JP2005534739A

JP2005534739A - シアニン染料リポーターを用いたタンパク質の部位特異的標識

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Publication number: JP2005534739A
Application number: JP2004523938A
Authority: JP
Inventors: コットン，グラハム
Original assignee: アマシャムバイオサイエンスユーケイリミテッド
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2005-11-17
Also published as: EP1525266A1; CA2493309A1; WO2004011556A1; AU2003246957A1

Abstract

下記式（Ｉ）の化合物が開示される。
【化１】

式中、Ｄはシアニン染料及びその誘導体から選択される染料であり、Ｂは親和性標識であり、Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基からなり、ＭはＦとの結合に適合した基であり、Ｌ^１及びＬ^２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の結合原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含み得る基からなる。本発明は、合成又は組換えペプチド又はタンパク質及びその誘導体のＮ−末端又はＣ−末端へのシアニン染料リポーター基の直接結合を部位特異的に可能にすると共に、得られる標識分子の精製を可能にする方法にも関する。

Description

本発明は、シアニン染料をリポーター分子として使用するタンパク質の部位特異的標識のための試薬及び方法に関する。特に本発明は、チオエステル活性化基を含むと共に、チオエステル反応部分を含有するか、又はチオエステル反応部分を含有するように誘導体化された標的分子との反応性を有する基を含む新規なシアニン染料誘導体に関する。

生体分子の標識及び検出で使用するための蛍光リポーターに対する関心及び要望が高まっている。シアニン及び関連染料（例えば、剛直化シアニン染料やスクアレイン）は、他の蛍光染料試薬に比べて幾つかの利点を有しており、配列決定、マイクロアレイ、フローサイトメトリー及びプロテオミックスのような様々な分野で蛍光標識として広く使用されている。例えば、米国特許第５５６９５８７号（Ｗａｇｇｏｎｅｒら）には、−ＯＨ、−ＮＨ_２又は−ＳＨ基を含有するか、或いはかかる基を含有するように誘導体化された標的分子との反応に適した反応基を有する水溶性シアニン染料誘導体が開示されている。シアニン染料は、非常に高い吸光係数及び好ましい量子収率を有することが特徴である。加えて、シアニン染料は良好な光安定性を有しており、容易に光漂白されない。

数多くの用途では、蛍光標識染料とタンパク質のような標的分子との間に（共有結合の形態で）恒久的な結合を形成することが必要である。ペプチド及びタンパク質標識の化学は文献中に十分に記載されており、現在では広範囲の標識試薬が商業的に入手できる。蛍光標識試薬を用いたタンパク質標識に関する総説及び事例については、“Ｎｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂｅｌｌｉｎｇ，ａＰｒａｃｔｉｃａｌＩｎｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９７、及び“ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ”，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．，１９９２を参照されたい。

タンパク質又はペプチド中に蛍光標識を部位特異的に組み込むことは、ある種の生化学及び生物物理学的研究、例えば蛍光共鳴エネルギー移動並びにタンパク質の構造及び機能の研究で大きな利益となり得る。標的ポリペプチド中に蛍光標識を部位特異的に結合するための一方法は、天然の化学的連結反応を利用する。この方法に従えば、Ｎ−末端システイン残基を含む非保護ペプチド断片とα−チオエステル基を含む第二の非保護ペプチド断片とを生理的ｐＨで化学選択的に連結することで、、これらの一次配列にかかわりなく、連結部位にアミド結合が生成される。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），６，Ｒ２４７−２６０、Ｇｉｒｉａｔ，Ｉ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄＰｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２００１），２３，１７１−１９９、及びＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｙｎ．Ｌｅｔｔ．，（２００１），６，７３３−７４０の総説を参照されたい。

Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄＷｏｎｇ，Ｃ−Ｈ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００２），４１，２１７１−２１７４）は、フルオレセイン及びビオチンチオエステル誘導体の製造並びにこれらとＮ−末端システイン含有組換えタンパク質との反応を記載している。Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄＰａｎｎｅｌｌ，Ｌ．Ｋ．（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年７月１８日にオンラインで出版）は、Ｃｙ５（商標）のベンジルチオエステルの製造及びそれに続くＮ−末端システイン残基含有合成ポリペプチドとの反応を報告した。

しかし、リポーターも親和性標識に共有結合されているシアニン染料のチオエステル誘導体を記載した報告は存在しない。タンパク質及びペプチドの部位特異的標識に伴う反応でかかる試薬を使用することは、蛍光染料で標識した標識を引き続いて分離及び精製するために有利であろう。したがって本発明は、合成又は組換えペプチド又はタンパク質及びその誘導体のＮ−末端又はＣ−末端へのシアニン染料リポーターの直接結合を部位特異的に可能にすると共に、得られる標識分子の精製を可能にする新規なシアニン染料試薬及び方法を提供する。
米国特許第５５６９５８７号明細書 "Ｎｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂｅｌｌｉｎｇ，ａＰｒａｃｔｉｃａｌＩｎｒｏｄｕｃｔｉｏｎ"，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９７ "ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ"，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．，１９９２Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），６，Ｒ２４７−２６０Ｇｉｒｉａｔ，Ｉ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄＰｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２００１），２３，１７１−１９９Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｙｎ．Ｌｅｔｔ．，（２００１），６，７３３−７４０Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄＷｏｎｇ，Ｃ−Ｈ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００２），４１，２１７１−２１７４Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄＰａｎｎｅｌｌ，Ｌ．Ｋ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年７月１８日にオンラインで出版

本発明の一態様に従えば、カルボン酸チオエステル基及びチオエステルとの共有結合反応に適した基から選択される１以上の標的結合基を含有する、シアニン染料又はその誘導体を含んでなる化合物であって、当該化合物がそれに共有結合した親和性標識を含むことを特徴とする化合物が提供される。

好適には、本化合物は下記式（Ｉ）を有する。

式中、
Ｄはシアニン染料及びその誘導体から選択される染料であり、
Ｂは親和性標識であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基からなり、
ＭはＦとの結合に適合した基であり、
Ｌ^１及びＬ^２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の結合原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含み得る基からなる。

好適には、Ｌ^１及びＬ^２の各々に２〜３０の原子が存在し、好ましくは６〜２０の原子が存在する。

好ましくは、Ｌ^１及びＬ^２は次式の基から独立に選択される。

−{(ＣＨＲ′)_ｐ−Ｑ−(ＣＨＲ′)_ｒ}_ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。

特に好ましいＱは、−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ′は前記に定義した通りである。）から選択される。

一実施形態では、Ｌ^２は開裂可能なリンカーであり、さらに、好適には化学的に開裂可能な基、酵素で開裂可能な基及び光化学的に開裂可能な基から選択できる基Ｐを含み得る。好適な化学的に開裂可能な基には、いずれも塩基性条件下で開裂されるカルバミン酸エステル及びカルボン酸エステルがある。好適な酵素で開裂可能な基は、エステル基、アミド基及びホスホジエステル基のような基から選択できる。かかる基は、プロテアーゼ、エステラーゼ及びホスホジエステラーゼのようなヒドロラーゼの基質であり、かかるヒドロラーゼで加水分解される。式（Ｉ）の化合物中で使用するために適した光開裂可能な基Ｐは、４，５−ジアルコキシ−２−ニトロベンジルアルコールリンカー（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．Ｐ．，ａｎｄＪｏｎｅｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），６０，２３１８−２３１９）又はフェナシルリンカー（Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９７６），４１，３２５８−３２６１）を含み得る。これらの基は３００ｎｍの照明下で効率的な光反応を受け、親和性標識からの染料分子又は染料標識タンパク質の急速な開裂をもたらす。

好適には、基Ｍは標的結合基Ｆを結合するために適合した任意適宜の官能基であり得る。好ましくは、Ｍは次式から選択される。

式中、Ｒ′は前記に定義した通りである。

好適な親和性標識は、ビオチン、デスチオビオチン及びＨｉｓ標識、イミノジ酢酸、ニトリロトリ酢酸などの金属キレート配位子から選択できる。好ましい親和性標識は、ビオチン及びデスチオビオチンから選択される。

本発明の一実施形態では、標的結合基Ｆは次式のカルボン酸チオエステルである。

式中、Ｌ′は単結合であるか、或いは炭素原子から選択される１〜３０の結合原子を含み、適宜−ＮＨ−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択される１以上の基を含む基であり、Ｒ″は適宜スルホネートで置換され得るＣ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_６〜Ｃ_１０アリール又はＣ_７〜Ｃ_１５アラルキルであるか、或いは−(ＣＨ_２)_２−ＣＯＮＨ_２である。Ｌ′が単結合である場合、標的結合基Ｆは基Ｍに直接結合される。

代わりの実施形態では、標的結合基Ｆは次式の１，２−アミノチオール基である。

式中、Ｌ′は前記に定義した通りである。

かくして本発明は、シアニン染料又はその誘導体を含んでなる蛍光標識試薬であって、分子中に標的結合基及び親和性標識を組み込むことで修飾された蛍光標識試薬を提供する。標的結合基は、カルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択できる。標的結合基がチオエステル基である場合、それは標的分子（好適にはタンパク質又はペプチド）又はその誘導体上の１，２−アミノチオール基と選択的に反応する。別法として、シアニン染料は標的上のチオエステル基と反応するための１，２−アミノチオール基を含み得る。リポーター分子の化学構造中に反応性チオエステル官能基又は（別法として）１，２−アミノチオール官能基を組み込むことにより、簡便な一段階法で標的分子を直接標識することができる。本発明の方法に従えば、ペプチド及びタンパク質の標識は、一次配列の組成にかかわりなく部位特異的である。Ｎ−末端システイン官能基又はチオエステル官能基をもった標的一次配列を生成することにより、標的をシアニン染料の適当な誘導体（好適には、それぞれチオエステル及び１，２−アミノチオール誘導体）と共にインキュベートすることで部位特異的な標識を直接に達成できる。さらに、標識試薬中に親和性標識が含まれることにより、引き続いて蛍光染料標識タンパク質又はペプチドを精製することを可能にする。

好適には、シアニン染料又はシアニン染料誘導体は、染料中に１以上のカルボン酸チオエステル基又はチオエステルとの共有結合反応に適した基が組み込まれていることを条件として、シアニン染料、剛直化シアニン染料及びスクアレイン染料から選択される。表１は、特定の励起特性（Ａｂｓ）及び発光特性（Ｅｍ）を有するシアニン染料の若干の例を示している。

第一の態様に係る一実施形態では、本化合物は下記式（II）を有する。

式中、
基Ｒ^３及びＲ^４はＺ^１環構造に結合していると共に、基Ｒ^５及びＲ^６はＺ^２環構造に結合しており、
ｎは１〜３の整数であり、
Ｚ^１及びＺ^２は、１つの環又は２つの縮合環を含む芳香族又はヘテロ芳香族環系を完成するために必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子から選択される５又は６の原子を有すると共に、適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子を有し、
Ｘ及びＹは同一であるか又は異なっており、＞ＣＲ^８Ｒ^９、酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−、＞Ｎ−Ｗ（式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素及び基Ｒ^１０から選択される。）から選択され、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０の１以上は次式の基であり、

（式中、Ｂ、Ｆ、Ｍ、Ｌ^１及びＬ^２は前記に定義した通りである。）
基Ｒ^７は水素及び非置換又はアリール置換であり得るＣ_１〜Ｃ_４アルキルから独立に選択されるか、或いは２以上のＲ^７が次式の基と一緒になって、Ｒ^７で置換されると共に、適宜−Ｏ−、−Ｓ−及び＞ＮＲ^７（式中、Ｒ^７は前記に定義した通りである。）から選択されるヘテロ原子を含み得る炭化水素環系を形成し、

（式中、ｎは前記に定義した通りである。）
残りの基Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は水素、ハロゲン、アミド、シアノ、ニトロ、モノ−又はジ−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル及び基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート及び第四アンモニウムから選択され、ｍは０又は１〜６の整数である。）からなる群から独立に選択され、
残りの基Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は独立にＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りの基Ｒ^１及びＲ^２は水素、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙ及びｍは前記に定義した通りである。）、及び非置換であるか又は２以下のニトロ基で置換され得るベンジルから独立に選択される。

第一の態様に係る第二の実施形態では、本化合物は下記式（III）を有する。

式中、
基Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５はＸ及びＹを含む環に結合しているか、或いは適宜Ｚ^１及びＺ^２環構造の原子に結合しており、
Ｚ^１及びＺ^２は、１つの環又は２つの縮合環を含む芳香族又はヘテロ芳香族環系を完成するために必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子から選択される５又は６の原子を有すると共に、適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子を有し、
Ｘ及びＹは同一であるか又は異なっており、＞ＣＲ^８Ｒ^９、酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−、＞Ｎ−Ｗ（式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素及び基Ｒ^１０から選択される。）から選択され、
ＡはＯ及びＮＲ^１６（式中、Ｒ^１６は次式の置換アミノ基である。）から選択され、

基Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１７及びＲ^１８の１以上は次式の基であり、

（式中、Ｂ、Ｆ、Ｍ、Ｌ^１及びＬ^２は前記に定義した通りである。）
残りの基Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５は水素、ハロゲン、アミド、シアノ、ニトロ、モノ−又はジ−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル及び基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート及び第四アンモニウムから選択され、ｍは０又は１〜６の整数である。）からなる群から独立に選択され、
残りの基Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は独立にＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りの基Ｒ^１７は水素、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びアリールから選択され、残りの基Ｒ^１８はＣ_１〜Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、炭素原子数２〜７のアシル基、及びチオカルバモイル基から選択される。

好適には、式（II）及び（III）に係る化合物中で、Ｚ^１及びＺ^２はフェニル、ピリジル、ナフチル、アントラニル、インデニル、フルオレニル、キノリニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル及びベンゾイミダゾリル部分からなる群から独立に選択される。１つの環又は２つの縮合環を含む追加の環系は、当業者には容易に明らかとなろう。好ましくは、Ｚ^１及びＺ^２はフェニル、ピリジル、ナフチル、キノリニル及びインドリル部分からなる群から選択される。特に好ましいＺ^１及びＺ^２はフェニル及びナフチル部分である。

好適には、式（II）及び（III）の化合物の基Ｒの１以上は、化合物に親水特性を付与するための水可溶化基である。可溶化基（例えば、スルホネート、スルホン酸及び第四アンモニウム）は、式（II）及び（III）の化合物の芳香族環構造Ｚ^１及び／又はＺ^２に直接結合できる。別法として、可溶化基はＣ_１〜Ｃ_６アルキルリンカー鎖によって前記芳香族環構造に結合でき、基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｍは前記に定義した通りである。）から選択できる。別の可溶化基は、炭水化物残基（例えば、単糖類）又はポリエチレングリコール誘導体であり得る。水可溶化成分の例には、−(ＣＨ_２)_３−ＳＯ_３ ⁻及び−(ＣＨ_２)_４−ＳＯ_３ ⁻のようなＣ_１〜Ｃ_６アルキルスルホネートがある。しかし、式（II）又は（III）の染料の芳香族環構造に直接結合した１以上のスルホネート基又はスルホン酸基が特に好ましい。タンパク質を標識する場合、水溶性は有利であり得る。

一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は蛍光リポーター分子である。この実施形態では、式（II）及び（III）の化合物中の置換基Ｒのいずれもがニトロ基を含まない。

別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（II）及び（III）の化合物の芳香族環構造に結合した基Ｒの１以上が１以上のニトロ基を含む非蛍光又は実質的に非蛍光の染料である。この実施形態では、好適には、１以上のニトロ基がＺ^１及び／又はＺ^２芳香族環構造に直接結合していればよい。別法として、モノ−又はジ−ニトロ置換ベンジル基がＺ^１及び／又はＺ^２芳香族環構造に結合していてもよく、適宜これらの環構造がさらに１以上のニトロ基で置換されていてもよい。本発明に係る非蛍光又は実質的に非蛍光のシアニン染料或いはシアニン染料誘導体は、欧州特許第１０８６１７９Ｂ１号（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＵＫＬｉｍｉｔｅｄ）に記載されているように、生体分子に係る反応中での結合及び／又は開裂事象の検出を伴うアッセイに際して蛍光供与体／受容体対の一成分を標識するために使用できる。

第一の態様に係る実施形態では、
ｉ）アリールは、６〜１０の炭素原子を有する１つの芳香環又は２つの縮合芳香環を含む芳香族置換基（例えば、フェニル又はナフチル）であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖又は枝分れアルキル基、アラルキル及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシ））で独立に置換され、
ii）ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択できる１以上で３以下のヘテロ原子を含む単環式又は二環式五〜十員芳香環系であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖又は枝分れアルキル基、アラルキル及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシ））で独立に置換され、
iii）アラルキルは、アリール又はヘテロアリール基で置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルキル基であり、
iv）ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される。

標的結合基Ｆのおかげで、本発明に係る化合物は、生物学的検出系での用途のため、標的生体材料を部位特異的に共有結合で標識するのに有用である。好適な標的材料には、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質、ペプチド、抗体、抗原及びタンパク質−核酸（ＰＮＡ）がある。リポーター部分は、細胞（生細胞又は死細胞）内でのリポーターの経路を指示し得る化学種、或いは細胞への出入りを助ける化学種、例えば、親油性膜の透過を可能にするための長鎖アルキル残基、或いは二本鎖ＤＮＡを含む核又は他の細胞領域にリポーターを局在させるための挿入化学種に結合することもできる。

第二の態様では、Ｎ−末端システインを含むか、又はＮ−末端システインを含むように誘導体化された対象タンパク質を標識するための方法であって、
ｉ）前記タンパク質を含む液体に下記式（Ｉ）の化合物を添加し、

（式中、
Ｄはシアニン染料及びその誘導体から選択される染料であり、
Ｂは生体親和性標識であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基からなり、
ＭはＦとの結合に適合した基であり、
Ｌ^１及びＬ^２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の結合原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含み得る基からなる。）
ii）前記タンパク質を標識するのに適した条件下で前記化合物を前記タンパク質と共にインキュベートする
ことを含んでなる方法が提供される。

好適には、Ｌ^１及びＬ^２の各々には２〜３０の原子が存在し、好ましくは６〜２０の原子が存在する。

標的タンパク質を標識するのに使用するための好ましい式（Ｉ）の化合物は、前記に定義したような式（II）又は（III）を有するものである。

本発明の化合物を用いる共有結合標識は、前記に定義したように１以上のカルボン酸チオエステル基又は１，２−アミノチオール基を有する標的を用いて達成できる。標的は、標的材料の相補的基と共有結合し得る量の、前記に定義したような１以上の基Ｆを有する本発明の化合物と共にインキュベートすればよい。標的材料及び本発明の化合物は、標的材料を本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間にわたりインキュベートされる。即ち、例えば、チオエステル基Ｆは１，２−アミノチオール基を含むか、又は１，２−アミノチオール基を含むように誘導体化された上記標的材料の任意のものと反応して共有結合を形成し得る。これらの方法及びそれで得られる生成物（例えば、リポーター標識生体分子）も、本発明の追加の態様として想定されている。

好適には、対象タンパク質は抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、微生物材料、細胞及び細胞膜からなる群から選択できる。

第二の態様に係る特定の実施形態では、支持体に結合した固定化リガンド（又は特異結合パートナー）に対する親和性標識部分の親和性を利用するアフィニティークロマトグラフィーにより、染料で標識した対象タンパク質を分離及び／又は精製する方法が提供される。アフィニティークロマトグラフィーは、生理的条件下で標識及び非標識タンパク質分子の分離を可能にする迅速で簡便な方法を提供する。親和性標識で標識したタンパク質はアフィニティーカラムに選択的に結合させることができ、未反応のタンパク質はカラムを洗浄することで除去できる。好適に特異結合部分には、（ビオチン標識に対しては）アビジン又はストレプトアビジンがあり、（Ｈｉｓ標識又はイミノジ酢酸に対しては）固定化金属イオン、例えばＣｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）及びＦｅ（III）がある。タンパク質の親和精製のための方法は当業者にとって公知であり、例えば、Ｏｓｔｒｏｖｅ，Ｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９０），Ｖｏｌ１８２，ｐａｇｅ３５７を参照されたい。

典型的な標識方法では、Ｎ−末端システイン残基を含む標的ペプチド又はタンパク質を、約１．５％のＭＥＳＮＡを含むｐＨ約７．３〜７．４のリン酸塩緩衝液（通例は２００ｍＭＮａＣｌ、２００ｍＭリン酸ナトリウム）中で過剰のシアニン染料チオエステル誘導体（例えば、Ｃｙ５−ＭＥＳＮＡ（Ｃｙ５−メルカプトエタンスルホン酸エステル））と共に撹拌する。標識反応中での標的ポリペプチドの濃度は一般に１００μＭ〜１０ｍＭである一方、Ｃｙ５−ＭＥＳＮＡは一般に過剰に（例えば、１．５〜３倍のモル過剰量で）存在する。標的ポリペプチド濃度が比較的低い場合、Ｃｙ５−ＭＥＳＮＡの濃度は通常は１ｍＭ以上に維持される。一般に、小さいペプチドを標識するためには、Ｃｙ５−ＭＥＳＮＡ及びＭＥＳＮＡ補助因子の溶液を凍結乾燥した標的に直接添加する。

通例、本発明の試薬を用いるタンパク質及び大きいポリペプチドの部位特異的標識のためには、まず標的を、標識反応に影響を及ぼさないことが知られている適当な緩衝液中に置き換える。次いで、Ｃｙ５−ＭＥＳＮＡ及びＭＥＳＮＡチオール補助因子を連結緩衝液中に溶解した等容の溶液をタンパク質に添加して、反応体の所望最終濃度を得る。反応生成物を室温で一晩撹拌する。高い反応体濃度に対しては反応時間を１時間未満に短縮することができ、標的ポリペプチドの安定性が問題となる場合には、標識反応を４℃で効率的に行うことができる。標識反応の完了後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を約５０ｍＭの最終濃度となるように添加し、所望の物質をアフィニティークロマトグラフィーで単離する。

天然の化学的連結反応及び発現タンパク質連結反応を実施する場合には、ペプチド断片の連結を助けるため、及び／又は反応体又は生成物を安定化するため、様々な変性剤、有機溶剤及び界面活性剤を反応緩衝液に添加できる。かかる試薬は、必要ならば生成物の収率を高めるため、標識反応中で使用することもできる。その例には、特に限定されないが、塩化グアニジニウム、尿素、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、トリトンＸ−１００、オクチルグルコシド、１，６−ヘキサンジオール及びグリセロールがある。

本発明に従って誘導体化シアニン染料を用いる連結反応は、適宜７．０〜８．０のｐＨ及び４〜３７℃の範囲で変化する温度で実施できる。かかる温度範囲は本明細書中に記載した部位特異的標識に適合していると考えられる。

本方法の利点は、タンパク質系基質中に外来の標識をレジオ選択的で特異的なやり方で導入することを可能にし、かくして標識がタンパク質の生物学的機能に及ぼすことのある有害な効果を最小限に抑え得ることである。染料の過剰添加が生物学的活性を妨げる可能性がある場合には、標識の化学量論的関係を制御することが重要である。加えて、このような標識の化学量論的関係の制御が内部部位ではなく単一の末端部位に向けられるならば、これは標識化学種の生物学的有効性をさらに維持するという利益をもたらし得る。

以下の実施例及び図面を参照することで本発明をさらに詳しく説明する。図面中では、
図１は、実施例３及び４に係るチオエステル誘導体（α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡ）によるＧｒｂ２ＳＨ２ドメインのＮ−末端システイン誘導体の標識反応から得られた生成物を示している。

実験
１．２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−１−｛６−オキソ−６−［（２−スルホエチル）チオ］ヘキシル｝−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム

無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍｌ）に７−アゾベンゾトリアゾリルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ、６６ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を溶解した溶液中のＣｙ（商標）５モノ酸（４７ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）に、無水ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３０μｌ、０．１７２４ｍｍｏｌ）を添加し、５分間混合した。次いで、この活性化染料溶液を、ＤＭＦ（２ｍｌ）及びＤＩＥＡ（３０μｌ、０．１７２４ｍｍｏｌ）に２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ、４０ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）を溶解した撹拌溶液に乾燥窒素雰囲気下で添加した。この混合物に、乾燥４Ａモレキュラーシーブ（約１ｇ、＜５ミクロン、活性化粉末）を固体として添加した。乾燥窒素雰囲気下で、混合物を暗所において室温で一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー分析（逆相Ｃ１８プレート、溶離剤水／アセトニトリル（７０：３０、０．１％ＴＦＡ含有）は主成分（Ｒｆ_{ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ}＝０．２５）を示し、微量の出発原料（Ｒｆ_ａｃｉｄ＝０．１２）も認められなかった。

モレキュラーシーブを濾過により除去して濾液を過剰の酢酸エチル中に滴下し、青色の固体を濾別し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＰｒｏｄｉｇｙＣ１８カラム、２０ｍｌ／分で３０分間にわたり１５％Ｂ〜３０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、６５０ｎｍでのＵＶ検出］で精製した。生成物を濃青紫色の固体（４０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ、８３％収率）として単離した。

正確な単一同位体質量：Ｃ_３５Ｈ_４５Ｏ_１０Ｎ_２Ｓ_４は７８１を要求する。実測質量（ＭａｌｄｉＴｏｆ、ＬＣ−ＭＳ）：Ｍ^＋７８１．２５。δＨ（３００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）：８．３７（ｔ，１Ｈ）、８．３６（ｔ，１Ｈ）、７．８３（ｄ，１Ｈ）、７．８２（ｄ，１Ｈ）、７．６７（ｄｄ，１Ｈ）、７．６４（ｄｄ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，１Ｈ）、７．３３（ｄ，１Ｈ）、６．６１（ｔ，１Ｈ）、６．３８（ｄ，１Ｈ）、６．２８（ｄ，１Ｈ）、４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．０８（ｔ，２Ｈ）、３．０６（ｍ，２Ｈ）、２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．５６（ｔ，２Ｈ）、１．６４（ｍ，２Ｈ）、１．２８（ｔ，３Ｈ，７．１）、１．４０（ｍ，２Ｈ）。λ_ｍａｘ（ａｂｓ）＝６４７ｎｍ。（ε（Ｈ_２Ｏ）＝２３００００Ｍ^−１ｃｍ^−１）。

２．２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−１−｛６−オキソ−６−［（２−スルホエチル）チオ］ヘキシル｝−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムを用いる標識の特異性の判定
２．１Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ _２の調製
ｉ）Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂の合成
ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いる市販のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４３３Ａ自動化ペプチドシンセサイザーを使用し、全体にわたり装置製造業者の推奨手順に従ってＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂を合成した。Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を活性化剤として用い、０．２５ミリモルスケールでペプチドを合成した。

ii）Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ _２

Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂（１００ｍｇ、理論添加量０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）を脱保護し、室温の９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／２．５％水（３ｍｌ）中で２時間処理して固相から分離した。粗生成物を１０倍過剰量の冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、２５００ｒｐｍで５分間遠心し、エーテルをデカンテーションで除去した。粗ペプチドをエーテルでさらに２回洗い、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム、溶離剤Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配：１ｍｌ／分で３０分間にわたり０〜７３％Ｂ、２１４ｎｍでの検出］で精製した。生成物を単離して凍結乾燥することで、無色の綿毛状固体（重量２１ｍｇ、６０％）を得た。単一同位体質量：９０６．４。実測質量（ＬＣ−ＭＳ）：ＭＨ^＋９０７．３、Ｍ^＋Ｎａ９２９．６。２１４ｎｍでのＲＰ−ＨＰＬＣ（ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム、溶離剤Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、１ｍｌ／分で２５分間にわたり５〜５０％Ｂ、６５０ｎｍでのＵＶ検出）で判定して純度＞９５％。

iii）Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ _２
固体のＨ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（重量３．０ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）に、１．５％２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩を含む２００ｍＭリン酸塩緩衝液、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２（４００μｌ）にＣｙ５−ＭＥＳＮＡ（３．５ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を添加した。反応混合物をローラー上に乗せ、暗所において室温で３０分間撹拌した。インキュベーション中、青色の沈殿が生じたが、アセトニトリル（４０μｌ）を添加したところ再溶解した。

次いで、２００ｍＭリン酸塩緩衝液、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２（０．５ｍｌ、０．００２５ｍｍｏｌ）中の５００ｍＭＤＴＴ（２００μｌ）を反応混合物に添加して完全に混合し、暗所において室温でさらに３０分間撹拌した。次いで、粗反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ［ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム、溶離剤Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配：４ｍｌ／分で３０分間にわたり２０〜３５％Ｂ、６５０ｎｍ及び２１４ｎｍでの検出］で精製した。生成物を単離し、青色の綿毛状固体として凍結乾燥した（６５０ｎｍでのＵＶ／ＶＩＳで測定して１．６ｍｇ、５０％収率、６５０ｎｍでのＲＰ−ＨＰＬＣで判定して純度９８％）。単一同位体質量：Ｃ_６７Ｈ_１０１Ｎ_１６Ｏ_１８Ｓ_４は１５４５．６３６を要求する。実測値（ＬＣ−ＭＳ）：Ｍ^＋１５４５．７。

２．２標識ペプチドの特性決定
ｉ）Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ _２に関するエルマン試験
Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２の試料を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２７（緩衝原液）に溶解して、６５０ｎｍでのＵＶ／ＶＩＳで測定して０．３μＭペプチド原液を得た。

０．３μＭペプチド原液（４０μｌ）及び１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２７（５０μｌ）中の１０ｍＭ５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を緩衝原液（９１０μｌ）中で混合して緑色の溶液を得た。（ＴＮＢ^２−の生成に原因する）４１２ｎｍでの吸光度をＤＴＮＢブランク［緩衝原液（９５０μｌ）中の１０ｍＭＤＴＮＢ原液（５０μｌ）］に対して記録した。ＴＮＢ^２−の既知モル吸収係数（１４１５０Ｍ^−１ｃｍ^−１）を用いてチオール濃度を求めたところ、ペプチド濃度の約２倍の６５５μＭであって、２つの遊離チオール基が確認された。［ＳＨ］＝［Ａ４１２ｎｍ（試料）−Ａ４１２ｎｍ（基準材料）／ε（ＴＮＢ^２−）
ii）Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ _２の酵素消化
１０％アセトニトリルを含むＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０（１００μｌ）にＣｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（６５０ｎｍでのＵＶ／ＶＩＳで測定して１８０μｇ）を溶解した溶液に、ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０（７０μｌ）中のＡｓｐ−Ｎを添加した。反応混合物を暗所において室温で４時間撹拌した。反応混合物を、ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０（５５μｌ）中の２５０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣＬ（ＴＣＥＰ）で３０分間処理した。還元した反応混合物を水中の０．１％ＴＦＡで１：５に希釈し、逆相ＨＰＬＣ［ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、溶離剤Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、１ｍｌ／分で３０分間にわたり５〜５０％Ｂ、２１４ｎｍでのＵＶ、６５０ｎｍ］で精製した。反応混合物の２種の成分は、Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（単一同位体質量：Ｃ_４４Ｈ_６０Ｎ_５Ｏ_１１Ｓ_３は９３０．３４５１を要求する。実測質量（ＭＡＬＤＩＴｏｆ）：Ｍ^＋９３０．０）及びＨ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（単一同位体質量：Ｃ_２３Ｈ_４３Ｎ_１１Ｏ_８Ｓは６３３．３０１６を要求する。実測質量（ＭＡＬＤＩＴｏｆ）：Ｍ^＋６３３．０）として同定された。

３．α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡ［Ｎ ^６ −（６−｛（２Ｚ）−２−［（２Ｅ，４Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム−２−イル）ペンタ−２，４−ジエニリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝ヘキサノイル）−Ｎ ^２ −（６−｛［６−（５−メチル−２−オキソイミダゾリジン−４−イル）ヘキサノイル］アミノ｝ヘキサノイル）リシルチオエタン−２−スルホン酸］の調製

３．１ α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ［２−［（１Ｅ，３Ｅ）−５−（１−｛６−［（５−カルボキシ−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンチル）アミノ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，３−ペンタジエニル］−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム塩］の調製
Ｃｙ５モノ遊離酸カリウム塩（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＬｔｄ）（４５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（７２０μｌ）を無水ジメチルスルホキシド（１８ｍｌ）に溶解した。これにＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（６６６ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した後、ＴＬＣ（ＲＰＣ_１８、１：１メタノール：水）によれば無視できる量の出発原料が残留していた。反応混合物をジエチルエーテル中にゆっくりと注入して生成物（Ｃｙ５モノＮＨＳエステル）を沈殿させ、これを濾別し、酢酸エチルで洗い、真空中で乾燥した。生成物を無水ジメチルスルホキシド（１８ｍｌ）に再溶解し、ＤＩＥＡ（７２０μｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ−リシン−ＯＨ（３６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）（９ｍｌ）とジメチルスルホキシド（９ｍｌ）の混合物中に懸濁した。懸濁液をＣｙ５ＮＨＳエステルの溶液にゆっくりと添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣ（ＲＰＣ_１８、２：３メタノール：水）は、出発原料の消失及び新しい生成物スポットの生成を示した。

生成物をＨＰＬＣ（ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム（５０×４．１４ｃｍ）、流量２５ｍｌ／分、８０分間にわたり２０〜８０％Ｂの勾配（溶離剤Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、溶離剤Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）、６５０ｎｍでの検出）で精製した。所望の生成物を含む画分をプールし、溶媒の大部分を減圧下で除去し、残留物を凍結乾燥した。生成物（α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ）を綿毛状の藍色固体（４８７ｍｇ、７４％）として得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）実測値：１００８（Ｍ^＋）［理論値（Ｃ_５４Ｈ_６４Ｎ_４Ｏ_１１Ｓ_２）：１００９］。^１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、Ｄ_６ＤＭＳＯ）：１．２７（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３）、１．３５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．５５（ｍ′ｓ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．７（ｓ，１２Ｈ，(ＣＨ_３)_２）、１．７８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．０５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２）、３．０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、３．９２（ｍ，１Ｈ，ＣＨアミノ酸）、４．１１（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ_２，Ｎ^＋ＣＨ_２）、４．２７（ｍ，３Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２，ＣＨフルオレニル）、６．３（ｄ，２Ｈ，α，α′メチン），６．５９（ｔ，１Ｈ，γメチン）、７．２８〜７．４８（ｍ′ｓ，６Ｈ，Ｆｍｏｃ及びインドールＡｒ）、７．６５（ｄ，２Ｈ，フルオレニルＡｒ）、７．７３（ｄ，２Ｈ，フルオレニルＡｒ）、７．８５（ｓ，２Ｈ，インドールＡｒ）、７．９（ｄ，２Ｈ，インドールＡｒ）、８．３８（ｔ，２Ｈ，β，β′メチン）。

３．２ ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ［Ｎ ^６ −（６−｛（２Ｅ）−２−［（２Ｅ，４Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム−２−イル）ペンタ−２，４−ジエニリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝ヘキサノイル）リシン］の調製
ＮＭＰ中２０％ピペリジンの混合物（２ｍｌ）中でα−Ｆｍｏｃ−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を脱保護した。ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、１：１ＭｅＯＨ：水）は、出発原料のスポット（ｒｆ＝０．４６）に比べて新しい生成物スポット（ｒｆ＝０．９２）の生成を示した。ピペリジンを減圧下で除去し、反応混合物をジエチルエーテル中に注入することで染料を沈殿させた。生成物を濾別し、ジクロロメタン、次いで酢酸エチルで洗うことで、黄色のＦｍｏｃ由来副生物を除去した。生成物を水に溶解し、濾過し、次いでＨＰＬＣ（ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＣ１８カラム、１０ｍｌ／分で４５分間にわたり０〜５０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、２１５ｎｍでの検出）で精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、減圧下で溶媒を除去して青色の残留物を得た。残留物を酢酸エチルでトリチュレートし、得られた固体を４０℃で真空乾燥した。生成物（ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ）を濃青色の固体（４３ｍｇ、４８％）として得た。分析用ＨＰＬＣＡＫＴＡ分析：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８カラム、１ｍｌ／分で３０分間にわたり０〜５０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、６５０ｎｍでの検出、ｒｔ＝２０．２２分。ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）実測値：７８５（Ｍ^＋）［理論値（Ｃ_３９Ｈ_５３Ｎ_４Ｏ_９Ｓ_２）：７８５］。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_６ＤＭＳＯ）：１．２６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３）、１．５２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．６２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．６９（ｓ，１２Ｈ，(ＣＨ_３)_２）、２．０２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２．９２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、３．８５（ｍ，１Ｈ，ＣＨアミノ酸）、４．１０（ｍ，ＮＣＨ_２，Ｎ^＋ＣＨ_２）、６．２９（ｄ，１Ｈ，αメチン）、６．３４（ｄ，１Ｈ，α′メチン）、６．５８（ｔ，１Ｈ，γメチン）、７．３２（ｍ，２Ｈ，インドールＡｒ）、７．８２（ｄ，２Ｈ，インドールＡｒ）、８．０４（ｍ，３Ｈ，ＮＨ_３ ^＋）、８．３７（ｔ，２Ｈ，β，β′メチン）。

３．３Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸の調製
Ｄ−デスチオビオチン（２５０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（２ｍｌ）に溶解した。この溶液にＰｙＡＯＰ（６１０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２００μｌ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素下において室温で３時間撹拌した後、６−アミノカプロン酸（１５３ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）及び追加量のＤＩＥＡ（２００μｌ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をさらに４時間撹拌した。ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、１：２ＭｅＯＨ：水、シンナムアルデヒド染色による検出）は、出発原料（ｒｆ＝０．７６）に比べて新しい生成物スポット（ｒｆ＝０．６３）の生成を示した。反応混合物を過剰のジエチルエーテル中に注入して褐色の油を得た。油を酢酸エチルでトリチュレートしてオフホワイトの固体を得た。生成物を濾別し、ＨＰＬＣ［ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＣ１８カラム、１０ｍｌ／分で１０分間にわたり０〜５０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、２１５ｎｍでの検出］で精製した。所望の生成物を含む画分をプールし、減圧下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルでトリチュレートして白色の固体を得た。生成物を濾別し、４０℃で減圧乾燥した。生成物（Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸）を白色の固体（４８ｍｇ、１２．５％）として得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）実測値：３２７（Ｍ^＋）［理論値（Ｃ_１６Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_４）：３２７］。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ^６ＤＭＳＯ）：０．９６（ｄ，３Ｈ，ＣＨ_３）、１．２５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．３４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、１．４８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ_２）、２．０３（ｍ，２Ｈ，Ｃ(Ｏ)ＣＨ_２）、２．６０（ｍ，２Ｈ，Ｃ(Ｏ)ＣＨ_２）、３．０１（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ_２）、３．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．６０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、６．１１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．２９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．７１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。

３．４Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの調製
Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸（４８ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ビス（テトラメチレン）−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＳＰｙＵ）（９０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（４０μｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下において室温で６時間撹拌したところ、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、１：２ＭｅＯＨ：水、シンナムアルデヒド染色による物質検出）は、出発原料（ｒｆ＝０．６８）に比べて基線位置に新しい生成物の生成を示した。反応混合物をジエチルエーテル中に注入して褐色のガムを得た。上澄み液をデカンテーションで除去し、ガムを再びジエチルエーテルで処理した。固体は生じなかった。ガムを減圧下で乾燥し、６２ｍｇの理論収量を仮定して、生成物（Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を次の染料結合反応で直接使用した。

３．５ α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ［Ｎ ^６ −（６−｛（２Ｚ）−２−［（２Ｅ，４Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム−２−イル）ペンタ−２，４−ジエニリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝ヘキサノイル）−Ｎ ^２ −（６−｛［６−（５−メチル−２−オキソイミダゾリジン−４−イル）ヘキサノイル］アミノ｝ヘキサノイル）リシン］の調製
ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ（４３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）、Ｄ−デスチオビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（６２ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（８０μｌ、０．４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中で一緒に３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、１：１ＭｅＯＨ：水）は、出発原料のスポットの直下に新しい生成物スポット（ｒｆ＝０．７９）の生成を示した。生成物をジエチルエーテル（２００ｍｌ）中に沈殿させ、次いで濾別した。この物質が^１ＨＮＭＲで純粋とわかるまで、ＨＰＬＣ［ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＣ１８カラム、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、様々な勾配、２１５ｎｍでの検出］で繰返し精製した。分析用ＨＰＬＣＡＫＴＡ分析：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８カラム、１ｍｌ／分で３０分間にわたり０〜５０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、６５０ｎｍでの検出、ｒｔ＝２２．０４分。ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）実測値：１０９４（Ｍ^＋）［理論値（Ｃ_５５Ｈ_８０Ｎ_７Ｏ_１２Ｓ_２）：１０９４］。

３．６ α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡ［Ｎ ^６ −（６−｛（２Ｚ）−２−［（２Ｅ，４Ｅ）−５−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム−２−イル）ペンタ−２，４−ジエニリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝ヘキサノイル）−Ｎ ^２ −（６−｛［６−（５−メチル−２−オキソイミダゾリジン−４−イル）ヘキサノイル］アミノ｝ヘキサノイル）リシルチオプロパン−３−スルホン酸］の調製
α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＯＨ（１０ｍｇ、８．８μｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（２ｍｌ）に溶解し、ＰｙＡＯＰ（１０ｍｇ、１９．２μｍｏｌ）、ＭＥＳＮＡ（５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１０μｌ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を窒素下で４時間撹拌した。反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ［ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＣ１８カラム、１０ｍｌ／分で４５分間にわたり１５〜４０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、２１５ｎｍでの検出］で精製した。生成物を含む画分を合わせ、減圧下で溶媒の大部分を除去し、残留物を凍結乾燥した。生成物を綿毛状の青色固体（４ｍｇ、３７％）として得た。ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、１：１水：アセトニトリル）：ｒｆ＝０．７６。分析用ＨＰＬＣＡＫＴＡ分析：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ１８カラム、１ｍｌ／分で３０分間にわたり０〜５０％Ｂ、溶離剤Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、溶離剤Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、６５０ｎｍでの検出、ｒｔ＝２１．０４分。λ_ｍａｘ＝６４８ｎｍ（ＰＢＳ緩衝液）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）実測値：１２１９（ＭＨ^＋）［理論値（Ｃ_５７Ｈ_８４Ｎ_７Ｏ_１４Ｓ_４）：１２１８］。

４．タンパク質の標識及び親和精製
４．１ α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡによるＮ−末端システインＧｒｂ２ＳＨ２の標識及び精製
Ｎ−末端システインＧｒｂ２ＳＨ２（Ｎ−Ｃｙｓ−Ｇｒｂ２ＳＨ２）（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２中で２００μＭ）（２００μｌ）にα−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡ（反応緩衝液中で２ｍＭ）（２００μｌ）を添加した。Ｎ−Ｃｙｓ−Ｇｒｂ２ＳＨ２は組換え技術を用いて調製した。反応緩衝液は、塩化ナトリウム（２００ｍＭ）及び４％ＭＥＳＮＡを含むリン酸塩緩衝液（２００ｍＭ）、ｐＨ７．２からなっていた。反応混合物を、光から保護するためにホイルで包み、室温で１２時間放置した。次いで、ｄｌ−ジチオトレイトール（最終濃度６０ｍＭ）で反応を停止した。高速脱塩カラム、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、２ｍｌ／分）の溶離剤及び２８０ｎｍでの検出を用いるＦＰＬＣで、未反応染料を標識／非標識タンパク質から分離した。タンパク質画分を合わせ、デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン親和性プローブ標識タンパク質をストレプトアビジンビーズ（ＰＩＥＲＣＥＵｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）ストレプトアビジン）に結合した。ビーズをＰＢＳ緩衝液及び結合緩衝液（５００ｍＭＮａＣｌを含むＰＢＳ緩衝液）の両方で激しく洗った。冷ビオチン（１．６ｍＭ）を添加することで、生成物（α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｒｂ２ＳＨ２）をストレプトアビジンビーズから抽出した。数回の抽出操作が必要であった。この物質を透析（ＰＩＥＲＣＥＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｓｅｒ（商標）ミニ透析ユニット、７０００ｍｗｃｏ）でさらに精製することで、試料から遊離ビオチンを除去した。生成物を、下記の対照品と共に、ＳＤＳＰＡＧＥで分析した（図１参照）。

Ｃｙ５蛍光に関するパラメーターを用いて蛍光標識を含む画分を検出するタイフーン（Ｔｙｐｈｏｏｎ）イメージャーを用いてゲルをイメージ化した（図１Ａ）。次いで、ゲルをクーマシーブルー染色で染色することでタンパク質含有画分を決定した（図１Ｂ）。ＳＤＳＰＡＧＥゲルは、（ａ）非標識タンパク質（ＸＡ因子及びＮ−Ｃｙｓ−Ｇｒｂ２ＳＨ２の両方）がストレプトアビジンビーズに結合しなかったこと（図１Ａ及び１Ｂ、カラム５）（濃いタンパク質染色）、並びに（ｂ）冷ビオチンを添加することで生成物がストレプトアビジンビーズから除去されたこと（図１Ａ及び１Ｂ、カラム７及び８）（タンパク質染色及びＣｙ５蛍光の両方）を示している。

実施例３及び４に係るチオエステル誘導体（α−Ｄ−デスチオビオチン−ε−Ｃｙ５−Ｌ−リシン−ＭＥＳＮＡ）によるＧｒｂ２ＳＨ２ドメインのＮ−末端システイン誘導体の標識反応から得られた生成物を示している。

Claims

カルボン酸チオエステル基及びチオエステルとの共有結合反応に適した基から選択される１以上の標的結合基を含有する、シアニン染料又はその誘導体を含んでなる化合物であって、当該化合物がそれに共有結合した親和性標識を含むことを特徴とする化合物。
下記式（Ｉ）を有する、請求項１記載の化合物。

式中、
Ｄはシアニン染料及びその誘導体から選択される染料であり、
Ｂは親和性標識であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基からなり、
ＭはＦとの結合に適合した基であり、
Ｌ^１及びＬ^２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の結合原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含み得る基からなる。
Ｌ^１及びＬ^２の各々が２〜３０の原子を含む、請求項２記載の化合物。
Ｌ^１及びＬ^２が次式の基から独立に選択される、請求項２記載の化合物。
−{(ＣＨＲ′)_ｐ−Ｑ−(ＣＨＲ′)_ｒ}_ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
Ｑが−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ′は前記に定義した通りである。）から選択される、請求項４記載の化合物。
前記親和性標識がビオチン及びデスチオビオチンから選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の化合物。
前記親和性標識がＨｉｓ標識、イミノジ酢酸及びニトリロトリ酢酸から選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の化合物。
標的結合基Ｆが次式のカルボン酸チオエステルである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の化合物。

式中、Ｌ′は単結合であるか、或いは炭素原子から選択される１〜３０の結合原子を含み、適宜−ＮＨ−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択される１以上の基を含む基であり、Ｒ″は適宜スルホネートで置換され得るＣ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_６〜Ｃ_１０アリール又はＣ_７〜Ｃ_１５アラルキルであるか、或いは−(ＣＨ_２)_２−ＣＯＮＨ_２である。
標的結合基Ｆが次式の１，２−アミノチオール基である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の化合物。

式中、Ｌ′は前記に定義した通りである。
当該化合物が下記式（II）を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物。

式中、
基Ｒ^３及びＲ^４はＺ^１環構造に結合していると共に、基Ｒ^５及びＲ^６はＺ^２環構造に結合しており、
ｎは１〜３の整数であり、
Ｚ^１及びＺ^２は、１つの環又は２つの縮合環を含む芳香族又はヘテロ芳香族環系を完成するために必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子から選択される５又は６の原子を有すると共に、適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子を有し、
Ｘ及びＹは同一であるか又は異なっており、＞ＣＲ^８Ｒ^９、酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−、＞Ｎ−Ｗ（式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素及び基Ｒ^１０から選択される。）から選択され、
基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０の１以上は次式の基であり、

（式中、Ｂ、Ｆ、Ｍ、Ｌ^１及びＬ^２は前記に定義した通りである。）
基Ｒ^７は水素及び非置換又はアリール置換であり得るＣ_１〜Ｃ_４アルキルから独立に選択されるか、或いは２以上のＲ^７が次式の基と一緒になって、Ｒ^７で置換されると共に、適宜−Ｏ−、−Ｓ−及び＞ＮＲ^７（式中、Ｒ^７は前記に定義した通りである。）から選択されるヘテロ原子を含み得る炭化水素環系を形成し、

（式中、ｎは前記に定義した通りである。
残りの基Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は水素、ハロゲン、アミド、シアノ、ニトロ、モノ−又はジ−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル及び基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート及び第四アンモニウムから選択され、ｍは０又は１〜６の整数である。）からなる群から独立に選択され、
残りの基Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は独立にＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りの基Ｒ^１及びＲ^２は水素、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙ及びｍは前記に定義した通りである。）、及び非置換であるか又は２以下のニトロ基で置換され得るベンジルから独立に選択される。）
当該化合物が下記式（III）を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物。

式中、
基Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５はＸ及びＹを含む環に結合しているか、或いは適宜Ｚ^１及びＺ^２環構造の原子に結合しており、
Ｚ^１及びＺ^２は、１つの環又は２つの縮合環を含む芳香族又はヘテロ芳香族環系を完成するために必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子から選択される５又は６の原子を有すると共に、適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子を有し、
Ｘ及びＹは同一であるか又は異なっており、＞ＣＲ^８Ｒ^９、酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−、＞Ｎ−Ｗ（式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素及び基Ｒ^１０から選択される。）から選択され、
ＡはＯ及びＮＲ^１６（式中、Ｒ^１６は次式の置換アミノ基である。）から選択され、

基Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１７及びＲ^１８の１以上は次式の基であり、

（式中、Ｂ、Ｆ、Ｍ、Ｌ^１及びＬ^２は前記に定義した通りである。）
残りの基Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５は水素、ハロゲン、アミド、シアノ、ニトロ、モノ−又はジ−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル及び基−(ＣＨ_２)_ｍ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート及び第四アンモニウムから選択され、ｍは０又は１〜６の整数である。）からなる群から独立に選択され、
残りの基Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は独立にＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りの基Ｒ^１７は水素、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びアリールから選択され、残りの基Ｒ^１８はＣ_１〜Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、炭素原子数２〜７のアシル基、及びチオカルバモイル基から選択される。
Ｚ^１及びＺ^２がフェニル、ピリジル、ナフチル、キノリニル及びインドリル部分からなる群から独立に選択される、請求項１０又は請求項１１記載の化合物。
Ｚ^１及びＺ^２がフェニル及びナフチル部分から選択される、請求項１０又は請求項１１記載の化合物。
Ｎ−末端システインを含むか、又はＮ−末端システインを含むように誘導体化された対象タンパク質を標識するための方法であって、
ｉ）前記タンパク質を含む液体に下記式（Ｉ）の化合物を添加し、

（式中、
Ｄはシアニン染料及びその誘導体から選択される染料であり、
Ｂは生体親和性標識であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基からなり、
ＭはＦとの結合に適合した基であり、
Ｌ^１及びＬ^２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の結合原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含み得る基からなる。）
ii）前記タンパク質を標識するのに適した条件下で前記化合物を前記タンパク質と共にインキュベートする
ことを含んでなる方法。
Ｌ^１及びＬ^２の各々が２〜３０の原子を含む、請求項１４記載の化合物。
Ｌ^１及びＬ^２が次式の基から独立に選択される、請求項１４記載の方法。
−{(ＣＨＲ′)_ｐ−Ｑ−(ＣＨＲ′)_ｒ}_ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
Ｑが−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ′は前記に定義した通りである。）から選択される、請求項１６記載の方法。
さらに、染料で標識された対象タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで分離及び／又は精製することを含む、請求項１４乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
前記対象タンパク質が抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、微生物材料、細胞及び細胞膜から選択される、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。