CN103534233A - 用于标记靶分子的杂双官能酯 - Google Patents

用于标记靶分子的杂双官能酯 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及一种用于使点击-反应性基团与载体分子或固体载体缀合的反应性酯剂。所述反应性酯剂具有通式IA，其中变量R1、R2、R3、Ra和L在整个申请中描述。

Description

用于标记靶分子的杂双官能酯
本申请要求2011年3月25日提交的美国临时专利申请号61/467,674的优先权，其公开内容通过引用而全文结合到本文中。
发明领域
公开了新的点击-反应性(click-reactive)化合物和标记方法。所述化合物被水增溶性苯酚酯激活，并且与包含亲核体的载体分子或固体载体接触，以得到点击-标记的载体分子或固体载体。
发明背景
有效点击-标记靶分子的能力取决于在反应和缀合条件下在标记和靶分子二者上存在的反应性基团。试剂(例如琥珀酰亚胺基酯(SE)和全氟苯基(PFP)酯)对水具有高反应性速率，从而限制制备、包装、分配和纯化条件和它们随后的贮存期限。此外，由于它们的水解反应性，在与期望的生物分子反应之前，用于在含水缓冲液中的生物分子标记反应的大多数试剂水解；因此，这些试剂被大大浪费(其通常需要以摩尔过量使用)。
Gee等人(Tetrahedron Letters (1999)，40，1471-1474)描述了用于染料标记的4-磺基四氟苯基(STP)酯。这些基团已显示适于在含水环境中缀合。
Koichi等人(Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1987)，35(3)，1044-1048)和Tsuji等人(Peptide Chemistry (1986)，Volume Date 1985，23rd 111-114)描述了经由用二氯苯酚磺酸钾、二溴苯酚磺酸钠和硝基苯酚磺酸钠的酯活化的肽合成。未提供分子的标记或缀合的描述。
虽然存在许多标记试剂并且已在断续的成功下使用，但是仍需要在生物学相关的反应条件下产生高标记收率的点击-标记试剂。此外，需要在含水环境中稳定并且不水解的点击-标记试剂。
发明概述
本发明提供了一种反应性基团，比起标准N-羟基琥珀酰亚胺基(SE)和全氟苯酚(PFP)酯，其具有较大的水解稳定性，当经由插入接头(intervening linker)与点击-反应性基团连接时，形成本发明的点击-标记试剂。本发明的反应性基团为水溶性的，得到具有意外的含水稳定性的点击-标记试剂。
本发明的一个说明性方面提供了一种式IA的化合物或其盐：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE002
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团。
本发明的另一个说明性方面提供了一种制备式IA的化合物或其盐的方法：
Figure 879345DEST_PATH_IMAGE002
IA
所述方法包括：
使式IB的化合物或其盐：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE004
IB
与式IC的化合物或其互变异构体或盐接触：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE006
IC
其中
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，
L为接头，和
Ra为点击-反应性基团。
本发明的另一个说明性方面提供了一种点击-标记载体分子或固体载体的方法，所述方法包括：
使包含亲核基团X并且具有式Rb-X的所述载体分子或固体载体与式IA的化合物或其盐接触：
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；
和
形成式I的化合物或其盐：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE008
I
其中
L为接头，
Ra为点击-反应性基团，和
Rb为包含亲核基团X的载体分子或固体载体。
本发明的另一个说明性方面提供了一种具有下式的点击-标记的载体分子或固体载体：
Figure 950124DEST_PATH_IMAGE008
I
其中
L为接头，
Ra为点击-反应性基团，和
Rb为包含亲核基团X的载体分子或固体载体。
本发明的另一个说明性方面提供了一种用于点击-标记载体分子或固体载体的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
a) 式IA的化合物或其盐：
Figure 79754DEST_PATH_IMAGE002
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；
和
b) 用于点击-标记所述载体分子或固体载体的用法说明。
由以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，详细描述和具体实施例(尽管表明本发明的优选实施方案)仅通过说明的方式给出，因为由该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图简述
图1显示点击抗体-多标签概念：经由不同的路线向抗体重链和/或轻链加入叠氮化物基团：代谢的-糖、代谢的-氨基酸、酶的-糖和化学的-SDP。
图2显示点击抗体-通过化学方法标签点击处理：使用SDP-N3，以通过化学方法用叠氮化物基团点击-标记抗体重链和轻链，使得能够进行随后的点击-化学。
图3显示化学(SDP-N3)点击标签-一种非常有效的过程：使用SDP-N3以标记在抗-GFP抗体中Lys残基的氨基侧链的化学点击-标记；标记不具有链特异性，并且由Lys残基(所示SDP-N3-改性抗体+ DIBO转化的低聚物(Oligo))的频率规定。
发明详述
本发明提供了用于点击-标记载体分子或固体载体的点击-标记试剂。本发明的点击-标记试剂通常包括式IA的化合物，包含用于活化点击-反应性基团的苯酚酯，其中L为接头，R1为卤素，R2为卤素，R3包含水增溶基团，和Ra为点击-反应性基团：
Figure 894126DEST_PATH_IMAGE002
IA
在活化点击-反应性基团之后，使所得到的点击-标记试剂与包含至少一个亲核基团(例如胺、硫醇基或羟基)的载体分子或固体载体接触，由此形成点击-标记的载体分子或固体载体。所得到的点击-标记的载体分子例如是稳定的，从而提供一种用于点击-标记生物分子(例如蛋白质或多核苷酸)的优良方法。所得到的生物分子可随后加入到生物学溶液，以用于许多点击-类型环加成反应，包括但不限于i) 铜-催化的Huisgen环加成或在叠氮化物与末端炔之间的1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑，ii) Diels-Alder反应，其为二烯与亲二烯体之间的环加成反应，和/或iii) 亲核取代反应，其中一种反应性物类为具有显著环应变的环氧或氮杂环丙烷化合物。
本文描述的苯酚酯在水溶液中具有优良的稳定性性质，并且对于生物分子上的胺保持高度反应性，使得它们成为本发明点击-标记试剂组分的理想选择。它们的水解稳定性对于制备、处理容易性、储存稳定性和生物分子标记效率具有显著的影响。此外，使用本发明的点击-标记试剂，显著改进试剂的纯化，并且可通过硅胶快速色谱法进行。使用许多常规的SE或PFP酯，不可能柱纯化，由于分子的高反应性和低稳定性。本发明的酯对于冻干也是稳定的，这大大提高处理和包装的容易性。比起现有的酯-改性的标记试剂(例如SE和PFP酯)，当储存时，在水解稳定性较大的同时降解也较少。
此外，较大的水解稳定性得到较大的标记效率，与等量的SE相比，本发明的化合物得到几乎两倍的生物分子标记。不束缚于理论，认为该效果也至少部分由于这样的分子情况：其中例如，比起SE或PFP部分，SDP部分将本发明的点击-标记试剂“引导”至载体分子或固体载体上更多和/或更好的部位。
此外，本发明的化合物已显示在宽范围的pH条件(pH 6-9)下对生物分子标记具有活性。宽的pH反应性范围为重要的特性，由于在较高的pH下许多生物分子由于它们有限的溶解度而不能被标记。这在蛋白质的选择性N-末端标记中也是有利的，其通常在较低的pH范围发生。
定义
在详细描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于具体的组合物或过程步骤，因为这些可变化。应注意到，除非上下文明确说明另外的情况，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。因此，例如，提及“一个点击-反应性基团”包括多个这样的基团，并且提及“一个接头”包括多个接头，等等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明相关领域普通技术人员通常理解的相同的含义。定义以下术语用于本文描述的本发明的目的：
“烷基”是指具有1-10个碳原子并优选1-6个碳原子的一价饱和脂族烃基。通过举例，该术语包括直链和支链烃基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。
“取代的烷基”是指具有1-5个、优选1-3个或更优选1-2个选自以下的取代基的烷基：烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、芳硫基(arylthio)、取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、环烷氧基、取代的环烷氧基、环烷硫基、取代的环烷硫基、环烯基、取代的环烯基、环烯基氧基、取代的环烯基氧基、环烯基硫代(cycloalkylthio)、取代的环烯基硫代、胍基、取代的胍基、卤素、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂芳硫基、取代的杂芳硫基、杂环基、取代的杂环基、杂环基氧基、取代的杂环基氧基、杂环基硫代(heterocyclylthio)、取代的杂环基硫代、硝基、SO3H、取代的磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇基、烷硫基和取代的烷硫基，其中所述取代基如本文所定义。
“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。通过举例，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。
“取代的烷氧基”是指基团-O-(取代的烷基)，其中取代的烷基如本文所定义。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代的杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-和取代的杂环基-C(O)-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。酰基包括“乙酰基”基团CH3C(O)-。
“酰基氨基”是指基团-NRC(O)烷基、-NRC(O)取代的烷基、-NRC(O)环烷基、-NRC(O)取代的环烷基、-NRC(O)环烯基、-NRC(O)取代的环烯基、-NRC(O)烯基、-NRC(O)取代的烯基、-NRC(O)炔基、-NRC(O)取代的炔基、-NRC(O)芳基、-NRC(O)取代的芳基、-NRC(O)杂芳基、-NRC(O)取代的杂芳基、-NRC(O)杂环基和-NRC(O)取代的杂环基，其中R为氢或烷基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“酰氧基”是指基团烷基-C(O)O-、取代的烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、取代的烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、取代的芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、取代的环烷基-C(O)O-、环烯基-C(O)O-、取代的环烯基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、取代的杂芳基-C(O)O-、杂环基-C(O)O-和取代的杂环基-C(O)O-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
本文使用的术语“炔反应性的”是指这样的化学部分，其与在另一个分子上的炔改性基团选择性反应，以在炔改性基团与炔反应性基团之间形成共价化学键。炔-反应性基团的实例包括但不限于叠氮化物。“炔-反应性的”还可指含有与炔基团选择性反应的化学部分的分子。
“氨基”是指基团-NH2。
“取代的氨基”是指基团-NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代的烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代的环烷基、-SO2-环烯基、-SO2-取代的环烯基、-SO2-芳基、-SO2-取代的芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代的杂芳基、-SO2-杂环基和-SO2-取代的杂环基，其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，条件是R’和R”不均为氢，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。当R’为氢，并且R”为烷基时，取代的氨基有时在本文中称为烷基氨基。当R’和R”为烷基时，取代的氨基有时在本文中称为二烷基氨基。当提及单取代的氨基时，是指R’或R”中的任一个为氢但不均为氢。当提及二取代的氨基时，是指R’和R”均不为氢。
“氨基羰基”是指基团-C(O)NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基硫代羰基”是指基团-C(S)NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基羰基氨基”是指基团-NRC(O)NR’R”，其中R为氢或烷基，并且R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基硫代羰基氨基”是指基团-NRC(S)NR’R”，其中R为氢或烷基，并且R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基羰基氧基”是指基团-O-C(O)NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基磺酰基”是指基团-SO2NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基磺酰基氧基”是指基团-O-SO2NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氨基磺酰基氨基”是指基团-NR-SO2NR’R”，其中R为氢或烷基，并且R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基(alkyenyl)、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“脒基”是指基团-C(=NR’”)R’R”，其中R’、R”和R’”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且其中R’和R”与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“芳基”或“Ar”是指具有单一环(例如，苯基)或多个稠合环(例如，萘基或蒽基)的具有6-14个碳原子的一价芳族碳环基团，所述稠合环可为芳族或可不为芳族(例如，2-苯并噁唑啉酮、2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点在芳族碳原子处。优选的芳基包括苯基和萘基。
“取代的芳基”是指被1-5个、优选1-3个或更优选1-2个选自以下的取代基取代的芳基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、芳硫基、取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、环烷氧基、取代的环烷氧基、环烷硫基、取代的环烷硫基、环烯基、取代的环烯基、环烯基氧基、取代的环烯基氧基、环烯基硫代、取代的环烯基硫代、胍基、取代的胍基、卤素、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂芳硫基、取代的杂芳硫基、杂环基、取代的杂环基、杂环基氧基、取代的杂环基氧基、杂环基硫代、取代的杂环基硫代、硝基、SO3H、取代的磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇基、烷硫基和取代的烷硫基，其中所述取代基如本文所定义。
“芳氧基”是指基团-O-芳基，其中芳基如本文所定义，通过举例，包括苯氧基和萘氧基。
“取代的芳氧基”是指基团-O-(取代的芳基)，其中取代的芳基如本文所定义。
“芳硫基”是指基团-S-芳基，其中芳基如本文所定义。
“取代的芳硫基”是指基团-S-(取代的芳基)，其中取代的芳基如本文所定义。
“烯基”是指具有2-6个碳原子并优选2-4个碳原子并且具有至少1个并优选1-2个烯基不饱和部位的烯基。例如，这样的基团举例说明有乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基。
“取代的烯基”是指具有1-3个取代基、并优选1-2个取代基的烯基，所述取代基选自：烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、芳硫基、取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、环烷氧基、取代的环烷氧基、环烷硫基、取代的环烷硫基、环烯基、取代的环烯基、环烯基氧基、取代的环烯基氧基、环烯基硫代、取代的环烯基硫代、胍基、取代的胍基、卤素、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂芳硫基、取代的杂芳硫基、杂环基、取代的杂环基、杂环基氧基、取代的杂环基氧基、杂环基硫代、取代的杂环基硫代、硝基、SO3H、取代的磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇基、烷硫基和取代的烷硫基，其中所述取代基如本文所定义，条件是任何羟基取代不与乙烯基(不饱和)碳原子连接。
“炔基”是指具有2-6个碳原子并优选2-3个碳原子并且具有至少1个并优选1-2个炔基不饱和部位的炔基。
“取代的炔基”是指具有1-3个取代基、并优选1-2个取代基的炔基，所述取代基选自：烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、芳硫基、取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、环烷氧基、取代的环烷氧基、环烷硫基、取代的环烷硫基、环烯基、取代的环烯基、环烯基氧基、取代的环烯基氧基、环烯基硫代、取代的环烯基硫代、胍基、取代的胍基、卤素、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂芳硫基、取代的杂芳硫基、杂环基、取代的杂环基、杂环基氧基、取代的杂环基氧基、杂环基硫代、取代的杂环基硫代、硝基、SO3H、取代的磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇基、烷硫基，和取代的烷硫基，其中所述取代基如本文所定义，条件是任何羟基取代不与炔碳原子连接。
本文使用的术语“水溶液”是指主要为水并且保持水的溶液特性的溶液。当水溶液含有除了水以外的溶剂时，水通常为主要溶剂。
本文使用的术语“叠氮化物反应性的”是指这样的化学部分：其与在另一个分子上的叠氮基改性基团选择性反应，以在叠氮基改性基团与叠氮化物反应性基团之间形成共价化学键。叠氮化物-反应性基团的实例包括但不限于炔，包括但不限于末端炔；膦，包括但不限于三芳基膦；和如在Agard等人的J. Am. Chem. Soc.，2004，126 (46)：15046-15047中描述的环辛炔和二氟环辛炔，如在Boon等人的WO2009/067663 A1 (2009)中描述的二苯并环辛炔，和如在Debets等人的Chem. Comm.，2010，46：97-99中描述的氮杂-二苯并环辛炔。以上描述的各种二苯并环辛炔在本文中统称为环辛炔基团。“叠氮化物-反应性的”还可指含有与叠氮基选择性反应的化学部分的分子。
“氮烯基(azenyl)”是指基团-N=NH。“取代的氮烯基”是指-N=NR’，其中R’为烷基、取代的烷基、氨基(即，三氮烯基)、亚氨基(叠氮化物)、取代的氨基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基。
“羰基”是指相当于-C(=O)-的二价基团-C(O)-。
“羧基”或“羧基”是指-COOH或其盐。
“羧基酯”或“羧基酯”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-取代的环烷基、-C(O)O-环烯基、-C(O)O-取代的环烯基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-取代的杂芳基、-C(O)O-杂环基和-C(O)O-取代的杂环基，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“(羧基酯)氨基”是指基团-NR-C(O)O-烷基、取代的-NR-C(O)O-烷基、-NR-C(O)O-烯基、-NR-C(O)O-取代的烯基、-NR-C(O)O-炔基、-NR-C(O)O-取代的炔基、-NR-C(O)O-芳基、-NR-C(O)O-取代的芳基、-NR-C(O)O-环烷基、-NR-C(O)O-取代的环烷基、-NR-C(O)O-环烯基、-NR-C(O)O-取代的环烯基、-NR-C(O)O-杂芳基、-NR-C(O)O-取代的杂芳基、-NR-C(O)O-杂环基和-NR-C(O)O-取代的杂环基，其中R为烷基或氢，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“(羧基酯)氧基”是指基团-O-C(O)O-烷基、取代的-O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-取代的芳基、-O-C(O)O-环烷基、-O-C(O)O-取代的环烷基、-O-C(O)O-环烯基、-O-C(O)O-取代的环烯基、-O-C(O)O-杂芳基、-O-C(O)O-取代的杂芳基、-O-C(O)O-杂环基和-O-C(O)O-取代的杂环基，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“氰基”是指基团-CN。
“环烷基”是指具有单一或多个环状环的具有3-10个碳原子的环烷基，包括稠合的、桥连的和螺环(spiro ring)体系。合适的环烷基的实例包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基和环辛基。
“环烯基”是指具有单一或多个环状环并且具有至少一个>C=C<环不饱和并优选1-2个>C=C<环不饱和部位的具有3-10个碳原子的非芳族环状烷基。
“取代的环烷基”和“取代的环烯基”是指具有1-5个或优选1-3个选自以下的取代基的环烷基或环烯基：氧代、硫酮、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、芳硫基、取代的芳硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、环烷氧基、取代的环烷氧基、环烷硫基、取代的环烷硫基、环烯基、取代的环烯基、环烯基氧基、取代的环烯基氧基、环烯基硫代、取代的环烯基硫代、胍基、取代的胍基、卤素、羟基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂芳硫基、取代的杂芳硫基、杂环基、取代的杂环基、杂环基氧基、取代的杂环基氧基、杂环基硫代、取代的杂环基硫代、硝基、SO3H、取代的磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇基、烷硫基和取代的烷硫基，其中所述取代基如本文所定义。
“环烷氧基”是指-O-环烷基。
“取代的环烷氧基”是指-O-(取代的环烷基)。
“环烷硫基”是指-S-环烷基。
“取代的环烷硫基”是指-S-(取代的环烷基)。
“环烯基氧基”是指-O-环烯基。
“取代的环烯基氧基”是指-O-(取代的环烯基)。
“环烯基硫代”是指-S-环烯基。
“取代的环烯基硫代”是指-S-(取代的环烯基)。
“DIBO”是指二苯并环辛炔。
“胍基”是指基团-NHC(=NH)NH2。
“取代的胍基”是指-NR13C(=NR13)N(R13)2，其中每个R13独立地选自氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，并且与共同的胍基氮原子连接的两个R13基团与其结合的氮任选连接在一起以形成杂环基或取代的杂环基，条件是至少一个R13不是氢，并且其中所述取代基如本文所定义。
“H”表示氢。
“卤素”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘.
“羟基”或“羟基”是指基团-OH。
“杂芳基”是指在环内具有1-10个碳原子和1-4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳族基团。这样的杂芳基可具有单一的环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠合的环(例如，吲嗪基或苯并噻吩基)，其中所述稠合的环可为芳族或可不为芳族和/或含有杂原子，条件是连接点通过芳族杂芳基的原子。在一个实施方案中，杂芳基的氮和/或硫环原子任选被氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基(thiophenyl)和呋喃基。
“取代的杂芳基”是指被1-5个，优选1-3个或更优选1-2个取代基取代的杂芳基，所述取代基选自与对于取代的芳基定义的取代基相同的基团。
“杂芳氧基”是指-O-杂芳基。
“取代的杂芳氧基”是指基团-O-(取代的杂芳基)。
“杂芳硫基”是指基团-S-杂芳基。
“取代的杂芳硫基”是指基团-S-(取代的杂芳基)。
“杂环”或“杂环基”或“杂环烷基”或“杂环基”是指在环内具有1-10个碳原子和1-4个选自氮、硫或氧的杂原子的具有单一环或多个稠合环(包括稠合的、桥连的和螺环体系)的饱和或不饱和基团，其中在稠合的环体系中，一个或多个环可为环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过非芳族环。在一个实施方案中，杂环基的氮和/或硫原子任选被氧化，以提供N-氧化物、亚磺酰基、磺酰基部分。
“取代的杂环基”或“取代的杂环烷基”或“取代的杂环基”是指被1-5个或优选1-3个与对于取代的环烷基所定义的相同取代基取代的杂环基。
“杂环基氧基”是指基团-O-杂环基。
“取代的杂环基氧基”是指基团-O-(取代的杂环基)。
“杂环基硫代”是指基团-S-杂环基。
“取代的杂环基硫代”是指基团-S-(取代的杂环基)。
杂环和杂芳基的实例包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为硫吗啉基)、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷和四氢呋喃基。
“肼基”是指基团-NHNH2-、=NNH-或=N(+)HNH2-。
本文使用的术语“试剂盒”是指相关的组分(通常为一种或多种化合物或组合物)的包装套件及其使用说明。
“取代的肼基”是指肼基，其中非氢原子(例如烷基)悬垂于肼基胺基团的一个或两个。取代的肼基的实例为-N(烷基)-NH2或=N+(烷基)-NH2。
“硝基”是指基团-NO2。
“氧代”是指原子(=O)或(-O-)。
本文使用的术语“SDP”是指磺基二氯苯酚和磺基二氯苯基(当提及酯时)。
本文使用的“SDP-N3”是指化合物：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE010
。
“螺环基”是指具有螺接(spiro union) (由为环的唯一共同成员的单一原子形成的螺接)的具有环烷基或杂环基环的具有3-10个碳原子的二价饱和环基，用以下结构举例说明：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE012
。
“磺酰基”是指二价基团-S(O)2-。
“取代的磺酰基”是指基团-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代的烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代的环烷基、-SO2-环烯基、-SO2-取代的环烯基、-SO2-芳基、-SO2-取代的芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代的杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代的杂环基，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。取代的磺酰基包括基团例如甲基-SO2-、苯基-SO2-和4-甲基苯基-SO2-。
“磺酰基氧基”是指基团-OSO2-烷基、-OSO2-取代的烷基、-OSO2-烯基、-OSO2-取代的烯基、-OSO2-环烷基、-OSO2-取代的环烷基、-OSO2-环烯基、-OSO2-取代的环烯基、-OSO2-芳基、-OSO2-取代的芳基、-OSO2-杂芳基、-OSO2-取代的杂芳基、-OSO2-杂环基、-OSO2-取代的杂环基，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“硫代酰基”是指基团H-C(S)-、烷基-C(S)-、取代的烷基-C(S)-、烯基-C(S)-、取代的烯基-C(S)-、炔基-C(S)-、取代的炔基-C(S)-、环烷基-C(S)-、取代的环烷基-C(S)-、环烯基-C(S)-、取代的环烯基-C(S)-、芳基-C(S)-、取代的芳基-C(S)-、杂芳基-C(S)-、取代的杂芳基-C(S)-、杂环基-C(S)-和取代的杂环基-C(S)-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基如本文所定义。
“硫醇基”是指基团-SH。
“硫代羰基”是指相当于-C(=S)-的二价基团-C(S)-。
“硫酮”是指原子(=S)。
“烷硫基”是指基团-S-烷基，其中烷基如本文所定义。
“取代的烷硫基”是指基团-S-(取代的烷基)，其中取代的烷基如本文所定义。
“立体异构体”或“立体异构体”是指一个或多个立体中心的手性不同的化合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。
“互变异构体”是指质子的位置不同的化合物的交替的形式，例如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体，或含有与环-NH-部分和环=N-部分二者连接的环原子的杂芳基的互变异构形式，例如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。
除非另外说明，否则本文未明确定义的取代基的命名通过命名官能团的末端部分接着是朝向连接点的相邻官能团而实现。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
应理解的是，在以上定义的所有取代基团中，本文中不旨在包括通过用另外的取代基对取代基本身进行定义而得到的聚合物(例如，具有取代芳基作为取代基的取代芳基，其本身被取代芳基取代，而该取代芳基又被取代芳基进一步取代，等)。在这种情况下，该取代的最大数量为3。例如，具有两个其它的取代芳基的取代芳基的系列取代局限于-取代芳基-(取代芳基)-取代芳基。
类似地，应理解的是，以上定义不旨在包括不允许的取代模式(例如，被5个氟基团取代的甲基)。这样的不允许的取代模式为技术人员众所周知。
“盐”是指化合物的可接受的盐，该盐衍生自多种本领域众所周知的有机和无机反荷离子，并且仅通过举例，包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵；并且当分子含有碱性官能团时，为有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中以一般性意义使用，包括具有任何长度的氨基酸残基的聚合物。本文使用术语“肽”指具有小于250个氨基酸残基，通常小于100个氨基酸残基的多肽。该术语适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物)以及天然存在的氨基酸聚合物。
本文使用的“水增溶基团”表示提高基础分子的水溶解度的极性和/或带电荷的(优选阴离子)取代基。水增溶基团可直接悬垂于基础分子或通过接头。本发明的水增溶基团包括羧基、磺酸、羟基、取代的氮烯基、聚氧化烯(例如PEG)、磷酸基团、双膦酸基团或向分子中引入另外的净电荷和/或极性的取代基。
本文使用的术语“反应性基团”是指能与另一化学基团反应以形成共价键的基团，即，在合适的反应条件下具有共价反应性，并且通常代表对于另一物质的连接点。在本发明中，标记试剂包含式IA的反应性基团，并且载体分子或固体载体包含至少一个合适的亲核体，其与式IA的反应性基团反应以形成共价键。
本文使用的术语“载体分子”是指可与本发明的标记试剂共价键合的生物学或非生物学组分。这样的组分包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质装配物(lipid assembly)、合成的聚合物、聚合的微颗粒、生物学细胞、病毒和它们的组合。本文使用的载体分子包含用于与本发明的标记试剂反应的亲核体。以下更详细地描述载体分子。
本文使用的术语“点击-反应性基团”是指在例如以下具有反应性的化学部分：i) 铜-催化的Huisgen环加成或在叠氮化物与末端炔之间的1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑，ii) Diels-Alder反应，其为二烯与亲二烯体之间的环加成反应，和/或Iii) 亲核取代反应，其中一种反应性物类为具有显著环应变的环氧或氮杂环丙烷化合物。这样的化学反应可使用(但不限于)简单的杂原子有机反应物，并且可靠、具有选择性、立体特异性和放热的。本发明的化合物(所述化合物包括“点击-反应性基团”)不限于需要铜-催化以用于环加成的那些。能携带SDP基团的任何可点击的化合物认为在本发明的范围内。
本文使用的“共价键合”表示直接共价键或通过相应于接头部分的多个原子。
本文使用的术语“环加成”是指其中两个或更多个π (pi)-电子系统(例如，不饱和分子或相同分子的不饱和部分)组合以形成环状产物的化学反应，其中键多重性存在净降低。在环加成中，π (pi)电子用于形成新的π (pi)键。环加成的产物被称为“加合物”或“环加合物”。不同种类的环加成为本领域已知的，包括但不限于[3+2]环加成和Diels-Alder反应。[3+2]环加成(其也被称为1,3-偶极环加成)在1,3-偶极与亲偶极(dipolarophile)之间发生，并且通常用于构建5-元杂环。术语“[3+2]环加成”也包括叠氮化物与环辛炔和Agard等人的J. Am. Chem. Soc.，2004，126 (46)：15046-15047描述的二氟环辛炔、Boon等人的WO2009/067663 A1 (2009)描述的二苯并环辛炔和Debets等人的Chem. Comm.，2010，46：97-99描述的氮杂-二苯并环辛炔之间的“无铜(copperless)”[3+2]环加成。
本文使用的术语“标记试剂”是指包含式IA的点击-反应性基团和苯酚酯的本发明化合物。
本文使用的术语“接头”是指结合1-20个选自C、N、O、S和P的非氢原子的单一的共价键或一系列稳定的共价键。本发明的标记试剂可包含使报道分子与式IA的反应性基团或载体基团或固体载体共价连接的接头。示例性连接成员包括包含-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等的部分。“可裂解的接头”为具有一个或多个可裂解的基团的接头，其可通过反应或条件的结果而破坏。术语“可裂解的基团”是指通过裂解使释放的部分与缀合物的其余部分连接的键，允许从缀合物的其余部分释放缀合物的一部分(例如，荧光或荧光部分)的部分。这样的裂解为化学性质的或通过酶介导的。示例性酶可裂解的基团包括以天然的氨基酸结尾的天然的氨基酸或肽序列。
除了酶可裂解的基团以外，在本发明的范围内，包括一个或多个通过酶以外的剂的作用而裂解的部位。示例性非酶裂解剂包括但不限于酸、碱、光(例如，硝基苄基衍生物、苯酰基、安息香酯)和热。许多可裂解的基团为本领域已知的。参见，例如，Jung等人的Biochem. Biophys. Acta，761：152-162 (1983)；Joshi等人的J. Biol. Chem.，265：14518-14525 (1990)；Zarling等人的J. Immunol.，124：913-920 (1980)；Bouizar等人的Eur. J. Biochem.，155：141-147 (1986)；Park等人的J. Biol. Chem.，261：205-210 (1986)；Browning等人的J. Immunol.，143：1859-1867 (1989)。此外，宽范围的可裂解的双官能(同型-和杂-双官能)间隔臂市售可得。
一种示例性可裂解的基团(酯)为可通过试剂(例如，氢氧化钠)裂解的可裂解的基团，导致含有羧酸酯(carboxylate)的片段和含有羟基的产物。
本文使用的术语“样品”是指可含有如下定义的目的分析物的任何材料或本发明的载体分子或固体载体。通常，样品包含细胞群体、细胞提取物、亚细胞组分、组织培养物、体液和组织。样品可在水溶液、活的细胞培养物中或固定在固体或半固体表面例如凝胶、膜、玻璃表面、微颗粒或微阵列上。
本文使用的术语“固体载体”是指基本上不溶于液相并且能结合目的分子或颗粒的基质或介质。本发明的固体载体包括半固体载体并且不限于特定类型的载体。可用的固体载体包括固体和半固体基质，例如气凝胶和水凝胶、树脂、珠粒、生物芯片(包括薄膜涂布的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称为微量滴定板或微量培养板)、膜、传导和非传导金属、玻璃(包括显微镜载玻片)和磁性载体。可用的固体载体的更具体实例包括硅胶、聚合膜、颗粒、衍生的塑料膜、玻璃珠粒、棉、塑料珠粒、氧化铝凝胶、多糖例如琼脂糖凝胶(Sepharose)、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝基纤维素、重氮基纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、胶乳珠粒、磁性珠粒、顺磁珠粒、超顺磁珠粒、淀粉等。
点击-标记试剂
根据本发明，提供了点击-标记试剂以及用所述试剂标记样品中的载体分子或标记固体载体的方法。本发明的点击-标记试剂包含本文定义的点击-反应性基团和本文定义的式IA的反应性苯酚酯。通过本领域众所周知的方法，点击-标记试剂可用于标记各种各样的载体分子和固体载体，所述标记的载体分子和固体载体可随后用于多种点击-类型环加成反应，包括但不限于i) 铜-催化的Huisgen环加成或在叠氮化物与末端炔之间的1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑，ii) Diels-Alder反应，其为二烯与亲二烯体之间的环加成反应，和/或iii) 亲核取代反应，其中一种反应性物类为具有显著环应变的环氧或氮杂环丙烷化合物。本发明的化合物(所述化合物包括“点击-反应性基团”)不限于需要铜-催化以用于环加成的那些。能携带SDP基团的任何可点击的化合物认为在本发明的范围内。
本发明的一个说明性方面提供了一种式IA的化合物或其盐：
Figure 169119DEST_PATH_IMAGE002
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团。
在一个实施方案中，L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。还更特别是，L为单一的共价键。或者，L为-烷基-或-取代的烷基-；更特别是-戊基-或-聚乙二醇(polyethylglycol)-或-氨基-dPEG4-酸。或者，L为-取代的杂环基-；更特别是，-哌啶-1-羰基-。
在另一个实施方案中，R1和R2为氯。在另一个实施方案中，R1和R2为氟。
在另一个实施方案中，R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。更特别是，R3为-SO3 -。
在一个特别优选的实施方案中，R1和R2为氯，而R3为-SO3 -。
在另一个实施方案中，Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。在另一个实施方案中，Ra的点击-反应性是铜-催化的。在又一个实施方案中，Ra的点击-反应性不是铜-催化的。更特别是，Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
在另一个实施方案中，式IA的化合物为盐。更特别是，所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
在另一个实施方案中，式IA的化合物可溶于水溶液。
在另一个实施方案中，式IA的化合物具有下式：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE014
或其盐，
其中
L为接头，而Ra为点击-反应性基团。
在又一个实施方案中，本发明的化合物具有下式：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE016
其中变量如本文所述，并且每个L基团彼此独立。
本发明的另一个说明性方面提供了一种制备式IA的化合物或其盐的方法：
Figure 170573DEST_PATH_IMAGE002
IA
所述方法包括：
使式IB的化合物或其盐：
Figure 510418DEST_PATH_IMAGE004
IB
与式IC的脲
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE018
(uronium)盐化合物或其互变异构体或盐接触：
IC
其中
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，
L为接头，和
Ra为点击-反应性基团。
在一个具体的实施方案中，接触步骤在二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下进行。在另一个实施方案中，接触步骤在有机溶剂中进行。
本发明的另一个说明性方面提供了一种具有以下结构的脲盐化合物或其互变异构体或盐：
Figure 723728DEST_PATH_IMAGE006
IC
其中
R1为卤素，
R2为卤素，和
R3为水增溶基团。
在一个实施方案中，R1和R2为氯。在另一个实施方案中，R3为-SO3 -。在一个特别优选的实施方案中，R1和R2为氯，而R3为-SO3。
通常，式IA的本发明的点击-标记试剂(化合物)通过使下式的苯酚缩合而制备：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE020
XI
其中R1、R2和R3如本文所定义，具有含有羧酸和接头的点击-反应性基团Ra，其中Ra和L如本文所定义，在有机或含水/有机溶剂系统中。羧酸可用试剂(例如碳二亚胺)原位活化，接着与苯酚XI反应。羧酸还可通过转化为亲电等价物(例如酰基氯)而活化，接着与苯酚XI反应。
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE022
或者，苯酚XI可通过转化为脲
Figure DEST_PATH_IMAGE023
盐而活化，或者准备或者原位产生，接着与羧酸反应；该反应可通过催化剂(例如4-二甲基氨基吡啶(DMAP))来促进：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
所述点击-标记试剂可用于通过本领域众所周知的方法点击-标记各种各样的载体分子和固体载体，所述标记的载体分子和固体载体可随后用于多种点击-类型环加成反应。固体载体或载体分子可与点击-标记试剂直接连接(其中接头为单键)或通过接头连接，即，一系列稳定的键。当接头为一系列稳定的共价键时，接头通常结合1-30个选自C、N、O、S和P的非氢原子。当接头不是单一的共价键时，接头可为稳定的化学键的任何组合，任选包括单键、双键、叁键或芳族碳-碳键以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、硫-硫键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和氮-铂键。通常接头结合小于15个非氢原子，并且包含醚、硫醚、硫脲、胺、酯、氨甲酰、磺酰胺、酰肼键和芳族或杂芳族键的任何组合。通常接头为单一的碳-碳键和氨甲酰、磺酰胺或硫醚键的组合。接头的键通常导致可在接头中发现的以下部分：醚、硫醚、氨甲酰、硫脲、磺酰胺、尿素、氨基甲酸酯、肼、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和胺部分。接头的实例包括取代或未取代的聚亚甲基、亚芳基、烷基亚芳基、亚芳基烷基或芳硫基。
在一个实施方案中，接头含有1-6个碳原子；在另一个实施方案中，接头包含硫醚键。示例性连接成员包括包含-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等的部分。在另一个实施方案中，接头为或结合式-(CH2)d(CONH(CH2)e)z-，其中d为0-5的整数，e为1-5的整数，z为0或1。在其它实施方案中，接头为或结合式-O-(CH2)-。在又一个实施方案中，接头为或结合亚苯基或2-羧基-取代的亚苯基。
在一个优选的实施方案中，前述点击-标记试剂(化合物)中的任一个用于以下描述的方法中。
缀合物的制备
在另一个说明性实施方案中，提供了一种用于形成本发明的点击-标记试剂和载体分子或固体载体的缀合物的方法。该方法包括：
a) 使本发明的点击-标记试剂与载体分子或固体载体组合，以形成组合的样品，其中所述试剂为式IA的化合物；和，
b) 将所述组合的样品温育对于化合物足够的时间，以与载体分子或固体载体形成共价键，从而形成缀合物。
使用本发明的点击-标记试剂，通过本领域公认的有机合成方法(Haugland，MOLECULAR PROBES，见上，(2005))制备载体分子(例如，药物、肽、毒素、核苷酸、磷脂和其它有机分子)的缀合物以及固体载体的缀合物。优选，形成共价键的缀合由以下组成：在合适的溶剂中简单地混合本发明的点击-标记试剂，其中待缀合的试剂和物质均可溶。反应优选在室温下或以下，在无额外试剂下自发进行。水不溶性物质的化学改性(使得可制备期望的化合物-缀合物)优选在非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或氯仿)中实施。水溶性材料的类似改性容易地通过使用本发明的化合物而实现。
制备肽或蛋白质缀合物通常包括首先在室温下或以下，以约1-10 mg/mL，在含水缓冲液中溶解待缀合的肽或蛋白质。当加入到待缀合的蛋白质的溶液中时，适当的点击-标记试剂随后以足以得到合适缀合程度的量溶解于非羟基溶剂(通常为DMSO或DMF)中。用于任何蛋白质或其它组分的试剂的合适量方便地通过实验确定，其中将可变量的试剂加入到蛋白质中，将缀合物通过色谱法纯化，以分离未缀合的化合物，并且在其期望的应用中测试点击-标记的蛋白质缀合物。
在向组分溶液中加入点击-标记试剂之后，将混合物温育合适的时间段(通常在室温下约1小时至在冰上数小时)，并且通过凝胶过滤、透析、HPLC、在离子交换或疏水聚合物上吸附或其它合适的方式，除去过量的试剂。点击-标记的-缀合物在溶液中使用或将其冻干。采用这种方式，合适的缀合物可由抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、凝集素、酶、蛋白质A和G、细胞蛋白质、白蛋白、组蛋白、生长因子、激素和其它蛋白质制备。
聚合物(包括生物聚合物和其它较高分子量聚合物)的缀合物通常通过本领域公认的方式(例如，Brinkley等人的Bioconjugate Chem.，3：2 (1992))制备。在这些实施方案中，可利用单一类型的反应部位(如对于多糖典型的)或可利用多种类型的反应部位(例如，胺、硫醇、醇、苯酚)，如对于蛋白质典型的。
当使聚合物改性时，相对于预期的化合物取代程度，通常使用过量的点击-标记试剂。任何残余的、未反应的试剂或水解产物通常通过透析、色谱法或沉淀而除去。可使用将试剂从其缀合物洗脱去掉的溶剂，通过薄层色谱法检测残余的、未缀合的点击-标记试剂的存在情况。在所有情况下，通常优选试剂尽可能实用的保持浓缩，以得到足够的缀合率。
本发明的另一个说明性方面提供了一种点击-标记载体分子或固体载体的方法，所述方法包括：
使包含亲核基团X并且具有式Rb-X的所述载体分子或固体载体与式IA的化合物或其盐接触：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE026
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；
和
形成式I的化合物或其盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE027
I
其中
L为接头，
Ra为点击-反应性基团，和
Rb为包含亲核基团X的载体分子或固体载体。
在一个具体的实施方案中，L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。
在另一个实施方案中，R1和R2为氯。
在另一个实施方案中，R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。更特别是，R3为-SO3 -。
在一个特别优选的实施方案中，R1和R2为氯，而R3为-SO3 -。
在另一个实施方案中，Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。在另一个实施方案中，Ra的点击-反应性是铜-催化的。在又一个实施方案中，Ra的点击-反应性不是铜-催化的。更特别是，Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
在另一个实施方案中，式IA的化合物为盐。更特别是，所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
在另一个实施方案中，式IA的化合物可溶于水溶液。
在另一个实施方案中，式IA的化合物具有下式：
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE028
或其盐，其中
L为接头，而Ra为点击-反应性基团。
在另一个实施方案中，Rb为固体载体。更特别是，Rb为柱或凝胶。或者，Rb为载体分子。还更特别是，载体分子选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、药物、脂质和合成的聚合物。更特别是，载体分子为蛋白质。
本发明的另一个实施方案还包括在所述接触步骤之后用式IA的化合物温育所述载体分子或固体载体。
在另一个实施方案中，接触步骤在水溶液中进行。
在另一个实施方案中，X为氨基、硫代或氧代基团。
本发明的另一个说明性方面提供了一种具有下式的点击-标记的载体分子或固体载体：
I
其中
L为接头，
Ra为点击-反应性基团，和
Rb为包含亲核基团X的载体分子或固体载体。
载体分子
多种载体分子可用于本发明。示例性载体分子包括抗原、甾族化合物、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核酸聚合物、碳水化合物、脂质和聚合物。
在一个示例性实施方案中，载体分子包含氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质装配物、合成的聚合物、聚合的微颗粒、生物学细胞、病毒和它们的组合。在另一个示例性实施方案中，载体分子选自半抗原、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、蛋白质、肽或多糖。
在一个示例性实施方案中，载体分子包含氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质装配物、合成的聚合物、聚合的微颗粒、生物学细胞、病毒和它们的组合。在另一个示例性实施方案中，载体分子选自半抗原、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、蛋白质、肽或多糖。在一个优选的实施方案中，载体分子为氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质装配物、酪胺、合成的聚合物、聚合的微颗粒、生物学细胞、细胞组分、离子螯合部分、酶底物或病毒。在另一个优选的实施方案中，载体分子为抗体或其片段、抗原、抗生物素蛋白或链霉抗生物素、生物素、葡聚糖、抗体结合蛋白质、荧光蛋白质、琼脂糖和非生物学微颗粒。通常，载体分子为抗体、抗体片段、抗体-结合蛋白质、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、毒素、凝集素或生长因子。优选的半抗原包括生物素、地高辛配基(digoxigenin)和荧光团。
抗体结合蛋白质包括但不限于蛋白质A、蛋白质G、可溶性Fc受体、蛋白质L、凝集素、抗-IgG、抗-IgA、抗-IgM、抗-IgD、抗-IgE或其片段。
在一个示例性实施方案中，酶底物选自氨基酸、肽、糖、醇、链烷醇酸、4-胍基苯甲酸、核酸、脂质、硫酸盐/酯、磷酸盐/酯、-CH2OCO烷基和它们的组合。因此、酶底物可通过选自以下的酶裂解：肽酶、磷酸酶、糖苷酶、脱烷基酶、酯酶、胍基苯甲酸酶(guanidinobenzotase)、硫酸酯酶、脂肪酶、过氧化物酶、组蛋白脱乙酰基酶、神经酰胺糖内切酶(endoglycoceramidase)、核酸外切酶、还原酶和核酸内切酶。
在另一个示例性实施方案中，载体分子为氨基酸(包括被保护或被磷酸酯、碳水化合物或C1-C22羧酸取代的那些)或氨基酸的聚合物(例如肽或蛋白质)。在一个相关的实施方案中，载体分子含有至少5个氨基酸，更优选5-36个氨基酸。示例性肽包括但不限于神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物和蛋白激酶底物。其它示例性肽可用作细胞器定位肽，也就是，通过细胞运输机制用于将缀合的化合物靶向定位在特定的细胞亚结构内。优选的蛋白质载体分子包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、蛋白质A、蛋白质G、藻胆蛋白和其它荧光蛋白质、激素、毒素和生长因子。通常，蛋白质载体分子为抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、毒素、凝集素或生长因子。
在另一个示例性实施方案中，载体分子包含核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，任选含有另外的接头或间隔基用于连接荧光团或其它配体，例如炔基键(美国专利号5,047,519)、氨基烯丙基键(美国专利号4,711,955)或其它键。在另一个示例性实施方案中，核苷酸载体分子为核苷或脱氧核苷或双脱氧核苷。
示例性核酸聚合物载体分子为单链或多链、天然或合成的DNA或RNA寡核苷酸，或DNA/RNA杂合物，或结合独特接头例如吗啉衍生的磷酸酯(AntiVirals，Inc.，Corvallis OR)，或肽核酸例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元，其中所述核酸含有少于50个核苷酸，更通常少于25个核苷酸。
在另一个示例性实施方案中，载体分子包含碳水化合物或多元醇，其通常为多糖例如葡聚糖、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、淀粉、琼脂糖和纤维素，或为聚合物，例如聚(乙二醇)。在一个相关的实施方案中，多糖载体分子包括葡聚糖、琼脂糖或FICOLL。
在另一个示例性实施方案中，载体分子包含脂质(通常具有6-25个碳原子)，包括糖脂、磷脂和神经鞘脂类。或者，载体分子包含脂质囊泡(例如脂质体)或为脂蛋白(参见以下)。
或者，载体分子为细胞、细胞系统、细胞碎片或亚细胞颗粒。这种类型的缀合材料的实例包括病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、生物学细胞(例如动物细胞、植物细胞、细菌或酵母)或细胞组分。可被标记或其组成分子可被标记的细胞组分的实例包括但不限于溶酶体、内体、细胞质、核、组蛋白、线粒体、高尔基体、内质网和液泡。
在另一个实施方案中，载体分子为金属螯合部分。虽然结合目的金属离子并且使其荧光性质变化的任何螯合剂为合适的缀合物，但是优选的金属螯合部分为冠醚，包括二芳基二氮杂冠醚，如在Kuhn等人的美国专利号5,405,975 (1995)中描述的；1,2-双-(2-氨基苯氧基乙烷)-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)的衍生物，如在Kuhn等人的美国专利号5,453,517 (1995) (通过引用结合)和Tsien等人的美国专利号5,049,673 (1991)中描述的；2-羧基甲氧基-苯胺-N,N-二乙酸(APTRA)的衍生物，如Ragu等人的Am. J. Physiol.，256：C540 (1989)描述的；和基于吡啶基的和菲咯啉金属离子螯合剂，如在Kuhn等人美国专利号5,648,270 (1997)中描述的。
本发明的酯任选以化学反应性形式制备，并且与聚合物(例如葡聚糖)进一步缀合，以改进它们作为传感器的效用，如在美国专利号5,405,975和5,453,517中描述的。
在另一个示例性实施方案中，载体分子与有机或无机材料非共价缔合。通过在膜内非共价结合，具有亲脂性取代基的载体分子的示例性实施方案可用于靶向脂质装配物(例如生物膜或脂质体)，例如，用作用于膜结构的探针或用于在脂质体、脂蛋白、膜、塑料、亲脂性微球体或类似材料中结合。
在一个示例性实施方案中，载体分子包含特异性结合对成员，其中本发明的点击-标记试剂(化合物)与特异性结合对成员缀合，并且用于检测样品中的分析物。或者，标记的特异性结合对成员的存在表明特异性结合对的互补成员的位置；每一个特异性结合对成员在表面上或在腔中具有某一区域，该区域与另一个成员的具体空间和极性组构特异性结合，和与其互补。示例性结合对示于表1。
表1. 代表性特异性结合对
抗原 抗体
生物素 抗生物素蛋白(或链霉抗生物素或抗-生物素)
IgG* 蛋白质A或蛋白质G
药物 药物受体
叶酸 叶酸结合蛋白质
毒素 毒素受体
碳水化合物 凝集素或碳水化合物受体
肽 肽受体
蛋白质 蛋白质受体
酶底物 酶
DNA (RNA) cDNA (cRNA)†
激素 激素受体
离子 螯合剂
抗体 抗体-结合蛋白质
*IgG为免疫球蛋白
† cDNA和cRNA为用于杂交的互补链
固体载体
在一个示例性实施方案中，本发明的点击-标记试剂与固体载体(包括半固体载体)键合。适用于本发明的固体载体通常基本上不溶于液相。本发明的固体载体不限于具体类型的载体。而是，可利用大量的载体并且为本领域普通技术人员已知的。因此，可用的固体载体包括半固体，例如气凝胶和水凝胶、树脂、珠粒、生物芯片(包括薄膜涂布的生物芯片)、多孔板(也称为微量滴定板)、膜、传导和非传导金属和磁性载体。可用的固体载体的更具体实例包括硅胶、聚合的膜、颗粒、衍生的塑料膜、玻璃珠粒、棉、塑料珠粒、氧化铝凝胶、多糖例如琼脂糖凝胶、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝基纤维素、重氮基纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、胶乳珠粒、磁性珠粒、顺磁珠粒、超顺磁珠粒、淀粉等。
在一些实施方案中，固体载体可包括固体载体反应性官能团，包括但不限于羟基、羧基、氨基、硫醇基、醛、卤素、硝基、氰基、酰氨基、尿素、碳酸酯、氨基甲酸酯、异氰酸酯、砜、磺酸酯、磺酰胺、亚砜等，用于连接本发明的化合物。在一个优选的实施方案中，固体载体含有亲核基团，例如氨基、硫醇基或羟基。
可基于期望的最终用途和各种合成方案的适宜性来选择合适的固相载体。例如，当期望形成酰胺键以将本发明的化合物与固体载体连接时，可采用通常可用于肽合成的树脂，例如聚苯乙烯(例如，PAM-树脂，得自BachemInc.，Peninsula Laboratories等)、POLYHIPE™树脂(得自Aminotech，加拿大)、聚酰胺树脂(得自Peninsula Laboratories)、接枝聚乙二醇的聚苯乙烯树脂(TentaGel™，Rapp Polymere，Tubingen，德国)、聚二甲基-丙烯酰胺树脂(可得自Milligen/Biosearch，California)或PEGA珠粒(得自Polymer Laboratories)。
使用点击-标记的载体分子和固体载体的方法
在一个示例性实施方案中，本发明提供了点击-标记的载体分子和固体载体，其可用于多种点击-类型环加成反应。
使用本文描述的方法，载体分子可经化学改性，即，点击-标记，以含有叠氮化物部分；炔部分，包括但不限于末端炔部分；活化的炔部分，包括但不限于环辛炔部分；膦部分，包括但不限于三芳基膦部分；Diels Alder反应物，和具有显著环应变的环氧或氮杂环丙烷化合物。这些叠氮化物部分、炔部分、活化的炔部分、膦部分、Diels Alder反应物和环氧或氮杂环丙烷化合物为非天然的、非扰乱性生物垂直化学部分(non-perturbing bioorthogonol chemical moieties)，其具有可通过高度选择性反应而改性的独特化学官能性。所述反应用于这样的方法，其中的一些在本文中描述，即，其中含有叠氮化物部分或末端炔部分的生物分子的化学改性利用铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成，在本文中也称为“点击化学”；含有叠氮化物部分或活化的-炔部分的生物分子的化学改性利用环加成反应；和含有叠氮化物部分或三芳基膦部分的生物分子的化学改性利用Staudinger连接(ligation)。
在某些实施方案中，通过向细胞供应通过脂质过氧化反应可结合到细胞中的生物分子的含炔的、含活化的炔的、含膦的或含叠氮基的分子前体，使生物分子化学改性。在某些实施方案中，通过向细胞供应通过脂质过氧化反应可结合到细胞中的生物分子的含末端炔的、含环辛炔的、含三芳基膦的或含叠氮基的分子前体，使生物分子改性。
“点击化学”
叠氮化物和末端或内部炔可经历1,3-偶极环加成(Huisgen环加成)反应，以得到1,2,3-三唑。然而，该反应需要长的反应时间和升高的温度。或者，在室温下，叠氮化物和末端炔可经历铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)。这样的铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(也称为“点击”化学)为Huisgen 1,3-偶极环加成的变体，其中有机叠氮化物和末端炔反应，以得到1,2,3-三唑的1,4-区域异构体。“点击”化学反应的实例描述于Sharpless等人(2005年10月6日公布的美国专利申请公布号20050222427，国际申请号PCT /US03/17311；Lewis W G等人，Angewandte Chemie-国际版，41 (6)：1053；在Kolb，H.C.等人，Angew. Chem. Inst. Ed. 2001，40：2004-2021中综述的方法)，其开发以高收率彼此反应的试剂，并且在杂原子键(与碳-碳键相对)中几乎没有副反应，以产生化合物库。本文描述的“点击”化学用于标记改性的生物分子的方法。
用作“点击”化学反应的催化剂的铜为Cu (I)还原态，所述化学反应用于本文描述的方法以使标记与改性生物分子缀合。用于这样的铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成的铜(I)的来源可为任何亚铜盐，包括但不限于卤化亚铜，例如溴化亚铜或碘化亚铜。然而，该区域选择性环加成也可在金属催化剂和还原剂存在下进行。在某些实施方案中，在还原剂存在下，铜可以Cu (II)还原态(例如，作为盐，例如但不限于Cu(NO3)2、Cu(OAc)2或CuSO4)提供，其中通过还原Cu(II)原位形成Cu(I)。这样的还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、金属铜、氢醌、维生素K1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、Fe2+、Co2+或施加的电位。在其它实施方案中，还原剂包括选自Al、Be、Co、Cr、Fe、Mg、Mn、Ni、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co、Pt、Pd、Ni、Rh和W的金属。
用于标记改性生物分子的铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成可在水中和多种溶剂中实施，包括水与多种(部分)可溶混的有机溶剂的混合物，所述有机溶剂包括醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔丁醇(tBuOH)和丙酮。
不限于任何具体的机理，Cu (I)态的铜为用于本文描述的方法中的铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成或“点击”化学反应的优选催化剂。某些金属离子在含水溶剂中不稳定，例如Cu(I)，因此，稳定配体/螯合剂可用于改进反应。在某些实施方案中，至少一种铜螯合剂用于本文描述的方法，其中这样的螯合剂结合Cu (I)态的铜。在某些实施方案中，至少一种铜螯合剂用于本文描述的方法，其中这样的螯合剂结合Cu (II)态的铜。在某些实施方案中，铜(I)螯合剂为含1,10-菲咯啉的铜(I)螯合剂。这样的含菲咯啉的铜(I)螯合剂的非限制实例包括但不限于红菲咯啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)和浴铜灵二磺酸(BCS；2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。在其它实施方案中，铜(I)螯合剂为如在Jentzsch等人的Inorganic Chemistry，48(2)：9593-9595 (2009)中描述的THPTA。在其它实施方案中，铜(I)螯合剂为在Finn等人的美国专利公布号US2010/0197871中描述的那些，其公开内容通过引用结合到本文中。用于这样的方法的其它螯合剂包括但不限于N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二甲酸(PDA)、S-羧基甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、曲恩汀(trientine)、四-亚乙基聚胺(TEPA)、N,N,N’,N’-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二甲酸(PDA)、S-羧基甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、三-(苄基-三唑基甲基)胺(TBTA)或它们的衍生物。已知大多数金属螯合剂(其中的多种为化学、生物化学和医学领域已知的)螯合若干金属，因此通常可测试金属螯合剂在铜催化的1,3环加成反应中的作用。在某些实施方案中，组氨酸用作螯合剂，而在其它实施方案中，谷胱甘肽用作螯合剂和还原剂。
用于本文描述的“点击”化学反应的还原剂的浓度可在微摩尔至毫摩尔范围。在某些实施方案中，还原剂的浓度为约100微摩尔至约100毫摩尔。在其它实施方案中，还原剂的浓度为约10微摩尔至约10毫摩尔。在其它实施方案中，还原剂的浓度为约1微摩尔至约1毫摩尔。
在某些实施方案中，使用“点击”化学用于标记改性生物分子的本文描述的方法，在用于反应的铜(II)已与还原剂接触之后，加入至少一种铜螯合剂。在其它实施方案中，至少一种铜螯合剂可在铜(II)与还原剂接触之后立即加入。在其它实施方案中，在铜(II)和还原剂已在反应混合物中组合之后约5秒-约24小时之间加入铜螯合剂。在其它实施方案中，至少一种铜螯合剂可在任何时间加入到包括铜(II)和还原剂的反应混合物中，例如，仅通过举例，在铜(II)与还原剂接触之后立即，或在铜(II)与还原剂在反应混合物中接触约5分钟内。在一些实施方案中，至少一种铜螯合剂可在铜(II)与还原剂已组合之后约5秒-约1小时、约1分钟-约30分钟、约5分钟-约1小时、约30分钟-约2小时、约1小时-约24小时、约1小时-约5小时、约2小时-约8小时加入，以用于反应混合物。
在其它实施方案中，一种或多种铜螯合剂可向这样的“点击”化学反应中加入多于一次。在其中向反应中加入多于一种铜螯合剂的实施方案中，两种或更多种铜螯合剂可结合Cu (I)态的铜，或者一种或多种铜螯合剂可结合Cu (I)态的铜并且一种或多种另外的螯合剂可结合Cu (II)态的铜。在某些实施方案中，一种或多种铜螯合剂可在初始加入铜螯合剂之后向“点击”化学反应中加入。在某些实施方案中，在向反应中初始加入铜螯合剂之后加入的一种或多种铜螯合剂可与在较早时间向反应中加入的铜螯合剂相同或不同。
可使用本领域众所周知的方法测定和优化用于本文描述的“点击”化学反应的铜螯合剂的浓度，包括本文描述的那些，使用“点击”化学来标记改性生物分子，接着检测这样标记的生物分子，以测定标记反应的效率和标记的生物分子的完整性。在某些实施方案中，用于本文描述的方法的螯合剂浓度为微摩尔至毫摩尔范围，仅通过举例，为1微摩尔至100毫摩尔。在某些实施方案中，螯合剂浓度为约10微摩尔至约10毫摩尔。在其它实施方案中，螯合剂浓度为约50微摩尔至约10毫摩尔。在其它实施方案中，可在包括水-可混溶性溶剂的溶液中提供螯合剂，所述溶剂例如醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔丁醇(tBuOH)和丙酮。在其它实施方案中，螯合剂可在包括溶剂(例如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF))的溶液中提供。
在利用本文描述的“点击”化学标记改性生物分子的方法的某些实施方案中，改性生物分子可具有叠氮化物部分，而标记具有炔部分，而在其它实施方案中，改性生物分子可具有炔部分，而标记具有叠氮化物部分。
在利用本文描述的“点击”化学标记改性生物分子的方法的某些实施方案中，包含“点击”化学反应物的溶液还包含Cu(I)离子；Cu(I)离子和铜螯合剂；Cu(II)离子和至少一种还原剂；或Cu(II)离子、至少一种还原剂和铜螯合剂。
活化的炔化学
通过使用活化的炔与叠氮化物反应，叠氮化物和炔可经历不含催化剂的[3+2]环加成。这样的不含催化剂的[3+2]环加成可用于本文描述的方法，以将标记与改性生物分子缀合。炔可通过环应变活化，例如，仅通过举例，对这样的炔环悬垂吸电子基团的八元环结构，或者炔可通过加入路易斯酸例如(仅通过举例，Au(I)或Au(III))而活化。已描述通过环应变活化的炔。例如，Agard等人的J. Am. Chem. Soc.，2004，126 (46)：15046-15047描述的环辛炔和二氟环辛炔、Boon等人的WO2009/067663 A1 (2009)描述的二苯并环辛炔和Debets等人的Chem. Comm.，2010，46：97-99描述的氮杂-二苯并环辛炔。
在利用本文描述的活化的炔标记改性生物分子的方法的某些实施方案中，生物分子可具有叠氮化物部分，而标记具有活化的炔部分；而在其它实施方案中，改性生物分子可具有活化的炔部分，而标记具有叠氮化物部分。
Staudinger连接
涉及三价磷化合物与有机叠氮化物之间的反应的Staudinger反应(Staudinger等人Helv. Chim. Acta 1919，2，635)已用于许多应用。(Gololobov等人Tetrahedron 1980，37，437)；(Gololobov等人Tetrahedron 1992，48，1353)。对两种反应物的性质几乎没有限制。Staudinger连接为Staudinger反应的修改，其中在三芳基膦上放置亲电捕集(通常为甲基酯)。在Staudinger连接中，aza-ylide中间体在含水介质中重排，以产生酰胺键和氧化膦，将两种分子连接在一起，而在Staudinger反应中，在水解后，两种产物不共价连接。这样的连接描述于美国专利申请号20060276658。在某些实施方案中，膦可具有邻近的酰基，例如酯、硫代酯或N-酰基咪唑(即，膦基酯、膦基硫代酯、膦基咪唑)，以当水解时捕集aza-ylide中间体和形成稳定的酰胺键。在某些实施方案中，膦可为二芳基膦或三芳基膦，以稳定膦。用于本文描述的Staudinger连接方法以将标记与改性生物分子缀合的膦包括但不限于环状或无环、卤代、双磷或甚至聚合的。类似地，叠氮化物可为烷基、芳基、酰基或磷酰基。在某些实施方案中，这样的连接在不含氧的无水条件下进行。本文描述的生物分子可使用Staudinger连接来改性。
在利用本文描述的Staudinger连接标记改性生物分子的方法的某些实施方案中，改性生物分子可具有叠氮化物部分，而标记具有膦部分，包括但不限于三芳基膦部分；而在其它实施方案中，改性生物分子可具有膦部分，而标记具有叠氮化物部分。
翻译后修饰生物分子的化学改性
利用与在蛋白质的表面上更常发现的胺、羧酸酯或硫氢基的亲核取代反应，可使蛋白质改性。然而，本文描述的方法利用“点击”反应、环加成反应或Staudinger连接，而不是亲核取代反应，用于生物分子的选择性改性。这样的反应可在室温下、在含水条件下进行。在本文描述的“点击”化学的情况下，通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，实现优良的区域选择性。参见，例如，Tomoe等人，(2002) Org. Chem. 67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41：2596-2599。由“点击”化学环加成得到的所得5-元环在还原环境中通常不可逆，并且在含水环境中针对水解而稳定达延长的时间段。因此，经由这样的5-元环与标记剂、检测剂、报道分子、固体载体或载体分子连接的生物分子在还原环境中稳定。
在生物分子(包括但不限于蛋白质)已被叠氮基部分、炔部分(包括但不限于末端炔部分，例如，-C≡CH部分)、活化的炔部分(包括但不限于环辛炔部分)或膦部分(包括但不限于三芳基膦部分)改性后，它们可在适当的条件下反应，以与报道分子、载体分子或固体载体形成缀合物。在某些实施方案中，用于这样的缀合的这样的生物分子可作为在细胞中；作为细胞裂解物；作为分离的生物分子；和/或作为纯化的生物分子存在，通过凝胶电泳分离或在固体或半固体基质上。
在本文描述的方法和组合物中，叠氮化物部分可用作在改性生物分子上的炔反应性基团，和在报道分子、固体载体或载体分子上的叠氮化物反应性部分；或者炔、活化的炔或膦部分可用作改性生物分子上的叠氮化物反应性基团，并且叠氮化物部分可用作在报道分子、固体载体或载体分子上的炔反应性部分。叠氮化物反应性部分可包含炔部分，包括但不限于末端炔基团，包括但不限于-C≡CH；活化的炔部分，包括但不限于环辛炔基团；或膦部分，包括但不限于三芳基膦基团。在某些实施方案中，生物分子可被一个或多个炔反应性部分或一个或多个叠氮化物反应性部分改性。在某些实施方案中，这样的生物分子为蛋白质。
在本文描述的方法和组合物的某些实施方案中，包含至少一个叠氮基基团的改性蛋白质可被包含至少一个叠氮化物反应性基团的报道分子、固体载体和/或载体分子选择性标记，所述叠氮化物反应性基团包括但不限于炔基团、活化的炔基团或膦基团，或它们的组合。在其它实施方案中，包含至少一个炔基团(包括但不限于末端炔基团，例如-C≡CH)、活化的炔基团(包括但不限于环辛炔基团)或膦基团(包括但不限于三芳基膦基团)的改性蛋白质可被包含至少一个炔反应性基团(包括但不限于叠氮基基团)的报道分子、固体载体和/或载体分子选择性标记。在其它实施方案中，包含至少一个炔基团(包括但不限于末端炔基团，例如-C≡CH)、至少一个活化的炔基团(包括但不限于环辛炔基团)或至少一个膦基团(包括但不限于三芳基膦基团)的改性蛋白质可被包含至少一个炔反应性基团(包括但不限于叠氮基基团)的报道分子、固体载体和/或载体分子选择性标记。
在某些实施方案中，两个叠氮化物-反应性基团用于标记改性生物分子：第一个可为末端炔基团，例如，-C≡CH，用于“点击”化学反应，而第二个为膦，例如三芳基膦基团，用于Staudinger连接。在其它实施方案中，两个叠氮化物-反应性基团用于标记改性生物分子：第一个可为末端炔基团，例如，-C≡CH，用于“点击”化学反应，而第二个可为活化的炔基团，例如环辛炔基团，用于环加成反应。
在某些实施方案中，炔反应性部分和叠氮化物反应性部分用于标记改性生物分子：第一个可为用于“点击”化学反应的炔反应性部分，例如，叠氮基基团；而第二个可为末端炔基团，例如，-C≡CH；活化的炔基团，例如，环辛炔基团，用于环加成反应；或膦基团，例如，三芳基膦基团，用于Staudinger连接。
在一个实施方案中，利用“点击”化学，以用包含叠氮基基团的生物分子；和报道分子、固体载体或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子包含炔基团，例如，末端炔基团。在另一个实施方案中，利用“点击”化学，以用包含炔基团(例如，末端炔基团)的生物分子；和报道分子、固体载体和/或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子包含叠氮基基团。
在另一个实施方案中，利用环加成反应，以用包含活化的炔基团(例如，环辛炔基团)的生物分子；和报道分子、固体载体和/或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子含有叠氮基基团。
在另一个实施方案中，利用环加成反应，以用包含叠氮基基团的生物分子和报道分子、固体载体和/或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子包含活化的炔基团，例如，环辛炔基团。
在另一个实施方案中，利用Staudinger连接，以用包含叠氮基基团的生物分子；和报道分子、固体载体和/或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子包含膦基团，例如，三芳基膦基团。
在另一个实施方案中，利用Staudinger连接，以用包含膦基团(例如，三芳基膦基团)的蛋白质；和报道分子、固体载体和/或载体分子形成缀合物，其中所述报道分子、固体载体和载体分子包含叠氮基基团。
本文描述的方法不旨在局限于这两种叠氮化物反应性基团或化学反应，而是预期利用与报道分子、固体载体或载体分子连接的叠氮化物反应性基团的任何化学反应可与本文描述的叠氮化物改性蛋白质一起使用。
用于本文描述的方法和组合物的报道分子、固体载体和载体分子可包含至少一个炔基团，包括但不限于末端炔基团；至少一个活化的炔基团，包括但不限于环辛炔基团；或至少一个膦基团，包括但不限于三芳基膦基团；能与本发明的改性生物分子的叠氮基基团反应。用于本文描述的方法和组合物的报道分子、固体载体和载体分子可包含至少一个能与本发明的改性生物分子的炔基团、活化的炔基团或膦基团反应的叠氮化物部分。
在某些实施方案中，本文描述的报道分子、固体载体和载体分子的炔基团为能与本发明的改性生物分子反应的末端炔基团。在一些实施方案中，末端炔基团为-C≡CH。
在某些实施方案中，本文描述的报道分子、固体载体和载体分子的活化的炔基团为能与本发明的改性生物分子反应的末端炔基团。在一些实施方案中，活化的炔基团为环辛炔基团。
在某些实施方案中，本文描述的报道分子、固体载体和载体分子的膦基团为能与本发明的改性生物分子反应的膦基团。在一些实施方案中，膦基团为三芳基膦基团。
在某些实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的报道分子可包括但不限于标记，而载体分子可包括但不限于亲和力标签、核苷酸、寡核苷酸和聚合物。固体载体可包括但不限于固体载体树脂、微量滴定板和微阵列载玻片.
样品制备：
最终使用者将决定样品的选择和制备样品的方式。样品包括但不限于用于标记的任何材料，其含有适于与本发明的点击-标记试剂反应的亲核体。优选该材料为生物学衍生的或合成的大分子。
样品可为生物学流体，例如全血、血浆、血清、鼻分泌物、痰、唾液、尿、汗、经皮渗出物、脑脊液等。生物学流体还包括其中目的分析物已分泌至培养基中的组织和细胞培养基。或者，样品可为来自动物的完整器官、组织或细胞。所述样品来源的实例包括肌肉、眼、皮肤、性腺、淋巴结、心脏、脑、肺、肝、肾、脾、胸腺、胰、实体瘤、巨噬细胞、乳腺、间皮等。细胞包括但不限于原核细胞和真核细胞，其包括初级培养物和永生化细胞系。真核细胞包括但不限于卵巢细胞、上皮细胞、循环免疫细胞、β细胞、肝细胞和神经元。
在许多情况下，可能有利的是向样品中加入少量的非离子去污剂。通常去污剂以约0.01-0.1体积%存在。说明性非离子去污剂包括聚氧化烯二醇，例如，Pluronics、Tweens、Triton X-100等。
试剂盒
本发明另外的实施方案包括包含用于标记载体分子或固体载体的本文描述的点击-标记试剂的试剂盒。除了化合物以外，试剂盒还包括关于报道分子、载体分子或固体载体的用法说明。一个具体的实施方案提供了一种用于用载体分子或固体载体和点击-标记试剂形成缀合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
a) 式IA的化合物或其盐：
Figure 550837DEST_PATH_IMAGE026
IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；
和
b) 用于点击-标记所述载体分子或固体载体的用法说明。
在一个实施方案中，L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。还更特别是，L为单一的共价键。或者，L为-烷基-或-取代的烷基-；更特别是-戊基-或-聚乙二醇-或-氨基-dPEG4-酸。或者，L为-取代的杂环基-；更特别是，-哌啶-1-羰基-。
在另一个实施方案中，R1和R2为氯。在另一个实施方案中，R1和R2为氟。
在另一个实施方案中，R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。更特别是，R3为-SO3 -。
在一个特别优选的实施方案中，R1和R2为氯，而R3为-SO3 -。
在另一个实施方案中，Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。在另一个实施方案中，Ra的点击-反应性是铜-催化的。在又一个实施方案中，Ra的点击-反应性不是铜-催化的。更特别是，Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
在另一个实施方案中，式IA的化合物为盐。更特别是，所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
在另一个实施方案中，式IA的化合物可溶于水溶液。
在另一个实施方案中，式IA的化合物具有下式：
Figure 121626DEST_PATH_IMAGE028
或其盐，
其中
L为接头，而Ra为点击-反应性基团。
在本发明的测定中，通常采用各种辅助材料。在一个示例性实施方案中，缓冲液和/或稳定剂存在于试剂盒组分中。在另一个示例性实施方案中，试剂盒包含指示剂溶液或指示剂“试纸条(dipstick)”、印迹装置(blotter)、培养基、比色皿等。在又一个示例性实施方案中，试剂盒包含指示剂筒(其中试剂盒组分与固体载体结合)，以用于自动化检测器。在另一个示例性实施方案中，试剂盒还包括分子量标记，其中所述标记选自磷酸化的和非磷酸化的多肽、钙-结合和非钙结合多肽、磺酸化的和非磺酸化的多肽以及甲硅烷基化的和非甲硅烷基化的多肽。在另一个示例性实施方案中，试剂盒还包含选自固定溶液、检测试剂、标准物、洗涤液和它们的组合的成员。
以上提供了本发明的详细说明，给出以下实施例用于说明本发明的目的，并且不应看作是限制本发明或权利要求书的范围。
实施例
实施例1
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE030
经过2分钟时间段，向1,1,3,3-四甲基尿素(2.5 mL，21 mmol)/10 mL甲苯溶液中加入小份草酰氯(2.0 mL，23 mmol)，同时将反应混合物在冰-水浴温度下搅拌。在室温下搅拌18小时后，减压下，将反应混合物浓缩至约5 mL的体积，过滤收集所得到的沉淀物。将收集的固体溶解于约20 mL水中，接着用六氟磷酸钾(3.8 g，21 mmol)/50 mL水溶液处理，同时将混合物在室温下剧烈搅拌，以得到白色沉淀物。过滤收集沉淀物，并且真空干燥。固体随后用约8 mL丙酮处理，过滤，以除去不溶性材料。将所得到的滤液以小份加入到60 mL乙醚中，同时在室温下剧烈搅拌。过滤收集期望的产物，真空干燥，以得到4.5 g (76 %)白色固体。
实施例2
向3,5-二氯-4-羟基苯磺酸(2.9 g，8.2 mmol)/35 mL乙腈溶液中加入[氯(二甲基氨基)亚甲基]二甲基六氟磷酸铵(3.2 g，11 mmol)。随后经过5分钟，以小份加入三乙胺(3.4 mL，25 mmol)，同时将混合物在冰-水浴温度下搅拌。搅拌30分钟后，过滤所得到的沉淀物，滤饼用约10 mL乙腈洗涤。将合并的滤液减压浓缩，以得到粗产物。粗产物通过柱色谱法在硅胶上纯化(洗脱液，H2O:CH3CN，2:98-7:97)，以得到2.6 g (53 %)白色固体状的期望产物。TLC：Rf=0.41 (硅胶，15 % H2O/CH3CN)。
实施例3
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE034
经过5分钟时间段，向5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(1.6 g，7.3 mmol，Boons等人Angew. Chem. Int. Ed. 47，2253-2255，2008)/30 mL无水THF的溶液中加入小份氢化钠(60 %分散在矿物油中，1.1 g，28 mmol)，同时将反应混合物在室温下搅拌。搅拌30分钟后，加入一份溴代乙酸乙酯(2.0 mL，18 mmol)，将整个反应混合物在N2气氛下在室温下搅拌5小时。经过5分钟时间段，向反应混合物中缓慢加入20 mL 1 M NaOH的水溶液，同时在室温下搅拌。随后加入20 mL甲醇，将反应混合物在50℃下搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温后，加入20 mL水。经过5分钟时间段，通过以小份加入10 mL 3 M HCl的水溶液，将反应混合物的pH调节至pH 3，同时在室温下搅拌。随后用氯仿(2×75 mL)萃取，接着用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，以得到粗产物。通过柱色谱法经硅胶纯化(洗脱液，5 %甲醇/氯仿)，以得到1.5 g (73 %)白色固体状的期望产物。TLC：Rf = 0.32 (硅胶，15 %甲醇/氯仿)，最大吸收：290 nm，304 nm，在甲醇中。
实施例4
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE036
向化合物 3 (0.60 g，2.2 mmol)和DMAP (0.26 g，2.2 mmol)/30 mL无水DMF的溶液中加入化合物 2 (1.52 g，2.6 mmol)，将混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物在真空下浓缩，以除去DMF，所得到的粗产物通过柱色谱法经硅胶纯化(洗脱液，甲醇/氯仿(5:95-12:88))，以得到白色固体。将其溶解于20 mL水/甲醇(1:1)中，并且用50 mL Dowex 50WX2-200H Na形式处理，以得到钠形式的期望产物(0.97 g，85 %)。TLC：Rf = 0.73 (25 %甲醇/氯仿)，最大吸收：290 nm和304 nm，在甲醇中。
实施例5
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE038
化合物 6采用如在实施例4中描述的类似方式由化合物 5 (1.0 mmol，van Delft等人Chem. Commun. 46，97-99，2010)、DMAP (1.0 mmol)和化合物 2制备。纯化和盐交换后，得到白色固体状的期望产物。
实施例6
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE040
化合物 8采用如在实施例4中描述的类似方式由化合物 7 (1.0 mmol，Bertozzi等人Organic Letters 10，3097-3099，2008)、DMAP (1.0 mmol)和化合物 2 (1.5 mmol)在15 mL无水DMF中制备。纯化和盐交换后，得到白色固体状的期望产物。
实施例7
Figure 2012800150722100002DEST_PATH_IMAGE042
化合物 9采用如在实施例4中描述的类似方式由4-戊炔酸(1.0 mmol)、DMAP (1.0 mmol)和化合物 2 (1.5 mmol)在15 mL无水DMF中制备。纯化和盐交换后，得到白色固体状的期望产物。
实施例8
Figure DEST_PATH_IMAGE044
化合物 10采用如在实施例4中描述的类似方式由12-叠氮基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(1.0 mmol)、DMAP (1.0 mmol)和化合物 2 (1.5 mmol)在15 mL无水DMF中制备。纯化和盐交换后，得到白色固体状的期望产物。
实施例9
Qdot®605-DIBO缀合物
将化合物 4 (10 mg/mL，在DMSO中)的溶液(7 μL)加入到Qdot®605 AMP-PEG2K-100N (8.4 μM，在50 mM硼酸盐缓冲液中，pH 8.3)的溶液(120 μL)中，同时在室温下搅拌。将反应混合物在室温下搅拌1小时后，通过经过用PBS缓冲液(pH 7.3)洗脱的BioGel P-30 (培养基树脂)脱盐柱，将Qdot®605-DIBO缀合物与游离的未反应试剂分离。通过在室温下搅拌过夜，使得到的期望的Qdot®605-DIBO缀合物(10 μL)点击(click)到Alexa Fluor 647叠氮化物(6 μL，1 mg/mL)。通过尺寸排阻(SEC) HPLC分析，估计标记程度(DOL)。由吸收光谱，通过在650 nm和600 nm处峰之间的高度比估计DOL为1.26。
实施例10
抗体的化学(SDP-N3)点击标签
经由SDP-N3的化学点击-标记用于标记在抗-GFP抗体中Lys残基的胺侧链；标记不是链特异性的，并且通过Lys残基的频率来规定。SDP-N3-改性抗体+DIBO-转化的寡核苷酸结果示于图3。
以上引用的每一个参考文献在此通过引用结合，如同在本文中被完整阐述。

Claims (75)

1. 一种式IA的化合物或其盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
　　　　IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团。
2. 权利要求1的化合物，其中Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。
3. 权利要求1的化合物，其中Ra的点击-反应性是铜-催化的。
4. 权利要求1的化合物，其中所述Ra的点击-反应性不是铜-催化的。
5. 权利要求1的化合物，其中L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。
6. 权利要求1的化合物，其中R1和R2为氯。
7. 权利要求1的化合物，其中R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。
8. 权利要求6的化合物，其中R3为-SO3 -。
9. 权利要求1的化合物，其中式IA的化合物为盐。
10. 权利要求9的化合物，其中所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
11. 权利要求1的化合物，其中Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
12. 权利要求8的化合物，其中Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
13. 权利要求12的化合物，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
14. 权利要求12的化合物，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
15. 权利要求12的化合物，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中A为可含有杂原子和/或与一个或多个5-元或6-元芳族或杂芳族环稠合的取代或未取代的环辛炔环。
16. 权利要求13的化合物，其中所述化合物为
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
17. 权利要求14的化合物，其中所述化合物为
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
18. 权利要求15的化合物，其中所述化合物选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure DEST_PATH_IMAGE016
和
Figure DEST_PATH_IMAGE018
。
19. 一种制备式IA的化合物或其盐的方法：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
　　　IA
所述方法包括：
使式IB的化合物或其盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
　　IB
与式IC的化合物或其互变异构体或盐接触：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
　　　IC
其中
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，
L为接头，和
Ra为点击-反应性基团。
20. 权利要求19的方法，其中所述接触步骤在二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下进行。
21. 权利要求19的方法，其中所述接触步骤在有机溶剂中进行。
22. 权利要求19的方法，其中R1和R2为氯。
23. 权利要求22的方法，其中R3为-SO3 -。
24. 权利要求19的方法，其中Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。
25. 权利要求19的方法，其中Ra的点击-反应性是铜-催化的。
26. 权利要求19的方法，其中Ra的点击-反应性不是铜-催化的。
27. 权利要求19的方法，其中L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。
28. 权利要求23的方法，其中Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
29. 权利要求28的方法，其中式IB的化合物具有下式：
。
30. 权利要求28的方法，其中式IB的化合物具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
。
31. 权利要求28的方法，其中式IB的化合物具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE030
其中A为可含有杂原子和/或与一个或多个5-元或6-元芳族或杂芳族环稠合的取代或未取代的环辛炔环。
32. 权利要求29的方法，其中式IB的化合物为
Figure DEST_PATH_IMAGE032
。
33. 权利要求30的方法，其中式IB的化合物为
Figure DEST_PATH_IMAGE034
。
34. 权利要求31的方法，其中式1B的化合物选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
、
Figure DEST_PATH_IMAGE038
和
Figure DEST_PATH_IMAGE040
。
35. 一种点击-标记载体分子或固体载体的方法，所述方法包括：
使包含亲核基团X并且具有式Rb-X的所述载体分子或固体载体与式IA的化合物或其盐接触：
　　　IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；
和
形成式I的化合物或其盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE042
　　I
其中
L为接头，
Ra为点击-反应性基团，和
Rb为包含亲核基团X的载体分子或固体载体。
36. 权利要求35的方法，其中X为氨基、硫代或氧代基团。
37. 权利要求35的方法，其中L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。
38. 权利要求35的方法，其中R1和R2为氯。
39. 权利要求35的方法，其中R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。
40. 权利要求35的方法，其中R3为-SO3 -。
41. 权利要求35的方法，其中Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。
42. 权利要求35的方法，其中Rb为固体载体。
43. 权利要求35的方法，其中Rb为载体分子。
44. 权利要求43的方法，其中所述载体分子选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、药物、脂质和合成的聚合物。
45. 权利要求44的方法，其中所述载体分子为蛋白质。
46. 权利要求45的方法，其中所述蛋白质为抗体的重链或轻链。
47. 权利要求35的方法，其中式IA的化合物为盐。
48. 权利要求47的方法，其中所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
49. 权利要求35的方法，所述方法还包括在所述接触步骤之后用式IA的化合物温育所述载体分子或固体载体。
50. 权利要求35的方法，其中所述接触步骤在水溶液中进行。
51. 权利要求35的方法，其中式IA的化合物可溶于水溶液。
52. 权利要求44的方法，其中式IA的化合物具有包含以下的式：
。
53. 权利要求44的方法，其中式1A的化合物具有包含以下的式：
Figure 777562DEST_PATH_IMAGE006
。
54. 权利要求52的方法，其中式1A的化合物为
Figure 172772DEST_PATH_IMAGE010
。
55. 权利要求53的方法，其中式1A的化合物为
Figure 800193DEST_PATH_IMAGE012
。
56. 一种点击-标记的载体分子，其通过权利要求35的方法制备。
57. 权利要求56的点击-标记的载体分子，其中所述载体分子选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、药物、脂质和合成的聚合物。
58. 一种用于点击-标记载体分子或固体载体的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
a) 式IA的化合物或其盐：
　　　IA
其中
L为接头，
R1为卤素，
R2为卤素，
R3包含水增溶基团，和
Ra为点击-反应性基团；和
b) 用于点击-标记所述载体分子或固体载体的用法说明。
59. 权利要求58的试剂盒，其中Ra为炔反应性部分、叠氮化物反应性部分、二烯、亲二烯体、环氧化物或氮杂环丙烷化合物。
60. 权利要求58的试剂盒，其中Ra的点击-反应性是铜-催化的。
61. 权利要求58的试剂盒，其中Ra的点击-反应性不是铜-催化的。
62. 权利要求58的试剂盒，其中L为共价键、-烷基-、-取代的烷基-、-烯基-、-取代的烯基-、-杂环基-、-取代的杂环基-、-芳基-、-取代的芳基-、-杂芳基-、-取代的杂芳基-、-环烷基-、-取代的环烷基-、-氧基-、-烷氧基-、-取代的烷氧基-、-烷氧基烷基-、聚(烷氧基烷基)-、PEG、-硫代-、-氨基-或-取代的氨基-。
63. 权利要求58的试剂盒，其中R1和R2为氯。
64. 权利要求58的试剂盒，其中R3为-COO-、-SO3 -、取代的氮烯基、PEG、磷酸基或双膦酸基。
65. 权利要求63的试剂盒，其中R3为-SO3 -。
66. 权利要求58的试剂盒，其中式IA的化合物为盐。
67. 权利要求66的试剂盒，其中所述盐包含钾离子、钠离子或三乙基铵离子。
68. 权利要求58的试剂盒，其中Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
69. 权利要求65的试剂盒，其中Ra为炔反应性部分或叠氮化物反应性部分。
70. 权利要求69的试剂盒，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure 269450DEST_PATH_IMAGE004
。
71. 权利要求69的试剂盒，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure 468350DEST_PATH_IMAGE006
。
72. 权利要求69的试剂盒，其中所述化合物具有包含以下的式：
Figure 199546DEST_PATH_IMAGE008
其中A为可含有杂原子和/或与一个或多个5-元或6-元芳族或杂芳族环稠合的取代或未取代的环辛炔环。
73. 权利要求70的试剂盒，其中所述化合物为
Figure 192909DEST_PATH_IMAGE010
。
74. 权利要求71的试剂盒，其中所述化合物为
Figure 760288DEST_PATH_IMAGE012
。
75. 权利要求72的试剂盒，其中所述化合物选自：
Figure 497300DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure 83002DEST_PATH_IMAGE016
和
Figure 824431DEST_PATH_IMAGE018
。
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