CN102807588B

CN102807588B - 一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法

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Publication number: CN102807588B
Application number: CN201110147956.0A
Authority: CN
Inventors: 朱维平; 杨弋; 黄楚森; 尹琴; 徐玉芳; 钱旭红; 陈孟杰; 王新
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2031-06-02
Also published as: CN102807588A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法。设计和合成了一类能够特异性检测蛋白质相邻巯基的小分子荧光探针，结合荧光偏振技术、蛋白质荧光电泳和共聚焦荧光显微技术建立了一种用于原位荧光标记检测生物体内源性相邻巯基蛋白的方法。

Description

一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法

技术领域

本发明涉及一种原位检测生物体内相邻巯基蛋白质的化合物及其方法，尤其是一种以萘酰亚胺类化合物为荧光探针的相邻巯基蛋白质的原位荧光检测方法。

背景技术

细胞内氧化还原环境的变化深刻地影响着细胞内各种生理功能。相邻巯基蛋白质，作为氧化还原平衡中还原端的顶点，密切参与各类氧化还原的调节，在酶活性的调节、细胞信号传导、疾病发生进程等方面起着非常重要的作用。由于蛋白质的巯基修饰基本没有光谱学特性，无法直接测量，而一般的检测手段常常需要破坏细胞再通过化学方法检测，通常无法得到相邻巯基蛋白在细胞内分布的信息。而细胞结构的破坏会导致细胞内各细胞器氧化还原环境，以及各种与相邻巯基相关酶类的重新分布。荧光成像可以提供大量直观，动态的信息，是进行生命科学研究的主要手段之一。

钱永健等基于相邻巯基与三价砷特异性结合的特点设计合成出了用于双砷荧光探针FLAsH及其类似物(Science1998，281，269-272；US6008278)，但是该类探针只用于发展一种蛋白质标记策略，涉及到的相邻巯基蛋白是通过外源性导入的多肽链，内源性的细胞中的相邻巯基蛋白反而被外加的一定浓度的EDT给抑制住。

Ebright，R.H.等发展一类基于内源性相邻巯基蛋白的双砷探针(US20040019104，US20060141531)，该类探针虽然可以同细胞内内源性的相邻巯基蛋白作用，但是该类探针也只用于发展一种蛋白质标记策略，并非将该类探针用于检测相邻巯基蛋白以及与之密切相关的氧化还原信号转导和氧化还原蛋白质组学研究。同时，该类探针上连接了两个砷基团，在化学计量学上并不能同单一的一个含相邻巯基的蛋白结合，容易在同一个探针分子上连接上不同种类的相邻巯基蛋白。因此，以上两类探针只注重于发展一种蛋白质标记策略，并不能用于原位检测内源性的相邻巯基蛋白。

因此，设计合成特异性的相邻巯基蛋白质小分子荧光探针，发展蛋白质相邻巯基的原位荧光成像技术及相关蛋白质组技术，对系统性地研究与揭示蛋白质巯基氧化还原状态在信号转导这一与许多重要疾病相关的重大生命科学领域中的功能与作用具有重要意义，是目前十分迫切的任务。

发明内容

本发明设计合成了一类特异性原位检测蛋白质相邻巯基的化合物，建立了一种原位荧光标记检测生物体内蛋白质相邻巯基的方法。

本发明提供下式II化合物：

式中，

m为1、2或3；

R选自NH₂或NHC(O)R¹；

R¹选自-R³-NHR²或-R³-COOH；

R²选自H和氨基保护基；

R³为C_1-12烷基。

在一具体实施例中，m为1。

在一具体实施例中，R为NH₂。

在一具体实施例中，R¹为C_3-8烷基-NHR²。

在一具体实施例中，R¹为C_3-8烷基-COOH。

在一具体实施例中，R²为H。

在一具体实施例中，R²为-C(O)O-C_1-6烷基。

“保护基”在本文中指一种原子基团，当连接至分子中的反应性官能基时，遮蔽、减少或防止官能基的反应性。典型地，保护基如需要可在合成期间选择性除去。保护基的例子可见Greene和Wuts的《有机化学中的保护基》(第3版，1999，约翰维斯父子出版社，纽约)和Harrison等人的《合成有机方法之大纲》(第1-8册，1971-1996，约翰维斯父子出版社，纽约)。代表性氨基保护基包括(但不限制于)甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲基、苯甲氧羰基(“CBZ”)、叔丁氧羰基(“Boc”)、三甲基甲硅烷基(“TMS”)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“TES”)、三苯甲基和取代的三苯甲基、烯丙氧羰基、9-芴基甲氧羰基(“FMOC”)、硝基蔾芦氧羰基(“NVOC”)等。

在一具体实施例中，所述氨基保护基选自Boc₂O、苄基、Fmoc、乙酰基(Ac-)、磺酰基、苄氧羰基(Cbz)。

本发明也涉及上述式II化合物在制备荧光探针中的应用。

在一具体实施例中，所述荧光探针如本发明所述。

本发明提供一种荧光探针，其由一个式II化合物与一个荧光分子共价连接形成。

在一具体实施例中，本发明的荧光探针具有下式I所示结构：

式中，

m为1、2或3；

L为连接臂；

A为荧光分子。

在一具体实施例中，L选自烷基链和水溶性连接臂。

在一具体实施例中，烷基链为长1-12个碳原子的烷基链。

在一具体实施例中，烷基链为长2-10个碳原子的烷基链。

在一具体实施例中，水溶性连接臂选自1-12个碳原子的二甘醇胺链和乙二醇醚链。

在另一具体实施例中，水溶性连接臂选自1-8个碳原子的二甘醇胺链和乙二醇醚链。

在一具体实施例中，示例性的式I化合物可如下式III所示：

式中，VTA指二硫醇保护的对氨基亚砷酸；X为-CH₂-；n为1-10之间的整数，优选1-6之间的整数。

在式I和III的一个具体实施例中，m为1。

在式I和III的一个具体实施例中，n为1-5的整数。

在式I和III的一个具体实施例中，荧光分子或荧光团部分采用各类不同波长、水溶性和脂溶性不同的发射团，包括但不限于萘酰亚胺、NBD-Cl(4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑)、荧光素、菁染料Cy3和Cy5等。

VTA通过包括但不限于氨基与羧基缩合，氨基烷基化等方式与荧光团连接。这些连接方式是本领域技术人员根据式II化合物与荧光分子上的相应连接基团而能够容易地确定的。

本文中，烷基可含有1-12个碳原子，例如，可含有2-10个碳原子，2-8个碳原子，或3-8个碳原子。烷基可以是直链烷基或支链烷基。

在式I和III的一个具体实施例中，所述荧光分子选自：

本发明的探针分子能够与蛋白质上相邻巯基特异性作用。因此，本发明还包括式I、II和III化合物在相邻巯基蛋白质的检测或定位中的应用。

本发明还包括一种检测或定位相邻巯基蛋白质的方法，所述方法包括将本发明的式I或III所示的探针分子给予检测对象，和检测所述化合物中的荧光分子，从而检测或定位所述相邻巯基蛋白质。

在一具体实施例中，本发明采用荧光偏振技术对相邻巯基蛋白进行离体检测。在此实施例中，通过利用本发明的荧光探针结合相邻巯基蛋白前后的偏振值发生明显差异达到特异性检测靶标蛋白的目的。

在一具体实施例中，本发明采用荧光共聚焦显微镜研究细胞亚显微结构，利用单标(例如，使用本发明的荧光探针)、双标(例如，使用本发明的荧光探针和内质网探针或线粒体探针进行双标)和三标(例如，使用本发明的荧光探针、内质网探针和线粒体探针进行三标)进行亚细胞器定位，从而达到检测细胞水平上相邻巯基蛋白在细胞器上的原位荧光标记检测。

所述内质网探针和线粒体探针可从市售途径获得，例如可使用Invitrogen的Mito-trackerDeepRed(线粒体探针)和ER-trackerBlueWhiteDPX(内质网探针)。这些探针的用量可根据实际检测情况而定。当然，也可根据实际情况选择适当的其它探针来实施本发明的检测和/或定位。

本发明的方法还可结合电泳技术和流式细胞仪，进行与相邻巯基蛋白相关的氧化还原蛋白质组学研究。

在一具体实施例中，本发明方法利用本发明探针分子结合荧光偏振技术和蛋白质荧光电泳对相邻巯基蛋白进行检测。

在一具体实施例中，本发明方法利用利用本发明探针分子原位检测生物体内内源性相邻巯基蛋白。

在一具体实施例中，本发明方法利用本发明的探针分子进行氧化还原蛋白质组学研究。

可用于本发明探针分子进行检测的相邻巯基蛋白指一类包含一对及以上的空间上邻近巯基的蛋白质，包括但不限于硫氧还蛋白(Trx)和牛血清蛋白(BSA)，其中Trx蛋白含有一对相邻巯基，牛血清蛋白含有17对相邻巯基。在该类蛋白质中，相邻巯基不一定在序列上相互挨近，但是必须在空间上足够邻近以至能够使它们在氧化条件下成二硫键，在还原条件下能以邻近巯基形式存在。如果蛋白质上一对巯基满足在氧化条件下能够成为二硫键，那么该对巯基就被称为相邻巯基。

本发明的检测对象或检测样品可包括例如，各种组织、器官和血液，这些组织、器官和血液中的细胞，细胞培养物等。任何需要检测和/或定位其相邻巯基蛋白的对象或样品都可用于本发明。

本发明还包括式I和III探针分子的制备方法，包括设计合成了一个稳定的蛋白质相邻巯基受体二硫醇保护的对氨基亚砷酸(VTA)，和通过引入荧光团和适当的连接臂修饰，从而合成了所示探针分子。制备本发明探针分子的示范性实施例可参见本申请的实施例1-3中的流程。本领域技术人员可根据实际所要制备的探针分子，适当改变所述流程中的反应物质和条件，这些都在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

1.合成的相邻巯基受体VTA2在生理环境中有较好的氧化还原耐受性，有较好的脂溶性，能够更好透过细胞膜。

2.合成了一系列不同波长范围的小分子荧光探针，可以满足不同波长检测范围的需求。

3.引入荧光偏振技术，首次实现了对相邻巯基蛋白的离体荧光检测。

4.利用荧光共定位技术，首次实现了对于内源性相邻巯基蛋白在细胞器上的原位检测。

5.利用电泳技术和流式细胞仪，结合小分子荧光的特点，首次实现了利用荧光检测手段进行与相邻巯基蛋白相关的氧化还原蛋白质组学研究。

附图说明

图1为设计合成的小分子荧光探针同相邻巯基蛋白结合的作用模型示意图。其中：设计的这些荧光小分子主要通过受体VTA部分同蛋白质上的相邻巯基进行特异性的置换反应结合到相邻巯基蛋白质上。

图2为合成的小分子荧光探针NPE和S11的吸收和发射光谱图。其中：(a)为化合物NPE在HEPES中的吸收和发射光谱；(b)为化合物S11在HEPES中的吸收和发射光谱。

图3为NPE对于rTrx的选择性。采用SDS-PAGE电泳显示小分子荧光探针对于含有一对相邻巯基的蛋白rTrx具有很好的选择性。其中：rTrx为含有一对相邻巯基的硫氧还蛋白，oTrx-1为在表达和纯化过程中一对相邻巯基被氧化的硫氧还蛋白，oTrx-M为硫氧还蛋白中69为半胱氨酸上的巯基被双氧水氧化后的形式，oTrx-2为硫氧还蛋白一对相邻巯基被双氧水氧化成二硫键的形式，rTrx-M为硫氧还蛋白只有69位一个半胱氨酸上的巯基的形式。CTNPE为小分子探针NPE的一个阴性参照物。

图4为以BSA为模型蛋白，利用荧光偏振技术进行的在EDT(乙二硫醇)和PAO(对氨基亚砷酸)存在下时NPE对相邻巯基蛋白的动力学测试。其中：(a)为EDT和PAO分别存在时NPE对相邻巯基蛋白的动力学曲线；(b)为EDT浓度对NPE和相邻巯基蛋白结合的影响；(c)为PAO浓度对NPE和相邻巯基蛋白结合的影响。

图5为NPE对于相邻巯基蛋白在细胞水平上参与的氧化还原荧光检测。其中DTT为还原剂，AT-2和diamide为两种氧化剂。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，本发明的保护范围不受所举之例的限制。实施例中所用到的试剂，除非另有说明，否则都是从市场上直接购得的，其均依常规方法使用。

实施例1

以萘酰亚胺为荧光团的目标探针的合成，其合成路线如下：

VTA1：对氨基苯胂酸(10.85g，50mmol)溶解在甲醇中，加热回流使溶液变澄清，再滴加苯肼(10.30mL，100mmol)，10分钟滴加完毕。产生大量氮气，当氮气变得很少的时候，继续回流1小时。反应液在90℃浓缩，加入水85mL和0.1M氢氧化钠水溶液(85mL)，乙醚(2×75mL)洗涤，水相中加入氯化铵水溶液(1M，40mL)置于0℃冰箱结晶析出大量白色针状晶体对氨基苯胂酸氧化物，真空干燥得到产品5.54g(收率53％)。置于KOH中充Ar气保存。

VTA2：VTA1(1.24g，6.43mmol)溶解在无水甲醇中，加热回流，滴加乙二硫醇(0.65mL，8.46mmol)，回流10分钟后，将反应液置于-78℃冰箱中析出部分白色固体，然后加入甲苯共沸带走残留的以二硫醇。旋干得到浅黄色固体，乙醇(50mL)重结晶。得到白色棱形结晶1.01g(收率60％)。mp86.3-87.1℃；GC-MS95％，259(M+H，100％)，231(60％)，124(80％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ3.13-3.36(m，4H)，5.40(s，N-H，2H)，6.56(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(d，J＝4.8Hz，2H)。

保护的氨基己酸：6-氨基己酸(1.12g，8.54mmol)溶解在2M氢氧化钠水溶液中(7mL)加入1，4-二氧六环(14mL)，冰浴下滴加(Boc)₂O，滴完升至室温，搅拌过夜。旋干溶剂，加入水溶解，用1M盐酸调节pH至2，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干得无色油状液体3.76g(90％收率)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ11.16(br，1H)，4.51(brs，1H)，3.08(br，2H)，2.32(t，2H，J＝7.2Hz)，1.59-1.67(m，2H)，1.46-1.51(m，2H)，1.42(s，9H)，1.31-1.38(m，2H)；IR(KBr，cm^-1)：3346，2980，2934，2867，1708，1521，1369，1280，1248，1171，862。

VTA3：保护的氨基己酸(2.31g，10mmol)溶解在25mLDMF中，S2(2.33g，9mmol)溶解在4mL四氢呋喃中加入S3溶液中，搅拌均匀后加入HATU(4.18g，11mmol)和DIEA(1.92mL，11mmol)，Ar气保护下室温搅拌过夜。旋干溶剂，柱层析，石油醚/乙酸乙酯＝4/1到2/1梯度洗脱得到白色固体3.11g(收率73％)。¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ7.54-7.61(m，4H)，4.62(br，1H)，3.34-3.40(m，2H)，3.13-3.21(m，4H)，2.37(t，2H，J＝7.2Hz)，1.72-1.79(m，2H)，1.50-1.57(m，2H)，1.46(s，9H)，1.37-1.42(m，2H)；¹³CNMR(CDCl₃，100MHz)δ171.3，156.1，138.9，138.5，131.5，119.4，79.2，41.7，40.1，37.5，29.6，28.4，26.1，24.9；IR(KBr，cm^-1)：3368，2930，2851，2345，1696，1666，1587，1508，1394，1368，1257，1169；MS(ESI)m/z495[(M+Na)⁺，100％]。

VTA4：VTA3(300mg，0.635mmol)溶解在10mL二氯甲烷中，冰浴下滴加TFA(8.15mL)，滴完后撤去冰浴升至室温，继续搅拌2小时。旋干溶剂得到三氟乙酸盐，不做进一步处理直接往下做下一步反应。为了表征结构，取出一小部分柱层析得到白色晶体。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ10.00(s，1H)，7.62(d，2H，J＝8.4Hz)，7.55(d，2H，J＝8.4)，3.39-3.14(m，4H)，2.30(t，2H，J＝7.2Hz)，2.15(t，2H，J＝7.6Hz)，1.61-1.53(m，2H)，1.33-1.61(m，8H)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ171.9，140.7，137.3，131.7，119.1，49.0，41.8，26.5，25.4；IR(KBr，cm^-1)：3327，2957，2840，1661，1579，1490，1392，1065，933，809，719；MS(ESI)m/z395[(M+Na)⁺，100％]。

VTA5：将4-溴-5-硝基-1，8-萘酐(200mg，0.62mmol)分散在20mL无水乙醇中，VTA4(231mg，0.62mmol)溶解在10mL无水乙醇中慢慢滴加.反应液加热回流40分钟.TLC显示反应结束后，减压蒸除无水乙醇后，粗品用硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇50/1.得到浅黄色固体VTA5(169mg，收率40.3％).¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ9.96(s，1H)，8.63-8.37(m，4H)，7.54(q，4H，J＝5.2Hz)，4.03(t，2H，J＝7.2Hz)，3.39-3.32(m，4H)，3.19-3.13(m，4H)，2.31(t，2H，J＝7.2Hz)，1.69-1.61(m，4H)，1.39-1.36(m，2H)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ171.7，163.0，162.3，140.5，137.3，136.6，132.3，131.7，131.4，130.5，126.3，124.8，123.1，122.8，120.3，119.0，118.2，41.8，36.5，27.5，26.4，25.1；IR(KBr，cm^-1)：3541，3311，3093，2934，2848，2354，1704，1665，1587，1544，1392，1350，832，742；MS(ESI)m/z700[(M+Na)⁺，100％]。

NPE：将VTA5(86mg，0.127mmol)溶解在乙二醇单甲醚中，逐滴滴加二甘醇胺(0.2mL，2.0mmol)。加完后，反应也回流3小时。TLC显示反应结束，减压蒸除反应溶剂得到粗品。硅胶柱层析得到黄色晶体NPE(69mg，收率72％).¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ9.96(s，1H)，8.22(d，2H，J＝8.4Hz)，7.56(dd，4H，J＝8.0，12.8Hz)，6.87(d，2H，J＝8.8Hz)，3.98(t，2H，J＝6.8Hz)，3.76-3.74(m，4H)，3.53(sbr，7H)，3.42-3.35(m，6H)，3.20-3.14(m，2H)，2.31(t，2H，J＝7.2Hz)，1.64-1.61(m，4H)，1.37-1.32(m，2H)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ171.8，163.7，153.2，140.6，137.3，133.6，132.2，131.7，119.2，110.8，110.4，107.3，72.6，68.5，60.5，43.9，41.8，36.7，28.0，26.6，25.3；IR(KBr，cm^-1)：3416，3334，2918，2860，2362，2311，1680，1638，1583，1517，1408，1357，1112，1069，809，746，517；HRMS(ES+)calcdforC₃₄H₄₃AsN₄O₇S₂[M+H]⁺759.1867，found759.1863。

实施例2

以NBD为荧光团的目标探针合成，其合成路线如下：

S6：VTA4(122mg，0.328mmol)溶解在10mL二氯甲烷中，加入三乙胺(75μL)，搅拌后，将NBD-Cl(78.3mg，0.393mmol)溶解在8mL二氯甲烷中慢慢滴加到S5溶液中，室温搅拌过夜。反应液由浅黄色变为深棕色。旋干溶剂柱层析，二氯甲烷/甲醇＝20/1到10/1梯度洗脱得到棕黄色固体58mg(收率33％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ1.40(q，2H)，1.66(m，4H)，2.31(t，2H，J＝7.2Hz)，3.47(t，2H，J＝6.0Hz，)，6.42(d，1H，J＝9.2Hz)，7.00(t，1H，J＝7.2Hz)，7.26(t，2H，J＝7.6Hz)，7.55(d，2H，J＝7.6Hz)，8.49(d，1H，J＝8.8Hz)。

实施例3

以荧光素为荧光团的目标探针合成，其合成路线如下：

S8：荧光素(3.32g，10mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.41g，12mmol)及DCC(3.15g，15mmol)溶解在10mL干燥的DMF中，在氩气保护下磁力搅拌加热至70～80℃，反应1小时。冰浴冷却，有大量晶体析出，过滤，将副产物二环己基脲(白色结晶)滤掉，滤饼用丙酮洗至白色，弃去；滤液为深红色溶液，浓缩，不做进一步处理直接往下做下一步反应。

S9：S8(2.49g，5.77mmol)溶解在10mL的DMF中，加入哌嗪(0.99g，11.55mmol)和三乙胺(2.4mL，17.32mmol)。反应液容器用铝箔覆盖以避光，氩气保护下室温搅拌14小时。用乙酸中和。旋干溶剂，得深红色油状物；柱层析，二氯甲烷/甲醇＝5/1到2/1梯度洗脱得到红色固体S9(0.60g，收率为27％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ4.32(s，8H)，6.50(t，2H，J＝9.2Hz)，6.89(d，2H，J＝9.2Hz)，7.45(s，1H)，7.56(d，1H，J＝2.8Hz)，7.65(s，2H)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ42.2，48.2，103.7，114.4，122.0，127.8，129.7，129.8，130.8，131.3，131.5，136.3，148.9，156.7，167.1，175.1；ESI-Ms：[M+H]⁺：401.2，[M+Na]⁺：423.1。

S10：VTA2(100mg，0.39mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(42.5mg，0.42mmol)溶解在8mL的甲苯中，呈乳白色乳状液，磁力搅拌下加入少许THF，溶液变得澄清透明。加热回流，继续搅拌2.5小时。冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到白色雪花状晶体S10(134.81mg，收率为97％)。¹HNMR(d₆-DMSO，400MHz)δ2.20(t，2H，J＝6.4Hz)，2.37(t，2H，J＝6.8Hz)，3.80(m，2H)，7.54(q，4H，J＝8.4Hz)，11.92(s，1H)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ34.3，35.2，41.8，118.9，131.7，136.6，141.3，173.1，176.0。

S11：S9(100mg，0.25mmol)和S10(179.65mg，0.50mmol)溶解在10mLDMF中，搅拌均匀，依次加入DIEA，EDC-HCl，和HOBt，呈橙红色澄清透明溶液，氩气保护下室温搅拌过夜。减压蒸馏除去溶剂，得红色固体。柱层析，二氯甲烷/甲醇＝25/1到15/1梯度洗脱得到橙红色固体S11(23.02mg，收率7.4％)，充Ar气保存。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ10.09(s，1H)，7.61-7.53(m，8H)，7.39(br，1H)，6.61(d，2H，J＝9.2Hz)，6.09(d，2H，J＝8.0Hz)，6.0(br，2H)，5.41(br，1H)，3.28-3.15(m，8H)，2.54(d，2H，J＝8.0Hz)，2.0(dd，2H，J₁＝7.2Hz，J₂＝7.6Hz)；¹³CNMR(DMSO-d₆，100MHz)δ157.6，148.5，140.8，137.1，135.9，132.6，131.7，130.8，130.4，130.3，129.6，129.1，123.5，119.0，103.5，44.9，41.7，31.7，29.5，29.4，29.2，29.1，29.0，22.5；ESI-Ms：[M+H]⁺：742.1，[M+Na]⁺：764.0。

实施例4

目标荧光探针的光谱性能测试

1)紫外及荧光光谱的测定

合成的目标探针真空干燥后，天平上精确称量样品(精确到0.0001克)，用DMSO溶剂定容，配成10^-3M的溶液。移取0.1mL该溶液于10mL容量瓶中，真空抽干溶剂，最后用HEPES或者PBS缓冲液稀释至刻度，得到10^-5M的溶液，用于吸收光谱和发射光谱的测试。

2)目标探针荧光量子产率的测定

合成的目标荧光探针的相对荧光量子产率Φ_f是以罗丹明B(Φ_f＝0.49在乙醇中)为参照测得的，结果取三次测量的平均值，按(1-1)式计算：

Φ_s＝Φ_ref.A_ref.F_s/(F_ref.A_s)(1-1)

式中：Φ_s、Φ_ref分别表示待测样品和标准物的荧光量子产率；A_s、A_ref分别表示待测样品和标准物对该激发波长的发射光的吸光度；F_s、F_ref分别表示待测样品和标准物的积分荧光强度。在测得的数据中选择了NPE和S11的光谱数据作为典型代表。结果见图2。

实施例5

利用荧光偏振技术和电泳进行相邻巯基蛋白的离体测试，以Trx和BSA作为模型蛋白，在实施例中合成的探针NPE作为小分子荧光探针，分别进行选择性、竞争性、浓度梯度和动力学测试。

1.NPE对还原性硫氧还蛋白rTrx(只含有一对相邻巯基)的选择性

用50μMNPE对10μM拥有不同巯基形式的Trx蛋白进行标记，在HEPES缓冲液，37℃时标记30分钟。标记完后马上进行SDS-PAGE电泳。电泳胶用CarestreamInVivoImagingFXSystem(激发波长：460nm，发色波长：535nm)进行荧光成像。获得荧光成像图后，再进行考马斯亮蓝检测染色操作。结果如图3所示，只有rTrx这一条带有荧光响应。结合考马斯亮蓝的显色结果，说明NPE对于拥有不同巯基形式的硫氧还蛋白oTrx-1，oTrx-2，oTrx-M和rTrx-M都没有响应，唯独对于rTrx(拥有一对相邻巯基)有很好响应，因此NPE对相邻巯基蛋白具有很高的选择性。

2.以BSA作为模型蛋白，利用荧光偏振技术进行NPE对相邻巯基蛋白的竞争性、浓度梯度和动力学测试

荧光偏振测试在Bio-TekSynergy2多功能酶标仪上进行。100μl不同的生物分析试剂(包括PAO、EDT、各种带巯基的小分子等)和200nM的NPE分别加入到96孔板中。最后加入100μl，200nM的不同形式的BSA。这样使每个空中的NPE和不同形式的BSA的最终浓度为100nM。震荡混匀5秒后进行荧光偏振值读数。用到的激发滤光片：485nm(20nm可调范围)，发射滤镜：528nm(20nm可调范围)。结果如图4所示。

实施例6

利用实施例1中合成的探针NPE对Changliver细胞中的相邻巯基蛋白进行细胞器定位研究。

1.NPE对细胞内相邻巯基蛋白荧光成像检测

将Changliver细胞(Changlivercells来源于美国细胞菌种库(ATCC)，在DMEM(高糖)培养基中37℃培养)用PBS洗两次，然后用5μMNPE在37℃下进行标记。为了研究PAO或DTT对细胞中的相邻蛋白的作用。将5μMPAO或2mMDTT加入标记细胞中。30分钟后，洗掉没有标记上的游离的NPE或游离的PAO和DTT。用OlympusFV1000+IX481共聚焦显微镜进行荧光成像。UPLSAPO100X油镜(NA：1.40)，488nm激发，接受500-600nm的发射光。

2.细胞内相邻巯基蛋白细胞器共定位研究

将Changliver细胞用PBS洗两次后，首先用50nM的Mito-trackerDeepRed(商业化线粒体探针，购自Invitrogen)标记，洗掉游离的Mito-trackerDeepRed，再用5μMNPE进行标记，洗掉游离的NPE，最后用100nMER-trackerBlueWhiteDPX(商业化的内质网探针，购自Invitrogen)进行标记。为了排除三标时荧光信号之间的相互干扰采用如下滤镜：ER-trackerBlueWhiteDPX的激发为405nm，收集425-490nm的发射光。NPE的激发为488nm，收集500-600nm的发射光。Mito-TrackerDeepRed的激发为635nm，收集大于650nm的发射光。所得结果显示NPE标记的细胞显示出了绿色的荧光，而其阴性对照物CTNPE标记的细胞则只显示很微弱的背景荧光，说明NPE能够对细胞内的相邻巯基蛋白有很好的响应。用PAO和DTT处理后的细胞也只显示了很微弱的背景荧光，则说明PAO和DTT抑制住了NPE和细胞内的相邻巯基蛋白的作用。因此PAO和DTT是相邻巯基很好的抑制剂。三色荧光共标结果显示NPE标记的相邻巯基蛋白主要存在于线粒体中。

实施例7

利用NPE进行与相邻巯基蛋白相关的氧化还原蛋白质组学研究：Changeliver细胞在35mm的培养皿中培养到80％融合后收取。从200mM的储液中吸取DTT加入到培养皿中使之浓度到2mM。12小时后用DPBS洗掉DTT。同样条件下，在另一培养皿中加入氧化剂Aldrithiol-2(AT-2)或Diamide(全部购自sigma-aldrich)。11.5小时后洗掉这些氧化剂。对于DTT处理的细胞用5μMNPE进行标记30分钟，然后用DPBS洗两遍。对于用Diamide或AT-2处理的细胞，同时要加入NPE共标30分钟后，再用DPBS洗掉。然后刮出细胞，进行裂解。裂解液在冰中超声处理后，10,000转高速离心10分钟，蛋白质浓度用蛋白质浓度测定试剂盒Bio-RadDCproteinassayKitII(Cat.500-0112)标定。每条泳道上加入8μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。

所得结果如图5所示，在还原剂DTT的作用下，细胞内的蛋白质上的二硫键更还原为更过的相邻巯基，这样细胞内的相邻巯基蛋白含量上升。从图中可以看到，随着DTT量的升高，NPE标记的荧光强度上升。相反，随着氧化剂Diamide加入量的升高，NPE标记的荧光强度则相应降低。这是Diamide将相邻巯基氧化为二硫键，这样细胞内的相邻巯基蛋白含量就降低。

虽然以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出各种合适的修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

Claims

1.下式II化合物：

式中，

m为1、2或3；

R选自NHC(O)R¹；

R¹选自-R³-NHR²或-R³-COOH；

R²选自H和氨基保护基；

R³为C_1-12烷基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R¹为C_3-8烷基-NHR²。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R¹为C_3-8烷基-COOH。

4.一种荧光探针分子，其由权利要求1－3中任一项所述的一个式II化合物与一个荧光分子共价连接形成。

5.如权利要求4所述的荧光探针分子，其特征在于，所述荧光探针分子具有下式I所示结构：

式中，

m为1、2或3；

L为连接臂；

A为荧光分子。

6.如权利要求5所述的荧光探针分子，其特征在于，所述A选自萘酰亚胺、4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑、荧光素、菁染料Cy3和Cy5。

7.如权利要求5所述的荧光探针分子，其特征在于，L选自烷基链和水溶性连接臂。

8.如权利要求7所述的荧光探针分子，其特征在于，所述烷基链为长1－12个碳原子的烷基链。

9.如权利要求8所述的荧光探针分子，其特征在于，烷基链为长2－10个碳原子的烷基链。

10.如权利要求7所述的荧光探针分子，其特征在于，所述水溶性连接臂选自1-12个碳原子的二甘醇胺链和乙二醇醚链。

11.如权利要求10所述的荧光探针分子，其特征在于，所述水溶性连接臂选自1－8个碳原子的二甘醇胺链和乙二醇醚链。

12.如权利要求5所述的荧光探针分子，其特征在于，所述荧光探针分子选自：

13.权利要求4－12中任一项所述的探针分子在相邻巯基蛋白质的检测或定位中的应用。

14.一种检测或定位相邻巯基蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4－12中任一项所述的探针分子给予检测对象，和检测或定位所述化合物中的荧光分子，从而检测或定位所述相邻巯基蛋白质。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括，采用荧光偏振技术对相邻巯基蛋白进行离体检测，通过利用所述荧光探针结合相邻巯基蛋白前后的偏振值发生明显差异实现特异性检测所述相邻巯基蛋白质；或者，采用荧光共聚焦显微镜研究细胞亚显微结构，在细胞水平上实现相邻巯基蛋白在细胞器中的定位。