JP2005532543A5 - - Google Patents

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本発明はまた、タンパク質中の利用可能な標的アミノ酸残基すべてを標識し、それによって、標識タンパク質分子の単一集団が本質的に得られるように、蛍光染料でタンパク質を飽和標識する方法も提供するものである。好適には、標的アミノ酸はシステイン残基である。「利用可能」という用語は、アミノ酸残基が反応のために蛍光染料に接近可能であることをいう。利用可能なシステイン残基は接近可能で還元(すなわち、遊離チオール)型でなければならない。
Figure 2005532543
Figure 2005532543
Figure 2005532543

Claims (18)

  1. 式(I)及びそれらの塩の2種以上の異なる蛍光染料を含んでなる蛍光染料の整合セット。
    Figure 2005532543
    式中、nは1、2又は3であって上記染料の各々で異なり、
    1及びZ2は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
    1及びR2基の一方は次式の基であり
    Figure 2005532543
    (式中、Yは標的結合基である。)、
    残りのR1又はR2基は−(CH24−W又は−(CH2r−Hから選択され、
    3基は、R1又はR2のいずれかが−(CH2r−Hである場合(この場合R3はWである。)を除いて、水素であり、
    Wはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
    pは3〜6の整数であり、
    qは2又は3となるように選択され、
    rは1〜5の整数であり、
    上記染料の2種類のnが+1だけ異なる場合にはその2種類の染料のp、q及びrの1つは−1だけ異なることを特徴とする。
  2. 式(II)及びそれらの塩の2種以上の異なる蛍光染料を含んでなる蛍光染料の整合セット。
    Figure 2005532543
    式中、nは1、2又は3であって上記染料の各々で異なり、
    1及びR2基の一方は次式の基であり
    Figure 2005532543
    (式中、Yは標的結合基である。)、
    残りのR1又はR2基は−(CH24−W又は−(CH2r−Hから選択され、
    3基は、R1又はR2のいずれかが−(CH2r−Hである場合(この場合R3はWである。)を除いて、水素であり、
    Wはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
    pは3〜6の整数であり、
    qは2又は3となるように選択され、
    rは1〜5の整数であり、
    上記染料の2種類のnが+1だけ異なる場合にはその2種類の染料のp、q及びrの1つは−1だけ異なることを特徴とする。
  3. 式(I)又は(II)の2種以上の異なる蛍光染料を含み、
    nが1又は2となるように選択され、
    pが4又は5となるように選択され、
    qが2又は3となるように選択され、
    rが1、2又は3となるように選択される、請求項1又は請求項2記載の整合セット。
  4. 染料セットの各染料における標的結合基Yが同一であってマレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の整合セット。
  5. 染料Yの各々がマレイミド基である、請求項4記載の整合セット。
  6. 前記塩がK+、Na+、NH4 +、R3NH+及びR4+(式中、RはC1〜C4アルキルである。)から選択される、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の整合セット。
  7. 以下のセットから選択される、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の染料の整合セット。
    セット1
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(1−エチル−3,3−ジメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物I)と、
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(1,3,3−トリメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物II)、
    セット2
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(1−プロピル−3,3−ジメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物III)と、
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(1−エチル−3,3−トリメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物IV)、
    セット3
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(1−エチル−3,3−ジメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物I)と、
    1−(5−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソペンチル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(1−エチル−3,3−トリメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物V)、
    セット4
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(3,3−ジメチル(1−スルホ−ブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物VI)と、
    1−(5−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソペンチル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(3,3−ジメチル−(1−スルホ−ブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物VII)、
    セット5
    1−(6−{[3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロピル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(1−エチル−3,3−ジメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物VIII)と、
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(1−エチル−3,3−トリメチル−5−スルホ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物IV)、及び
    セット6
    1−(6−{[3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロピル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−2−[(1E,3E)−3−(3,3−ジメチル(1−スルホ−ブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)プロプ−1−エニル]−3,3−ジメチル−3H−インドリウム(化合物IX)と、
    1−(6−{[2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)エチル]アミノ}−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチル−2−[(1E,3E,5E)−5−(3,3−ジメチル−(1−スルホ−ブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエニル]−3H−インドリウム(化合物X)。
  8. 試料中のタンパク質の混合物を標識する方法であって、タンパク質の各々が1以上のシステイン残基を含んでおり、当該方法が、
    i)試料を含む水性液体に、ンパク質のシステイン残基と共有結合で反応し得る標的結合基を有する請求項1又は請求項2記載の蛍光染料の整合セットから選択される蛍光染料を添加し、
    ii)染料をタンパク質と反応させてタンパク質を染料で標識する
    ことを含み、もってタンパク質中の利用可能なシステイン残基すべてを染料で標識する方法。
  9. 前記シアニン染料がスルホン酸又はスルホネート基を含む、請求項記載の方法
  10. 前記標的結合基がマレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される、請求項8又は請求項記載の方法。
  11. 工程i)の前に、タンパク質を還元剤で処理する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
  12. 前記染料がタンパク質50μg当たり染料5〜200nmolで使用される、請求項8記載の方法。
  13. 前記標識がpH6.0〜9.0で実施される、請求項8記載の方法。
  14. 試料中の1種以上のタンパク質を標識する方法であって、当該方法が、
    i)該1種以上のタンパク質を含む液体試料に、個々の蛍光染料が次の式(I):
    Figure 2005532543
    (式中、nは1、2又は3であって上記染料の各々で異なり、
    1及びZ2は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
    1及びR2基の一方は次式の基であり
    Figure 2005532543
    (式中、Yは標的結合基である。)、
    残りのR1又はR2基は、−(CH24−W又は−(CH2r−Hから選択され、
    3基は、R1又はR2のいずれかが−(CH2r−Hである場合(この場合R3はWである。)を除いて、水素であり、
    Wはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
    pは3〜6の整数であり、
    qは2又は3となるように選択され、
    rは1〜5の整数である。)及びそれらの塩からなる蛍光染料の整合セットから選択される蛍光染料であって、染料の2種類のnが+1だけ異なる場合にはその2種類の染料のp、q及びrの1つは−1だけ異なることを特徴とするものを添加し、
    ii)1種以上のタンパク質の標識化に適した条件下で、染料を試料と共にインキュベートすることを含む方法。
  15. 1及びZ2の各々がフェニル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表す、請求項14記載の方法。
  16. nが1又は2となるように選択され、
    pが4又は5となるように選択され、
    qが2又は3となるように選択され、
    rが1、2又は3となるように選択される、
    請求項14又は請求項15記載の方法。
  17. 前記標的結合基Yがマレイミド基及びヨードアセトアミド基から選択される、請求項14乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。
  18. 式(I)及びそれらの塩の2種以上の異なる蛍光染料を含む蛍光染料の整合セットを含んでなるキット。
    Figure 2005532543
    式中、nは下記染料の各々について異なっており、1、2又は3であり、
    1及びZ2は独立にフェニル又はナフチル環系を完成するのに必要な炭素原子群を表し、
    1及びR2基の一方は次式の基であり
    Figure 2005532543
    (式中、Yは標的結合基である。)、
    残りのR1又はR2基は、−(CH24−W又は−(CH2r−Hから選択され、
    3基は、R1又はR2のいずれかが−(CH2r−Hである場合(この場合R3はWである。)を除いて、水素であり、
    Wはスルホン酸及びスルホネートから選択され、
    pは3〜6の整数であり、
    qは2又は3となるように選択され、
    rは1〜5の整数であり、
    上記染料の2種類のnが+1だけ異なる場合にはその2種類の染料のp、q及びrの1つは−1だけ異なることを特徴とする。
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