DE112019007287T5

DE112019007287T5 - Multikapillar-elektrophoresevorrichtung und verfahren zur probenanalyse

Info

Publication number: DE112019007287T5
Application number: DE112019007287.0T
Authority: DE
Inventors: Noriyuki Sumida; Takashi Anazawa; Michiru Fujioka; Motohiro Yamazaki; Taro Nakazawa
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2022-04-14
Also published as: GB2599029A; GB202117085D0; WO2020245961A1; CN113939733B; JPWO2020245961A1; US20220229013A1; CN113939733A; JP7261877B2; GB2599029B

Abstract

Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung umfasst: ein Kapillar-Array, die durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren gebildet wird; eine Lichtquelle, die die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt; einen Photodetektor, der die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren detektiert; und eine arithmetische Steuereinheit, die eine Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal vom Photodetektor entsprechend berechnet. Die arithmetische Steuereinheit ist dazu konfiguriert, die Signalintensität einem Korrekturindex entsprechend zu korrigieren, der für jede Kombination der Kapillaren mit einem Fluorophor, mit dem die Probe markiert ist, bestimmt wurde.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung und ein Verfahren zur Probenanalyse.
Stand der Technik
Als Technik zur Analyse einer Basensequenz oder einer Basenlänge von DNA sind Elektrophoreseverfahren wohlbekannt. Eines der Elektrophoreseverfahren ist die Kapillar-Elektrophorese, bei welcher die Elektrophorese in einem Kapillarrohr (im Folgenden als „Kapillare“ bezeichnet) durchgeführt wird. Bei der Kapillar-Elektrophorese wird eine DNA-haltige Probe in eine mit einem Trennmedium gefüllte Kapillare injiziert, und in diesem Zustand wird eine hohe Spannung über die Kapillaren angelegt. Dabei wandert die DNA als negativ geladenes Ladungsteilchen in der Kapillare abhängig von ihrer eigenen Größe zur Anodenseite, wodurch in der Kapillare eine dem Molekulargewicht entsprechende Bande entsteht. Jede DNA ist fluoreszenzmarkiert und emittiert bei Bestrahlung mit Anregungslicht Fluoreszenz. Eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden. Durch deren Detektion wird eine Basensequenz oder eine Basenlänge der DNA bestimmt.
Zur Beschleunigung einer Analyse kann in einer einzelnen Elektrophoresevorrichtung ein Kapillar-Array verwendet werden, in welchem eine Vielzahl von Kapillaren angeordnet sind. Eine derartige Elektrophoresevorrichtung wird auch als Multikapillararray-Elektrophoresevorrichtung bezeichnet, und eine Anordnung aus einer Vielzahl von Kapillaren wird auch als Kapillar-Array bezeichnet.
Eine Methode zur Bestrahlung solch eines Kapillar-Arrays mit Licht ist ein Detektionsverfahren, in welchem eine Fluoreszenz detektiert wird, indem Anregungslicht (zum Beispiel Laserlicht) von einem oder beiden Enden des Kapillar-Array aus so eingestrahlt wird, dass es die Kapillaren durchläuft. Dabei durchläuft das Laserlicht die angeordneten Kapillaren eine nach der anderen. Wenn das Laserlicht eine Kapillare durchläuft, wird es an einer Grenzfläche zwischen Substanzen mit unterschiedlichem Brechungsindex (zum Beispiel einem Material der Kapillare und Luft) gestreut, und das Laserlicht wird abgeschwächt. Daher ist die Intensität des Laserlichts, mit dem eine Kapillare in der Nähe der Lichtquelle bestrahlt wird, die höchste unter den Kapillaren, und das Laserlicht, mit dem eine weiter entfernt liegende Kapillaren bestrahlt wird, weist eine reduzierte Intensität auf. Aus diesem Grund ist auch die Fluoreszenzintensität, die in jeder Kapillare detektiert wird, ja nach Entfernung von der Lichtquelle unterschiedlich.
In solch einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung ist die Fluoreszenzintensität von Kapillare zu Kapillare unterschiedlich, selbst wenn in jeder Kapillare die gleiche DNA-Menge analysiert wird. Im Folgenden wird ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität unter den Kapillaren, der selbst dann auftritt, wenn gleiche Mengen an DNA analysiert werden, als „konfigurationsbedingte Schwankung“ bezeichnet.
Diese konfigurationsbedingte Schwankung erschwert den quantitativen Vergleich der durch Analyse erhaltenen Fluoreszenzintensität zwischen den Kapillaren. Um dieses Problem zu lösen, wird in Patentliteratur 1 ein Verfahren angewandt, bei dem eine Ablaufzeit des Lichts von Kapillare zu Kapillare unterschiedlich ist. In Patentliteratur 2 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die Fluoreszenzintensität unter Verwendung einer internen Standardprobe korrigiert wird.
Doch selbst mit den in Patentliteratur 1 und 2 beschriebenen Verfahren ist es schwierig, einen genauen quantitativen Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen einer Vielzahl von Kapillaren durchzuführen.
Liste der Bezugsliteratur
Patentliteratur

Patentliteratur 1: Ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 2012-168138
Patentliteratur 2: Ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 2016-176764

Kurzfassung der Erfindung
Technisches Problem
Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht des obigen Problems ersonnen, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung und eines Verfahrens zur Probenanalyse, die einen quantitativen Vergleich zwischen einer Vielzahl von Kapillaren ermöglichen.
Lösung des Problems
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Kapillar-Array, die durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren gebildet wird; eine Lichtquelle, die die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt; einen Photodetektor, der die Fluoreszenz von einer Probe in jeder Kapillare detektiert; und eine arithmetische Steuereinheit, die eine Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal vom Photodetektor entsprechend berechnet. Die arithmetische Steuereinheit ist dazu konfiguriert, die Signalintensität einem Korrekturindex entsprechend zu korrigieren, der für jede Kombination der Kapillaren mit einem Fluorophor, mit dem die Probe markiert ist, bestimmt wurde.
Eine Multikapillar-Array-Elektrophoresevorrichtung gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Kapillar-Array, das durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren gebildet wird; eine Lichtquelle, die die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt; einen Photodetektor, der die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren detektiert; eine arithmetische Steuereinheit, die dazu konfiguriert ist, eine Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal vom Photodetektor entsprechend zu berechnen und die Signalintensität einem Korrekturindex entsprechend, der für jede der Kapillaren bestimmt wurde, zu korrigieren; eine Korrekturindex-Berechnungseinheit, die den Korrekturindex berechnet. Die Korrekturindex-Berechnungseinheit bestrahlt die Kapillaren mit Anregungslicht, misst Raman-Licht und berechnet den Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität des Raman-Lichts.
In einem Verfahren zur Probenanalyse gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Probe unter Verwendung einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung analysiert, die eine Vielzahl von Kapillaren aufweist. Das Verfahren zur Probenanalyse umfasst: einen Schritt des Bewirkens der Elektrophorese der Probe über die Kapillaren; einen Schritt des Detektierens, mit einem Photodetektor, der Fluoreszenz, die durch Bestrahlen der Kapillaren mit Anregungslicht erzeugt wird; einen Schritt des Berechnens der Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal des Photodetektors entsprechend; und einen Schritt des Korrigierens einer Signalintensität der Fluoreszenz einem Korrekturindex entsprechend, der für jede Kombination der Kapillaren mit einem Fluorophor, mit dem die Probe markiert ist, bestimmt wurde.
In einem Verfahren zur Probenanalyse gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Probe unter Verwendung einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung analysiert, die eine Vielzahl von Kapillaren aufweist. Das Verfahren zur Probenanalyse umfasst: einen Schritt des Bewirkens der Elektrophorese der Probe über die Kapillaren; einen Schritt des Detektierens, mit einem Photodetektor, der Fluoreszenz, die durch Bestrahlen der Kapillaren mit Anregungslicht erzeugt wird; einen Schritt des Berechnens der Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal des Photodetektors entsprechend; einen Schritt des Bestrahlens der Kapillaren mit Anregungslicht, Messens von Raman-Licht und Berechnens eines Korrekturindexes auf der Basis einer Signalintensität des Raman-Lichts; und einen Schritt des Korrigierens einer Signalintensität der Fluoreszenz dem Korrekturindex entsprechend.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung und ein Verfahren zur Probenanalyse bereit, die einen quantitativen Vergleich zwischen einer Vielzahl von Kapillaren ermöglichen.
Figurenliste

1 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer Konfiguration einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform.
2 ist ein Blockschaltbild zur näheren Erläuterung einer Konfiguration einer Photobestrahlungseinheit 108;
3 ist ein Ablaufplan zur Erläuterung eines Verfahrens zur Probenanalyse in der Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung der ersten Ausführungsform;
4 ist ein schematisches Diagramm zur Erläuterung eines Verfahrens zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten in der ersten Ausführungsform;
5 ist ein Graph, der ein Versuchsergebnis zeigt;
6 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer zweiten Ausführungsform;
7 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer dritten Ausführungsform;
8 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer vierten Ausführungsform;
9 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer fünften Ausführungsform; und
10 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer sechsten Ausführungsform.

Beschreibung von Ausführungsformen
Im Folgenden werden die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Bezug nehmend auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. In den beigefügten Zeichnungen können funktionsgleiche Elemente mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet sein. Die beigefügten Zeichnungen veranschaulichen Ausführungsformen und Umsetzungsbeispiele, die mit dem Prinzip der vorliegenden Offenbarung in Übereinstimmung stehen. Die beigefügten Zeichnungen dienen jedoch dem leichteren Verständnis der vorliegenden Offenbarung und schränken die Auslegung der vorliegenden Offenbarung in keiner Weise ein. Die Beschreibung beschreibt lediglich ein typisches Beispiel und schränkt die Ansprüche oder Anwendungsbeispiele der vorliegenden Offenbarung in keiner Weise ein.
Die folgenden Ausführungsformen wurden ausreichend detailliert beschrieben, um dem Fachmann die Umsetzung der vorliegenden Offenbarung zu ermöglichen. Es versteht sich jedoch, dass andere Umsetzungen und Ausführungsformen möglich sind und Änderungen an der Konfiguration und Struktur und der Austausch verschiedener Elemente vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der technischen Philosophie oder vom Geist der vorliegenden Offenbarung abzuweichen. Daher ist die folgende Beschreibung nicht einschränkend zu interpretieren.
[Erste Ausführungsform]
Die Konfiguration einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf die schematische Darstellung in 1 beschrieben. Die Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung 1 umfasst einen Vorrichtungshauptkörper 101 und einen Steuerrechner 102.
Der Vorrichtungshauptkörper 101 ist über ein Kommunikationskabel mit dem Steuerrechner 102 verbunden, und ein Bediener bedient den Steuerrechner 102, um jede der im Vorrichtungshauptkörper 101 vorgesehenen Einheiten zu steuern, und empfängt am Steuerrechner 102 Daten, die mit dem Photodetektor 104 detektiert wurden. Der Steuerrechner 102 umfasst einen Bildschirm als Datenanzeigebildschirm zur Anzeige empfangener Daten. Der Steuerrechner 102 kann im Vorrichtungshauptkörper 101 integriert sein.
Der Vorrichtungshauptkörper 101 umfasst außerdem eine arithmetische Steuerschaltung 103, einen Photodetektor 104, ein thermostatisches Bad 105, ein Kapillar-Array 106, eine Lichtquelle 107 und eine Photobestrahlungseinheit 108.
Die arithmetische Steuerschaltung 103 führt auf der Basis eines Detektionssignals vom Photodetektor 104 die arithmetische Verarbeitung eines Messwerts (Fluoreszenzintensität) durch und nimmt eine Korrektur an diesem Messwert (Fluoreszenzintensität) vor. Die arithmetische Steuerschaltung 103 steuert den Vorrichtungshauptkörper 101 einer Eingabe oder einer Anweisung vom Steuerrechner 102 gemäß. Der Photodetektor 104 ist ein optischer Sensor, der eine Fluoreszenz detektiert, die durch Laserlicht als Anregungslicht entsteht, das von der Lichtquelle 107 auf das Kapillar-Array 106 einstrahlt. Als Lichtquelle 107 kann ein Flüssigkeitslaser, ein Gaslaser oder ein Halbleiterlaser auf geeignete Weise verwendet werden, und auch eine LED kann stattdessen verwendet werden. Die Lichtquelle 107 kann das Kapillar-Array 106 von beiden Seiten der Anordnung aus mit Anregungslicht bestrahlen oder dazu konfiguriert sein, diese auf zeitgeteilte Weise mit Anregungslicht zu bestrahlen.
Das thermostatische Bad 105 ist ein Temperaturregelungsmechanismus zur Regelung der Temperatur des Kapillar-Arrays 106. Das thermostatische Bad 105 ist mit einem wärmeisolierenden Material ausgekleidet, um das Innere des Bads auf eine konstante Temperatur zu halten, und regelt die Temperatur durch einen Heiz- und Kühlmechanismus 123. Dadurch wird die Temperatur des größten Teils des Kapillar-Arrays 106 auf eine konstante Temperatur von zum Beispiel etwa 60 °C gehalten.
Das Kapillar-Array 106 ist durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren 119 (vier im Beispiel in 1) gebildet. Das Kapillar-Array 106 kann als austauschbares Element konfiguriert sein, das durch ein neues ersetzt werden kann, wenn eine Beschädigung oder eine Verschlechterung der Qualität festgestellt wird. Das Kapillar-Array 106 kann durch ein anderes Multikapillar-Array ersetzt werden, das je nach Messung eine andere Anzahl von Kapillaren oder Kapillaren anderer Länge aufweist.
Jede der Kapillaren 119, aus denen das Kapillar-Array 106 besteht, ist aus einem Glasröhrchen mit einem Innendurchmesser von mehreren zehn bis mehreren hundert µm und einem Außendurchmesser von mehreren hundert µm gebildet. Die Oberfläche jedes Glasröhrchens kann mit einer Polyimidfolie überzogen sein, um seine Festigkeit zu erhöhen. An einer Stelle, die mit Laserlicht bestrahlt wird, und in deren Nachbarschaft ist die Polyimidfolie jedoch von der Oberfläche der Kapillaren 119 entfernt. Die Kapillaren 119 sind mit einem Trennmedium zur Auftrennung von DNA-Molekülen in einer biologischen Probe gefüllt. Ein Beispiel für ein Trennmedium ist ein Polyacrylamid-Trenngel (nachstehend als Polymer bezeichnet) für die Elektrophorese, das von verschiedenen Unternehmen kommerziell erhältlich ist.
Die Photobestrahlungseinheit 108 ist an einem Abschnitt des Kapillar-Arrays 106 angeordnet. Wie weiter unten beschrieben, ist die Photobestrahlungseinheit 108 dazu konfiguriert, Laserlicht (Anregungslicht) von der Lichtquelle 107 gemeinsam in die Kapillaren 119 einzuleiten und die Fluoreszenz, die von der Vielzahl von Kapillaren 119 abgegeben wird, zum Photodetektor 104 zu leiten. Das heißt, die Photobestrahlungseinheit 108 weist eine Projektionsoptik mit einer Lichtleitfaser, einer Linse und dergleichen auf, um einen Photobestrahlungsbereich, der im Kapillar-Array 106 vorgesehen ist, mit Laserlicht als Messlicht zu bestrahlen.
Der Vorrichtungshauptkörper 101 umfasst außerdem einen Ladekopf 109, einen Kathodenpufferbehälter 111, einen Probenbehälter 112, eine Polymerkartusche 113, einen Anodenpufferbehälter 114, einen Array-Kopf 117 und einen Förderer 118.
Der Ladekopf 109 ist an einem Ende des Kapillar-Arrays 106 vorgesehen. Der Ladekopf 109 fungiert als eine Elektrode (Kathode), an welche eine negative Spannung angelegt wird, um eine biologische Probe in die Kapillaren 119 einzuleiten. Der Array-Kopf 117 ist am anderen Ende des Kapillar-Arrays 106 angeordnet, und der Array-Kopf 117 bündelt die Vielzahl von Kapillaren 119. Der Array-Kopf 117 ist auf der Unterseite des Array-Kopfs mit einer Spitze 121 versehen, die in die Polymerkartusche 113 eingesteckt wird.
Der Förderer 118 ist dazu konfiguriert, den Kathodenpufferbehälter 111, den Probenbehälter 112, die Polymerkartusche 113 und den Anodenpufferbehälter 114 auf seine Oberseite zu laden und zu befördern. Das Förderer 118 kann zum Beispiel drei Elektromotoren und Linearaktuatoren umfassen, sodass der Förderer in drei Achsrichtungen (nach oben und unten, nach links und rechts, nach vorne und hinten) beweglich ist. Der Kathodenpufferbehälter 111 und der Anodenpufferbehälter 114 sind Behälter, die einen Puffer für die Elektrophorese enthalten, und der Probenbehälter 112 ist ein Behälter, der eine zu messende Probe enthält.
Die Polymerkartusche 113 ist ein Behälter, der ein Polymer für die Elektrophorese enthält. Die Polymerkartusche 113 ist an ihrem Oberteil 122 mit einem hochplastischen Material wie Gummi oder Silikon abgedichtet und ist mit einem Spritzenmechanismus 120 zum Einfüllen des Polymers und dem Förderer 118 gekoppelt. Im Anodenpufferbehälter 114 ist eine Anode 115 zum Anlegen einer positiven Spannung für die Elektrophorese mit einem Puffer in Kontakt angeordnet. Eine Gleichstromversorgung 116 ist zwischen der Anode 115 und dem Ladekopf 109 als Kathode verbunden.
Der Förderer 118 fördert den Kathodenpufferbehälter 111 und den Probenbehälter 112 zu den Kathodenenden 110 der Kapillaren 119. Dabei bewegt sich der Anodenpufferbehälter 114 zur Spitze 121, die dem Anodenende der Kapillaren 119 entspricht. Die Anzahl der Probenröhren, die im Probenbehälter 112 enthalten sind, entspricht der der Kapillaren 119. Ein Bediener gibt DNA in die Probenröhren.
Die arithmetische Steuerschaltung 103 umfasst außerdem eine Messwertberechnungseinheit 1032, eine Korrekturindexberechnungseinheit 1033, eine Korrektureinheit 1034 und eine Korrekturindex-Datenbank 1035.
Die Messwertberechnungseinheit 1032 berechnet auf der Basis eines Detektionssignals vom Photodetektor 104 einen Messwert (Fluoreszenzintensität). Die Korrekturindex-Berechnungseinheit 1033 berechnet einen Korrekturindex zur Korrektur eines Messwerts, der durch die Messwert-Berechnungseinheit 1032 berechnet wurde. Die Korrektureinheit 1034 berechnet einen korrigierten Messwert, indem sie einen Korrekturindex auf den Messwert der Messwertberechnungseinheit 1032 anwendet. Die Korrekturindex-Datenbank 1035 ist eine Datenbank, in der auf diese Weise berechnete Korrekturindizes gespeichert werden.
Ein Verfahren zum Füllen eines Polymers aus der Polymerkartusche 113 in die Kapillaren 119 ist wie folgt:

(1) Der Förderer 118 wird betätigt, und der Array-Kopf 117 wird über die Polymerkartusche 113 bewegt.
(2) Die Spitze 121 des Array-Kopfs 117 durchsticht das Oberteil 122 der Polymerkartusche 113. Dabei umschließt das hochplastische Oberteil 122 der Polymerkartusche 113 die Spitze 121 des Array-Kopfs 117, um sie in engen Kontakt miteinander zu bringen, wodurch die Polymerkartusche 113 und die Kapillaren 119 in einem hermetisch abgedichteten Zustand verbunden sind.
(3) Der Spritzenmechanismus 120 presst ein Polymer in der Polymerkartusche 113 nach oben, um das Polymer in die Kapillaren 119 zu injizieren.

Eine Konfiguration der Photobestrahlungseinheit 108 wird Bezug nehmend auf 2 näher beschrieben. Eine beispielhafte Photobestrahlungseinheit 108 ist aus einer Vielzahl von Reflexionsspiegeln 202 und einer Kondensorlinse 203 konfiguriert. Die Reflexionsspiegel 202 sind reflektierende Komponenten, um eine Ausbreitungsrichtung des Laserlichts von der Lichtquelle 107 zu ändern. Die Kondensorlinse 203 konzentriert das Laserlicht auf einen Photobestrahlungsbereich im Kapillar-Array 106. Andere optische Komponenten wie z. B. ein Filter, ein Lichtpolarisator, eine Wellenplatte oder dergleichen können in geeigneter Weise vorgesehen sein, die graphische Darstellung solcher optischen Komponenten wurde hier jedoch der Einfachheit halber ausgelassen.
Das von der Lichtquelle 107 emittierte Laserlicht 201 wird von den Reflexionsspiegeln 202 umgelenkt und nach der Bündelung durch die Kondensorlinse 203 zu den Kapillaren 119 geleitet. Das Laserlicht 201 fällt auf eine Kapillare 119 nach der anderen ein. Eine Fluoreszenzintensität der Fluoreszenz, die durch den Einfall des Laserlichts 201 entsteht, wird mit dem Photodetektor 104 beobachtet, wodurch eine Analyse der DNA in einer Probe durchgeführt werden kann.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Analyse einer Probe in einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung Bezug nehmend auf den Ablaufplan in 3 beschrieben.
In Schritt S300 wird zuerst eine Wellenlänge des von der Lichtquelle 107 emittierten Laserlichts kalibriert, bevor eine zu analysierende Probe (nachstehend als „reale Probe“ bezeichnet) analysiert wird. Bei der Wellenlängenkalibrierung wird die Elektrophorese einer bekannten DNA-Probe (nachstehend als „Referenzstandard“ bezeichnet) veranlasst, die mit dem gleichen Fluorophor markiert ist wie die reale Probe, um Wellenlängenspektrumsdaten als Referenz zu erhalten. Diese Operation wird bei einem Austausch des Kapillar-Arrays 106 aufgrund einer Verschlechterung oder einer Längenänderung auf jeden Fall durchgeführt.
Zur Vorbereitung (Laden der Verbrauchsstoffe) legt ein Bediener dann den Kathodenpufferbehälter 111, den Probenbehälter 112, die Polymerkartusche 113 und den Anodenpufferbehälter 114 auf den Förderer 118 (Schritt S301). Die Analyse wird dann einer Anweisung vom Steuerrechner 102 entsprechend vom Bediener gestartet (Schritt S302).
Wenn die Analyse gestartet wurde, wird zuerst der Förderer 118 betätigt, um die Polymerkartusche 113 zur Spitze 121 des Array-Kopfs 117 zu befördern (Schritt S303). Dabei werden die Kathodenenden 110 der Kapillaren mit einem im Kathodenpufferbehälter 111 enthaltenen Kathodenpuffer in Kontakt gebracht. Dann wird ein Polymer durch den Spritzenmechanismus in das Kapillar-Array 106 injiziert (Schritt S304). Gleichzeitig wird ein altes Polymer, das in einer vorherigen Elektrophorese verwendet wurde, aus den Kapillaren 119 im Kathodenpufferbehälter 111 entsorgt. Die Menge eines Polymers, die aus der Polymerkartusche 113 in die Kapillaren 119 injiziert wird, wird vom Steuerrechner 102 spezifiziert, und die spezifizierte Menge des Polymers wird durch den Spritzenmechanismus 120 injiziert.
Wenn das Füllen des Polymers abgeschlossen ist, wird eine Vorelektrophorese gestartet (Schritt S305). Die Vorelektrophorese wird vor dem eigentlichen Analyseprozess durchgeführt, um das Polymer in den Kapillaren 119 in einen für die Analyse geeigneten Zustand zu bringen. Die Vorelektrophorese erfolgt in der Regel, indem zwischen der Anode 115 und dem Ladekopf 109 einige bis mehrere zehn Minuten lang eine Spannung von etwa einigen bis mehreren zehn kV angelegt wird.
Nach Abschluss der Vorelektrophorese werden die Kathodenenden 110 der Kapillaren im Kathodenpufferbehälter 111 gereinigt (Schritt S306). Dann wird der Probenbehälter 112 zu den Kathodenenden 110 der Kapillaren befördert (Schritt S307). Wenn in diesem Zustand eine Spannung von etwa mehreren kV an die Kathodenenden 110 der Kapillaren angelegt wird, wird zwischen einer Probenflüssigkeit und der Spitze 121 ein elektrisches Feld erzeugt, und die Probe im Probenbehälter 112 wird in die Kapillaren 119 einleitet (Schritt S308). Nach dem Einleiten der Probe werden die Kathodenenden 110 der Kapillaren erneut im Kathodenpufferbehälter 111 gereinigt.
Danach wird eine bestimmte Spannung angelegt, um die Elektrophorese der Probe zu starten (Schritt S309). Bei der Elektrophorese wird einer Probe in den Kapillaren 119 durch Einwirkung eines zwischen dem Kathoden- und Anodenpuffer erzeugten elektrischen Felds Mobilität verliehen, und die Probe wird aufgrund eines von den Eigenschaften der Probe abhängigen Unterschieds in der Mobilität getrennt. Hier wird als Beispiel der Fall einer DNA-Probe beschrieben.
DNA weist aufgrund einer Phosphodiesterbindung als Gerüst der Doppelhelix in einem Trennmedium (Polymer) eine negative elektrische Ladung auf. Daher wandert die DNA im elektrischen Feld zur Anodenseite hin. Da das Trennmedium (Polymer) eine Netzwerkstruktur aufweist, ist die Mobilität der DNA von der Leichtigkeit des Maschendurchgangs, das heißt, von der Größe der DNA abhängig. DNA mit kurzer Basenlänge geht leicht durch die Maschenstruktur und ist sehr mobil, während auf DNA mit langer Basenlänge das Gegenteil zutrifft.
Da die DNA zuvor mit einem fluoreszierenden Material (Fluorophor) markiert wurde, wird die DNA der Kürze ihrer Basenlänge nach an der Photobestrahlungseinheit 108 optisch detektiert. In der Regel werden die Messzeit und die Spannungsanlegezeit der Probe mit der längsten Elektrophoresezeit entsprechend eingestellt. Die detektierte Fluoreszenz wird mit einem Referenzspektrum verglichen, das durch die Wellenlängenkalibrierung in Schritt 300 erhalten wurde, um das Fluorophor zu identifizieren. Dieser Prozess wird als Farbkonversion bezeichnet (Schritt S310). Wenn nach Beginn des Spannungsanlegens eine bestimmte Zeit angelaufen ist, wird das Spannungsanlegen nach der Datenerfassung gestoppt, und die Analyse wird beendet (Schritt S311). Das Vorstehende ist ein grundlegendes Verfahren für elektrophoretische Analysen. In der Messwertberechnungseinheit 1032 der arithmetischen Steuerschaltung 103 wird auf diese Weise für jede der Kapillaren 119 ein Wert der Fluoreszenzintensität als Messwert erhalten.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Korrektur eines Messwerts (Fluoreszenzintensität), der in der ersten Ausführungsform erhalten wurde, Bezug nehmend auf die schematische Darstellung in 4 beschrieben. In der ersten Ausführungsform wird, wie oben erwähnt, in Bezug auf einen erhaltenen Messwert ein „Korrekturkoeffizient“ als Beispiel für einen Korrekturindex erhalten, mit welchem der Messwert multipliziert wird, und der Messwert wird korrigiert, indem dieser Korrekturkoeffizient angewandt wird. Ein Korrekturkoeffizient, der hier erhalten wird, weist für jede Kombination der Vielzahl von Kapillaren 119 mit der Vielzahl von Fluorophoren einen anderen Wert auf. Mit anderen Worten, selbst bei einer gleichen Kapillare 119 ergibt sich für jedes Fluorophor ein anderer Korrekturkoeffizient, wenn eine zu messende Probe mit verschiedenen Fluorophoren markiert ist. Auch wenn die verwendeten Fluorophore gleich sind, ergibt sich ein anderer Korrekturkoeffizient, wenn die Kapillaren 119 verschieden sind. Ein geeignetes Beispiel für einen Korrekturindex ist ein Korrekturkoeffizient, mit dem ein Messwert multipliziert wird. Doch jeder Korrekturindex ist akzeptabel, solange er die zweckmäßige Korrektur eines Messwerts ermöglicht, und die Form eines Korrekturindexes ist vernachlässigbar.
Ein Verfahren zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten in der ersten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 4 beschrieben. Der Einfachheit halber wird in der Beschreibung angenommen, dass das Kapillar-Array 106 vier Kapillaren 119-1 bis 4 umfasst (4(a)). Die Anzahl vier ist jedoch nur ein Beispiel, und es versteht sich, dass die folgende Beschreibung auf entsprechende Weise anwendbar ist, wenn eine andere Anzahl verwendet wird. 4(b) und 4(c) veranschaulichen eine Methode zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten, und 4(e) zeigt ein Beispiel für einen Zahlenwert der Fluoreszenzintensität nach der Korrektur mit dem Korrekturkoeffizienten. Die Zahlenwerte in den Tabellen von 4(c) bis 4(e) sind hypothetische Werte zur Veranschaulichung und beziehen sich nicht auf real gemessene Werte.
Bei der Wellenlängenkalibrierung vor Beginn der Analyse (Schritt S300 in 3) wird die Signalintensität jeder der vier Kapillaren 119-1 bis 4 für alle Fluorophoren gemessen. Zum Beispiel werden drei Fluorophor-Arten A, B, C als Fluorophore verwendet. Bei der Wellenlängenkalibrierung werden vor der Messung für die vier Kapillaren 119-1 bis 4 gleiche Bedingungen hergestellt. Zum Beispiel wird die gleiche Menge an DNA in die jeweiligen Probenröhren gegeben, die den vier Kapillaren 119-1 bis 4 entsprechen. In diesem Zustand sollte in der durch Wellenlängenkalibrierung erhaltenen Fluoreszenzintensität im Idealfall kein Unterschied zwischen den Kapillaren vorhanden sein. Tatsächlich ist jedoch die oben erwähnte „konfigurationsbedingte Schwankung“ zwischen den Kapillaren vorhanden. Selbst unter den obigen Umständen können zwischen verschiedenen Kapillaren erhebliche Unterschiede (Schwankungen) in der Fluoreszenzintensität festgestellt werden. Um diese Schwankung zu reduzieren, wird in der ersten Ausführungsform ein Korrekturkoeffizient durch die folgende Methode berechnet, in der Korrekturindex-Datenbank 1035 gespeichert und zur Korrektur eines Messwerts angewandt.
Wenn an den durch die Wellenlängenkalibrierung erhalten Referenzspektrumsdaten eine Farbkonversion durchgeführt wird, wird die Fluoreszenzintensität Int(nX) jedes der Fluorophore A, B, C in jeder der Kapillaren 119-1 bis 4 erhalten (4(b)). Hier ist n die Nummer bzw. Endziffer (1 bis 4) einer Kapillare, und X ist die Art (A, B, C) des Fluorophors. In 4(b) ist eine Fluoreszenzintensität jeder der drei Fluorophor-Arten A, B, C in jeder der vier Kapillaren 119-1 bis 4 dargestellt. Zum Beispiel wird bei der Messung mit dem Fluorophor A für die vier Kapillaren 119-1 bis 4 jeweils die Fluoreszenzintensität Int (1A), Int(2A), Int(3A), Int(4A) erhalten. Bei der Messung mit dem Fluorophor B wird für die vier Kapillaren 119-1 bis 4 jeweils die Fluoreszenzintensität Int(1B), Int(2B), Int(3B), Int(4B) erhalten. Bei der Messung mit dem Fluorophor C wird für die vier Kapillaren 119-1 bis 4 jeweils die Fluoreszenzintensität Int (IC), Int(2C), Int(3C), Int(4C) erhalten.
Hier wird unter den Fluoreszenzintensitäten Int(nA), Int(nB), Int(nC) der Fluorophore A bis C diejenige, die den kleinsten Wert aufweist, jeweils als niedrigste Fluoreszenzintensität Int(yA), Int(yB), Int(yC) definiert. Im Beispiel von 4(b) ist die niedrigste Fluoreszenzintensität Int(yA) in Bezug auf das Fluorophor A die Fluoreszenzintensität Int(4A) = 0,7 der Kapillare 119-4; die niedrigste Fluoreszenzintensität Int(yB) in Bezug auf das Fluorophor B ist die Fluoreszenzintensität Int(1B) = 0.6 der Kapillare 119-1; und die niedrigste Fluoreszenzintensität Int(yC)in Bezug auf das Fluorophor C ist die Fluoreszenzintensität Int(2C) = 0,9 der Kapillare 119-2.
In der ersten Ausführungsform wird die niedrigste Fluoreszenzintensität Int(yA), Int(yB), Int(yC) als Bezugswert genommen, und ein Korrekturkoeffizient k(nX) wird berechnet, indem jeder Messwert durch diesen Bezugswert dividiert wird. Zum Beispiel wird ein Korrekturkoeffizient k(nA) für das Fluorophor A durch k(nA)=Int(yA)/Int(nA) berechnet. Ein Korrekturkoeffizient k(nB) für das Fluorophor B wird durch k(nB)= Int(yB)/Int(nB) berechnet. Ein Korrekturkoeffizient k(nC) für das Fluorophor C wird durch k (nC)=Int (yC)/Int (nC) berechnet. Auf diese Weise wird für jede der insgesamt 12 Kombinationen aus einer Vielzahl von Kapillaren 119-1 bis 4 mit einer Vielzahl von Fluorophoren A bis C ein Korrekturkoeffizient k(nX) berechnet.
Wie in 4(d) gezeigt, nimmt der Korrekturkoeffizient k(nX), der der niedrigsten Fluoreszenzintensität Int(yX) zugeordnet ist, den höchsten Wert 1,00 an. In Bezug auf jeden der Fluorophoren A bis C sind die kleinsten Korrekturkoeffizienten k(nX) einer Kombination mit der höchsten Fluoreszenzintensität zugeordnet. In 4(d) sind die Zahlenwerte der Korrekturkoeffizienten auf die zweite Dezimalstelle gerundet, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die erhaltenen Korrekturkoeffizienten k(nX) werden in der Korrekturindex-Datenbank 1035 gespeichert.
Im Beispiel von 4(c) und 4(d) werden Korrekturkoeffizienten mit der niedrigsten Fluoreszenzintensität Int(yX) als Bezugswert berechnet, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Stattdessen kann zum Beispiel auch ein Durchschnittswert, ein Maximalwert oder ein Medianwert der Fluoreszenzintensität oder ein numerischer Wert in einer bestimmte Kapillare zur Berechnung verwendet werden.
Nachdem für jede Kombination der Kapillaren 119-1 bis 4 mit den Fluorophoren A bis C ein Korrekturkoeffizient k(nX) erhalten wurde, wird die Elektrophorese einer realen Probe durchgeführt, um eine Fluoreszenzintensität f(nX) zu erhalten. Durch Multiplikation dieser Fluoreszenzintensität f(nX) mit dem in 4(d) gezeigten Korrekturkoeffizienten k(nX) werden korrigierte Fluoreszenzintensitäten f' (nX) erhalten, wie in 4(e) gezeigt.
Eine Fluoreszenzintensität f(nX) vor der Korrektur weist eine Schwankung unter den verschiedenen Kapillaren auf, selbst wenn das gleiche Fluorophor zur Messung der gleichen Probe verwendet wird. Dagegen ist es durch Multiplikation mit einem Korrekturkoeffizienten k(nX) möglich, eine korrigierte Fluoreszenzintensität f' (nX) zu erhalten, die für die Vielzahl von Kapillaren 119-1 bis 4 in Bezug auf einen gleichen Fluorophor im Wesentlichen den gleichen Wert hat, wie in 4(e) gezeigt.
Die Korrektur mit einem Korrekturkoeffizienten k(nX) muss nicht unbedingt so eingestellt sein, dass die korrigierten Fluoreszenzintensitäten f' (nX) im Wesentlichen gleich sind. Es reicht aus, den Korrekturfaktor auf solch einen Wert einzustellen, dass die Schwankung in der Signalintensität zwischen den Kapillaren nach der Korrektur im Vergleich zur Schwankung vor der Korrektur mindestens reduziert wird, wenn der Korrekturkoeffizient k(nX) auf die Signalintensität der Vielzahl von Kapillaren angewandt (multipliziert) wird. Für die Messung mit einer realen Probe ist es wünschenswert, den gleichen Fluorophor wie bei der Wellenlängenkalibrierung zu verwenden, oder Fluorophore zu verwenden, die mindestens im Wellenlängenband der Lichtemission miteinander übereinstimmen, um die Wirkung der Korrektur zu verstärken.
In der obigen Ausführungsform wird ein Korrekturkoeffizient, der aus Wellenlängenkalibrierungsdaten in einer Einzelvorrichtung erhalten wurde, zur Korrektur eines Messwerts in derselben Vorrichtung verwendet. Stattdessen ist es jedoch auch möglich, einen Korrekturkoeffizienten, der mit einer bestimmten Vorrichtung erhalten wurde, zur Korrektur eines Messwerts für eine reale Probe zu verwenden, der mit einer anderen Vorrichtung erhalten wurde.
[Ausführungsformen]
Die Wirkung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde anhand unter Verwendung der unten beschriebenen Proben verifiziert:
(Proben)
Als Referenzstandard für die Wellenlängenkalibrierung wurde PowerPlex (eingetragenes Warenzeichen) 4C Matrix Standard (Promega Co.) verwendet. Als reale Probe wurde eine Probe verwendet, die durch Amplifikation mit dem PowerPlex (Warenzeichen) 16HS System (von Promega Co.) mit Humangenom-DNA erhalten wurde, die von Promega Co. als Vorlage bereitgestellt wurde. Beide Proben wurden dem von Promega Co. empfohlenen Standardprotokoll entsprechend hergestellt. In diesem Versuch wurden sowohl der Referenzstandard als auch die reale Probe mit vier verschiedenen Fluorophor-Arten (5-FAM, JOE, TMR, CXR) markiert.
(Analyseverfahren)
Die Kapillar-Elektrophorese wird allgemein mit realen Proben durchgeführt, die von Kapillare zu Kapillare unterschiedlich sind. In diesem Versuch wurde jedoch für alle Kapillaren die gleiche Menge derselben realen Probe analysiert, um die Wirkung der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen. Das heißt, die gleiche Menge eines bei der Wellenlängenkalibrierung verwendeten Referenzstandards oder einer realen Probe wurde in den Probenbehälter 112 einer wie in 1 gezeigt konfigurierten Kapillar-Elektrophoresevorrichtung gegeben. Die Kapillarlänge bei der Elektrophorese war 36 cm, die bei der Probeninjektion anliegende Spannung war 1,6 kV, und die bei Elektrophorese anliegende Spannung war 15 kV.
Die Farbkonversion in Schritt 311 erfolgte an Daten, die durch die Wellenlängenkalibrierung in Schritt 300 erhalten wurden, und ein Korrekturkoeffizient wurde der obigen Methode gemäß berechnet. Dann wurde die Elektrophorese der realen Probe durchgeführt und ein Vergleich durchgeführt, um zu sehen, wie sich ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den Kapillaren vor und nach Anwendung des obigen Korrekturkoeffizienten ändert.
(Versuchsergebnis)
5 zeigt ein Ergebnis des Versuchs. In 5 stellt die Vertikalachse die Fluoreszenzintensität dar, und die Horizontalachse stellt die Nummer jeder Kapillare dar. Jeder Punkt in den Zeichnungen zeigt die beobachtete Fluoreszenzintensität in jedem Amplifikationsprodukt an. Bei diesem Versuch waren, wie oben erwähnt, gleiche Mengen einer realen Probe im Probenbehälter angeordnet. Daher sollte die Fluoreszenzintensität zwischen den Kapillaren im Idealfall gleich sein.
In den Beobachtungsdaten vor der Korrektur (linke Seite) wurde jedoch ein nahezu doppelt so großer Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den Kapillaren festgestellt. Wie aus den Beobachtungswerten nach der Korrektur (rechte Seite) zu ersehen ist, wurde eindeutig nachgewiesen, dass dieser Unterschied in der Fluoreszenzintensität durch die Korrektur gemäß der vorliegenden Ausführungsform nivelliert werden kann.
(Modifikation 1)
Es folgt die Beschreibung der Modifikation 1 der ersten Ausführungsform. In der ersten Ausführungsform wird ein Korrekturkoeffizient k(nX) unter Verwendung von Daten berechnet, die während der Wellenlängenkalibrierung erhalten wurden (Schritt S300). In der Modifikation 1 dagegen wird eine Probe mit einer bekannten Konzentration mit dem Fluorophor X markiert und eine Elektrophorese veranlasst, und ein Korrekturkoeffizient k(nX) wird unter Verwendung der daraus resultierenden Fluroreszenzintensitätsdaten berechnet.
Angenommen, dass c(nX) eine DNA-Konzentration in einer Probe mit bekannter Konzentration ist, die zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten k(nX) verwendet wird. Hier ist n die Nummer jeder der Kapillaren 119-1 bis 4 und X die Art des Fluorophors. Ferner sei angenommen, dass avg(X) ein Durchschnittswert ist, der durch Mittelung der DNA-Konzentrationen c(nX) in den Kapillaren erhalten wird. Ferner wird ein Konzentrationsverhältnis r(nX) der DNA zwischen den Kapillaren als r(nX) = avg(X)/c(nX) definiert.
Wenn Int(nX) die Fluoreszenzintensität des Fluorophors X in jeder der Kapillaren 119 ist, lässt sich ein Korrekturkoeffizient k(nX) durch k(nX) = Int (yX)/{r(nX)×Int (nX)} berechnen. Wie in der ersten Ausführungsform ist y die Nummer der Kapillare, deren Fluoreszenzintensität am kleinsten ist.
Wenn ein Korrekturkoeffizient k(nX) wie oben beschrieben erhalten wird, ist es möglich, eine Korrektur wie in der ersten Ausführungsform vorzunehmen, indem die durch Messen einer realen Probe erhaltene Fluoreszenzintensität f(nX) mit diesem Korrekturkoeffizienten k(nX) multipliziert wird. In der obigen Beschreibung der Modifikation 1 wurde zur Berechnung des Korrekturkoeffizienten k(nX) ein Durchschnittswert der Konzentration c(nX) verwendet. Stattdessen kann zur Berechnung jedoch auch ein Maximalwert, ein Minimalwert oder ein Medianwert der Fluoreszenzintensität oder ein numerischer Wert einer bestimmten Kapillare verwendet werden.
(Modifikation 2)
Es folgt die Beschreibung der Modifikation 2 der ersten Ausführungsform. In der ersten Ausführungsform werden Daten, die während der Wellenlängenkalibrierung (Schritt S300) erhalten wurden, zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten k(nX) verwendet. Bei Modifikation 2 dagegen wird eine Probe mit einem bekannten Konzentrationsverhältnis mit dem Fluorophor X markiert, und eine Elektrophorese wird veranlasst. Die daraus resultieren Fluoreszenzintensitätsdaten werden zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten verwendet.
Angenommen, dass r(nX) ein Konzentrationsverhältnis der DNA ist, das zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten k(nX) verwendet wird, und Int(X) die Fluoreszenzintensität des Fluorophors X ist. Hier ist n die Nummer einer Kapillare und X die Art des Fluorophors. Ein Korrekturkoeffizient k(nX) lässt sich durch k(nX) = Int (yX)/{r(nX)×Int (nX)} berechnen. Wie in der ersten Ausführungsform ist y die Nummer der Kapillare, deren Fluoreszenzintensität am kleinsten ist.
Wenn ein Korrekturkoeffizient k(nX) wie oben beschrieben erhalten wird, ist es möglich, wie in der ersten Ausführungsform eine Korrektur durchzuführen, indem die durch Messen einer realen Probe erhaltene Fluoreszenzintensität f(nX) mit diesem Korrekturkoeffizienten k(nX) multipliziert wird.
(Modifikation 3)
Es folgt die Beschreibung der Modifikation 3 der ersten Ausführungsform. In der ersten Ausführungsform werden während einer spezifischen Wellenlängenkalibrierung (Schritt S300) erhaltene Daten zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten k(nX) verwendet. Dagegen wird in Modifikation 2, in Modifikation 3 der Korrekturkoeffizient anhand einer Vielzahl von Wellenlängenkalibrierungsdaten berechnet.
Wenn n die Nummer einer Kapillare ist, X die Art des verwendeten Fluorophors ist und die Wellenlängenkalibrierung m mal durchgeführt wird, wird ein Durchschnittswert Avg(nX) der Fluoreszenzintensität Int(nX) für n-mal erhalten. Unter den n Daten des Durchschnittswerts Avg(nX) wird eine Kapillare (Nummer y) bestimmt, in der die niedrigste Fluoreszenzintensität erhalten wurde, und deren Durchschnittswert Avg(yX) wird erhalten. Dadurch kann ein Korrekturkoeffizient k(nX) mit dem Fluorophor X als k(nX) = Avg(yX)/Avg(nX) bestimmt werden. Eine korrigierte Fluoreszenzintensität kann dann erhalten werden, indem die Fluoreszenzintensität f(nX) einer realen Probe, die mit dem Fluorophor X markiert wurde, mit dem Korrekturkoeffizienten k(nX) multipliziert wird. Hier wurde zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten ein Durchschnittswert verwendet, stattdessen kann jedoch auch ein Maximalwert, ein Minimalwert oder ein Medianwert verwendet werden.
[Zweite Ausführungsform]
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 6 beschrieben. Die Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform kann die gleiche Konfiguration wie in der ersten Ausführungsform (1) haben, und eine wiederholte Beschreibung wird ausgelassen. Auch die allgemeine Arbeitsweise (3) der Ausführungsformen ist im Wesentlichen gleich.
Die zweite Ausführungsform unterscheidet sich jedoch von der ersten Ausführungsform in einer Technik zur Berechnung von Korrekturkoeffizienten. Das heißt, in der ersten Ausführungsform wurde der Korrekturkoeffizient so berechnet, dass bei Verwendung des gleichen Fluorophors die Fluoreszenzintensitäten nach der Korrektur unter der Vielzahl von Kapillaren im Wesentlichen gleich sind oder die Schwankung in der Fluoreszenzintensität mindestens reduziert wird. In der zweiten Ausführungsform wird der Korrekturkoeffizient dagegen so bestimmt, dass die Fluoreszenzintensitäten unabhängig vom Unterschied in den Kapillaren oder im verwendeten Fluorophor für alle Kombinationen im Wesentlichen gleich sind oder die Schwankung in der Fluoreszenzintensität mindestens reduziert wird (eine erhebliche Schwankung auf ein vernachlässigbares Niveau reduziert wird). Dies wird Bezug nehmend auf 6 beschrieben.
Auch 6 veranschaulicht ein Beispiel für ein Kapillar-Array 106, das vier Kapillaren 119-1 bis 4 umfasst (6(a)). 6(b) und 6(c) zeigen eine Methode zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten, und 6(e) zeigt beispielhafte Zahlenwerte der Fluoreszenzintensität nach der Korrektur durch einen Korrekturkoeffizienten. Wie in 4 sind die Zahlenwerte in den Tabellen von 6(c) bis 6(e) hypothetische Werte zur Veranschaulichung, die sich nicht auf real gemessene Werte beziehen.
In 6(a) bis 6(c) wird, wie in 4, während der Wellenlängenkalibrierung (Schritt S300 in 3) vor Beginn der Analyse eine Signalintensität jeder der vier Kapillaren 119-1 bis 4 mit jeweiligen Fluorophoren gemessen. Die Schritte bis zu diesem Punkt sind die gleichen wie in der ersten Ausführungsform.
In der zweiten Ausführungsform wird unter den 12 Fluoreszenzintensitäten Int(nX), die für die Kombination der vier Kapillaren 119-1 bis 4 mit drei verschiedenen Fluorophor-Arten A bis C erhalten wurden, die Intensität Int (n₀X₀) mit dem kleinsten Wert bestimmt. In 6(c) ist Int(noXo) die Fluoreszenzintensität Int(1B), die durch Messen mit dem Fluorophor B in der Kapillare 119-1 erhalten wurde. n₀ ist die Nummer der Kapillare, in der die Fluoreszenzintensität am kleinsten ist, und X₀ ist die die Art des Fluorophors in dieser Kapillare mit der kleinsten Fluoreszenzintensität.
In der zweiten Ausführungsform wird ein Korrekturkoeffizient k(nX) auf der Basis dieser kleinsten Fluoreszenzintensität Int (n₀X₀) durch k(nX) = Int(n₀X₀)/Int(nX) berechnet. Das heißt, in der zweiten Ausführungsform wird die Korrektur nicht nur so durchgeführt, dass zwischen einer Vielzahl von Kapillaren kein Unterschied in der Fluoreszenzintensität auftritt, sondern auch so, dass zwischen einer Vielzahl von verschiedenen Fluorophor-Arten kein Unterschied in der Fluoreszenzintensität auftritt. Im Ergebnis wird die Korrektur so durchgeführt, dass die Fluoreszenzintensitäten für jede Kombination von Kapillaren und Fluorophoren im Wesentlichen gleich sind oder die Schwankung in der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu vor der Korrektur mindestens reduziert wird.
6(d) zeigt Beispiele für auf diese Weise berechnete Korrekturkoeffizienten k(nX), die erhalten wurden, indem die kleinste Fluoreszenzintensität Int(n₀X₀) durch eine Fluoreszenzintensität Int(nX) dividiert wird, wie in 6(c) gezeigt. Dem Korrekturkoeffizienten k(nX) in 6(d) gemäß kann eine korrigierte Fluoreszenzintensität f'(nX), wie in 6(e) gezeigt, erhalten werden, indem die Fluoreszenzintensität f(nX) einer realen Probe, die zum Beispiel mit einem Fluorophor X markiert ist, mit k(nX) multipliziert wird. Im Gegensatz zur ersten Ausführungsform sind alle Fluoreszenzintensitäten f'(nX) unabhängig von der Art der Fluorophore oder von der Art der Kapillaren auf 0,6 angeglichen.
[Dritte Ausführungsform]
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 7 beschrieben. Die Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung in der dritten Ausführungsform kann die gleiche Konfiguration wie in der ersten Ausführungsform (1) haben, und eine wiederholte Beschreibung wird ausgelassen. Auch die allgemeine Arbeitsweise (3) der Ausführungsformen ist im Wesentlichen gleich. Doch in der dritten Ausführungsform wird, statt einen Korrekturkoeffizienten k(nX) unter Verwendung eines tatsächlichen Messwerts der Fluoreszenzintensität Int(nX) zu berechnen, auf der Basis einer Anpassungskurve einer Verteilung der Fluoreszenzintensität Int(nX) ein Näherungswert bestimmt und anhand dieses Näherungswerts ein Korrekturkoeffizient k(nX) berechnet.
Eine Methode zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten in der dritten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 7 beschrieben. Hier wird als Beispiel ein Fall beschrieben, in welchem ein Kapillar-Array 106 mit 96 Kapillaren 119-1 bis 96 und zwei verschiedenen Fluorophor-Arten A, B verwendet werden ( 7(a) und 7(b)). Die Anzahl 96 ist ebenfalls nur beispielhaft, und es versteht sich, dass eine andere Anzahl möglich ist. 7(b) bis 7(e) veranschaulichen eine Methode zur Berechnung eines Näherungswerts und zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten auf der Basis dieses Näherungswerts. 7(f) zeigt beispielhafte Zahlenwerte der Fluoreszenzintensität nach der Korrektur durch einen Korrekturkoeffizienten. Die Zahlenwerte in den Tabellen von 7(c) bis 7(f) sind hypothetische Werte zur Veranschaulichung und beziehen sich nicht auf real gemessene Werte.
Nachdem, wie in der ersten Ausführungsform, anhand der Wellenlängenkalibrierungsdaten eine Fluoreszenzintensität Int(nX) erhalten wurde (7(b)), wird ein Streudiagramm mit der Entfernung einer Kapillare von der Lichtquelle 107 als Horizontalachse und der Fluoreszenzintensität Int(nX) als Vertikalachse erstellt (7(c)). Auf der Basis des erhaltenen Streudiagramms wird zum Beispiel durch die Methode der kleinsten Quadrate eine Anpassungskurve Ca, Cb mit den Fluorophoren A, B für die jeweilige Fluoreszenzintensität Int(nA), Int(nB) erhalten. Anhand dieser Anpassungskurven Ca, Cb wird für jede Kapillare und jedes Fluorophor ein Näherungswert Int(nX') der Fluoreszenzintensität berechnet ( ).
Wenn in einer Kapillare mit der Nummer n ein Näherungswert Int(nX') des Fluorophors X (A oder B) erhalten wird, wie zum Beispiel in 7(d), lässt sich ein Korrekturkoeffizient k(nX) durch k(nX) = Int (yX')/Int (nX') berechnen (7(e)). Hier gibt Int(yX') den minimalen Näherungswert an, der unter den Messungen mit dem Fluorophor X (A oder B) der kleinste ist. Die Verwendung dieses Korrekturkoeffizienten k(nX) ermöglicht die Korrektur eines tatsächlich gemessenen Werts f(nX) einer realen Probe ( 7(f)). Im Beispiel von 7 (7(d)) wird der kleinste Näherungswert Int(yX') für beide Fluorophore A, B in der ersten Kapillare 119-1 erhalten. Das heißt, ein Näherungswert Int(yA') = Int(1A') = 1,15 und Int(yB') = Int(1B') = 0,65.
[Vierte Ausführungsform]
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der vierten Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 8 beschrieben. Die Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung in der vierten Ausführungsform kann die gleiche Konfiguration wie in der ersten Ausführungsform (1) haben, und eine wiederholte Beschreibung wird ausgelassen. Auch die allgemeine Arbeitsweise (3) der Ausführungsformen ist im Wesentlichen gleich. Von den obigen Ausführungsformen unterscheidet sich die vierte Ausführungsform jedoch in der Technik zur Lichtdetektion im Photodetektor 104 und durch die Methode zur Berechnung des Korrekturkoeffizienten.
Das heißt, in den obigen Ausführungsformen wurde zur Messung der Fluoreszenzintensität eine Probe verwendet, die mit dem gleichen Fluorophor markiert war wie eine reale Probe, und ein Korrekturkoeffizient wurde auf der Basis des Messergebnisses berechnet. Dagegen wird in der vierten Ausführungsform eine Vielzahl von Kapillaren 119, die mit einer gleichen Substanz (zum Beispiel Puffer oder einer anderen Substanz (z. B. Wasser)) gefüllt sind, mit Anregungslicht bestrahlt, und die Intensität ihres Raman-Lichts wird mit dem Photodetektor 104 gemessen, um einen Korrekturkoeffizienten zu berechnen. Dies wird Bezug nehmend auf 8 beschrieben. Ein Beispiel für eine Substanz, mit der die Kapillaren 119 gefüllt werden, um die Intensität des Raman-Lichts zu messen, ist Puffer. Im Folgenden wird hauptsächlich ein Fall beschrieben, in welchem Raman-Licht von einem Puffer gemessen wird, die gleiche Wirkung kann jedoch auch durch Messung des Raman-Lichts von einer anderen Substanz als Puffer erreicht werden.
Zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten werden die Kapillaren 119-1 bis 4 mit einem Puffer gefüllt, und dann wird die Photobestrahlungseinheit 108 mit Laserlicht von der Lichtquelle 107 bestrahlt. Dann wird an jeder der Kapillaren 119-1 bis 4 die Raman-Lichtintensität Int(nX) (n = 1 bis 4) bei einer bestimmten Wellenlänge X gemessen. Wenn die Kapillaren 119-1 bis 4 mit dem gleichen Puffer gefüllt wurden, müsste die erhaltene Raman-Lichtintensität Int(nX) unter den Kapillaren im Idealfall im Wesentlichen gleich sein. Aufgrund der konfigurationsbedingten Schwankung in den Kapillaren 119-1 bis 4 kann jedoch eine erhebliche Schwankung der Raman-Lichtintensität Int(nX) in den Kapillaren 119-1 bis 4 auftreten (siehe 4(b)).
Dann wird unter den Raman-Lichtintensitäten Int(nX), die in den einzelnen Kapillaren 119-1 bis 4 erhalten wurden, diejenige mit der niedrigsten Signalintensität als die niedrigste Raman-Lichtintensität Int(yX) bestimmt. In 8(c) wird eine Raman-Lichtintensität Int(2X) der zweiten Kapillare 119-2 als Int(2X) = Int(yX) = 1,1 bestimmt.
Ein Korrekturkoeffizient k(n) auf der Basis dieser niedrigsten Raman-Lichtintensität Int(yX) wird für jede der Kapillaren 119-1 bis 4 durch k(n) = Int(yX)/Int(nX) berechnet ( 8(d)). Die berechneten Korrekturkoeffizienten k(n) werden in der Korrekturindex-Datenbank 1035 gespeichert.
Nachdem ein Korrekturkoeffizient k(n) wie oben beschrieben erhalten wurde, wird die Elektrophorese einer zu analysierenden Probe (nachstehend als „reale Probe“ bezeichnet) veranlasst, um eine Fluoreszenzintensität f(nX) zu erhalten. Indem diese Fluoreszenzintensität f(nX) mit einem Korrekturkoeffizienten k(n) multipliziert wird, der wie in 8(d) gezeigt erhalten wird, wird eine korrigierte Fluoreszenzintensität f' (nX) erhalten, wie in 8(e) gezeigt. Eine unkorrigierte Fluoreszenzintensität f(nX) unterliegt Schwankungen, selbst wenn eine gleiche Probe mit einem gleichen Fluorophor gemessen wird. Indem sie mit einem Korrekturkoeffizienten k(n) multipliziert werden, können die korrigierten Fluoreszenzintensitäten f'(nX), einen Wert haben, der unter den Kapillaren 119-1 bis 4 im Wesentlichen gleich ist, wie in 8(e) gezeigt. Das heißt, es ist möglich, unabhängig von der konfigurationsbedingten Schwankung der Kapillaren unter gleichen Bedingungen eine Fluoreszenzintensität zu erhalten, die unter den Kapillaren im Wesentlichen gleich ist.
[Fünfte Ausführungsform]
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der fünften Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 9 beschrieben. Wie die vierte Ausführungsform ist die fünfte Ausführungsform dazu konfiguriert, einen Korrekturkoeffizienten auf der Basis einer Raman-Lichtintensität zu berechnen. Die Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung in der fünften Ausführungsform kann die gleiche Konfiguration haben wie in der ersten Ausführungsform (1), und eine wiederholte Beschreibung wird ausgelassen. Auch die allgemeine Arbeitsweise (3) der Ausführungsformen ist im Wesentlichen gleich. In der vierten Ausführungsform wurde zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten eine Signalintensität an der Position eines Peaks in der Signalintensitätsverteilung des Raman-Lichts von einem Puffer verwendet. Dagegen wird in der fünften Ausführungsform zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten die Signalintensität einer Vielzahl von Wellenlängen verwendet, die in einer Signalintensitätsverteilung des Raman-Lichts eines Puffers enthalten sind. Dies wird Bezug nehmend auf 9 beschrieben.
Auch 9 veranschaulicht ein Beispiel für ein Kapillar-Array 106, das vier Kapillaren 119-1 bis 4 umfasst (9(a)). 9(b) bis 9(d) stellen eine Methode zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten dar.
Wie in der vierten Ausführungsform werden zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten die Kapillaren 119-1 bis 4 mit einem Puffer gefüllt, und dann wird Laserlicht von der Lichtquelle 107 zur Photobestrahlungseinheit 108 geleitet. Wie zum Beispiel in 9(b) gezeigt, ist eine Intensitätsverteilung P3 des Raman-Lichts vom Puffer eine Verteilung, die sich über einen breiteren Wellenlängenbereich hinweg erstreckt als die Intensitätsverteilungen P1, P2 der Fluoreszenz, die von einem Fluorophor emittiert wird.
In dieser fünften Ausführungsform wird an jeder der Kapillaren 119-1 bis 4 die Raman-Lichtintensität Int(nA), Int(nB) (n = 1 bis 4) mit der Wellenlänge Aa, Ab einer Raman-Lichtintensitätsverteilung P3 gemessen. Diese Wellenlängen Aa, Ab sind die Fluoreszenzwellenlängen der Fluorophore A, B, mit denen eine reale Probe markiert ist. Wenn die Intensitätsverteilung P3 des Raman-Lichts von einem Puffer die Fluoreszenzwellenlängen Aa, Ab von Fluorophoren, mit denen eine reale Probe markiert ist, überlappt, wie in 9(b) gezeigt, wird eine Intensität Int(nA), Int(nB) (n= 1 bis 4) des Raman-Lichts des Puffers bei den Fluoreszenzwellenlängen Aa, Ab gemessen und auf der Basis der Raman-Lichtintensität Int(nA), Int(nB) ein Korrekturkoeffizient k(nA), k(nB) berechnet. Dadurch kann eine Fluoreszenzintensität einer realen Probe genauer korrigiert werden.
Wenn die Raman-Lichtintensität Int(nA), Int(nB) (n = 1 bis 4) für jede der Kapillaren 119-1 bis 4 berechnet wird, wird dann unter Int(nA), Int(nB) diejenige, die den kleinsten Wert hat, als niedrigste Raman-Lichtintensität Int(yA), Int(yB) definiert. Im Beispiel in 9(c) ist eine Raman-Lichtintensität Int(2A) der Kapillare 119-2 die niedrigste Raman-Lichtintensität Int(yA) in Bezug auf das Fluorophor A; und eine Raman-Lichtintensität Int(1B) der Kapillare 119-1 ist die niedrigste Raman-Lichtintensität Int(yB) in Bezug auf das Fluorophor B.
Ein Korrekturkoeffizient k(nA), k(nB) wird auf der Basis dieser niedrigsten Raman-Lichtintensität Int(yA), Int(yB) durch k(nA) = Int(yA)/Int(nA), k(nB)=Int(yB)/Int(nB) berechnet. Die Fluoreszenzintensität des Fluorophors A, B wird auf geeignete Weise korrigiert, indem die Fluoreszenzintensität f(nX) einer mit dem Fluorophor X markierten realen Probe mit dem auf diese Weise erhaltenen Korrekturkoeffizienten k(nA), k(nB) multipliziert wird.
[Sechste Ausführungsform]
Eine Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der fünften Ausführungsform wird Bezug nehmend auf 10 beschrieben. In der ersten Ausführungsform wurde ein Korrekturkoeffizient auf der Basis einer Fluoreszenzintensität berechnet, die durch eine andere Elektrophorese als die Elektrophorese einer realen Probe erhalten wurde (z. B. Schritt S300 in 2). Dagegen ist die Vorrichtung in der sechsten Ausführungsform dazu konfiguriert, einen Korrekturkoeffizienten anhand der Fluoreszenzintensität zu berechnen, die durch Elektrophorese einer realen Probe erhalten wurde. Dies wird Bezug nehmend auf 10 beschrieben.
In 10 wird der Einfachheit halber ein Kapillar-Array 106 beschrieben, das vier Kapillaren 119-1 bis 4 umfasst ( 10(a)). 10(b) bis 10(d) zeigen eine Methode zur Berechnung eines Korrekturkoeffizienten, und 10(e) zeigt beispielhafte Zahlenwerte der Fluoreszenzintensität nach der Korrektur mit einem Korrekturkoeffizienten. Die Zahlenwerte in den Tabellen in 10(c) bis 10(e) sind hypothetische Werte zur Veranschaulichung und beziehen sich nicht auf real gemessene Werte.
Zuerst wird ein Referenzstandard, der mit dem gleichen Fluorophor markiert ist wie ein Fluorophor, das zur Markierung einer realen Probe verwendet wird, mit der realen Probe gemischt. Eine Elektrophorese der mit dem Referenzstandard gemischten realen Probe wird durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität der realen Probe wird wie gewöhnlich gemessen. In diesem Prozess wird jedoch auch die Fluoreszenzintensität des Referenzstandards gemessen. Dabei muss der Referenzstandard in den Elektrophoresesdaten zeitlich und räumlich von der realen Probe zu unterscheiden sein. Wie in 10(b) gezeigt, ist es zum Beispiel notwendig, eine Elektrophoresessteuerung durchzuführen, indem der Referenzstandard so mit der realen Probe gemischt wird, dass ein Peak T1 der Fluoreszenzintensität der realen Probe sich zeitlich von einem Peak R der Fluoreszenzintensität des Referenzstandards unterscheidet.
Nach der Farbkonversion (entspricht dem Schritt S310 in 2) ist Intr(nX) die beobachtete Fluoreszenzintensität des Referenzstandards. Hier ist n die Nummer einer Kapillare und X der Typ eines Fluorophors. Unter den erhaltenen Fluoreszenzintensitäten Intr (1X), Intr(2X), Intr(3X), Intr(4X) der vier Referenzstandards wird diejenige, die den kleinsten Wert hat, als niedrigste Fluoreszenzintensität Intr(yX) definiert. Im Beispiel in 10(c) ist die Fluoreszenzintensität Intr(3X) der Kapillare 119-3 die niedrigste Fluoreszenzintensität Intr(yX).
Wenn die niedrigste Fluoreszenzintensität erhalten wurde, wird ein Korrekturkoeffizient k(nX) wie in den obigen Ausführungsformen durch k(nX) = Int(yX)/Int(nX) berechnet. Wie bei den obigen Ausführungsformen kann zur Berechnung statt eines Minimalwerts (niedrigste Fluoreszenzintensität) auch ein Durchschnittswert, ein Maximalwert oder ein Medianwert der Fluoreszenzintensität verwendet werden. Ein Intensitätsunterschied zwischen Fluorophoren kann durch Anwendung des Korrekturkoeffizienten korrigiert werden, das heißt, indem die Fluoreszenzintensität f(nX) einer realen Probe mit k(nX) multipliziert wird.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die obigen Ausführungsformen beschränkt und schließt verschiedene Modifikationen ein. Zum Beispiel wurden die obigen Ausführungsformen im Detail beschrieben, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, und die vorliegende Erfindung muss nicht unbedingt alle beschriebenen Konfigurationselemente enthalten. Ein Teil der Konfigurationselemente einer Ausführungsform kann durch ein Konfigurationselement einer anderen Ausführungsform ersetzt werden, und ein Konfigurationselement einer Ausführungsform kann auch zu einer Konfigurationselementen einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Einige Konfigurationselemente jeder Ausführungsform können gestrichen werden, und andere Konfigurationselemente können hinzugefügt werden und diese ersetzen. Alle obigen Konfigurationselemente, Funktionen, Verarbeitungseinheiten, Verarbeitungsmittel und dergleichen können teilweise oder ganz durch Hardware implementiert werden, zum Beispiel, indem sie in integrierte Schaltungen entworfen werden.
Bezugszeichenliste

101: Gerätehauptkörper,
102: Steuerrechner,
103: Arithmetische Steuerschaltung,
104: Photodetektor,
105: Thermostatisches Bad,
106: Kapillar-Array,
107: Lichtquelle,
108: Photobestrahlungseinheit,
109: Ladekopf,
110: Kathodenende der Kapillaren,
111: Kathodenpufferbehälter,
112: Probenbehälter,
113: Polymerkartusche,
114: Anodenpufferbehälter,
115: Anode,
116: Gleichstrom-Stromversorgung,
117: Array-Kopf,
118: Förderer,
119: Kapillare,
120: Spritzenmechanismus,
121: Spitze,
122: Oberteil der Polymer-Patrone,
123: Heiz- und Kühlmechanismus,
201: Laserlicht,
202: Reflexionsspiegel,
203: Kondensorlinse

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

JP 2012168138 [0007]
JP 2016176764 [0007]

Claims

Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung, umfassend: ein Kapillar-Array, das durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren gebildet wird; eine Lichtquelle, die die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt; einen Photodetektor, der die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren detektiert; und eine arithmetische Steuereinheit, die eine dem Signal vom Photodetektor entsprechende Signalintensität der Fluoreszenz berechnet, wobei die arithmetische Steuereinheit dazu konfiguriert ist, die Signalintensität einem Korrekturindex entsprechend zu korrigieren, der für jede Kombination der Kapillaren mit einem Fluorophor, mit dem die Probe markiert ist, bestimmt wurde.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei, wenn der Korrekturindex auf eine Signalintensität angewandt wird, die durch Messen einer realen Probe erhalten wurde, die arithmetische Steuereinheit den Korrekturindex so einstellt, dass die Schwankung in der Signalintensität unter den Kapillaren nach Anwendung des Korrekturindexes im Vergleich zur Schwankung in der Signalintensität unter den Kapillaren vor Anwendung des Korrekturindexes reduziert wird.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei die arithmetische Steuereinheit die Signalintensität auf der Basis eines Korrekturindexes korrigiert, der für jede Kombination einer Vielzahl von Kapillaren mit einer Vielzahl von Fluorophor-Arten bestimmt wurde.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, außerdem umfassend: eine Korrekturindex-Berechnungseinheit, die den Korrekturindex berechnet, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit den Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität berechnet, die erhalten wurde, indem für die Kapillaren gleiche Bedingungen hergestellt werden und die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren gemessen wird.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit eine Signalintensität, die an einer der Kapillaren erhalten wurde, als Bezugswert nimmt und als Korrekturindex einen Wert berechnet, der erhalten wird, indem ein Wert der Signalintensität, der an jeder der Kapillaren erhalten wurde, durch diesen Bezugswert dividiert wird.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit auf der Basis einer Anpassungskurve einer Verteilung der Signalintensität einen Näherungswert der Signalintensität berechnet und den Korrekturindex auf der Basis des Näherungswerts berechnet.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit den Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität der Fluoreszenz berechnet, die erhalten wird, indem in den Kapillaren eine Elektrophorese einer bekannten Probe veranlasst wird, die mit dem gleichen Fluorophor markiert ist wie ein Fluorophor, mit dem eine reale Probe markiert wird.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung, umfassend: ein Kapillar-Array, das durch Anordnen einer Vielzahl von Kapillaren gebildet wird; eine Lichtquelle, die die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt; einen Photodetektor, der die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren detektiert; eine arithmetische Steuereinheit, die dazu konfiguriert ist, eine Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal vom Photodetektor entsprechend zu berechnen und die Signalintensität einem Korrekturindex, der für jede der Kapillaren bestimmt wurde, entsprechend zu korrigieren; und eine Korrekturindex-Berechnungseinheit, die den Korrekturindex berechnet, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit die Kapillaren mit Anregungslicht bestrahlt, Raman-Licht misst und den Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität dieses Raman-Lichts berechnet.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Korrekturindex-Berechnungseinheit eine Signalintensität bei einer spezifischen Wellenlänge verwendet, die in einer Signalintensitätsverteilung des Raman-Lichts enthalten ist, um den Korrekturindex zu berechnen.
Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 9, wobei die spezifische Wellenlänge eine Fluoreszenzwellenlänge einer Vielzahl von Fluorophor-Arten ist, mit denen eine realen Probe markiert ist.
Verfahren zur Probenanalyse zum Analysieren einer Probe unter Verwendung einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung, die mit einer Vielzahl von Kapillaren versehen ist, umfassend die folgenden Schritte: Bewirken der Elektrophorese der Probe über eine Vielzahl von Kapillaren; Detektieren der durch Bestrahlen der Kapillaren mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz unter Verwendung eines Photodetektors; Berechnen der Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal des Photodetektors entsprechend; und Korrigieren einer Signalintensität der Fluoreszenz einem Korrekturindex entsprechend, der für jede Kombination der Kapillaren mit einem Fluorophor, mit dem die Probe markiert ist, bestimmt wurde.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 11, wobei, wenn der Korrekturindex auf eine Signalintensität angewandt wird, die durch Messen einer realen Probe erhalten wurde, der Korrekturindex so eingestellt wird, dass die Schwankung in der Signalintensität unter den Kapillaren nach Anwendung des Korrekturindexes im Vergleich zur Schwankung der Signalintensität unter den Kapillaren vor Anwendung des Korrekturindexes reduziert wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 11, wobei der Korrekturindex für jede Kombination der Kapillaren mit einer Vielzahl von Fluorophoren-Arten bestimmt wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 11, außerdem umfassend den Schritt des: Berechnens des Korrekturindexes, wobei im Schritt des Berechnens des Korrekturindexes der Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität berechnet wird, die erhalten wird, indem für die Kapillaren gleiche Bedingungen hergestellt werden und die Fluoreszenz von einer Probe in den Kapillaren gemessen wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 14, wobei im Schritt des Berechnens des Korrekturindexes eine Signalintensität, die an einer der Kapillaren erhalten wurde, als Bezugswert genommen wird und als Korrekturindex ein Wert berechnet wird, der erhalten wird, indem ein Wert der Signalintensität, der an jeder der Kapillaren erhalten wurde, durch diesen Bezugswert dividiert wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 14, wobei im Schritt des Berechnens des Korrekturindexes auf der Basis einer Anpassungskurve einer Verteilung der Signalintensität ein Näherungswert der Signalintensität berechnet wird und der Korrekturindex auf der Basis des Näherungswerts berechnet wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 14, wobei im Schritt des Berechnens des Korrekturindexes der Korrekturindex auf der Basis einer Signalintensität der Fluoreszenz berechnet wird, die erhalten wird, indem in den Kapillaren eine Elektrophorese einer bekannten Probe durchgeführt wird, die mit dem gleichen Fluorophor markiert ist wie ein Fluorophor, mit dem eine reale Probe markiert ist.
Verfahren zur Probenanalyse zum Analysieren einer Probe unter Verwendung einer Multikapillar-Elektrophoresevorrichtung, die mit einer Vielzahl von Kapillaren versehen ist, umfassend die folgenden Schritte: Bewirken der Elektrophorese der Probe über eine Vielzahl von Kapillaren; Detektieren der durch Bestrahlen der Kapillaren mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz unter Verwendung eines Photodetektors; Berechnen der Signalintensität der Fluoreszenz einem Signal vom Photodetektor entsprechend; Bestrahlen der Kapillaren mit Anregungslicht, Messen des Raman-Lichts und Berechnen eines Korrekturindexes auf der Basis einer Signalintensität dieses Raman-Lichts; und Korrigieren einer Signalintensität der Fluoreszenz dem Korrekturindex entsprechend.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 18, wobei im Schritt des Berechnens des Korrekturindexes eine Signalintensität bei einer spezifischen Wellenlänge, die in einer Signalintensitätsverteilung des Raman-Lichts enthalten ist, zur Berechnung des Korrekturindexes verwendet wird.
Verfahren zur Probenanalyse nach Anspruch 19, wobei die spezifische Wellenlänge eine Fluoreszenzwellenlänge einer Vielzahl von Fluorophor-Arten ist, mit denen eine reale Probe markiert ist.