmmunology)２０(１９７１)、１０６１−１０６５参
照]。特に、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆
された担体材料、とりわけポリスチレンが使用され、好
ましくは、ＥＰ−Ａ−０２６９０９２に記載された方法
に従って調製される。同様に、結合相手Ｂはトロポニン
Ｔもしくはその類似物またはトロポニンＴと特異的に結
合できるモノクローナル抗体のいずれかを含んでおり、
標識化される。個々の測定方法のための通常の試薬が標
識化に好適である。すなわち、ラジオイムノアッセイで
は、標識化のために57Ｃoのような放射性同位元素が使
用される。酵素-免疫検定法法に一般的に使用される全
酵素が適しており、例えば、ペルオキシダーゼまたはβ
−ガラクトシダーゼが適している。通常の蛍光性の基
は、蛍光免疫検定法のための標識として好適である。こ
れら様々な試験法の詳細および該方法の変法は公知であ
る。トロポニンＴまたは抗体と標識との結合は、固相と
の結合と類似の方法で、すなわち共有的にまたは特異的
結合対を介して行うことができる。
ンＴの固定化のための担体、例えば、チューブ、プラス
チック製キュベット、微量滴定プレート、ビーズまたは
プラスチック製微小担体の材料として、ポリスチレン、
ビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
多糖類、シリコーン、ゴムもしくは処理ガラスのような
材料を使用することができる[例えば、イー・ティー・
マギオ(Ｅ.Ｔ.Ｍaggio)、“エンザイム・イムノアッセ
イ"(Ｅnzyme Ｉmmunoassay)、シー・エー・シー・プレ
ス、フロリダ(１９８０)、特に第１７５−１７８頁；Ｅ
Ｐ−Ａ−０６３０６４；バイオエンジニアリング(Ｂioe
ngineering)１６(１９７４)、９９７−１００３；シー
・ジェイ・センダーソン(Ｃ.Ｊ.Ｓenderson)およびディ
ー・ブイ・ウィルソン(Ｄ.Ｖ.Ｗilson)、イムノロジー
(Ｉmmunology)２０(１９７１)、１０６１−１０６５参
照]。特に、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆
された担体材料、とりわけポリスチレンが使用され、好
ましくは、ＥＰ−Ａ−０２６９０９２に記載された方法
に従って調製される。同様に、結合相手Ｂはトロポニン
Ｔもしくはその類似物またはトロポニンＴと特異的に結
合できるモノクローナル抗体のいずれかを含んでおり、
標識化される。個々の測定方法のための通常の試薬が標
識化に好適である。すなわち、ラジオイムノアッセイで
は、標識化のために57Ｃoのような放射性同位元素が使
用される。酵素-免疫検定法法に一般的に使用される全
酵素が適しており、例えば、ペルオキシダーゼまたはβ
−ガラクトシダーゼが適している。通常の蛍光性の基
は、蛍光免疫検定法のための標識として好適である。こ
れら様々な試験法の詳細および該方法の変法は公知であ
る。トロポニンＴまたは抗体と標識との結合は、固相と
の結合と類似の方法で、すなわち共有的にまたは特異的
結合対を介して行うことができる。
【００１８】抗体またはトロポニンＴは、公知の方法に
従って、前記の結合相手のうちの一方と、例えば、カル
ボジイミドおよびヒドロキシスクシンイミドを介して、
共有結合させる。
従って、前記の結合相手のうちの一方と、例えば、カル
ボジイミドおよびヒドロキシスクシンイミドを介して、
共有結合させる。
【００１９】酵素標識としてペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)
を用いるのが好ましい。
を用いるのが好ましい。
【００２０】また、本発明で用いる抗体の１つの例は、
ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応が５％未満であ
り、トロポニンＩおよび他の筋原線維タンパクとの交差
反応が２％未満である、心筋トロポニンＴと特異的に結
合できるポリクローナル抗体である。この抗体を製造す
るには、試験動物、好ましくはヒツジを、数カ月(好ま
しくは４〜６カ月)かけて、４〜６週間おきに少なくと
も４回ヒト心筋トロポニンＴおよびアジュバントで免疫
化し、生の血清を単離し、それを免疫吸着的に精製す
る。
ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応が５％未満であ
り、トロポニンＩおよび他の筋原線維タンパクとの交差
反応が２％未満である、心筋トロポニンＴと特異的に結
合できるポリクローナル抗体である。この抗体を製造す
るには、試験動物、好ましくはヒツジを、数カ月(好ま
しくは４〜６カ月)かけて、４〜６週間おきに少なくと
も４回ヒト心筋トロポニンＴおよびアジュバントで免疫
化し、生の血清を単離し、それを免疫吸着的に精製す
る。
【００２１】さらに、本発明で用いる抗体のもう１つの
例は、ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応が５％未満
であり、トロポニンＩおよび他の筋原線維との交差反応
が２％未満である、心筋トロポニンＴと特異的に結合で
きるモノクローナル抗体である。この抗体を製造するに
は、試験動物、好ましくは近親交配させたマウスを、数
カ月かけて、４〜６週間おきに少なくとも４回、ヒト心
筋トロポニンＴおよびアジュバントで腹腔内的に免疫化
し、Ｂリンパ球を単離し、永久骨髄腫セルライン(細胞
系統)と融合し、クローンを単離し、それらから抗体を
単離する。
例は、ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応が５％未満
であり、トロポニンＩおよび他の筋原線維との交差反応
が２％未満である、心筋トロポニンＴと特異的に結合で
きるモノクローナル抗体である。この抗体を製造するに
は、試験動物、好ましくは近親交配させたマウスを、数
カ月かけて、４〜６週間おきに少なくとも４回、ヒト心
筋トロポニンＴおよびアジュバントで腹腔内的に免疫化
し、Ｂリンパ球を単離し、永久骨髄腫セルライン(細胞
系統)と融合し、クローンを単離し、それらから抗体を
単離する。
【００２２】好ましくは、水酸化アルミニウムおよびボ
ルダテラ・ペルツシス(Ｂordatellapertussis)またはフ
ロイントアジュバントをアジュバントとして使用する。
ルダテラ・ペルツシス(Ｂordatellapertussis)またはフ
ロイントアジュバントをアジュバントとして使用する。
【００２３】よく知られたケーラー(Ｋoehler)およびミ
ルスタイン(Ｍilstein)[ネイチャー(Ｎature)２５６(１
９７５)、４９５−４９７]の方法に従って、融合の間に
得られるハイブリッド細胞の１次培養を、通常の方法
で、例えば市販の細胞ソーターを用いて、または“限界
希釈(limiting dilution)"によって、クローンする。こ
れらの培養をさらに用いて、単離した心筋トロポニンＴ
および患者の血清中の心筋トロポニンＴと陽性に反応さ
せ、骨格筋から得たトロポニンＴと陰性に反応させる。
このようにして得られたハイブリドーマセルラインが本
発明のモノクローナル抗体を生成する。公知の方法に従
って、これらのセルラインを培養することができ、それ
らから生成したモノクローナル抗体を単離することがで
きる。
ルスタイン(Ｍilstein)[ネイチャー(Ｎature)２５６(１
９７５)、４９５−４９７]の方法に従って、融合の間に
得られるハイブリッド細胞の１次培養を、通常の方法
で、例えば市販の細胞ソーターを用いて、または“限界
希釈(limiting dilution)"によって、クローンする。こ
れらの培養をさらに用いて、単離した心筋トロポニンＴ
および患者の血清中の心筋トロポニンＴと陽性に反応さ
せ、骨格筋から得たトロポニンＴと陰性に反応させる。
このようにして得られたハイブリドーマセルラインが本
発明のモノクローナル抗体を生成する。公知の方法に従
って、これらのセルラインを培養することができ、それ
らから生成したモノクローナル抗体を単離することがで
きる。
【００２４】この方法で得たハイブリドーマセルライン
の例としては、クローン ７.１ Ａ１２.２−２２(ＥＣ
ＡＣＣ ８９０６０９０１)およびクローン ８.１ Ｆ
６.７−２(ＥＣＡＣＣ ８９０３０３０８)が挙げられ
る。該セルラインは、ヨーロピアン・コレクション・オ
ブ・アニマル・セル・カルチャーズ(Ｅuropean Ｃollec
tion of Ａnimal Ｃell Ｃultures)(イギリス)に各々引
用した番号の下に寄託されている。
の例としては、クローン ７.１ Ａ１２.２−２２(ＥＣ
ＡＣＣ ８９０６０９０１)およびクローン ８.１ Ｆ
６.７−２(ＥＣＡＣＣ ８９０３０３０８)が挙げられ
る。該セルラインは、ヨーロピアン・コレクション・オ
ブ・アニマル・セル・カルチャーズ(Ｅuropean Ｃollec
tion of Ａnimal Ｃell Ｃultures)(イギリス)に各々引
用した番号の下に寄託されている。
【００２５】このようにして得たポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体は、ヒト骨格筋トロポニンＴに
対する交差反応性が低く、５％未満であり、好ましくは
２％未満であること、およびトロポニンＩおよび他の筋
原線維タンパクとの交差反応性が２％未満であることに
よって区別される。
たはモノクローナル抗体は、ヒト骨格筋トロポニンＴに
対する交差反応性が低く、５％未満であり、好ましくは
２％未満であること、およびトロポニンＩおよび他の筋
原線維タンパクとの交差反応性が２％未満であることに
よって区別される。
【００２６】これらのポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体は、血清または血漿のような試料において
心筋壊死の特異的測定に特に適している。抗体は、その
ままでこれらの測定法用として、またはキメラ抗体また
はそのフラグメント、例えば、対応する免疫学的性質を
有するＦabフラグメントとして用いることができる。か
くして、「抗体」なる用語は、完全抗体およびそのフラグ
メントを包含する。
ローナル抗体は、血清または血漿のような試料において
心筋壊死の特異的測定に特に適している。抗体は、その
ままでこれらの測定法用として、またはキメラ抗体また
はそのフラグメント、例えば、対応する免疫学的性質を
有するＦabフラグメントとして用いることができる。か
くして、「抗体」なる用語は、完全抗体およびそのフラグ
メントを包含する。
【００２７】
【実施例】以下、参考例、実施例および添付の図面によ
って、本発明を説明するが、本発明はこれに限定される
ものではない。パーセントは、重量％を意味する。
って、本発明を説明するが、本発明はこれに限定される
ものではない。パーセントは、重量％を意味する。
【００２８】参考例１ トロポニンＴの単離 緩衝液１： ０.０５モル／リットル トリス(Ｔris)／ＨＣl、pＨ７.
０ ０.０５モル／リットル ＫＣl １０ml／リットル トリトン(Ｔriton) Ｘ １００ ２ミリモル／リットル ＥＤＴＡ ０.５ミリモル／リットル ＤＴＴ(ジチオトレイトール) ０.０２％ アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ） ２ミリモル／リットル ＰＭＳＦ(フッ化フェニルメチル
スルホニル) ５ミリモル／リットル アミノカプロン酸 ２.５ml トラジロール(Ｔrasylol)／リットル ０.２mg ペプスタチン(Ｐepstatin)／リットル
０ ０.０５モル／リットル ＫＣl １０ml／リットル トリトン(Ｔriton) Ｘ １００ ２ミリモル／リットル ＥＤＴＡ ０.５ミリモル／リットル ＤＴＴ(ジチオトレイトール) ０.０２％ アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ） ２ミリモル／リットル ＰＭＳＦ(フッ化フェニルメチル
スルホニル) ５ミリモル／リットル アミノカプロン酸 ２.５ml トラジロール(Ｔrasylol)／リットル ０.２mg ペプスタチン(Ｐepstatin)／リットル
【００２９】緩衝液２： ０.０５モル／リットル トリス／ＨＣl、pＨ７.０ １モル／リットル ＫＣl ５モル／リットル 尿素 ２ミリモル／リットル ＥＤＴＡ ０.０２％ アジ化ナトリウム(ｗ／ｖ)
【００３０】緩衝液３： ５ミリモル／リットル リン酸カリウム、pＨ７.３ ２モル／リットル 尿素 ０.６モル／リットル ＫＣl ０.５ミリモル／リットル ＤＴＴ ０.０２％ アジ化ナトリウム(ｗ／ｖ)
【００３１】緩衝液４： ０.０５モル／リットル トリス／ＨＣl、pＨ７.８ ６モル／リットル 尿素 ０.０１モル／リットル ＮaＣl ２ミリモル／リットル ＥＤＴＡ ０.５ミリモル／リットル ＤＴＴ ０.０２％ アジ化ナトリウム(ｗ／ｖ）
【００３２】組織（弁および血管を除いた左心室)３０
０gを小片に切り刻み、４℃で最高１分間、４容量倍の
緩衝液１中においてミキサーで断続的にホモジナイズし
た。４℃で１５分間、２７５００gで不溶性成分を遠心
分離し、上清が完全に透明になるまでペレットを１リッ
トルの緩衝液１で洗浄した。
０gを小片に切り刻み、４℃で最高１分間、４容量倍の
緩衝液１中においてミキサーで断続的にホモジナイズし
た。４℃で１５分間、２７５００gで不溶性成分を遠心
分離し、上清が完全に透明になるまでペレットを１リッ
トルの緩衝液１で洗浄した。
【００３３】このペレットを、５〜６容量倍の緩衝液２
に取り、４℃で３〜４時間撹拌した。これを４℃で１５
分間、２７５００gで遠心分離した。
に取り、４℃で３〜４時間撹拌した。これを４℃で１５
分間、２７５００gで遠心分離した。
【００３４】５ミリモル／リットル ＡＴＰを上清に添
加し(硫酸アンモニウムの添加後の最終濃度)、４℃の硫
酸アンモニウム飽和水溶液／２ミリモル／リットルＥＤ
ＴＡの添加によって、３５％硫酸アンモニウムにした。
硫酸アンモニウム溶液は予めＫＯＨで中和しておいた。
ゆっくりと撹拌しながら、４℃で一晩インキュベートし
た。その後、４℃で２０分間、２７５００gで沈澱物を
遠心分離した。
加し(硫酸アンモニウムの添加後の最終濃度)、４℃の硫
酸アンモニウム飽和水溶液／２ミリモル／リットルＥＤ
ＴＡの添加によって、３５％硫酸アンモニウムにした。
硫酸アンモニウム溶液は予めＫＯＨで中和しておいた。
ゆっくりと撹拌しながら、４℃で一晩インキュベートし
た。その後、４℃で２０分間、２７５００gで沈澱物を
遠心分離した。
【００３５】上清に固形の硫酸アンモニウムを添加して
硫酸アンモニウム４５％飽和にし、４℃で４５分間撹拌
し、遠心分離した。３５〜４５％硫酸アンモニウム沈澱
物は、トロポニンＴを含有しており、さらに処理した。
ペレットを２５mlの緩衝液３にとり(ＯＤ ２８０nmは
１.５〜２である)、４℃で緩衝液３に対して透析し、そ
の間に緩衝液を少なくとも２回替えた。
硫酸アンモニウム４５％飽和にし、４℃で４５分間撹拌
し、遠心分離した。３５〜４５％硫酸アンモニウム沈澱
物は、トロポニンＴを含有しており、さらに処理した。
ペレットを２５mlの緩衝液３にとり(ＯＤ ２８０nmは
１.５〜２である)、４℃で緩衝液３に対して透析し、そ
の間に緩衝液を少なくとも２回替えた。
【００３６】透析した溶液をヒドロキシルアパタイトカ
ラムにかけ[バイオゲル・エイチ・ティー・ピー(Ｂioge
l ＨＴＰ)、約２５mgタンパク／５０mlカラム容量、流
速：１カラム容量／時間で負荷した]、４〜５カラム容
量倍の緩衝液３で再洗浄し、緩衝液３中５ミリモル／リ
ットル〜５５ミリモル／リットルのリン酸カリウム勾配
液で、１カラム容量倍／時で２０時間以内に溶離した。
トロポニンＴを含有する画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ゲル勾
配５〜２５％)を用いて測定し、プールし、緩衝液４に
対して透析した。
ラムにかけ[バイオゲル・エイチ・ティー・ピー(Ｂioge
l ＨＴＰ)、約２５mgタンパク／５０mlカラム容量、流
速：１カラム容量／時間で負荷した]、４〜５カラム容
量倍の緩衝液３で再洗浄し、緩衝液３中５ミリモル／リ
ットル〜５５ミリモル／リットルのリン酸カリウム勾配
液で、１カラム容量倍／時で２０時間以内に溶離した。
トロポニンＴを含有する画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ゲル勾
配５〜２５％)を用いて測定し、プールし、緩衝液４に
対して透析した。
【００３７】透析した溶液をカラムにかけ[ディ・イー
・エー・イー−サーバセル(ＤＥＡＥ−Ｓervacel) ＳＳ
２３、カラム容量２０〜３０ml、流速:１カラム容量／
時]、３カラム容量倍の緩衝液４で再洗浄し、緩衝液４
中０.０１モル／リットル〜０.２５モル／リットルのＮ
aＣl勾配液で、１カラム容量倍／時で２０時間以内に溶
離した。溶出液中にトロポニンＩが見られた。トロポニ
ンＴおよびトロポニンＣは別々に溶出した。ＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥに従って、トロポニンＴを含有する画分を集め、
緩衝液４に対して再透析し、後の使用のために−２０℃
で凍結させた。筋肉３００gからトロポニンＴ約６〜８m
gが得られた。
・エー・イー−サーバセル(ＤＥＡＥ−Ｓervacel) ＳＳ
２３、カラム容量２０〜３０ml、流速:１カラム容量／
時]、３カラム容量倍の緩衝液４で再洗浄し、緩衝液４
中０.０１モル／リットル〜０.２５モル／リットルのＮ
aＣl勾配液で、１カラム容量倍／時で２０時間以内に溶
離した。溶出液中にトロポニンＩが見られた。トロポニ
ンＴおよびトロポニンＣは別々に溶出した。ＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥに従って、トロポニンＴを含有する画分を集め、
緩衝液４に対して再透析し、後の使用のために−２０℃
で凍結させた。筋肉３００gからトロポニンＴ約６〜８m
gが得られた。
【００３８】参考例２ ヒトトロポニンＴに対するモノクローナル抗体の単離 ８〜１２週齢のＢalb／c マウスを、フロイント完全ア
ジュバントと一緒にトロポニンＴ(参考例１に従ってヒ
ト心筋から単離した)１００μgで腹腔内投与により免疫
した。６週間後、４週間おきにさらに３回、各５０μg
のトロポニンＴで免疫し、水酸化アルミニウムに吸着さ
せ、ボルダテラ・ペルツシスを腹腔内投与した。最後の
免疫の１週間後に、血液試料を採取し、試験動物の血清
中の抗体力価を測定した。免疫が陽性であれば、融合を
行う。融合の４日、３日および２日前に、それらを、各
々、ＰＢＳ(リン酸塩緩衝化食塩水)中トロポニンＴ１０
０μgで静脈内投与により再度免疫した。
ジュバントと一緒にトロポニンＴ(参考例１に従ってヒ
ト心筋から単離した)１００μgで腹腔内投与により免疫
した。６週間後、４週間おきにさらに３回、各５０μg
のトロポニンＴで免疫し、水酸化アルミニウムに吸着さ
せ、ボルダテラ・ペルツシスを腹腔内投与した。最後の
免疫の１週間後に、血液試料を採取し、試験動物の血清
中の抗体力価を測定した。免疫が陽性であれば、融合を
行う。融合の４日、３日および２日前に、それらを、各
々、ＰＢＳ(リン酸塩緩衝化食塩水)中トロポニンＴ１０
０μgで静脈内投与により再度免疫した。
【００３９】融合のために、免疫したマウスの１×１０
8脾臓細胞を、ガルフレ(Ｇalfre)[エンザイモロジー(Ｅ
nzymology)、７３、１９８１、p.３の方法]に従って２
×１０7骨髄腫細胞(Ｐ３ｘ６３Ａg８−６５３、ＡＴＣ
Ｃ−ＣＲＬ ８３７５)と混合し、その後、１０分間遠心
分離した(３００g、４℃)。細胞を血清不含培地で洗浄
し、４００gで再度遠心分離した。上清を吸引し、細胞
沈殿物に５０％ＰＥＧ溶液[分子量４０００、メルク・
カンパニー(Ｍerck Ｃompany)]１mlを添加した。その
後、室温で１５分間のうちに、胎児ウシ血清(ＦＣＳ)を
含まないＲＰＭＩ１６４０培地[ＲＰＭＩ＝ローズウェ
ル・パーカー・メモリー・インスティチュート(Ｒosewe
ll Ｐarker Ｍemory Ｉnstitute)]を用いて、ゆっくり
と２０mlに希釈した。その後、細胞懸濁液を４００gで
１０分間遠心分離し、細胞沈降物を選択培地(ＲＰＭＩ
１６４０、１０％ＦＣＳ、１００ミリモル／リットル
ヒポキサンチン、１mg／mlアザセリン)に取った。成長
因子に関しては、供給細胞の代わりとしてＨＥＣＳ[ヒ
ト内皮培養上清(Ｈuman Ｅndothelial Ｃulture Ｓuper
natant)][コウスター・カンパニー(Ｃostar Ｃompan
y)、Ｎo.６１１０]を用いた。
8脾臓細胞を、ガルフレ(Ｇalfre)[エンザイモロジー(Ｅ
nzymology)、７３、１９８１、p.３の方法]に従って２
×１０7骨髄腫細胞(Ｐ３ｘ６３Ａg８−６５３、ＡＴＣ
Ｃ−ＣＲＬ ８３７５)と混合し、その後、１０分間遠心
分離した(３００g、４℃)。細胞を血清不含培地で洗浄
し、４００gで再度遠心分離した。上清を吸引し、細胞
沈殿物に５０％ＰＥＧ溶液[分子量４０００、メルク・
カンパニー(Ｍerck Ｃompany)]１mlを添加した。その
後、室温で１５分間のうちに、胎児ウシ血清(ＦＣＳ)を
含まないＲＰＭＩ１６４０培地[ＲＰＭＩ＝ローズウェ
ル・パーカー・メモリー・インスティチュート(Ｒosewe
ll Ｐarker Ｍemory Ｉnstitute)]を用いて、ゆっくり
と２０mlに希釈した。その後、細胞懸濁液を４００gで
１０分間遠心分離し、細胞沈降物を選択培地(ＲＰＭＩ
１６４０、１０％ＦＣＳ、１００ミリモル／リットル
ヒポキサンチン、１mg／mlアザセリン)に取った。成長
因子に関しては、供給細胞の代わりとしてＨＥＣＳ[ヒ
ト内皮培養上清(Ｈuman Ｅndothelial Ｃulture Ｓuper
natant)][コウスター・カンパニー(Ｃostar Ｃompan
y)、Ｎo.６１１０]を用いた。
【００４０】ウエル当たり５×１０4細胞で２４ウエル
プレート[ナンク・カンパニー(ＮuncＣompany)]上に融
合細胞を撒いた。７〜１０日後にクローンの成長が肉眼
で見られた。参考例３に記載のＥＬＩＳＡ法によって、
１次培養の培養上澄液を試験した。抗原-特異的な抗体
を含有する１次培養を、９６ウエル細胞培養プレート
(ナンク・カンパニー)上で蛍光活性化細胞ソーターを用
いてさらにクローンした。供給細胞の代わりとしてＨＥ
ＣＳを用いた(前記参照)。
プレート[ナンク・カンパニー(ＮuncＣompany)]上に融
合細胞を撒いた。７〜１０日後にクローンの成長が肉眼
で見られた。参考例３に記載のＥＬＩＳＡ法によって、
１次培養の培養上澄液を試験した。抗原-特異的な抗体
を含有する１次培養を、９６ウエル細胞培養プレート
(ナンク・カンパニー)上で蛍光活性化細胞ソーターを用
いてさらにクローンした。供給細胞の代わりとしてＨＥ
ＣＳを用いた(前記参照)。
【００４１】このようにして、ハイブリドーマセルライ
ンクローン７.１Ａ１２.２−２２および８.１Ｆ６.７−
２の両者を単離することができた。これらは受託機関Ｅ
ＣＡＣＣ[ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマ
ル・セル・カルチャーズ(Ｅuropean Ｃollection of Ａ
nimal Ｃell Ｃultures)]に、下記受託番号の下で寄託
されている：ＥＣＡＣＣ ８９０６０９０１(＝クローン
７.１Ａ１２.２−２２)およびＥＣＡＣＣ ８９０３０
３０８(＝クローン ８.１Ｆ６.７−２)。
ンクローン７.１Ａ１２.２−２２および８.１Ｆ６.７−
２の両者を単離することができた。これらは受託機関Ｅ
ＣＡＣＣ[ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマ
ル・セル・カルチャーズ(Ｅuropean Ｃollection of Ａ
nimal Ｃell Ｃultures)]に、下記受託番号の下で寄託
されている：ＥＣＡＣＣ ８９０６０９０１(＝クローン
７.１Ａ１２.２−２２)およびＥＣＡＣＣ ８９０３０
３０８(＝クローン ８.１Ｆ６.７−２)。
【００４２】腹水を得るため、プリスタン(Ｐristan)
０.５mlで１回または２回前処置をしたＢalb／c マウス
に５×１０6ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。２
〜３週間後、マウスの腹から腹水を得ることができた。
通常の方法でこの腹水から抗体を単離することができ
た。これらモノクローナル抗体はヒト心筋トロポニンＴ
に対して特異的に指向し、骨格筋から得たトロポニンＴ
との交差反応性は全く示さないか、または僅かしか示さ
なかった。次に、これらをＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−２
２(クローン ７.１Ａ１２.２−２２由来)またはＭＡＢ
８.１Ｆ６.７−２(クローン ８.１Ｆ６.７−２由来)と
命名した。両モノクローナル抗体は、サブクラスＩgＧ
１／カッパに属する。
０.５mlで１回または２回前処置をしたＢalb／c マウス
に５×１０6ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。２
〜３週間後、マウスの腹から腹水を得ることができた。
通常の方法でこの腹水から抗体を単離することができ
た。これらモノクローナル抗体はヒト心筋トロポニンＴ
に対して特異的に指向し、骨格筋から得たトロポニンＴ
との交差反応性は全く示さないか、または僅かしか示さ
なかった。次に、これらをＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−２
２(クローン ７.１Ａ１２.２−２２由来)またはＭＡＢ
８.１Ｆ６.７−２(クローン ８.１Ｆ６.７−２由来)と
命名した。両モノクローナル抗体は、サブクラスＩgＧ
１／カッパに属する。
【００４３】参考例３ ヒト心筋トロポニンＴに対する抗体のスクリーニング試
験 免疫したマウスの血清中のトロポニンＴに対する抗体の
存在および特異性を測定するために、ハイブリッド細胞
の培養懸濁液または腹水において、試験の基本としてＥ
ＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、被覆緩衝剤(０.２モル
／リットル 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pＨ
９.３〜９.５)中、室温で１時間、ヒツジ由来のヒトト
ロポニンＴに対する１０μg／mlポリクローナル抗体(Ｉ
gＧ)(免疫吸着的に精製；骨格筋トロポニンＴと交差反
応せず、心筋トロポニンＴと交差反応する；参考例６に
従って調製)で微量滴定プレートを被覆した。０.９％塩
化ナトリウム溶液および１％ウシ血清アルブミンで２０
分間再被覆した。その後、洗浄緩衝液(０.９％塩化ナト
リウム溶液)で洗浄した。室温で１時間、振盪しなが
ら、ウエル当たり１００μlを用いて、抗原、精製した
１μg／mlヒトトロポニンＴまたは「天然(native)」トロ
ポニンＴ、すなわち梗塞血清(１：２に希釈)のインキュ
ベーションを行った。次いで、洗浄緩衝液で再度２回洗
浄した。室温で１時間、振盪しながら、ウエル当たり１
００μlを用いて、試料をインキュベートした。次い
で、洗浄液で再度２回洗浄した。次に、さらに、室温で
１時間、振盪しながら、ウエル当たり２５mＵのＰＡＢ
＜Ｍ−Ｆcg＞Ｓ−Ｆab(ＩＳ)-ペルオキシダーゼコンジ
ュゲート１００μlと一緒にインキュベートした。ここ
で、ＰＡＢ＜Ｍ−Ｆcg＞Ｓ−Ｆab(ＩＳ)は、免疫吸着に
よって精製したヒツジ由来のポリクローナル抗-マウス
Ｆcγ抗体のＦabフラグメントである。洗浄緩衝液を用
いた洗浄工程の後、通常の方法(例えば、室温で３０分
間、ＡＢＴＳを用いて、４０５nmでの吸光度の差をmＡ
で測定した)で、ペルオキシダーゼ活性を測定した。
験 免疫したマウスの血清中のトロポニンＴに対する抗体の
存在および特異性を測定するために、ハイブリッド細胞
の培養懸濁液または腹水において、試験の基本としてＥ
ＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、被覆緩衝剤(０.２モル
／リットル 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pＨ
９.３〜９.５)中、室温で１時間、ヒツジ由来のヒトト
ロポニンＴに対する１０μg／mlポリクローナル抗体(Ｉ
gＧ)(免疫吸着的に精製；骨格筋トロポニンＴと交差反
応せず、心筋トロポニンＴと交差反応する；参考例６に
従って調製)で微量滴定プレートを被覆した。０.９％塩
化ナトリウム溶液および１％ウシ血清アルブミンで２０
分間再被覆した。その後、洗浄緩衝液(０.９％塩化ナト
リウム溶液)で洗浄した。室温で１時間、振盪しなが
ら、ウエル当たり１００μlを用いて、抗原、精製した
１μg／mlヒトトロポニンＴまたは「天然(native)」トロ
ポニンＴ、すなわち梗塞血清(１：２に希釈)のインキュ
ベーションを行った。次いで、洗浄緩衝液で再度２回洗
浄した。室温で１時間、振盪しながら、ウエル当たり１
００μlを用いて、試料をインキュベートした。次い
で、洗浄液で再度２回洗浄した。次に、さらに、室温で
１時間、振盪しながら、ウエル当たり２５mＵのＰＡＢ
＜Ｍ−Ｆcg＞Ｓ−Ｆab(ＩＳ)-ペルオキシダーゼコンジ
ュゲート１００μlと一緒にインキュベートした。ここ
で、ＰＡＢ＜Ｍ−Ｆcg＞Ｓ−Ｆab(ＩＳ)は、免疫吸着に
よって精製したヒツジ由来のポリクローナル抗-マウス
Ｆcγ抗体のＦabフラグメントである。洗浄緩衝液を用
いた洗浄工程の後、通常の方法(例えば、室温で３０分
間、ＡＢＴＳを用いて、４０５nmでの吸光度の差をmＡ
で測定した)で、ペルオキシダーゼ活性を測定した。
【００４４】参考例４ ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応性の測定 参考例３の記載に従って、本発明の方法を行った。最初
に、心筋トロポニンＴの反応性を測定した。次に、交差
反応を試験する抗原(骨格筋トロポニンＴ)を各モノクロ
ーナル抗体に、濃度を増加させながら添加した。その
後、交差反応を下記式に従って算出した：
に、心筋トロポニンＴの反応性を測定した。次に、交差
反応を試験する抗原(骨格筋トロポニンＴ)を各モノクロ
ーナル抗体に、濃度を増加させながら添加した。その
後、交差反応を下記式に従って算出した：
【００４５】
【数１】
【００４６】参考例５ エピトープ特異性の測定 室温で１時間、または４℃で一晩、０.２ミリモル／リ
ットル 炭酸塩緩衝液(pＨ９.６)に入れたマウス抗体の
Ｆcg領域に対する１０μg／mlヒツジポリクローナル抗
体で、微量滴定プレートを被覆した。その後、２０分
間、インキュベーション緩衝液(０.９％塩化ナトリウム
溶液および１％ウシ血清アルブミン)で再被覆し、次い
で、洗浄緩衝液[０.９％塩化ナトリウム溶液、０.０５
％トゥイーン(Ｔween)２０]で洗浄した。その後、イン
キュベーション緩衝液(１％ウシ血清アルブミン含有０.
９％塩化ナトリウム溶液)中１０μg／mlモノクローナル
抗体(ＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−２２、ＭＡＢ １)１００
μlを添加し、室温で１時間、振盪しながらインキュベ
ートした。ペルオキシダーゼコンジュゲートとして存在
する第２のモノクローナル抗体(ＭＡＢ ８.１Ｆ６.７−
２、ＭＡＢ ２)を、室温で、溶液(１００mＵ／ml)中、
抗原(１μg／ml心筋トロポニンＴ)と一緒に予備インキ
ュベートした。
ットル 炭酸塩緩衝液(pＨ９.６)に入れたマウス抗体の
Ｆcg領域に対する１０μg／mlヒツジポリクローナル抗
体で、微量滴定プレートを被覆した。その後、２０分
間、インキュベーション緩衝液(０.９％塩化ナトリウム
溶液および１％ウシ血清アルブミン)で再被覆し、次い
で、洗浄緩衝液[０.９％塩化ナトリウム溶液、０.０５
％トゥイーン(Ｔween)２０]で洗浄した。その後、イン
キュベーション緩衝液(１％ウシ血清アルブミン含有０.
９％塩化ナトリウム溶液)中１０μg／mlモノクローナル
抗体(ＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−２２、ＭＡＢ １)１００
μlを添加し、室温で１時間、振盪しながらインキュベ
ートした。ペルオキシダーゼコンジュゲートとして存在
する第２のモノクローナル抗体(ＭＡＢ ８.１Ｆ６.７−
２、ＭＡＢ ２)を、室温で、溶液(１００mＵ／ml)中、
抗原(１μg／ml心筋トロポニンＴ)と一緒に予備インキ
ュベートした。
【００４７】ＭＡＢ １と一緒にプレートをインキュベ
ートした後、過剰の抗体を洗浄によって除去した。その
後、インキュベーション緩衝液中１％マウス正常血清で
プレートを再被覆した。予備インキュベートしたトロポ
ニンＴ／ＭＡＢ ２ペルオキシダーゼ複合体１００μlを
プレート上に置き、室温で１時間、振盪しながらインキ
ュベートした。結合したペルオキシダーゼ活性を、基質
としてＡＢＴＳを用いて肉眼で観察できるようにした。
ＭＡＢ ２がＭＡＢ １と同一であるかまたは重複したエ
ピトープであると認識すると、ＭＡＢ １／トロポニン
Ｔ／ＭＡＢ ２の間にペアが形成されず、その結果、基
質反応は起こらない。得られた結果は、モノクローナル
抗体７.１Ａ１２.２−２２および８.１Ｆ６.７−２の両
者が心筋トロポニンＴ抗原の異なるエピトープに指向し
ていることを示した。
ートした後、過剰の抗体を洗浄によって除去した。その
後、インキュベーション緩衝液中１％マウス正常血清で
プレートを再被覆した。予備インキュベートしたトロポ
ニンＴ／ＭＡＢ ２ペルオキシダーゼ複合体１００μlを
プレート上に置き、室温で１時間、振盪しながらインキ
ュベートした。結合したペルオキシダーゼ活性を、基質
としてＡＢＴＳを用いて肉眼で観察できるようにした。
ＭＡＢ ２がＭＡＢ １と同一であるかまたは重複したエ
ピトープであると認識すると、ＭＡＢ １／トロポニン
Ｔ／ＭＡＢ ２の間にペアが形成されず、その結果、基
質反応は起こらない。得られた結果は、モノクローナル
抗体７.１Ａ１２.２−２２および８.１Ｆ６.７−２の両
者が心筋トロポニンＴ抗原の異なるエピトープに指向し
ていることを示した。
【００４８】実施例１ ＥＬＩＳＡ法によるトロポニンＴの測定のための酵素-
免疫検定法 試薬１ １.２５μg／mlビオチニル化ＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−
２２[ジェイ・エイチ・ピーターズ等(Ｊ.Ｈ.Ｐeters et
al.)、モノクローナレ・アンチケルペル(Ｍonoklonale
Ａntikoerper)、スプリンゲル・ベルラグ(Ｓpringer
Ｖerlag)、ベルリン、１９８５、第２０９頁〜第２１２
頁] １０ミリモル／リットル クエン酸塩緩衝剤 ４７ミリモル／リットル リン酸塩緩衝剤、pＨ６.３ ５０mＵ／mlペルオキシダーゼとモノクローナル抗体８.
１Ｆ６.７−２とのコンジュゲート[ダブリュ・ナップ
(Ｗ.Ｋnapp)、ケイ・コルーバー(Ｋ.Ｋolubar)、ジー・
ウィック(Ｇ.Ｗick)の編集によるイムノフルオレセンス
・アンド・リレイテッド・ステイニング・テクニクス
(Ｉmmunofluorescence and Ｒelated Ｓtaining Ｔechn
iques)(第２１５頁〜第２２４頁、エルスヴァイア(Ｅls
evier)／ノース・ホランド(Ｎorth Ｈolland)、アムス
テルダム)におけるエム・ビー・ウイルソン(Ｍ.Ｂ.Ｗil
son)、ピー・ケイ・ナカネ(Ｐ.Ｋ.Ｎakane)(１９８７)
の方法と類似の方法で調製した、活性の値はペルオキシ
ダーゼに関係する]。
免疫検定法 試薬１ １.２５μg／mlビオチニル化ＭＡＢ ７.１Ａ１２.２−
２２[ジェイ・エイチ・ピーターズ等(Ｊ.Ｈ.Ｐeters et
al.)、モノクローナレ・アンチケルペル(Ｍonoklonale
Ａntikoerper)、スプリンゲル・ベルラグ(Ｓpringer
Ｖerlag)、ベルリン、１９８５、第２０９頁〜第２１２
頁] １０ミリモル／リットル クエン酸塩緩衝剤 ４７ミリモル／リットル リン酸塩緩衝剤、pＨ６.３ ５０mＵ／mlペルオキシダーゼとモノクローナル抗体８.
１Ｆ６.７−２とのコンジュゲート[ダブリュ・ナップ
(Ｗ.Ｋnapp)、ケイ・コルーバー(Ｋ.Ｋolubar)、ジー・
ウィック(Ｇ.Ｗick)の編集によるイムノフルオレセンス
・アンド・リレイテッド・ステイニング・テクニクス
(Ｉmmunofluorescence and Ｒelated Ｓtaining Ｔechn
iques)(第２１５頁〜第２２４頁、エルスヴァイア(Ｅls
evier)／ノース・ホランド(Ｎorth Ｈolland)、アムス
テルダム)におけるエム・ビー・ウイルソン(Ｍ.Ｂ.Ｗil
son)、ピー・ケイ・ナカネ(Ｐ.Ｋ.Ｎakane)(１９８７)
の方法と類似の方法で調製した、活性の値はペルオキシ
ダーゼに関係する]。
【００４９】試薬２ １００ミリモル／リットル リン酸塩−クエン酸塩緩衝
剤、pＨ４.４ ３.２ミリモル／リットル 過ホウ素酸ナトリウム １.９ミリモル／リットル ＡＢＴＳ(２,２'−アジノ−
ジ−[エチルベンゾチアゾリン−スルホネート(６)])。
剤、pＨ４.４ ３.２ミリモル／リットル 過ホウ素酸ナトリウム １.９ミリモル／リットル ＡＢＴＳ(２,２'−アジノ−
ジ−[エチルベンゾチアゾリン−スルホネート(６)])。
【００５０】試料として、３、５、１０または２５ng／
mlトロポニンＴを追加したヒト血清を用いた。ストレプ
トアビジンで被覆したポリスチレン管(ＥＰ−Ａ−０２
６９０９２に従って調製)を用いて反応を行った。
mlトロポニンＴを追加したヒト血清を用いた。ストレプ
トアビジンで被覆したポリスチレン管(ＥＰ−Ａ−０２
６９０９２に従って調製)を用いて反応を行った。
【００５１】測定法：２０〜２５℃で６０分間、管中
で、１mlの試薬１と一緒に試料０.２mlをインキュベー
トした。吸引し、水道水で２回洗浄した。次に、試薬２
を添加し、２０〜２５℃で３０分間インキュベートし、
光度計で４２０nmでの吸光度を測定した。この方法で、
標準曲線(第１図)が得られ、これによって、患者試料の
トロポニンＴ濃度を測定することができる。
で、１mlの試薬１と一緒に試料０.２mlをインキュベー
トした。吸引し、水道水で２回洗浄した。次に、試薬２
を添加し、２０〜２５℃で３０分間インキュベートし、
光度計で４２０nmでの吸光度を測定した。この方法で、
標準曲線(第１図)が得られ、これによって、患者試料の
トロポニンＴ濃度を測定することができる。
【００５２】参考例６ トロポニンＴに対するポリクローナル抗体の単離および
精製 最初に、フロイント完全アジュバント(ＣＦＡ)中０.１m
g／mlヒトトロポニンＴの溶液５５μlでヒツジを免疫し
た。さらに、７日目、１４日目および３０日目に免疫を
行った。次に、３０日毎に免疫した。これらの後の免疫
には、各々、ＣＦＡ中０.０５mg／mlトロポニンＴ溶液
２８μlを用いた。６カ月後、生の血清が得られた。生
の血清１リットルにエアロジル(Ａerosil)[製造元：デ
グッサ(Ｄegussa)]１５gを添加し、室温で１時間撹拌
し、遠心分離した。その後、上清に１.７モル／リット
ル 硫酸アンモニウムを添加し、室温で２時間ゆっくり
と撹拌した。その後、沈殿物を遠心分離し、透析緩衝液
(１５ミリモル／リットル リン酸カリウム、５０ミリモ
ル／リットル 塩化ナトリウム、pＨ７.０)０.２リット
ル中でホモジナイズし、透析緩衝液１０リットルに対し
て４℃で４回透析した。遠心分離の後、透析した生成物
を、溶離液として透析緩衝液を用いて、ＤＥ５２セルロ
ースによって精製した。
精製 最初に、フロイント完全アジュバント(ＣＦＡ)中０.１m
g／mlヒトトロポニンＴの溶液５５μlでヒツジを免疫し
た。さらに、７日目、１４日目および３０日目に免疫を
行った。次に、３０日毎に免疫した。これらの後の免疫
には、各々、ＣＦＡ中０.０５mg／mlトロポニンＴ溶液
２８μlを用いた。６カ月後、生の血清が得られた。生
の血清１リットルにエアロジル(Ａerosil)[製造元：デ
グッサ(Ｄegussa)]１５gを添加し、室温で１時間撹拌
し、遠心分離した。その後、上清に１.７モル／リット
ル 硫酸アンモニウムを添加し、室温で２時間ゆっくり
と撹拌した。その後、沈殿物を遠心分離し、透析緩衝液
(１５ミリモル／リットル リン酸カリウム、５０ミリモ
ル／リットル 塩化ナトリウム、pＨ７.０)０.２リット
ル中でホモジナイズし、透析緩衝液１０リットルに対し
て４℃で４回透析した。遠心分離の後、透析した生成物
を、溶離液として透析緩衝液を用いて、ＤＥ５２セルロ
ースによって精製した。
【００５３】溶出液を補足し、１５mg／mlのタンパク濃
度で、５０ミリモル／リットル リン酸カリウム、pＨ
７.５、１５０ミリモル／リットル 塩化ナトリウム(Ｐ
ＢＳ)、０.１％ナトリウムアジドの最終濃度にし、室温
で、骨格トロポニンＴ免疫吸着剤を充填したカラムに通
し、骨格トロポニンＴと交差反応をする抗体を除去し
た。抗体画分における骨格トロポニンＴ吸着剤に結合し
ない抗体の交差反応性を参考例４のＥＬＩＳＡ法で試験
し、所望の交差反応性が得られるまで、この操作を繰り
返した。次いで、抗体画分を心筋トロポニンＴ免疫吸着
剤カラムにのせ、ＰＢＳ／０.１％アジドでタンパクを
洗浄除去した。その後、１モル／リットルプロピオン酸
で溶離した。溶出液を１５ミリモル／リットル リン酸
カリウムおよび５０ミリモル／リットル 塩化ナトリウ
ム（pＨ７.０）に対して透析した。スフェロジル(Ｓphe
rosil)[ローン・プーラン(Ｒhone Ｐoulenc) ＸＯＣ０
０５]を１５％硝酸および水で洗浄し、乾燥させた後、
８５℃で一晩、ＤＭＳＯ中１０％(ｖ／ｖ)３−(トリエ
トキシシリル)プロピルアミンを用いてスフェロジル−
ＮＨ2に転換して、トロポニンＴ免疫吸着剤を調製し
た。この反応の後、ＤＭＳＯおよびイソプロパノールで
洗浄し、この吸着剤を５０℃で乾燥した。
度で、５０ミリモル／リットル リン酸カリウム、pＨ
７.５、１５０ミリモル／リットル 塩化ナトリウム(Ｐ
ＢＳ)、０.１％ナトリウムアジドの最終濃度にし、室温
で、骨格トロポニンＴ免疫吸着剤を充填したカラムに通
し、骨格トロポニンＴと交差反応をする抗体を除去し
た。抗体画分における骨格トロポニンＴ吸着剤に結合し
ない抗体の交差反応性を参考例４のＥＬＩＳＡ法で試験
し、所望の交差反応性が得られるまで、この操作を繰り
返した。次いで、抗体画分を心筋トロポニンＴ免疫吸着
剤カラムにのせ、ＰＢＳ／０.１％アジドでタンパクを
洗浄除去した。その後、１モル／リットルプロピオン酸
で溶離した。溶出液を１５ミリモル／リットル リン酸
カリウムおよび５０ミリモル／リットル 塩化ナトリウ
ム（pＨ７.０）に対して透析した。スフェロジル(Ｓphe
rosil)[ローン・プーラン(Ｒhone Ｐoulenc) ＸＯＣ０
０５]を１５％硝酸および水で洗浄し、乾燥させた後、
８５℃で一晩、ＤＭＳＯ中１０％(ｖ／ｖ)３−(トリエ
トキシシリル)プロピルアミンを用いてスフェロジル−
ＮＨ2に転換して、トロポニンＴ免疫吸着剤を調製し
た。この反応の後、ＤＭＳＯおよびイソプロパノールで
洗浄し、この吸着剤を５０℃で乾燥した。
【００５４】スフェロジル−ＮＨ2を１０％グルタルジ
アルデヒド溶液(pＨ３.７)と混合し、５５℃で２時間加
熱した。その後、真空下、ガラスフィルターによって懸
濁液を濾過した。ついで、スフェロジルの７容量倍の再
蒸留水で洗浄し、５容量倍の１０ミリモル／リットル
リン酸カリウム、pＨ８.０／０.１モル／リットル 塩化
ナトリウムで再度洗浄した。次いで、用いたスフェロジ
ルの約５０％の容量の１０ミリモル／リットル リン酸
カリウム、pＨ８／０.１モル／リットル 塩化ナトリウ
ム中、スフェロジル１ml当たりトロポニンＴ１０mgを丸
底フラスコに入れた。フラスコを、室温で一晩、回転エ
バポレーター上で回転させた。濾過の後、スフェロジル
を０.９％ＮaＣl溶液およびエタノールアミン溶液で、
再度、数回洗浄した。その後、３容量部のエタノールア
ミン溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。
濾過を再開した後、再度ＮaＣl溶液で洗浄した。その
後、ＰＢＳで免疫吸着剤をpＨ７.５に調節し、ＰＢＳ／
アジ化ナトリウムで平衡化した。４℃で貯蔵した。
アルデヒド溶液(pＨ３.７)と混合し、５５℃で２時間加
熱した。その後、真空下、ガラスフィルターによって懸
濁液を濾過した。ついで、スフェロジルの７容量倍の再
蒸留水で洗浄し、５容量倍の１０ミリモル／リットル
リン酸カリウム、pＨ８.０／０.１モル／リットル 塩化
ナトリウムで再度洗浄した。次いで、用いたスフェロジ
ルの約５０％の容量の１０ミリモル／リットル リン酸
カリウム、pＨ８／０.１モル／リットル 塩化ナトリウ
ム中、スフェロジル１ml当たりトロポニンＴ１０mgを丸
底フラスコに入れた。フラスコを、室温で一晩、回転エ
バポレーター上で回転させた。濾過の後、スフェロジル
を０.９％ＮaＣl溶液およびエタノールアミン溶液で、
再度、数回洗浄した。その後、３容量部のエタノールア
ミン溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。
濾過を再開した後、再度ＮaＣl溶液で洗浄した。その
後、ＰＢＳで免疫吸着剤をpＨ７.５に調節し、ＰＢＳ／
アジ化ナトリウムで平衡化した。４℃で貯蔵した。
【００５５】実施例２ 心筋壊死の判定 実施例１に従って、不安定な狭心症の症状を有する３７
体の患者の血清において、トロポニンＴ測定の酵素-免
疫検定法を行った。これらの患者のうち１３人(３０％)
においてトロポニンＴの有意な増加が見られた。これ
は、トロポニンＴの測定が、トロポニンＩ試験と比較し
て小さい梗塞の検出に対して明らかに高い感度を有する
ことを示した。壁内梗塞において、トロポニンＴの血清
濃度曲線は、トロポニンＩのそれとは有意に異なる。こ
れは第２図に示されているが、該第２図は、壁内筋梗塞
を有する５２人の患者の平均血清濃度曲線を示す。この
梗塞グループにおいて、平均としてのトロポニンＴが、
疼痛開始の後、＞３００時間増加することがわかった。
このグループの患者における絶対的診断感度の時間は、
６時間目〜１９５時間目までである。
体の患者の血清において、トロポニンＴ測定の酵素-免
疫検定法を行った。これらの患者のうち１３人(３０％)
においてトロポニンＴの有意な増加が見られた。これ
は、トロポニンＴの測定が、トロポニンＩ試験と比較し
て小さい梗塞の検出に対して明らかに高い感度を有する
ことを示した。壁内梗塞において、トロポニンＴの血清
濃度曲線は、トロポニンＩのそれとは有意に異なる。こ
れは第２図に示されているが、該第２図は、壁内筋梗塞
を有する５２人の患者の平均血清濃度曲線を示す。この
梗塞グループにおいて、平均としてのトロポニンＴが、
疼痛開始の後、＞３００時間増加することがわかった。
このグループの患者における絶対的診断感度の時間は、
６時間目〜１９５時間目までである。
【００５６】梗塞のサイズが大きく異なっている(Ｑ−
波および非−Ｑ−波ＡＭＩ)比較的大きい患者のグルー
プにおいて、トロポニンＴの絶対的診断感度の時間は、
疼痛開始の後、１２〜１４０時間目であった。トロポニ
ンＴ放出は、サイトゾルのおよび構造的に結合したマー
カータンパクの特性を示す。再灌流したＡＭＩにおい
て、顕著なトロポニンＴピークが１日目に見られ、これ
は非-再灌流ＡＭＩには存在しなかった(第３図)。初期
のトロポニンＴ放出における灌流依存性の変化を用い
て、血栓崩壊療法の効果を浸潤せずに予測することがで
きる。トロポニンＩを含む他のマーカータンパクについ
ては、同様の結果が全く見られなかった。
波および非−Ｑ−波ＡＭＩ)比較的大きい患者のグルー
プにおいて、トロポニンＴの絶対的診断感度の時間は、
疼痛開始の後、１２〜１４０時間目であった。トロポニ
ンＴ放出は、サイトゾルのおよび構造的に結合したマー
カータンパクの特性を示す。再灌流したＡＭＩにおい
て、顕著なトロポニンＴピークが１日目に見られ、これ
は非-再灌流ＡＭＩには存在しなかった(第３図)。初期
のトロポニンＴ放出における灌流依存性の変化を用い
て、血栓崩壊療法の効果を浸潤せずに予測することがで
きる。トロポニンＩを含む他のマーカータンパクについ
ては、同様の結果が全く見られなかった。
【００５７】
【発明の効果】本発明によれば、心筋梗塞および心筋に
対する他の損傷において、少なくとも１５０時間絶対的
診断感度の持続が可能な心筋トロポニンＴの免疫検定法
が提供でき、心筋壊死の判定に有効に利用できる。
対する他の損傷において、少なくとも１５０時間絶対的
診断感度の持続が可能な心筋トロポニンＴの免疫検定法
が提供でき、心筋壊死の判定に有効に利用できる。
【図１】 トロポニンＴアッセイの標準曲線を示すグラ
フ。
フ。
【図２】 壁内心筋梗塞を有する５２人の患者のトロポ
ニンＴの平均血清濃度を示すグラフ。
ニンＴの平均血清濃度を示すグラフ。
【図３】 疼痛開始の後、＜３.５時間の梗塞再灌流し
た患者２０人(ＥＲ)、疼痛開始の＞３.５時間の再灌流
をした患者２０人(ＬＲ)、および非-再灌流の梗塞を有
する患者２４人(ＰＯ)における血清中のトロポニンＴ濃
度の相対的な増加の局所的に加重価を与えた回帰線によ
る滑らかな走査プロットを示すグラフである。成功裏に
再灌流した梗塞における顕著な初期トロポニンＴ放出に
注意すべきである。
た患者２０人(ＥＲ)、疼痛開始の＞３.５時間の再灌流
をした患者２０人(ＬＲ)、および非-再灌流の梗塞を有
する患者２４人(ＰＯ)における血清中のトロポニンＴ濃
度の相対的な増加の局所的に加重価を与えた回帰線によ
る滑らかな走査プロットを示すグラフである。成功裏に
再灌流した梗塞における顕著な初期トロポニンＴ放出に
注意すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 アネリーゼ・ボルギャ ドイツ連邦共和国8132チュッチング、ク ステルマンストラッセ３番 (72)発明者 クラウス・ハレルマイヤー ドイツ連邦共和国8000ミュンヘン−２、 バルスストラッセ31番 (72)発明者 ジークフリード・ローゼル ドイツ連邦共和国8120バイルハイム、ア ンメルストラッセ27番 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，263（34），Ｐ．18488−18492 （1988)
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒト心筋トロポニンＴに対する少なくと
も１つの抗体およびヒト心筋トロポニンＴまたは該抗体
の結合相手Ｂと一緒に血清または血漿試料をインキュベ
ートし、それによって、ヒト心筋トロポニンＴに対する
抗体または結合相手Ｂのいずれかを測定可能な基で標識
し、こうして生成する測定可能な基を含有する免疫学的
複合体を単離し、単離した相または残りの相中の該測定
可能な基を測定することを特徴とするヒト心筋トロポニ
ンＴの測定方法。 - 【請求項２】 抗体が、トロポニンＩおよび他の筋原線
維タンパクに対する交差反応が＜２％であり、骨格筋ト
ロポニンＴに対する交差反応性が＜５％であるヒト心筋
トロポニンＴに対するモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体である請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 心筋壊死判定に用いる請求項１記載の測
定方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3913568 | 1989-04-25 | ||
| DE3922873A DE3922873A1 (de) | 1989-04-25 | 1989-07-12 | Spezifische antikoerper gegen troponin t, ihre herstellung und verwendung in einem reagenz zur bestimmung von hermuskelnekrosen |
| DE3922873-8 | 1989-07-12 | ||
| DE3913568-3 | 1989-07-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2109946A Division JP2564686B2 (ja) | 1989-04-25 | 1990-04-24 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07198718A JPH07198718A (ja) | 1995-08-01 |
| JP2818116B2 true JP2818116B2 (ja) | 1998-10-30 |
Family
ID=25880249
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2109946A Expired - Lifetime JP2564686B2 (ja) | 1989-04-25 | 1990-04-24 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 |
| JP6249289A Expired - Lifetime JP2818116B2 (ja) | 1989-04-25 | 1994-10-14 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2109946A Expired - Lifetime JP2564686B2 (ja) | 1989-04-25 | 1990-04-24 | 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6376206B1 (ja) |
| EP (1) | EP0394819B1 (ja) |
| JP (2) | JP2564686B2 (ja) |
| AT (1) | ATE117435T1 (ja) |
| DE (2) | DE3922873A1 (ja) |
| DK (1) | DK0394819T3 (ja) |
| ES (1) | ES2068937T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015224T3 (ja) |
| HK (1) | HK1002814A1 (ja) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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