DE3821454A1 - Verfahren zur aufbereitung gebrauchter elektrophorese-gele fuer die wiederverwendung - Google Patents
Verfahren zur aufbereitung gebrauchter elektrophorese-gele fuer die wiederverwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zur Aufbereitung gebrauchter Elektrophorese-Gele, die
Einsatz in der Trennung Fluoreszenz-markierter Desoxyribonucleinsäuren
(DNA), Ribonucleinsäuren (RNA) oder Proteine
finden.
Bisher werden DNA etc. dadurch getrennt, daß man sie der
Gel-Elektrophorese unterwirft. Die Bestimmung der getrennten
Produkte wird anschließend mit Hilfe Radioisotopen-
markierter oder Fluoreszenz-markierter DNA etc.
durchgeführt (wie beispielsweise aus der offengelegten
japanischen Patentanmeldung (Kokai) No. 61-62 843 ersichtlich).
In diesem Fall verbleibt die markierte Probe
nach Abschluß der Trennung und Bestimmung im Elektrophorese-
Gel. Dieses kann daher nicht wiederholt verwendet
werden. Dies bedeutet, daß Elektrophorese-Gele vor jeder
Trennung und Bestimmung gesondert hergestellt werden
müssen.
Vor kurzer Zeit kam ein verwerfbares (wegwerfbares) Gel
zur Trennung Radioisotopen-markierter Proben in den
Handel, wobei das Gel auf einen Film als Träger aufgetragen
ist. Durch die Verwendung einer solchen Anordnung
kann der Verfahrensschritt der jeweiligen Gelherstellung
eingespart werden. Allerdings kann das wegwerfbare Gel
für Bestimmungen mit Licht nicht verwendet werden, weil
bei Bestrahlung des Gels mit Licht zur Auslösung einer
beobachtbaren Fluoreszenz von dem Film selbst eine starke
Fluoreszenz emittiert wird. Diese stört die Fluoreszenz,
die von der Fluroreszenz-markierten DNA emittiert wird.
Dadurch ist es deutlich schlechter möglich, die von der
Fluoreszenz-markierten DNA emittierte Fluoreszenz zu
beobachten (beziehungsweise zu messen).
Wie es scheint, verlagert sich das Schwergewicht von Verfahren
zur Sequenzierung von DNA oder RNA oder von Verfahren
zur Proteinbestimmung von den konventionellen Verfahren
unter Einsatz von Markierung mit Radioisotopen auf
die Verfahren unter Fluoreszenz-Markierung. Allerdings
wurden bisher weder die Entwicklung eines verwerfbaren
fertigen Gels für ein Fluoreszenz-Markierungsverfahren,
noch die Regenerierung und Wiederverwendung des Gels vorgeschlagen.
Demzufolge muß das Gel bei Gelegenheit jeder
Trennung und Bestimmung frisch hergestellt werden. Dies
erfordert einen beschwerlichen Verfahrensschritt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein
Verfahren zur Wiederaufbereitung von Elektrophorese-Gelen
für die Wiederverwendung bereitzustellen, wobei ein Gel,
sobald es einmal hergestellt wurde, wiederholt verwendet
werden kann. Dabei wird der Verfahrensschritt der Herstellung
des Gels bei jeder Gelegenheit der Trennung und
Bestimmung, die auf der Basis einer Fluoreszenz-Markierung
durchgeführt wird, eingespart.
Diese Aufgabe kann überraschenderweise dadurch gelöst
werden, daß man einen leicht photo-dissoziierbaren Stoff
als Fluorophor verwendet und die im Gel verbliebene
Fluoreszenz-markierte DNA etc. nach der Bestimmung mit
Licht bestrahlt. Dadurch wird das Fluorophor zu einem
Stoff abgebaut, der nicht in der Lage ist, Fluoreszenz zu
emittieren.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Aufbereitung
von Elektrophorese-Gelen für die Wiederverwendung,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Elektrophorese-
Gele, die bei der elektrophoretischen Trennung von mit
einem Fluorophor markierten Proben und bei der Bestimmung
der von der durch Elektrophorese getrennten Probe emittierten
Fluoreszenz verwendet wurden, mit Licht bestrahlt
und dadurch das in dem Gel verbliebene Fluorophor photodissoziiert
und das bestrahlte Gel wieder verwendet.
Im allgemeinen emittieren Fluorophore, wenn sie mit Licht
bestrahlt werden, infolge der Anregung Fluoreszenz und
photo-dissoziieren gleichzeitig. Die Fähigkeit unter
Lichteinfluß zu dissoziieren (zu photo-dissoziieren),
hängt von der Art des Fluorophoren ab. Es gibt leicht
photo-dissoziierbare Fluorophore, beispielsweise Fluorescein-
Isothiocyanat (FITC; Wellenlänge des Lichtes für die
Anregung: 494 nm; Wellenlänge des emittierten
Lichtes: 511 nm). Wenn Desoxyribonucleinsäuren (DNA) etc.
mit einem derartigen leicht photo-dissoziierbaren Fluorophor
markiert und danach durch Gel-Elektrophorese getrennt
und bestimmt werden, zerfällt die Fluoreszenz-markierte
Probe, die nach der Bestimmung im Gel verbleibt,
bei starker Bestrahlung mit Licht und emittiert weiter
keine Fluoreszenz mehr. Obwohl die DNA etc. im Gel
verbleiben, können sie nicht mehr durch Bestrahlung mit
Licht emittiert werden. Aus diesem Grunde kann das Gel
für die Trennung und Bestimmung wiederverwendet werden.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die
Zeichnungen im einzelnen erläutert.
Fig. 1 zeigt eine schematische Ansicht einer Ausführungsform
gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht der in Fig. 1
dargestellten Ausführungsform.
Eine besondere, bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird nun im einzelnen unter Bezugnahme auf
die Fig. 1 und 2 beschrieben. Gegenstand dieser Ausführungsform
ist die Sequenzierung Fluoreszenz-markierter
DNA.
Auf einzelnen Spuren einer Elektrophorese-Gel-Platte 10
läßt man vier Arten von Fragmenten (A), (T), (C) und (G)
wandern. Diese Fragmente sind jeweils mit Fluorescein-
Isothiocyanat (FITC) an einem Ende markiert und enden
jeweils an ihrem anderen Ende mit Adenin (A), Thymin (T),
Cytosin (C) und Guanin (G).
Die Platte 10 ist sandwichartig zwischen Quarzplatten 11
zur Stützung des Gels eingelegt und an den beiden seitlichen
Enden mit Abstandshaltern 12 versehen. Ein für die
Bestimmung der Fragmente vorgesehener Bereich der Platte
10, der um eine vorher bestimmte Strecke vom Ausgangspunkt
der Wanderung der Fragmente entfernt ist, wird mit
einem Laserstrahl 9 zur Anregung der Fluorophore bestrahlt.
Der Laserstrahl 9 wird durch einen Generator 3
erzeugt. Die Fluoreszenz-markierte DNA 7 passiert den für
die Bestimmung vorgesehenen Bereich der Platte 10.
Von der Fluoreszenz-markierten DNA 7 emittierte Fluoreszenz
wird zu einer eine Photodiode enthaltenden Anordnung
16 durch ein Filter 13, eine Fokussierungslinse 14 und
einen Verstärker 15 geleitet.
Je kürzer das DNA-Fragment ist, desto weiter (schneller)
wandert es auf dem Gel. Die Basenzahl kann also über die
Zeit der Emission bestimmt werden, und die Art der Basen
kann über die Identifikation der Laufstrecken bestimmt
werden. Die Basensequenz läßt sich also aus der Basenzahl
und der Art der Basen bestimmen.
Als Anregungs-Lichtquelle 3 für die Bestimmung der Basensequenz
wird ein Argon-Laser (488 nm; 10 mW) verwendet.
Üblicherweise beträgt die Wanderungsdauer 5 bis 6 Stunden.
Dabei kann die Sequenz einer DNA mit bis zu 300
Basen bestimmt werden.
Fluoreszenz-markierte, lange DNA-Fragmente verbleiben im
Bereich zwischen dem Ausgangspunkt der Wanderung und dem
mit Licht bestrahlten Bereich der Bestimmung der Fragmente
nach Abschluß der Messung. Dies stellt eine schwerwiegende
Störung für die Bestimmung der nachfolgenden Proben
dar, da sich die Signale der im Gel verbliebenen Proben
der vorangehenden Bestimmung und die Signale der neuen
Proben überlagern. Um diese Störung zu beseitigen, wird
ein Argonlaser (488 nm; ungefähr 1 W) aus einer Laserlicht-
Quelle 4 auf eine Fläche mit einem Durchmesser von
ungefähr 1 mm fokussiert und als Laserstrahl in die
Gelplatte 10 von der Seite her eingeführt. Dies dient zur
Photodissoziation des Fluorophoren, das nach der Messung
im Gel verblieben ist. Die Einführung des Laserstrahls 8
in die Gelplatte 10 erfolgt über einen Umlenk-Spiegel 5
und einen beweglichen Spiegel 6. Durch die Bestrahlung
der Gelplatte 10 mit dem Laserstrahl 8 wird das FITC abgebaut.
Bei der Bestrahlung wird der bewegliche Spiegel 6
bewegt, um die gesamte Gelplatte 10 zu überstreichen. Die
so behandelte Elektrophorese-Gelplatte 10 kann wiederverwendet
werden.
Allerdings hat diese Anwendung Grenzen hinsichtlich des
Dissoziations-Wirkungsquerschnitts (σ) des markierenden
Stoffes und hinsichtlich der Intensität des Lasers. Diese
Grenzen wurden untersucht. Für FITC wurde der Dissoziations-
Wirkungsquerschnitt (σ) bestimmt; er beträgt ungefähr
σ = 0,5 × 10-20 cm².
Der Dissoziations-Wirkungsquerschnitt (σ) kann durch
die nachfolgende Gleichung definiert werden:
-dc = C · σ · ρ dt,
worin die einzelnen Parameter folgende Bedeutung haben:
C = Konzentration des Fluorophoren;
dC = Dissoziationsgeschwindigkeit des Fluorophoren pro Zeiteinheit;
ρ = Photonendichte.
dC = Dissoziationsgeschwindigkeit des Fluorophoren pro Zeiteinheit;
ρ = Photonendichte.
Durch Auflösen der obigen Gleichung kann die nachfolgende
Gleichung erhalten werden:
C = C o · e- σρ t ,
worin die einzelnen Parameter folgende Bedeutung haben:
C o = Konzentration zum Zeitpunkt t = 0;
t = (σ · ρ)-1: Zeit, in der die Konzentration den Wert e -1 erreicht; dies entspricht ungefähr der mittleren Lebensdauer des Stoffes.
t = (σ · ρ)-1: Zeit, in der die Konzentration den Wert e -1 erreicht; dies entspricht ungefähr der mittleren Lebensdauer des Stoffes.
Wenn ein Argonlaser mit einer Leistung von 1 W auf eine
Fläche von 1 mm² fokussiert gerichtet wird, beträgt die
Photonendichte ρ = 2,5 × 1019 Photonen/mm² · s. Aus dem
Dissoziations-Wirkungsquerschnitt σ und der Photonendichte
kann berechnet werden, daß die Zeit, in der die
FITC-Konzentration den Wert e -1 erreicht, also die
mittlere Lebensdauer, ungefähr bei 0,1 s liegt. Um das
Fluorophor in einem solchen Ausmaß zu dissoziieren, daß
seine Konzentration vernachlässigt werden kann, muß die
Bestrahlung für eine Zeit von ungefähr 0,5 s/mm durchgeführt
werden. Bei einer Bestrahlungszeit von 0,5 s kann
die Konzentration auf einen Wert von e -5, d. h. ungefähr
6 × 10-3, abgesenkt werden.
Die restlichen, mit FITC markierten Proben sind über den
gesamten Bereich der Wanderungsstrecken verteilt. Es ist
jedoch nicht erforderlich, die Proben auf den gesamten
Wanderungsstrecken zu dissoziieren. Es führt zu befriedigenden
Ergebnissen, die Fluorophore zu dissoziieren, die
im Bereich zwischen dem Startpunkt der Wanderung und der
Laser-bestrahlten Fläche zur Bestimmung der Fragmente
verbleiben. Wenn die Entfernung zwischen diesen beiden
Punkten 200 mm beträgt und wenn die Geschwindigkeit des
Abtastens mit dem Laserstrahl bei 2 mm/s liegt, beträgt
die Zeit für das Abtasten 100 s. Wenn eine preiswerte
Lichtquelle der 100 mW-Klasse als Laserlicht-Quelle verwendet
wird, liegt die Zeit für das Abtasten bei 1000 s,
d. h. bei ungefähr 20 Minuten. Längstens darf die Abtast-
Zeit für die Dissoziation der Fluorophoren eine
Stunde betragen. Wenn die Abtastzeit länger ist als 1
Stunde, ist es sinnvoller, eine neue Gelplatte herzustellen,
da diese schneller hergestellt ist, als es einer
derart langen Abtastzeit entspricht.
Im Lichte dieser Situation sollte für die Bestrahlung
eine Laserlicht-Quelle ausgewählt werden, deren Stärke
bei wenigsten 40 mW liegt. Je kleiner der Dissoziations-
Wirkungsquerschnitt (σ) ist, desto länger muß die
Abtastzeit sein. Die untere Grenze des Dissoziations-Wirkungsquerschnittes
liegt deshalb bei 10-22 cm². Dabei
benötigt die für die Dissoziation ausreichende Bestrahlung
mit einem Laser eine Stärke von 1 W eine Zeit von 20
s/mm. Es wird daher ungefähr 1 Stunde Zeit benötigt, bis
die Dissoziation vollständig erfolgt ist.
Andererseits ist ein zu großer Wert des Dissoziations-
Wirkungsquerschnittes störend. Der Wirkungsquerschnitt
der Fluoreszenz-Emission liegt üblicherweise im Bereich
von ungefähr 10-16 cm². Ein Fluorophor mit einem Wirkungsquerschnitt
der Dissoziation von 10-20 cm² emittiert
10⁴ Fluoreszenz-Signale durchschnittlich, bis es dissoziiert
ist. Je größer der Wert des Dissoziations-Wirkungsquerschnittes
ist, desto kleiner ist die Zahl der
emittierten Fluoreszenzen. Auf diesem Wege kann eine
höhere Empfindlichkeit erreicht werden. Die Zeit, die
eine DNA-Bande zum Passieren des bestrahlten Bereichs
benötigt, der 0,5 mm breit ist, liegt unter üblichen
Bedingungen der Trennung und Bestimmung von DNA bei 20
bis 30 s. Selbst wenn 50% des Fluorophoren in der
DNA-Bande während des Passierens des bestrahlten Bereiches
dissoziiert werden, ist es nicht im geringsten mit
einer Störung der Bestimmung verbunden. Wenn ein Argonlaser
mit einer Leistung von 5 bis 10 mW auf einen
Querschnitt von 0,5 mm² fokussiert wird und zur Bestimmung
verwendet wird, liegt die Photonendichte bei 2 bis
5 · 10⁷ Photonen/mm² · s. Bei einer Photonendichte von
1 · 10¹⁷ Photonen/mm² · s wird ein Fluorophor mit einem
Dissoziations-Wirkungsquerschnitt von 10-19 cm² innerhalb
einer Sekunde dissoziiert. Ein größerer Wert des Dissoziations-
Wirkungsquerschnittes als 10-19 cm² ist nicht
bevorzugt.
Wenn eine Fluoreszenz-markierte Verbindung mit einem
Dissoziations-Wirkungsquerschnitt von 10-19 bis 10-22 cm²
verwendet wird, kann die Bestimmung der Fluoreszenz mit
hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden, und die Wiederverwendung
des Gels nach der Photo-Dissoziation der
Verbindung ist möglich.
Die Bestrahlung mit Licht kann durchgeführt werden unter
Verwendung eines Bestrahlungsgerätes, das in einem linienförmigen
Strahl die Fläche überstreicht, unter Verwendung
einer Lampe, die die gesamte Oberfläche bestrahlt,
usw.
Wie oben beschrieben, wird eine Fluoreszenz-markierte
Verbindung, die in einer Trennungs-Gelplatte verblieben
ist, nach der Bestimmung ihres Verhaltens bei der elektrophoretischen
Trennung mittels der emittierten Fluoreszenz
photo-dissoziiert. Die dabei entstehende Gelplatte
kann nach Wiederaufarbeitung entsprechend der vorliegenden
Erfindung wiederverwendet werden.
Claims (6)
1. Verfahren zur Aufbereitung von Elektrophorese-Gelen
für die Wiederverwendung, dadurch gekennzeichnet, daß man
Elektrophorese-Gele, die bei der elektrophoretischen
Trennung von mit einem Fluorophor markierten Proben und
bei der Bestimmung der von der durch Elektrophorese getrennten
Probe emittierten Fluoreszenz verwendet wurden,
mit Licht bestrahlt und dadurch das in dem Gel verbliebene
Fluorophor photo-dissoziiert und das bestrahlte Gel
wiederverwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Stoff als Fluorophor verwendet wird, der einen Dissoziations-
Wirkungsquerschnitt von 10-22 bis 10-19 cm²
aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Fluorophor Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Argonlaser mit einer Stärke
von 40 mW oder mehr, der auf einer Fläche von 1 mm² fokussiert
wird, als Lichtquelle verwendet und das Elektrophorese-
Gel mit dem Argonlaser abtastet, wobei das Fluorophor
photo-dissoziiert wird.
5. Verfahren zur elektrophoretischen Trennung in Kombination
mit einer Licht-Bestimmung, umfassend
- - einen Bestimmungsschritt, in dem eine mit einem Fluorophor markierte Probe im Gel mittels Elektrophorese getrennt wird, das Gel in einem vorher bestimmten Bereich mit einem anregenden Lichtstrahl bestrahlt wird und die Fluoreszenz, die von der Probe bei Passieren eines vorher bestimmten Bereiches emittiert wird, bestimmt wird, und
- - einem Schritt der Wiederaufbereitung des Gels, bei dem das Gel nach Abschluß des Bestimmungsschrittes mit Licht bestrahlt wird, dadurch, daß in dem Gel verbliebene Fluorophor photo-dissoziiert wird und anschließend das Gel in dem Bestimmungsschritt wiederverwendet wird.
6. Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung in Kombination
mit einer Licht-Bestimmung, dadurch gekennzeichnet,
daß sie folgende Einrichtungen umfaßt:
- - eine Gelplatte zur elektrophoretischen Trennung von mit einem Fluorophor markierten Proben,
- - Einrichtungen zur Bestrahlung mit Licht, mit denen ein für die Bestimmung der Proben vorgesehener Bereich der Gelplatte mit Licht bestrahlt werden kann, wobei die den Bestimmungsbereich passierende Probe Fluoreszenz- Signale emittiert,
- - Einrichtungen zur Bestimmung der von der Probe emittierten Fluoreszenz und
- - Einrichtungen zur Dissoziation des Fluorophoren, mit denen die Gelplatte wenigstens in dem Bereich zwischen dem Bestimmungs-Bereich und dem Ausgangspunkt der Probenwanderung mit Licht bestrahlt und dabei das Fluorophore photo-dissoziiert werden kann.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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- 1988-06-24 US US07/211,284 patent/US4879012A/en not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4879012A (en) | 1989-11-07 |
| DE3821454C2 (de) | 1990-03-08 |
| JPS641949A (en) | 1989-01-06 |
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