DE112018007805T5 - Biopolymer-Analyseverfahren und Biopolymer-Analysevorrichtung - Google Patents

Abstract

Es besteht ein Phänomen, bei dem während einer Kapillarelektrophorese ein Störrauschen in einer Spikeform, das z. B. durch Verunreinigungen verursacht wird, und ein Störpeak mit einem Spektrum, das sich von einem Wellenlängenspektrum einer markierten fluoreszierenden Substanz unterscheidet, detektiert werden. Daher stellt die Offenbarung ein Verfahren bereit, mit der die Intensität der markierten fluoreszierenden Substanz selbst identifiziert werden kann, ohne dass ein durch Verunreinigungen verursachter Störfluoreszenzpeak einen Einfluss hat. In der Offenbarung wird eine Eigenschaft der Fluoreszenzintensität (ein Fluoreszenzprofil eines Störrauschens), die den Störpeaks gemeinsam ist, eingestellt, wird der Störpeak als eine fluoreszierende Substanz, die sich von der markierten fluoreszierenden Substanz unterscheidet, behandelt, und die fluoreszierende Substanz und das Störrauschen werden durch Farbkonvertierung mit der markierten fluoreszierenden Substanz + der Störfluoreszenzsubstanz getrennt (siehe Fig. 5).

Description

• Technisches Gebiet
• Die Offenbarung betrifft ein Biopolymer-Analyseverfahren und eine Biopolymer-Analysevorrichtung.
• Allgemeiner Stand der Technik
• Zur Bestimmung einer Basensequenz von einer DNA, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert ist, existiert als ein Verfahren beispielsweise das bekannte Didesoxy-Verfahren von Sanger et al. Bei diesem Didesoxy-Verfahren wird die zu analysierende DNA zunächst in einen Vektor eingebracht und amplifiziert und dann zu einer Einzelstrang-Template-DNA denaturiert. Anschließend wird eine Primer-DNA an diese Template-DNA gebunden und es erfolgt eine Komplementärstrangsynthese ausgehend von der Primer-DNA. Diesbezüglich wird außer vier Typen von Desoxynukleotidtriphosphaten ein spezifischer Typ eines Didesoxynukleotidtriphosphats hinzugefügt, der als Terminator dient. Sobald dieses Didesoxynukleotidtriphosphat eingebaut ist, stoppt die Komplementärstrangsynthese, und so entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die mit spezifischen Basen terminiert sind. Verwendet werden die Didesoxynukleotidtriphosphate der vier Basensorten Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T), nämlich ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, wobei die Durchführung der jeweiligen oben beschriebenen Komplementärstrangsynthesereaktionen, um unterschiedliche Längen von DNA-Fragmenten mit den jeweiligen terminalen Basen A, C, G und T zu erhalten, die Separierung dieser DNA-Fragmente durch Trennung nach Molekulargewichten und das Auslesen der Reihenfolge der Basensorten entsprechend den Molekulargewichten eine Analyse einer Basensequenz ermöglicht.
• Die Trennung nach Molekulargewicht wird mittels Elektrophorese unter Verwendung zum Beispiel eines Polyacrylamidgels durchgeführt. Das Hauptverfahren in den letzten Jahren besteht darin, ein Gel oder ein Polymer, welche eine Trennung nach Molekulargewicht ermöglichen, in eine Kapillare zu füllen und die Elektrophorese durchzuführen. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz von DNA (DNA-Sequenzierer), bei der dieses Kapillarelektrophoreseverfahren eingesetzt wird, ist derzeit der am weitesten verbreitete DNA-Sequenzierer, der eine kontinuierliche automatische Analyse bietet, um die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben mit hoher Geschwindigkeit sicherzustellen.
• Das Prinzip der Bestimmung der Basensorten der detektierten Fragmente besteht darin, dass die oben beschriebenen Fragmente zuvor mit vier verschiedenen Arten von fluoreszierenden Substanzen je nach terminaler Basensorte unterschiedlich markiert werden und mit einem Anregungslicht an einer bestimmten Detektionsposition bestrahlt werden, und die Basensorten aus den Unterschieden zwischen den erzeugten Fluoreszenzspektren bestimmt werden. Eine Vorrichtung, die auf diesem Prinzip basiert, kann neben der Verwendung als DNA-Sequenzierer auch zum Analysieren fluoreszenzmarkierter biologisch relevanter Verbindungen eingesetzt werden.
• Während verschiedene Kombinationen von fluoreszierenden Substanzen als Marker Verwendung finden können, werden hierbei, zum Beispiel, vier Arten von fluoreszierenden Substanzen mit verschiedenen Eigenschaften, wie blau, grün, gelb und rot, ausgewählt. Verwendet werden fluoreszierende Substanzen mit Fluoreszenzmaxima bei Wellenlängen von 528 nm, 549 nm, 575 nm bzw. 602 nm, die gegeneinander verschoben sind. Aus der Differenz der Wellenlängen dieser Fluoreszenzmaxima und der Differenz der Fluoreszenzspektren kann eine fluoreszierende Substanzart oder ein Mischzustand fluoreszierender Substanzarten identifiziert und somit die terminale Basensorte bestimmt werden. Als ein Verfahren zur Ermittlung einer fluoreszierenden Substanzart aus dem detektierten Fluoreszenzspektrum wird, zum Beispiel, ein bekanntes Verfahren wie in Patentliteratur 1 beschrieben verwendet.
• Während bei der Bestimmung einer Basensequenz für gewöhnlich vier Arten von fluoreszierenden Substanzen als Marker verwendet werden, besteht auch ein Messverfahren, das fünf oder mehr Arten einsetzt, um jeden Fragmenttyp mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Substanz zu markieren und ein DNA-Muster nach erfolgter Molekulargewichttrennung zu messen. Der Einsatz von fünf oder mehr Arten ermöglicht die Identifizierung der fluoreszierenden Substanzart anhand des Fluoreszenzspektrums und dergleichen anhand der detektierten fluoreszierenden Substanz und die Bestimmung eines Fragmenttyps und seiner Länge.
• Eine Messvorrichtung hat die Funktion, Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Wellenlängenbanden in mindestens gleicher oder größerer Anzahl als die der fluoreszierenden Substanzarten zu messen. Die fluoreszierenden Substanzen weisen voneinander verschiedene Fluoreszenzspektren auf, und ein Fluoreszenzinsitätsverhältnis für jeden von mehreren Wellenlängenbanden bezogen auf eine Spektraleigenschaft unterscheidet sich bei jeder fluoreszierenden Substanzart. Mittels einer Matrixberechnung wird dazu aus den Fluoreszenzintensitäten der detektierten Vielzahl von Wellenlängenbereichen und dem Fluoreszenzintensitätsverhältnis für jede fluoreszierende Substanzart eine Intensität (Menge) für jede fluoreszierende Substanzart umgerechnet. Da eine Menge der fluoreszierenden Substanzart einer Menge der Basensorte entspricht, kann eine Menge für jede Base ermittelt werden, und es kann eine durch Elektrophorese verursachte zeitliche Änderung jeder einzelnen Base erhalten werden.
• Beispielsweise beschreibt Patentliteratur 2 eine Kapillarelektrophoresevorrichtung wie oben ausgeführt. Im Allgemeinen wird in einer Kapillarelektrophoresevorrichtung eine Probe, die DNA als Messziel enthält, in ein Trennmedium, beispielsweise Polyacrylamid, in einer Quarzkapillare injiziert, und es wird eine Spannung an beiden Enden der Kapillare angelegt. Die Proben, in denen eine Proben-DNA enthalten ist, bewegen sich in der Kapillare und werden, zum Beispiel, nach Molekulargewichtsgrößen getrennt, und es bilden sich DNA-Banden in der Kapillare. Da jede DNA-Bande Fluorochrome wie oben beschrieben enthält, emittiert sie bei Bestrahlung mit einem Laserlicht, einem LED-Licht oder dergleichen eine Fluoreszenz. Durch Auslesen dieser Fluoreszenzemission mit einem Mittel zur Fluoreszenzmessung wird die Bestimmung einer Sequenz der DNA sichergestellt. Die Trennung und Analyse von Protein kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden, um eine Zusammensetzung des Proteins zu untersuchen. Ein Verfahren zur Lichtbestrahlung einer Probe in der Kapillarelektrophoresevorrichtung ist wie folgt. Das heißt, eine Kapillare an einem Ende oder Kapillaren an beiden Enden einer Kapillarenanordnung, die aus mehreren auf einem flachen Substrat angebrachten Kapillaren konfiguriert sind, werden mit einem Laserlicht bestrahlt, wobei das Laserlicht sich sequentiell zu benachbarten Kapillaren ausbreitet, um die Kapillarenanordnung zu durchqueren, und somit die Probe, die elektrophoretisch alle Kapillaren durchwandert, bestrahlt. Darüber hinaus ist ein Fluoreszenzdetektionsverfahren wie folgt. Dabei wird ein Bild einer Laserlichtbestrahlungseinheit auf der Kapillarenanordnung durch eine Kondensorlinse, ein transmissives Beugungsgitter und eine Abbildungslinse auf einem zweidimensionalen CCD erzeugt. Auf diese Weise werden die Intensitäten der Fluoreszenzlichter aus mehreren fluoreszierenden Substanzen bei mehreren Wellenlängenbanden detektiert (zum Beispiel bei Unterteilung eines Wellenlängenbereichs von 500 nm bis 700 nm in zwanzig Unterteilungen von je 10 nm).
• Entgegenhaltungsliste
• Patentliteratur
• Patentliteratur 1: Ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 2011-30502
• Patentliteratur 2: Ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 2004-144479
• Kurzdarstellung der Erfindung
• Technisches Problem
• Wie in Patentliteratur 1 offenbart, besteht die fluoreszierende Substanz als ein Detektionsziel in einer fluoreszierenden Substanz, die als Marker verwendet wird (eine markierte fluoreszierende Substanz). Das heißt, anhand der oben beschriebenen Matrixberechnung soll durch die Umrechnung ermittelt werden, von welcher fluoreszierenden Substanzart (Basensorte) die detektierte Fluoreszenzintensität abgeleitet ist bzw. wie groß das Mischungsverhältnis der fluoreszierenden Substanzarten (Basensorten) ist.
• Jedoch besteht ein Fall, bei dem eine andere Komponente als das Target (Detektions-Target) elektrophoretisch behandelt und in der Elektrophorese detektiert wird. Beispielsweise handelt es sich um einen Fall, wobei Verunreinigungen, Staub und dergleichen, die in der Elektrophoreseprobe enthalten sind, elektrophoretisch behandelt durch einen Detektionsbereich der Kapillare geleitet werden. Ein Störfluoreszenzpeak, der durch diese Verunreinigungen verursacht wird, kann ein Peaksignal der nativen, markierten fluoreszierenden Substanz überlagern oder selbst detektiert werden. In einem solchen Fall ist zu befürchten, dass der Störfluoreszenzpeak die Umrechnung in eine fluoreszierende Substanzart und die Bestimmung einer Basensorte beeinträchtigt, indem er zum Beispiel fälschlicherweise als eine der markierten fluoreszierenden Substanzen oder eine Kombination mehrerer markierter fluoreszierender Substanzen bestimmt wird.
• Da sich dieses Störfluoreszenzsignal von dem Fluoreszenzspektrum der markierten fluoreszierenden Substanz als Ziel unterscheidet, wird die Umrechnung mittels Matrixkonvertierung, die eine gewöhnliche Fluoreszenzspektralintensität in eine Intensität der fluoreszierenden Substanzart umrechnet, nicht korrekt durchgeführt. Das Störfluoreszenzsignal wird von der Intensität der fluoreszierenden Substanzart überlagert und zu einer ungenauen Intensität berechnet, wodurch das Problem entsteht, dass das Störfluoreszenzsignal die Bestimmung des Fragmenttyps und der Basensorte beeinträchtigt.
• Die Offenbarung wurde unter Berücksichtigung eines solchen Umstandes gemacht und stellt ein Verfahren zur Verfügung, um die Intensität einer markierten fluoreszierenden Substanz selbst zu identifizieren, ohne den Effekt eines durch Verunreinigungen verursachten Störfluoreszenzpeaks.
• Lösung des Problems
• Als ein Ergebnis der Analyse eines Elektrophoresepeaks, der nicht von einer als Marker verwendeten fluoreszierenden Substanz stammt, fanden die Erfinder heraus, dass dessen Spektrum einen Unterschied zum Fluoreszenzspektrum der als Marker verwendeten fluoreszierenden Substanz aufweist und dass eine Gemeinsamkeit zwischen den Spektren von mehreren von Verunreinigungen stammenden Fluoreszenzpeaks besteht.
• Gestützt auf der Erkenntnis der Erfinder behandelt die Offenbarung somit die Störfluoreszenz als eine elektrophoretisch behandelte fluoreszierende Substanz und bestimmt ein Fluoreszenzintensitätsverhältnis für jede von mehreren Wellenlängenbereichen der Störfluoreszenz, ähnlich wie bei anderen markierten fluoreszierenden Substanzen. Bei einer Matrixumkonvertierung zur Umrechnung einer Fluoreszenzspektralintensität in eine Intensität einer fluoreszierende Substanzart wird eine Berechnung als eine Matrix einer markierten fluoreszierenden Substanz (Q-Typ) und einer fluoreszierenden Störsubstanz (R-Typ) durchgeführt, um eine Konzentration der markierten fluoreszierenden Substanz zu errechnen. So wird sichergestellt, dass der Störfluoreszenzpeak als Störrauschen identifiziert wird, damit es aus dem Peak der markierten fluoreszierenden Substanz entfernt werden kann.
• Weitere, die Offenbarung betreffende Merkmale sind aus der vorliegenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Aspekte der Offenbarung werden durch Elemente, Kombinationen verschiedener Elemente und Modi der folgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Ansprüche erreicht und umgesetzt.
• Die vorliegende Beschreibung ist nur ein typisches Beispiel, und es versteht sich, dass die Ansprüche oder die Anwendungsbeispiele in keiner Weise einschränkend sein sollen.
• Vorteilhafte Effekte der Erfindung
• Mit der Offenbarung lässt sich auch dann, wenn ein durch Verunreinigungen verursachter Störfluoreszenzpeak in den Elektrophoresedaten (Elektropherogramm) detektiert wird, eine Intensität einer markierten fluoreszierenden Substanz selbst ohne einen Effekt des Störfluoreszenzpeaks berechnen, um so eine genaue Identifizierung und Detektion eines biologisch relevanten Elements, wie z. B. einer Basensorte, sicherzustellen.
• Figurenliste
• 1 ist eine Zeichnung, die eine beispielhafte schematische Konfiguration einer Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 gemäß der Ausführungsform veranschaulicht.
• 2 ist eine Zeichnung, die eine beispielhafte schematische interne Konfiguration (Lichtdetektionssystem) einer Detektionsmechanismuseinheit 37 als eine Komponente der Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 gemäß der Ausführungsform veranschaulicht.
• 3 ist ein Flussdiagramm zur Darlegung eines Analyseprozesses von Elektrophoresedaten, der von einer Datenverarbeitungseinheit 101 basierend auf einem Analyseverfahren 1 ausgeführt wird.
• 4 ist ein Flussdiagramm zur Darlegung eines Analyseprozesses von Elektrophoresedaten, der von der Datenverarbeitungseinheit 101 basierend auf einem Analyseverfahren 2 ausgeführt wird.
• 5 ist eine Zeichnung, die einen Effekt des Entfernens einer Störfluoreszenz gemäß Beispiel 1 veranschaulicht.
• 6 ist eine Zeichnung, die einen Effekt des Entfernens einer Störfluoreszenz gemäß Beispiel 2 veranschaulicht.
• 7 ist eine Zeichnung, die Spektralprofile der Fluoreszenz: x (q, p) von in Beispiel 3 verwendeten markierten fluoreszierenden Substanzen und ein Profil der Störfluoreszenz: y (r, p) (q = 0, 1, 2, 3, r = 0, p = 0, 1, 2, ..., 19) veranschaulicht.
• 8 ist eine Zeichnung, die ein beispielhaftes Elektropherogramm s (p, t) gemessen während einer Elektrophorese veranschaulicht.
• 9 ist eine Zeichnung, die einen Teil einer Intensitätswellenform: n (r, t) von einer fluoreszierenden Störsubstanz veranschaulicht, die nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate analysiert wurde (eine Signalintensität 901 einer Störfluoreszenz 1).
• 10 ist eine Zeichnung, die ein Ergebnis einer Störpeakentfernung durch eine Operation veranschaulicht (Fluoreszenzintensitätswellenformen f (q, t) von jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanzen: Intensitätswellenformen 1001 bis 1004 der fluoreszierenden Substanzen 1 bis 4).
• 11 ist eine Zeichnung, die Intensitätswellenformen der Fluoreszenz von markierten fluoreszierenden Substanzen (Intensitätswellenformen 1101 bis 1104 der fluoreszierenden Substanzen 1 bis 4) veranschaulicht, die ohne Einstellung der fluoreszierenden Störsubstanz als Vergleichsbeispiel berechnet wurden.
• 12 ist eine Zeichnung, die vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzprofilen (Profile 1201 bis 1204 der fluoreszierende Substanzen 1 bis 4) und zwei Arten von fluoreszierenden Störsubstanzprofilen (Profile 1205 und 1206 der Störfluoreszenzen 1 und 2) veranschaulicht.
• 13 ist eine Zeichnung, die Spektralprofile der Fluoreszenz: x (q, p) (q = 0, 1, 2, 3, 4, p = 0, 1, 2, ..., 19) der in Beispiel 4 verwendeten markierten fluoreszierenden Substanzen veranschaulicht.
• 14 ist eine Zeichnung, die ein Profil einer in Beispiel 4 verwendeten Störfluoreszenz: y (r, p) (r = 0, 1, p = 0, 1, 2, ..., 19) veranschaulicht.
• 15 ist eine Zeichnung, die ein beispielhaftes Elektropherogramm s (p, t) gemessen während einer Elektrophorese veranschaulicht.
• 16 ist eine Zeichnung, die Teile der Intensitätswellenformen: n (r, t) von den fluoreszierenden Störsubstanzen veranschaulicht, die nach dem Analyseverfahren 1 berechnet wurden.
• 17 ist eine Zeichnung, die ein Ergebnis veranschaulicht, das durch eine Operation nach dem Analyseverfahren 1 erhalten wurde (Fluoreszenzintensitätswellenformen: f (q, t) von den markierten fluoreszierenden Substanzen während der Elektrophorese).
• 18 ist eine Zeichnung, die Fluoreszenzintensitätswellenformen der markierten fluoreszierenden Substanzen veranschaulicht, die ohne Einstellung der Fluoreszenzprofile y (r, p) von den fluoreszierenden Störsubstanzen als Vergleichsbeispiel berechnet wurden.
• Beschreibung der Ausführungsformen
• Im Folgenden werden die Ausführungsform und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. In den beigefügten Zeichnungen können Elemente, die eine gemeinsame Funktionalität haben, mit der gleichen Zahl gekennzeichnet sein. Zu beachten ist, dass die beigefügten Zeichnungen zwar bestimmte Ausführungsformen und Beispiele veranschaulichen, die auf dem Prinzip der Offenbarung beruhen, dass sie jedoch zum Verständnis der Offenbarung dienen und keinesfalls für eine eingeschränkte Auslegung der Offenbarung zu verwenden sind.
• Während in der Ausführungsform die Darlegung der Offenbarung ausreichend detailliert ist, so dass eine fachkundige Person die Offenbarung ausführen kann, sind andere Implementierungen und Konfigurationen möglich, und muss dahingehend verstanden werden, dass Änderungen bei Konfigurationen und Strukturen und der Austausch von verschiedenen Komponenten möglich sind, ohne von dem Umfang und Geist der technischen Idee der Offenbarung abzuweichen. Dementsprechend darf die folgende Beschreibung nicht einschränkend ausgelegt werden.
• Darüber hinaus kann in der Ausführungsform die Funktion einer später beschriebenen Datenverarbeitungseinheit in Software implementiert werden, die auf einem Allzweckcomputer läuft, oder sie kann in spezieller Hardware oder einer Kombination aus Software und Hardware implementiert werden.
• Die Ausführungsform bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse eines biologisch relevanten Elements (eines Biopolymers), wie DNA und Protein, unter Verwendung einer fluoreszierenden Substanz als Marker, und bezieht sich beispielsweise auf ein Verfahren zur Bestimmung einer Basensequenz von DNA und eine Vorrichtung davon oder auf ein Verfahren zur Messung eines DNA-Musters nach Molekulargewichttrennung und eine Vorrichtung davon.
• Die Ausführungsform gibt ein Profil einer fluoreszierenden Substanz (einer nicht markierten fluoreszierenden Substanz), die keine markierte fluoreszierende Substanz ist, vor, (z.B. ein Profil eines Störrauschens), sowie ein Profil der markierten fluoreszierenden Substanz, erhält eine zeitliche Änderung (eine Wellenform) einer Fluoreszenzintensität der nicht markierten fluoreszierenden Substanz durch eine Operation (siehe Formel (1) und dergleichen, die später beschrieben wird) unter Verwendung des Profils der nicht markierten fluoreszierenden Substanz, und entfernt das Störrauschen aus den detektierten Elektropherogrammsignalen. Darüber hinaus erhält die Ausführungsform in direkter Weise eine Fluoreszenzintensität aus der markierten fluoreszierenden Substanz während der Elektrophorese mittels einer Operation der unten beschriebenen Formel (1).
• <Beispielhafte Konfiguration einer Kapillarelektrophoresevorrichtung>
• 1 ist eine Zeichnung, die eine beispielhafte schematische Konfiguration einer Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 gemäß der Ausführungsform veranschaulicht. Die Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 umfasst eine Biopolymer-Analysevorrichtung und umfasst beispielsweise eine mehrfache Kapillarenanordnung 1, einen ersten Pufferbehälter 23, einen Gelblock 4, einen zweiten Pufferbehälter 25, eine Spritze 10, einen Detektor 26, eine Lichtquelle 20, eine Detektionsmechanismuseinheit 37, einen Ofen 11, ein Hochspannungsnetzteil 21, eine Datenverarbeitungseinheit (ein Prozessor) 101, einen Speicher 102, eine Speichervorrichtung 103, eine Eingabevorrichtung (z.B. eine Computermaus, eine Tastatur, verschiedene Arten von Schaltern und ein Berührungsfeld) 104 und eine Ausgabevorrichtung (z.B. eine Anzeigevorrichtung und ein Lautsprecher, der einen Alarm und dergleichen ausgibt) 105. Die mehrfache Kapillarenanordnung 1 wird aus Kapillaren gebildet, die ein Trennmedium zum Trennen einer Probe enthalten. Der erste Pufferbehälter 23 enthält eine Pufferflüssigkeit 3, in die die negativen Elektroden 2 der mehrfachen Kapillarenanordnung und die Probeneinführungsabschnitte 22 eingetaucht sind. Der Gelblock 4 umfasst ein Ventil 6. Der zweite Pufferbehälter 25 enthält eine Pufferflüssigkeit 12, in die der Gelblock 4 und eine Masseelektrode 7 eingetaucht sind. Die Spritze 10 ist zum Einspritzen eines Gels als Elektrophoresemedium in die Kapillarenanordnung vorgesehen. Der Detektor 26 ist zur Gewinnung von Informationen je nach der Probe vorgesehen. Die Lichtquelle 20 bestrahlt eine Lichtbestrahlungsposition 8 mit einem Laserlicht 9 zur Anregung von fluoreszierenden Substanzen innerhalb der elektrophorierten Probe. Die Detektionsmechanismuseinheit 37 empfängt die von der Probe erzeugte Fluoreszenz. Der Ofen 11 regelt die Temperatur der Kapillarenanordnung 1. Das Hochspannungsnetzteil 21 legt eine Spannung an das Trennmedium an. Die Datenverarbeitungseinheit 101 führt verschiedene Arten von Prozessen aus. Der Speicher 102 speichert ein Profil von jeder markierten fluoreszierenden Substanz (gleichbedeutend mit einem Fluoreszenzspektralprofil) und ein Profil jeder im Folgenden beschriebenen Störfluoreszenz. Die Speichervorrichtung 103 speichert die Detektionsdaten und arithmetischen Operationsergebnisse der Vergangenheit. Das Eingabegerät 104 empfängt Bedienereingaben, zum Beispiel Anweisungen und verschiedene Arten von Daten. Das Ausgabegerät 105 gibt Detektionsergebnisse (Messergebnisse), Ergebnisse arithmetischer Operationen, Bestimmungsergebnisse und dergleichen aus.
• Die mehrfache Kapillarenanordnung 1 wird aus mehreren (zum Beispiel 96, 24, 16, 12 und 8) Kapillaren 16 aus Quarz als rohrförmige Elemente eingesetzt und konfiguriert, die in einer Linie ausgerichtet auf einer Ebene im Detektor 26 angebracht sind, der die Lichtbestrahlungsposition (die mit dem Laserlicht 9 bestrahlte Position) 8 umfasst. Während jede der Kapillaren 16 mit Polyimid oder dergleichen beschichtet ist, ist die Beschichtung in der Lichtbestrahlungsposition 8 entfernt, um eine Lichtbestrahlung zu ermöglichen. Die mehrfache Kapillarenanordnung 1 wird mit einer Untersuchungsprobe gefüllt, die eine Probe, beispielsweise DNA-Moleküle, und eine wässrige Lösung eines Polymers als Trennmedium zur Auftrennung der DNA-Moleküle in der Untersuchungsprobe enthält. Die mehrfache Kapillarenanordnung 1 umfasst ein Seitenende, an dem die Probeneinführungsabschnitte 22 zum Einführen der Probe in die Kapillaren 16 ausgestaltet sind und die negativen Elektroden 2 zum Anlegen einer negativen Spannung angeordnet sind. Das andere Ende weist einen Gelblockkopplungsabschnitt 5 auf, der mit dem Gelblock 4 gekoppelt ist, wobei das Trennmedium (z. B. die wässrige Polymerlösung mit Molekularsiebeffekt) aus dem Gelblock 4 in die Kapillarenanordnung 1 injiziert wird. Der Detektor 26 ist zwischen dem Probeneinführungsabschnitt 22 und dem Gelblockkopplungsabschnitt 5 angebracht.
• Ein Fließmedium-Injektionsmechanismus 24, der die wässrige Polymerlösung als elektrophoretisches Trennmedium in die Kapillaren 16 injiziert, umfasst den Gelblock 4, die Spritze 10 und das Ventil 6. wenn die wässrige Polymerlösung als elektrophoretisches Medium zum Beispiel in jede der Kapillaren 16 eingefüllt ist, schließt eine Steuereinheit (nicht veranschaulicht) das Ventil 6 und schiebt die Spritze 10 ein, um die wässrige Polymerlösung innerhalb der Spritze 10 in die Kapillaren zu injizieren.
• Die Kapillarenanordnung 1, der Gelblock 4, die Pufferflüssigkeit 3, die negative Elektrode 2, der Puffer 12 in einer Masseelektrodenseite, die Masseelektrode 7 und das Hochspannungsnetzteil 21 konfigurieren einen Spannungsanlegemechanismus zur Elektrophorese der Untersuchungsprobe innerhalb des Trennmediums (der wässrigen Polymerlösung). Bei der Elektrophorese wird die negative Elektrode 2 in die Pufferflüssigkeit 3 eingetaucht, und die Steuereinheit (nicht veranschaulicht) öffnet das Ventil 6. Hierdurch entsteht ein Leitungspfad bestehend aus der negativen Elektrode 2, der Pufferflüssigkeit 3, der Kapillarenanordnung (genauer gesagt, der wässrigen Polymerlösung in jeder Kapillare 16) 1, dem Gelblock (genauer gesagt, der wässrigen Polymerlösung im Gelblock 4) 4, dem Puffer 12 auf der Masseelektrodenseite und der Masseelektrode 7. Das Hochspannungsnetzteil 21 legt an diesen Leitungspfad eine Spannung an. Sobald die Spannung an den Leitungspfad angelegt wird, läuft die Elektrophorese der Untersuchungsprobe innerhalb des Trennmediums (der wässrigen Polymerlösung) ab, und zwar entsprechend den Eigenschaften ihrer Molekulargewichte und dergleichen.
• Ein optisches System der Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 ist konfiguriert aus der Lichtquelle 20, dem Detektor 26 mit der Lichtbestrahlungsposition 8 und der Detektionsmechanismuseinheit 37, die ein vom Detektor 26 erzeugtes Fluoreszenzlicht 35 detektiert. Die Lichtquelle 20 oszilliert das Laserlicht 9 (Lichtstrahlen von 488,0 nm und 514,5 nm). Anstelle des Laserlichts 9 kann auch ein LED-Licht, das zum Beispiel durch einen Bandpassfilter monochromatisiert ist, oder das Licht von einer anderen Lichtquelle, die zur Fluoreszenzanregung geeignet ist, verwendet werden. Im Detektor 26 sind die Lichtbestrahlungspositionen 8, also die Positionen, an denen das Laserlicht 9 durch die Kapillarenanordnung 1 hindurchtritt, parallel angebracht. Der Detektor 26 wird bei der Anordnung der Kapillaren 16 aus beiden Richtungen (in 1 nach oben und unten) mit dem Laserlicht 9 bestrahlt, so dass das Laserlicht 9 gleichzeitig die Lichtbestrahlungspositionen 8 der Vielzahl von Kapillaren durchdringt. Dieses Laserlicht 9 regt die Untersuchungsprobe an, so dass die Untersuchungsprobe Fluoreszenz ausstrahlt. Die Detektionsmechanismuseinheit 37, die einen zweidimensionalen Detektor 34 umfasst, detektiert diese Fluoreszenz, und so können Informationen je nach der Untersuchungsprobe, beispielsweise eine DNA-Molekularsequenz, gewonnen werden.
• <Beispielhafte interne Konfiguration der Detektionsmechanismuseinheit 37>
• 2 ist eine Zeichnung, die eine beispielhafte schematische interne Konfiguration (Lichtdetektionssystem) der Detektionsmechanismuseinheit 37 als eine Komponente der Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 gemäß der Ausführungsform veranschaulicht. 2 veranschaulicht die Detektionsmechanismuseinheit 37 und die Lichtbestrahlungsposition 8.
• Die Detektionsmechanismuseinheit 37 umfasst eine Fluoreszenzkondensorlinse 31, ein Gitter 32, eine Fokuslinse 33 und den zweidimensionalen Detektor 34, wie z. B. eine CCD-Kamera und eine CMOS-Kamera. Obwohl nicht veranschaulicht, kann ein optischer Filter zum Entfernen eines Anregungslichts nach Bedarf in der Mitte eines optischen Pfads eingefügt werden. Das Fluoreszenzlicht 35 der Untersuchungsprobe in den Kapillaren 16, die auf einer Anordnungsplattform 15 platziert sind, wird durch Bestrahlung der Lichtbestrahlungsposition 8 mit dem Laserlicht 9 erzeugt. Das Fluoreszenzlicht 35 wird mit der Fluoreszenzkondensorlinse 31 zu einem Parallellicht 36, wird mit dem Gitter 32 gestreut und gestaltet sich mit der Fokuslinse 33 zu einem Bild auf dem zweidimensionalen Detektor 34. Auf der rechten Seite in 2 wird eine beispielhafte Konfiguration von Elementen (die Kapillarenanordnung 1, die Lichtbestrahlungsposition 8, das Gitter 32 und der zweidimensionale Detektor 34) zur Bilderzeugung veranschaulicht. Bilder der Anordnung (sechzehn in der Zeichnung) der Kapillarenanordnung 1 sind in Y-Achsen-Richtung angeordnet, die Bilder werden erzeugt, indem die Lichtemission von jeder der Kapillaren 16 in X-Achsen-Richtung gestreut wird, und eine Fluoreszenzintensität in einer pro Pixel unterschiedlichen Wellenlänge in X-Achsen-Richtung des zweidimensionalen Detektors erfasst wird. Die Datenverarbeitungseinheit 101 analysiert die Signale der detektierten Fluoreszenzintensitäten, z. B. als Reaktion auf eine Anweisungseingabe durch einen Bediener über die Eingabevorrichtung 104, um eine Basensequenz und dergleichen zu bestimmen. Die Datenverarbeitungseinheit 101 gibt auch die Fluoreszenzintensitätssignale, die Basensequenz als Analyseergebnis und dergleichen auf der Ausgabevorrichtung 105 aus (zeigt sie an), beispielsweise als Reaktion auf eine Anweisungseingabe durch einen Bediener.
• <Übersicht über die Elektrophoresedatenanalyse>
• Im Folgenden wird ein Überblick über eine Elektrophoresedatenanalyse (Elektropherogramm) gemäß der Ausführungsform beschrieben.
• Die Kapillarelektrophoresevorrichtung 100 erfasst die Signale wiederholt während der Elektrophorese zu einem festgelegten Zeitpunkt (die Erfassung kann periodisch oder in jedem vorbestimmten Zeitraum unter Verwendung einer kontinuierlichen Bestrahlung mit dem Laserlicht 9 ausgeführt werden bzw. können der Zeitpunkt der Bestrahlung mit dem Laserlicht 9 und der Zeitpunkt der Signaldetektion synchronisiert werden). Zu beachten ist, dass die wiederholte Zählung t ist (wenn eine Messung in einer Sekunde durchgeführt wird, ist die Zählung = Zeit (Sekunde)).
• Die von jeder markierten fluoreszierenden Substanz emittierte Fluoreszenz, gibt ein Licht in einem bestimmten Intensitätsverhältnis bei jeder spektralen Wellenlänge je nach Fluoreszenzspektrum ab. Dieses wird beispielsweise durch Gitter und Prisma gestreut und mit dem Detektor erfasst. Basierend auf einer Kombination der markierten fluoreszierenden Substanzen wird ein Detektionswellenlängenbereich von einer Wellenlänge W1 bis zu einer Wellenlänge W2 eingestellt, und die Fluoreszenz innerhalb dieses Bereichs wird in mehreren Wellenlängenbanden unterteilt und detektiert. Zum Beispiel wird ein Wellenlängenbereich von 520 nm bis 700 nm durch Unterteilung einer Sensorfläche des zweidimensionalen Detektors 34 in zwanzig kontinuierliche Wellenlängenbanden unterteilt und detektiert. Wenn also eine unterteilte Wellenlängenbandzahl p (= 0, 1, 2, ..., P-1; P = die Anzahl der Unterteilungen) ist, eine Zahl einer markierten fluoreszierenden Substanzart q (= 0, 1, 2, ..., Q- 1; Q = die Anzahl der fluoreszierenden Substanzarten) ist, und eine Zahl einer Störfluoreszenz r (= 0, ..., R-1; R = die Anzahl der eingestellten fluoreszierenden Störsubstanzarten) ist, werden entsprechende Signalkomponenten zu einem Zeitpunkt t wie folgt dargestellt.
  ein Elektropherogrammsignal für jeden erkannten unterteilten Wellenlängenband: s (p, t)
  eine Fluoreszenzintensität von einer markierten fluoreszierenden Substanz während der Elektrophorese: f (q, t)
  eine Intensität eines elektrophorierten Fluoreszenzstörrauschens: n (r, t)
  eine Hintergrundintensität für jeden unterteilten Wellenlängenband: b (p, t)
  ein Fluoreszenzprofil einer markierten fluoreszierenden Substanz: x (q, p)
  ein Fluoreszenzprofil eines eingestellten Störrauschens: y (r, p)
• Dabei ist s (p, t) eine Intensität, die mittels Unterteilung in die mehreren Wellenlängenbanden detektiert wird (ein gemessenes Signal). Dabei ist f (q, t) die Fluoreszenzintensität jeder fluoreszierenden Substanz, die von einer Elektrophoresebande emittiert wird, und dergleichen. Dabei ist n (r, t) eine Intensität eines Störrauschens, das als in der Elektrophoresebande beinhaltet gilt. Dabei ist b (p, t) eine Hintergrundintensität eines jeden Detektionswellenlängenbands. Die Hintergrundintensität ist die Intensität eines Signals, das als Basislinie dient, und kann durch Extraktion eines Signals, das im tatsächlich detektierten s (p, t) auf nicht-pulsierende Weise schwankt, gewonnen werden. Dabei ist x (q, p) ein Fluoreszenzprofil von jeder markierten fluoreszierenden Substanz und ist ein Profil, das durch Standardisierung einer Intensität erhalten wird, die je Detektionswellenlängenband (p) detektiert wird, wenn jede markierte fluoreszierende Substanz (markierte fluoreszierende Substanzart (q)) selbst ein Licht je nach fluoreszierender Substanzart abgibt. Diese wird bei der Bestimmung der markierten fluoreszierenden Substanz eindeutig festgelegt und entspricht einem Fluoreszenzspektrum. Dabei ist y (r, p) ein Profil, das ähnlich wie x (q, p) für die als Störrauschen betrachtete Fluoreszenz berechnet und entsprechend einem Fluoreszenzspektrum des Störrauschens eingestellt wird. Beispielsweise ist dies ein Profil, das durch die Analyse des Störrauschens auf der Grundlage der akkumulierten Detektionsdaten gewonnen wird (bzw. davon ausgehend, welche Eigenschaft das Störrauschen hat). Auch wenn hier als „Störrauschprofil“ ausgedrückt, ist zu beachten, dass es auch als Profil einer anderen fluoreszierenden Substanz ausgedrückt werden kann, die sich von der markierten fluoreszierenden Substanz unterscheidet.
• Wenn im obigen eine Matrix, die s (0, t), ..., s (P-1, t) in P Zeilen und 1 Spalte darstellt, S ist, eine Matrix, die f (0, t), ..., f (Q-1, t) in Q Zeilen und 1 Spalte darstellt, F ist, eine Matrix, die n (0, t), ..., n (R-1, t) in R Zeilen und 1 Spalte darstellt, N ist, eine Matrix, die b (0, t), ...., b (P-1, t) in P-Zeilen und 1 Spalte darstellt, B ist, eine Matrix, die x (0, 0), ..., x (Q-1, P-1) in P-Zeilen und Q-Spalte darstellt, X ist, und eine Matrix, die y (0, 0), ..., y (R-1, P-1) in P-Zeilen und R-Spalte darstellt, Y ist, kann eine Formel (1) ausgedrückt werden. Zu beachten ist, dass die Matrizen S, F, N, B, X und Y in der Formel (1) kursiv und fett dargestellt sind.
  [Math. 1] $$S=XF+YN+B$$

  

  $$S=\left(\begin{array}{l}\text{s}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{s}\left(\text{r-1}\text{.t}\right)\hfill \end{array}\right)F=\left(\begin{array}{l}\text{f}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{.}\hfill \\ \text{f}\left(\text{0-1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)N=\left(\begin{array}{l}\text{n}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ \text{n}\left(\text{R-1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)B=\left(\begin{array}{l}\text{b}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{b}\left(\text{P-1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)$$

  

  $$X=\left(\begin{array}{cccccc}\text{x}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,0}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{0-1}\text{,0}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{0-1}\text{,1}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,2}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{0-1}\text{,2}\right)\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,P-1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,P-1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{0-1}\text{,P-1}\right)\end{array}\right)Y=\left(\begin{array}{ccccc}\text{y}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,0}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,1}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,2}\right)\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,P-1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,P-1}\right)\end{array}\right)$$

  
• Wenn z. B. die Anzahl der Unterteilungen zwanzig, die Anzahl der markierten fluoreszierenden Substanzen sechs und die Anzahl der fluoreszierenden Störsubstanzen zwei beträgt, kann dies als Formel (2) ausgedrückt werden.
  [Math. 2] $$\left(\begin{array}{l}\text{s}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{s}\left(\text{18}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{19}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)\text{=}\left(\begin{array}{cccccc}\text{x}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,0}\right)& .& .& .& \text{x}\left(\text{5}\text{,0}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,1}\right)& .& .& .& \text{x}\left(\text{5}\text{,1}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,2}\right)& .& .& .& \text{x}\left(\text{5}\text{,2}\right)\\ .& .& & .& & .\\ .& .& & .& & .\\ .& .& & .& & .\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,18}\right)& .& .& .& \text{x}\left(\text{0518}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,19}\right)& .& .& .& \text{x}\left(\text{5}\text{,19}\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}\text{f}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{3}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{4}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{5}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)\text{+}\left(\begin{array}{cc}\text{y}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,0}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,1}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,2}\right)\\ .& .\\ .& .\\ .& .\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,18}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,18}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,19}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,19}\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}\text{n}\left(\text{0}\text{,t}\right)\\ \text{n}\left(\text{1}\text{,t}\right)\end{array}\right)\text{+}\left(\begin{array}{l}\text{b}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{b}\left(\text{18}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{19}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)$$

  
• In der Formel (1) sorgt das Zusammensetzen der Matrix F und der Matrix N und das Ersetzen durch eine Matrix G in (Q+R) Zeilen und 1 Spalte und das Zusammensetzen der Matrix X und der Matrix Y und das Ersetzen durch eine Matrix Z in P Zeilen und (Q+R) Spalten für einen Ausdruck als Formel (3). Wenn die Anzahl der Unterteilungen P zwanzig, die Anzahl der markierten fluoreszierenden Substanzen Q sechs und die Anzahl der fluoreszierenden Störsubstanzen R zwei ist, kann die Formel (3) als Formel (4) ausgedrückt werden. Zu beachten ist, dass die Matrizen S, G, B und Z in der Formel (3) kursiv und fett dargestellt sind.
  [Math. 3] $$S=ZG+B$$

  

  $$G=\left(\begin{array}{l}\text{g}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{g}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{g}\left(\text{Q+R-1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{l}\text{f}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{f}\left(\text{Q-1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{n}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{n}\left(\text{R-1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)$$

  

  $$Z=\left(\begin{array}{cccccc}\text{z}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{z}\left(\text{1}\text{,0}\right)& .& .& .& \text{z}\left(\text{Q+R-1}\text{,0}\right)\\ \text{z}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{z}\left(\text{1}\text{,1}\right)& .& .& .& \text{z}\left(\text{Q+R-1}\text{,1}\right)\\ \text{z}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{z}\left(\text{1}\text{,2}\right)& .& .& .& \text{z}\left(\text{Q+R-1}\text{,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ \text{z}\left(\text{0}\text{,P-1}\right)& \text{z}\left(\text{1}\text{,P-1}\right)& .& .& .& \text{z}\left(\text{Q+R-1}\text{,P-1}\right)\end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccc}\text{x}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,0}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{Q-1}\text{,0}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{Q-1}\text{,1}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,2}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{Q-1}\text{,2}\right)\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,P-1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,P-1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{x}\left(\text{Q-1}\text{,P-1}\right)\end{array}\begin{array}{ccccc}\text{y}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,0}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,1}\right)\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,2}\right)\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{.}\\ \text{y}\left(\text{0}\text{,P-1}\right)& \text{.}& \text{.}& \text{.}& \text{y}\left(\text{R-1}\text{,P-1}\right)\end{array}\right)$$

  

  [Math. 4] $$\left(\begin{array}{l}\text{s}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{s}\left(\text{18}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{s}\left(\text{19}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccccc}\text{x}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{2}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{3}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{4}\text{,0}\right)& \text{x}\left(\text{5}\text{,0}\right)& \text{y}\left(\text{0}\text{,0}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,0}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{2}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{3}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{4}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{5}\text{,1}\right)& \text{y}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,1}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,1}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{2}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{3}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{4}\text{,2}\right)& \text{x}\left(\text{5}\text{,2}\right)& \text{y}\left(\text{0}\text{,2}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .& .& .\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{2}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{3}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{4}\text{,18}\right)& \text{x}\left(\text{5}\text{,18}\right)& \text{y}\left(\text{0}\text{,18}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,18}\right)\\ \text{x}\left(\text{0}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{1}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{2}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{3}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{4}\text{,19}\right)& \text{x}\left(\text{5}\text{,19}\right)& \text{y}\left(\text{0}\text{,19}\right)& \text{y}\left(\text{1}\text{,19}\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}\text{f}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{3}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{4}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{f}\left(\text{5}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{n}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{n}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{l}\text{b}\left(\text{0}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{1}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{2}\text{,t}\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ \text{b}\left(\text{18}\text{,t}\right)\hfill \\ \text{b}\left(\text{19}\text{,t}\right)\hfill \end{array}\right)$$

  
• Die Formel (3) stellt ein Matrixumrechnungsverfahren dar, das ein Störrauschen als fluoreszierenden Substanz betrachtet, davon ausgeht, dass die Probe den Q-Typ einer markierten fluoreszierenden Substanz, die in der Probe verwendet wird, und den R-Typ einer fluoreszierenden Störsubstanz enthält, und Fluoreszenzspektralintensitäten in Intensitäten der fluoreszierenden Substanzarten in Q+R-Typen von fluoreszierenden Substanzen umgerechnet.
• Wenn die Störfluoreszenz nicht detektiert wird, ist die Matrix N ≈ 0, und somit wird eine gewöhnliche Umrechnung durchgeführt. Wenn ein Störpeak durch Elektrophorese erkannt wird, ist es effektiv, die Matrix F und die Matrix N bei der Berechnung einer Basensorte und dergleichen zu erhalten.
• Die Matrix X und die Matrix Y sind feste Werte, die unter Elektrophoresebedingungen, wie einer fluoreszierenden Substanzart und einer Unterteilungsbedingung eines Fluoreszenzspektrums bestimmt werden. Aus diesen Werten und der gemessenen Matrix S und Matrix B werden nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate die Matrix F und die Matrix N zu jedem Zeitpunkt bestimmt. Mit diesem Hergang kann die Intensitätswellenform Matrix F der markierten fluoreszierenden Substanz, aus der ein Effekt des Störfluoreszenzpeaks entfernt wird, erhalten werden, und es können genaue Werte einer Basensorte und eines Fragmenttyps erhalten werden (ein Analyseverfahren 1).
• Das Berechnen einer Intensität für jeden Detektionswellenlängenband, d.h. einer Matrix YN aus der in der oben beschriebenen Berechnung erhaltenen Matrix N, und Subtrahieren dieser von der Matrix S, sichert den Erhalt eines Elektropherogramms, aus dem der Störpeak entfernt ist (ein Analyseverfahren 2).
• <Analyseprozess in der Datenverarbeitungseinheit>
• Hier werden die oben beschriebenen Analyseverfahren 1 und 2 als Prozesse beschrieben, die von der Datenverarbeitungseinheit 101 ausgeführt werden. 3 ist ein Flussdiagramm zur Darlegung eines Analyseprozesses von Elektrophoresedaten, der von der Datenverarbeitungseinheit 101 basierend auf dem Analyseverfahren 1 ausgeführt wird. 4 ist ein Flussdiagramm zur Darlegung eines Analyseprozesses von Elektrophoresedaten, der von der Datenverarbeitungseinheit 101 basierend auf dem Analyseverfahren 2 ausgeführt wird.
• Prozess gemäß Analyseverfahren 1
• Schritt 301
• Die Detektionsmechanismuseinheit 37 detektiert die Fluoreszenz, die von einer Untersuchungsprobe bei Bestrahlung der Untersuchungsprobe mit dem Laserlicht 9 generiert wird. In der Detektionsmechanismuseinheit 37 wird der zweidimensionale Detektor 34 in P aus einem Detektionswellenlängenband 0 bis P-1 unterteilt (P: die Anzahl der unterteilten Wellenlängen, z. B. P = 20), und die Detektionsdaten zu einer vorgegebenen Elektrophoresezeit t (z. B. t = 0 bis 10000) werden wiederholt ausgegeben. Die Datenverarbeitungseinheit 101 erhält die von der Detektionsmechanismuseinheit 37 wiederholt ausgegebenen Detektionsdaten als Elektropherogrammsignal (Elektrophoresedaten) s (p, t). Das heißt, hier können Elektropherogrammsignale von der Anzahl der unterteilten Wellenlängenbanden (P) erhalten werden. Die Datenverarbeitungseinheit 101 speichert beispielsweise die Elektropherogrammsignale s (p, t) von den sequentiell erhaltenen jeweiligen Wellenlängenbanden vorübergehend im Speicher 102.
• Schritt 302
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 liest die Elektropherogrammsignale in den jeweiligen Wellenlängenbanden aus dem Speicher 102 aus und extrahiert aus den Signalen jedes Signal, das eine nicht pulsierende Fluktuation aufweist, als ein Signal b (p, t) einer zeitlichen Änderung der Hintergrundintensität. Das heißt, da das Elektropherogrammsignal für jeden unterteilten Wellenlängenband (P-Teilung) erhalten wird, wird die zeitliche Änderung der Hintergrundintensität P extrahiert. Insbesondere wird ein Fluoreszenzintensitätssignal als hochfrequente Komponente entfernt, indem beispielsweise ein Tiefpassfilter auf das Elektropherogrammsignal s (p, t) angewendet wird, und außerdem werden Wellentäler detektiert und ein Signal, das durch Verbinden der Positionen der Wellentäler erhalten wird, kann als zeitliche Änderung b (p, t) der Hintergrundintensität eingestellt werden. Alternativ gibt es, zum Beispiel, ein Verfahren, um eine zeitliche Änderung der Hintergrundintensität einzustellen, indem man die Mindestintensität bei jedem konstanten Abschnitt erhält und diese verbindet.
• Schritt 303
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 liest die Fluoreszenzprofile der jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanzen, die in der Untersuchungsprobe verwendet werden, und ein Fluoreszenzprofil von einer anderen fluoreszierenden Substanz als die markierten fluoreszierenden Substanzen (eine nicht markierte fluoreszierenden Substanz: zum Beispiel, ein Störrauschen), die vorläufig erstellt werden, aus dem Speicher 102 aus. Die jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanzprofile sind eindeutig spezifizierte Profile, sofern Arten der markierten fluoreszierende Substanzen gefunden werden. Das Fluoreszenzprofil eines Störrauschens wird bestimmt, indem ein Merkmal eines Profils, welches das Störrauschen aufweist, angenommen wird, und jedes von den mehreren der in der Vergangenheit erhaltenen Elektrophoresedaten (die Elektropherogrammsignale) auf der Grundlage des angenommenen Profilmerkmals analysiert wird. Dementsprechend sind diese Profile feste Werte, die anhand der Elektrophoresebedingungen (einer fluoreszierenden Substanzart, einer Unterteilungsbedingung und dergleichen) bestimmt werden. Beispielsweise wurde jedes der markierten fluoreszierenden Substanzprofile und das Störfluoreszenzprofil vor der Durchführung der Elektrophorese ermittelt und im Speicher 102 vorab gespeichert.
• Schritt 304
• Die oben beschriebene Formel (2) oder (4) bezeichnet einen Zusammenhang zwischen dem detektierten Elektropherogrammsignal s (p, t), der Hintergrundintensität b (p, t) während der Elektrophorese, den Fluoreszenzprofilen x (q, p) der jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanz und dem eingestellten Störrauschprofil y (r, p); und die Fluoreszenzintensität f (q, t) der markierten fluoreszierenden Substanz während der Elektrophorese und die Intensität n (r, t) des Fluoreszenzrauschens während der Elektrophorese, in der vorbestimmten Anzahl von unterteilten Wellenlängen.
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 berechnet die Fluoreszenzintensität f (q, t) zu jedem Zeitpunkt und die Störfluoreszenzintensität n (r, t) zu jedem Zeitpunkt mit dem Verfahren der kleinsten Quadrate (ein Beispiel) auf Grundlage, zum Beispiel, der Formel (4).
• Schritt 305
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 zeigt die in Schritt 304 berechnete Fluoreszenzintensität f (q, t) zu jedem Zeitpunkt auf der Ausgabevorrichtung (einer Anzeigevorrichtung) 105 bei jeder markierten fluoreszierenden Substanz an (siehe z. B. 10 von Beispiel 2).
• Schritt 306
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 analysiert die Fluoreszenzintensität f (q, t) zu jedem in Schritt 304 berechneten Zeitpunkt, um eine in der Untersuchungsprobe enthaltenen Basensequenz zu bestimmen. Die Information über die ermittelte Basensequenz kann auf der Ausgabevorrichtung (der Anzeigevorrichtung) 105 angezeigt werden. Zu beachten ist, dass ein bekanntes Verfahren (z. B. das in Patentliteratur 1 beschriebene Verfahren) beim Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz verwendet werden kann.
• Prozess gemäß Analyseverfahren 2
• Bei dem Analyseverfahren 2 werden die gleichen Prozesse wie bei dem Analyseverfahren 1 von Schritt 301 bis 304 durchgeführt. Daher werden hier nur die Schritte 401 bis 403 beschrieben, die sich von dem Analyseverfahren 1 unterscheiden.
• Schritt 401
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 multipliziert das aus dem Speicher 102 ausgelesene Störfluoreszenzprofil y (r, p) mit der in Schritt 304 berechneten Störfluoreszenzintensität n (r, t) während der Elektrophorese und subtrahiert dies von dem detektierten Elektropherogrammsignal s (p, t) jedes Wellenlängenbands, um das Elektropherogrammsignal zu erhalten, aus dem eine Störpeakkomponente entfernt wird.
• Schritt 402
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 zeigt das Elektropherogrammsignal jedes Wellenlängenbands, aus dem die in Schritt 401 berechnete Störpeakkomponente entfernt wurde, auf der Ausgabevorrichtung (der Anzeigevorrichtung) 105 an (siehe beispielsweise den unteren Teil in 5 und den unteren Teil in 6 von Beispiel 1).
• Schritt 403
• Die Datenverarbeitungseinheit 101 analysiert das Elektropherogrammsignal jedes Wellenlängenbands, aus dem die in Schritt 402 berechnete Störpeakkomponente entfernt wird, um eine in der Untersuchungsprobe enthaltene Basensequenz zu bestimmen. Die Information über die ermittelte Basensequenz kann auf der Ausgabevorrichtung (der Anzeigevorrichtung) 105 angezeigt werden. Zu beachten ist, dass ein bekanntes Verfahren (z. B. das in Patentliteratur 1 beschriebene Verfahren) beim Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz verwendet werden kann.
• <Beispiel 1>
• 5 ist eine Zeichnung, die einen Effekt des Entfernens einer Störfluoreszenz gemäß Beispiel 1 veranschaulicht. Beispiel 1 ist ein Messergebnis, das auf der Grundlage von Analyseverfahren 2 erhalten wurde. Ein oberer Teil in 5 veranschaulicht eine zeitliche Änderung eines gemessenen (detektierten) Elektropherogramms s (p, t), ein mittlerer Teil in 5 veranschaulicht eine zeitliche Änderung einer Störfluoreszenz n (r, t), die durch eine Operation erhalten wurde, und der untere Teil in 5 veranschaulicht ein Elektropherogramm mit einem geringeren Effekt eines Störfluoreszenzpeaks, das durch Entfernen einer Detektionswellenlängenbandkomponente basierend auf der n (r, t) aus dem s (p, t) erhalten wurde.
• 5 veranschaulicht die Ergebnisse der Messung und der arithmetischen Operation, wenn es sich um fünf Arten von fluoreszierenden Substanzen handelte und wenn eine Art einer Störfluoreszenz ein vorher gemessenes und eingestelltes Fluoreszenzprofil aufwies. In 5 wurde die zeitliche Änderung von s (p, t) durch Extraktion der 2., 5., 8., 11., 14. und 17. Intensität von Signalen veranschaulicht, die in zwanzig unterteilt wurden (jede Wellenform veranschaulicht eine Intensitätsänderung von sechs Detektionswellenlängenbanden an). Ein Störpeak 501 wurde nahe der Elektrophoresezeit t = 9640 Scan detektiert. Der Störpeak 501 konnte als Störrauschen bestätigt werden, da eine detektierte Bandenbreite kleiner war als die Bandenbreite eines fluoreszierenden Substanzfragments. Die Subtraktion des Detektionswellenlängenbands auf Basis der Störfluoreszenzkomponente (die Signalwellenform im mittleren Teil in 5) von der zeitlichen Änderung der Signalwellenformen s (p, t) im oberen Teil in 5 stellt sicher, dass man die Wellenformen erhält, aus denen der Störpeak entfernt ist (die Signalwellenformen im unteren Teil in 5), wodurch eine genaue Analyse der Basen sichergestellt ist.
• Es ist zwar nicht in 5 veranschaulicht, doch auch wenn die zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensität f (q, t) aus der markierten fluoreszierenden Substanz direkt nach der Formel (3) bestimmt wird (dem Analyseverfahren 1), kann die Fluoreszenzintensitätwellenform, aus der der Störpeak entfernt wurde, erhalten. Deshalb, auch wenn ein Störrauschen einen Peak von einer Elektrophoresebande einer nativen fluoreszierenden Substanz überlagert, kann dessen Effekt entfernt werden.
• <Beispiel 2>
• 6 ist eine Zeichnung, die einen Effekt des Entfernens einer Störfluoreszenz gemäß Beispiel 2 veranschaulicht. Beispiel 2 ist ein Messergebnis, das auf der Grundlage von Analyseverfahren 2 ähnlich wie bei Beispiel 1 erhalten wurde. In 6, ebenso wie in 1, veranschaulicht ein oberer Teil in 6 eine zeitliche Änderung eines gemessenen (detektierten) Elektropherogramms s (p, t), veranschaulicht ein mittlerer Teil in 6 eine zeitliche Änderung einer Störfluoreszenz n (r, t), die durch eine Operation erhalten wurde, und veranschaulicht der untere Teil in 6 ein Elektropherogramm mit einem geringeren Effekt eines Störfluoreszenzpeaks, das durch Entfernen einer Intensitätskomponente des Detektionswellenlängenbereichs auf Basis der Störfluoreszenzkomponente aus dem s (p, t) erhalten wurde.
• In Beispiel 2 werden Störpeaks nahe den Elektrophoresezeitscans t = 11170, 12220, 12650 und 12720 detektiert, und die Störpeaks 601 bis 604 sind in dem s (p, t) zu sehen. Die Peaks 601 und 602 nahe den Scans 11170 und 12220 unterscheiden sich dem Fluoreszenzprofil zufolge von der markierten fluoreszierenden Substanz. Die Peaks 603 und 604 nahe den Scans 12650 und 12720 werden auch aufgrund der im Vergleich zu vielen anderen Elektrophoresebanden verringerten Bandenbreiten als Störrauschen identifiziert. Somit wurde bestätigt, dass der Störpeak ermittelt werden konnte. Durch Subtraktion der Intensitätskomponente des Detektionswellenlängenbands basierend auf der berechneten Störfluoreszenzkomponente (die Wellenform im mittleren Teil in 6) von der zeitlichen Änderung des s (p, t) im oberen Teil in 6 lassen sich die Wellenformen, aus denen die Störpeaks entfernt wurden, erhalten (die Signalwellenformen im unteren Teil in 6). Basierend auf diesen Signalwellenformen, aus denen die Störpeaks entfernt wurden, kann die Analyse der Basen genau durchgeführt werden.
• <Beispiel 3>
• Beispiel 3 veranschaulicht einen Effekt eines Ergebnisses auf der Grundlage von Analyseverfahren 1. Beispiel 3 veranschaulicht ein Beispiel, in dem vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen bei der Messung einer Probe zur Bestimmung einer Basensequenz verwendet wurden. Als die fluoreszierenden Substanzen 1, 2, 3 und 4 werden jeweils fluoreszierende Substanzen mit Fluoreszenzmaxima bei Wellenlängen von 528 nm, 549 nm, 575 nm und 607 nm verwendet. Der zweidimensionale Detektor 34 mit einer Pixelanzahl in X-Richtung von 256 oder 512 Pixeln wird verwendet, und ein Fluoreszenzbild wird durch Dispersion der Wellenlänge auf ca. 0,72 nm/Pixel erzeugt. Die Detektionswellenlängenbereiche sind auf W1 = 520 m und W2 = 692 nm eingestellt und werden durch ihre Unterteilung in zwanzig Bereiche mit annähernd gleichen Wellenlängenbandbreiten detektiert (die Breite der jeweiligen Wellenlängenbanden beträgt etwa 8,6 nm). Der zweidimensionale Detektor 34 berechnet die Intensität durch Integration einer Intensität über annähernd alle 12 Pixel.
• 7 veranschaulicht die Fluoreszenzspektralprofile: x (q, p) der in Beispiel 3 verwendeten markierten fluoreszierenden Substanzen und ein Profil der fluoreszierenden Störsubstanz: y (r, p) (q = 0, 1, 2, 3, r = 0, p = 0, 1, 2, ..., 19). In Beispiel 3 stellten die markierten fluoreszierenden Substanzen vier Arten der fluoreszierenden Substanzen 1, 2, 3 und 4 dar, und die fluoreszierende Störsubstanz stellte eine Art dar, wobei die jeweiligen Fluoreszenzintensitätseigenschaften zusätzlich im Voraus analysiert und ihre Fluoreszenzprofile erhalten wurden. 7 veranschaulicht die Profile 701 bis 704 der markierten fluoreszierenden Substanzen 1 bis 4 und ein Profil 705 einer fluoreszierenden Störsubstanz 1. Zu beachten ist, dass zur Veranschaulichung die Signalintensität so normiert wird, dass die kumulierten Werte der Intensitäten in allen unterteilten Wellenlängenbanden 1 werden.
• Wie in 7 veranschaulicht, haben die vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen und die eine Art von fluoreszierenden Störsubstanz unterschiedliche Wellenlängenprofile und können durch das Verfahren der kleinsten Quadrate aus der oben beschriebenen Formel (3) invers umgerechnet werden. Daher verarbeitet die Datenverarbeitungseinheit 101, wie in 3 beschrieben, die Fluoreszenzintensitätswellenformen: f (0, t), f (1, t), f (2, t) und f (3, t) der markierten fluoreszierenden Substanzen während der Elektrophorese und die Intensitätswellenform: n (0, t) der Störfluoreszenzsubstanz unter Verwendung des Verfahrens der kleinsten Quadrate.
• 8 veranschaulicht ein beispielhaftes Elektropherogramm s (p, t) bei der gemessenen Elektrophorese. In 8 sind die Elektrophoresezeitscans t = 8600 bis 9100 und die jeweiligen Intensitätsänderungen von zwanzig Wellenlängenbanden bei einer Detektionswellenlänge 0 bis zu einer Detektionswellenlänge 19 dargestellt. 9 ist eine Zeichnung, die einen Teil der Intensitätswellenform: n (0, t) der Störfluoreszenzsubstanz (eine Signalintensität 901 der Störfluoreszenz 1) veranschaulicht, die mit dem Verfahren der kleinsten Quadrate analysiert wurde. Wie in 9 zu sehen ist, wird ein Störpeak nahe dem Scan t = 8800 detektiert.
• Doch auch wenn ein solcher Störpeak detektiert wird, kann mit dem Verfahren gemäß der Offenbarung (dem Analyseverfahren 1), die Fluoreszenzintensitätswellenform aus der markierten fluoreszierenden Substanz ohne Einfluss dessen analysiert werden. 10 veranschaulicht ein Ergebnis der Entfernung eines Störpeaks durch die Operation (die Fluoreszenzintensitätswellenform f (0, t), f (1, t), f (2, t) und f (3, t) aus den jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanzen: Intensitätswellenformen 1001 bis 1004 der fluoreszierenden Substanzen 1 bis 4). Währenddessen veranschaulicht 11 die Fluoreszenzintensitätswellenformen der markierten fluoreszierenden Substanzen (Intensitätswellenformen 1101 bis 1104 der fluoreszierende Substanzen 1 bis 4), die ohne die Festlegung der fluoreszierenden Störsubstanz als Vergleichsbeispiel berechnet wurden. Die Fluoreszenzintensitätswellenform 1101 der fluoreszierenden Substanz 1 in 11 ist ab der Elektrophoresezeit t = 8800 bis 8850 abgestumpft und wird durch die Fluoreszenzintensitätswellenform ( 9) vom Störrauschen beeinflusst. Daher ist es möglich, die Identifikation einer Base in dem Teil mit stumpfer Wellenform falsch zu bestimmen. So nimmt zwar die Möglichkeit eines Fehlers ab, wenn die Abstumpfung der Intensitätswellenform 1101 der fluoreszierenden Substanz 1 klein ist, doch ist es auch möglich, dass die Grundfläche der fluoreszierenden Substanz 1 überlagert und angezeigt wird, wenn die Abstumpfung der Intensitätswellenform 1101 groß ist. Dementsprechend muss der Störanteil entfernt werden, um die Grundfläche genau identifizieren zu können. Im Gegensatz dazu ist zu sehen, dass die Fluoreszenzintensität aus der markierten fluoreszierenden Substanz nahe dem Störpeak (nahe der Elektrophoresezeit t = 8800) genauer berechnet wird bei der Fluoreszenzintensitätswellenform f (q, t): (q = 0, 1, 2, 3) in 10 veranschaulicht.
• Zu beachten ist, dass im Beispiel eine Art der fluoreszierenden Störsubstanz eingestellt wurde, es aber möglich ist, ein Störrauschen mit einem anderen Profil zu entfernen, wenn zwei Arten eingestellt sind, wodurch eine höhere Genauigkeit erreicht wird. 12 ist zum Beispiel eine Zeichnung, die Profile von vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen (Profile 1201 bis 1204 von den fluoreszierenden Substanzen 1 bis 4) und Profile von zwei Arten von fluoreszierenden Störsubstanzen (Profile 1205 und 1206 von den Störfluoreszenzen 1 und 2) veranschaulicht. Auch haben in diesem Fall die vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen 1201 bis 1204 und die beiden Arten der fluoreszierenden Störsubstanzen 1205 und 1206 voneinander unterschiedliche Wellenlängenprofile und können identifiziert werden.
• Wenn der Detektionswellenlängenbereich unterteilt und detektiert wird, müssen die Detektionswellenlängenbanden nicht unbedingt kontinuierlich sein, sondern es können auch diskontinuierliche (diskrete) Wellenlängenbanden verwendet werden. Darüber hinaus können die Wellenlängenbreiten der jeweiligen Wellenlängenbanden statt der gleichen Breite für jedes Wellenlängenband (die Detektionswellenlängenbandbreite ist gleich: sie ist in Beispiel 3 gleich eingestellt) beliebige Breiten aufweisen (zum Beispiel: ungleich eingestellte Detektionswellenlängenbandbreite: eine Wellenlängenbandbreite eines Peakteils ist größer eingestellt als die anderen Teile in Beispiel 4 (13 und 14), wie später beschrieben). Beispielsweise ist es möglich, die Breite in der Nähe der Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums zu erweitern (zu vergrößern) und die Breite des Wellenlängenbands, bei dem die Raman-Streuung des Laserlichts 9 detektiert wird, zu verkleinern (zu verkleinern) und das Signal aus dem Wellenlängenband nicht zu detektieren. Da der Effekt der Raman-Streuung des Laserlichts 9, der nicht von der markierten fluoreszierenden Substanz oder der fluoreszierenden Störsubstanz stammt, im Detektionssignal erscheint, wenn die Detektionswellenlängenbreite kontinuierlich und gleich ist, ist eine ungleiche Einstellung der Detektionswellenlängenbreite effektiv. Die Anzahl der Unterteilungen muss nicht zwanzig sein, wie in jedem Beispiel angegeben. Es ist nur notwendig, das Fluoreszenzprofil der markierten fluoreszierenden Substanz und das Fluoreszenzprofil der fluoreszierenden Störsubstanz unter diesen Bedingungen einzustellen.
• <Beispiel 4>
• In Beispiel 4 wurden fünf Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen verwendet und fünf Arten von Fragmenten analysiert. Als die markierten fluoreszierenden Substanzen 1, 2, 3, 4 und 5 wurden jeweils fluoreszierende Substanzen mit den Fluoreszenzmaxima bei Wellenlängen von etwa 520 nm, 550 nm, 570 nm, 590 nm und 655 nm verwendet. Der zweidimensionale Detektor 34 mit einer Pixelanzahl in X-Richtung von 256 oder 512 Pixeln wird verwendet, und ein Fluoreszenzbild wird durch Dispersion der Wellenlänge auf ca. 0,72 nm/Pixel erzeugt. Die Detektionswellenlängenbereiche sind auf W1 = 522,5 nm und W2 = 690 nm eingestellt. Die Anzahl der unterteilten Wellenlängenbanden beträgt zwanzig Unterteilungen, ähnlich wie in Beispiel 3. Die Wellenlängenbreiten (= Anzahl der Pixel) der jeweiligen Detektionswellenlängenbanden sind nicht identisch, sondern die Wellenlängen nahe der Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums wurden erweitert (vergrößert) und die anderen Wellenlängen wurden verkleinert (verringert) eingestellt. Die Breiten und die Intervalle der Detektionswellenlängenbanden wurden zufällig eingestellt.
• 13 ist eine Zeichnung, in der die Fluoreszenzspektralprofile: x (q, p) der in Beispiel 4 verwendeten markierten fluoreszierenden Substanzen veranschaulicht sind. 14 ist eine Zeichnung, in der die in Beispiel 4 verwendeten Störfluoreszenzprofile: y (r, p) (q = 0, 1, 2, 3, 4, r = 0, 1, p = 0, 1, 2, ..., 19) veranschaulicht sind. In Beispiel 4 wurde zusätzlich jede der Fluoreszenzstärkeeigenschaften vorab unter Verwendung von fünf Fluoreszenzarten 1, 2, 3, 4 und 5 für die markierte fluoreszierende Substanz und zwei Arten für die fluoreszierende Störsubstanz analysiert und ihre Fluoreszenzprofile erhalten. Die Intensitäten der Fluoreszenzprofile werden dargestellt, indem der integrierte Wert der Intensitäten der Wellenlängenbanden zu 1 normiert wird. Zu beachten ist, dass die Zahlen der Detektionswellenlängenbanden 1, 4, 7, 10 und 16 eingestellt sind, um die Fluoreszenz in etwa fünf Wellenlängenbereichen maximaler Fluoreszenz zu detektieren. Wie aus 13 und 14 ersichtlich ist, haben die fünf Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen und die zwei Arten von fluoreszierenden Störsubstanzen voneinander unterschiedliche Fluoreszenzprofile. Dementsprechend ist die inverse Umrechnung mit dem Verfahren der kleinsten Quadrate nach Formel (3) möglich. In Anbetracht dessen berechnet die Datenverarbeitungseinheit 101 die Fluoreszenzintensitätswellenformen aus den markierten fluoreszierenden Substanzen während der Elektrophorese: f (q, t), und die Intensitätswellenformen der fluoreszierenden Störsubstanzen: n (r, t) gemäß dem oben beschriebenen Analyseverfahren 1.
• 15 ist eine Zeichnung, die ein beispielhaftes Elektropherogramm s (p, t) während der gemessenen Elektrophorese veranschaulicht. 15 veranschaulicht die Intensitätsänderungen von zwanzig Wellenlängenbanden aus dem Detektionswellenlängenband 0 bis zum Detektionswellenlängenband 19 aus dem Elektrophoresezeitscan t = 10000 bis 115000. 16 ist eine Zeichnung, die Teile von Intensitätswellenformen der fluoreszierenden Störsubstanzen: n (r, t) veranschaulicht, die gemäß dem Analyseverfahren 1 berechnet wurden. Mit Bezug auf 15 wird ein Peak 1501, der keine Fluoreszenz aus den markierten fluoreszierenden Substanzen darstellt, nahe Scan t = 11100 erkannt. In 15 unterscheidet sich das Fluoreszenzprofil des Peaks 1501 von den fünf Arten der markierten fluoreszierenden Substanzen, und die Bandbreite ist im Vergleich zu den Fragmenten, die mit den fluoreszierenden Substanzen markiert sind, offenbar schmal. In Anbetracht dessen kann der Peak 1501 als Störpeak erkannt werden. Doch auch wenn ein solcher Störpeak 1501 detektiert wurde, konnte in Beispiel 4 die Fluoreszenzintensitätswellenform aus der markierten fluoreszierenden Substanz ohne Einfluss dessen analysiert werden.
• 17 ist eine Zeichnung, die ein Ergebnis (die Fluoreszenzintensitätwellenform: f (q, t) aus den markierten fluoreszierenden Substanzen während der Elektrophorese) veranschaulicht, das durch die Operation des Analyseverfahrens 1 erhalten wurde. 18 ist indes eine Zeichnung, in der die Fluoreszenzintensitätwellenformen der markierten fluoreszierenden Substanzen veranschaulicht werden, die ohne Einstellung des Fluoreszenzprofils y (r, p) der fluoreszierenden Störsubstanz als Vergleichsbeispiel berechnet wurden. In 18 ist ein scharfer Peak 1801 beim Scan t = 11100 zu erkennen. Im Gegensatz dazu erscheint der Peak 1801 nicht in den Fluoreszenzintensitätswellenformen f (q, t), die in 17 veranschaulicht sind. Dann führt die Datenverarbeitungseinheit 101 einen Analyseprozess an den Fluoreszenzintensitätswellenformen durch, aus dem der Störpeak 1801 entfernt wird. Dies stellt die Durchführung einer Fragmentanalyse mit geringerem Störeinfluss sicher.
• Zu beachten ist, dass in Beispiel 4 der Effekt der Störentfernung auch dann festgestellt werden konnte, wenn eine Art der fluoreszierenden Störsubstanz eingestellt war. Die Fragmentanalyse kann verschiedene Kombinationsmöglichkeiten der fluoreszierenden Substanzen berücksichtigen, wie im Fall von sechs oder vier Arten von markierten fluoreszierenden Substanzen, und kann den Störpeak identifizieren, um dessen Einfluss zu reduzieren.
• <Zuverlässigkeitsanzeige der Verarbeitung von Elektrophoreseergebnissen>
• In den oben beschriebenen Beispielen 1 bis 4 wird die Fluoreszenzintensität von einer anderen Substanz als der markierten fluoreszierenden Substanz als das Störrauschen extrahiert (siehe 5, 6, 9 und 16). Ideal ist, dass ein derartiges Störrauschen nicht in einem Elektrophoreseergebnis erscheint, aber es ist sehr schwierig, es auf Null zu bringen. Auch wenn die Vermischung des Störrauschens unvermeidlich ist, kann bei häufigem Auftreten des extrahierten Störrauschens oder bei zu großer Intensität (Pegel) des Störrauschens die Zuverlässigkeit des entsprechenden Elektrophoreseergebnisses (Detektionsdaten) selbst als gering eingestuft werden. Daher, zum Beispiel, wurden ein Schwellenwert der Auftretensfrequenz von Störrauschen und ein Schwellenwert der Intensität, die als wenig zuverlässig bestimmt werden kann, voreingestellt. Dann bestimmt die Datenverarbeitungseinheit 101, ob die extrahierte Auftretensfrequenz und Intensität des Störrauschens die oben beschriebenen Schwellenwerte überschreiten oder nicht, bestimmt, dass die Zuverlässigkeit des Elektrophoreseergebnisses niedrig ist, wenn mindestens ein Schwellenwert überschritten wird, und gibt das Bestimmungsergebnis an das Ausgabegerät 105 aus. Das Ausgabeformat kann eine Alarm- oder Warnanzeige sein, die auf dem Bildschirm angezeigt wird. Auf diese Weise kann eine Elektrophoresevorrichtung bereitgestellt werden, die eine Einheit zur Bestimmung der Elektrophoreseauswertung umfasst, wobei das Elektrophoreseergebnis anhand der Peakintensität und der Auftretensfrequenz ausgewertet wird. Dann kann ein Bediener bestimmen, ob die Messung der Elektrophorese erneut durchgeführt werden sollte.
• <Zusammenfassung>
• (i) Während in der Ausführungsform die Probe durch Kapillarelektrophorese elektrophoretisch aufgetrennt wird und die Zeitwellenform davon analysiert wird, ist die Offenbarung nicht auf die Kapillarelektrophorese beschränkt und ist allgemein auf die Elektrophorese anwendbar und weist einen ähnlichen Effekt auf. Die Emission von Licht durch eine andere Substanz als die markierte fluoreszierende Substanz kann auch dann erzeugt werden, wenn eine andere Messmethode als die Elektrophorese verwendet wird.
• Bei der Elektrophorese, wenn eine umgesetzte Probe in einem Medium mit Molekularsiebeffekt (z. B. einer wässrigen Polymerlösung) elektrophoretisch aufgetrennt wird, bewegen sich die Moleküle in der Reihenfolge des kleinsten Molekulargewichts und, insbesondere im Falle von DNA, trennt sich dabei jede einzelne Base. Das sequentielle Auslesen ermöglicht daher die Messung der Signalintensität. Da das Auslesen jeder einzelnen Base eine grundlegende Abfolge ist, können auch andere Verfahren als die Elektrophorese als Verfahren zum Auslesen jeder einzelnen Base verwendet werden. Zum Beispiel kann das Signal von jeder einzelnen Base gelesen werden, indem ein Verfahren wiederholt wird, wie z. B. das Anbringen einer fluoreszierenden Substanz an jeweils einer Base auf einem Substrat und-das Lesen dieser, dann das Entfernen dieser und das Anbringen einer fluoreszierenden Substanz an der nächsten Base und das Lesen dieser. Auch bei einem derartigen Verfahren und einer Vorrichtung zur Detektion der Basensequenz von DNA, bei dem sie sequenziell zur Reaktion gebracht werden, wird in manchen Fällen die Fluoreszenz von anderen als der markierten fluoreszierenden Substanz bei der Nachweisreaktion überlagert. Das heißt, es liegt ein Fall vor, bei dem das Signal von der anderen fluoreszierenden Substanz als der markierten fluoreszierenden Substanz (die als fluoreszierende Störsubstanz betrachtet wird) detektiert wird, und dies ist das Störrauschen. Daher, selbst wenn jede einzelne Base gelesen wird, wird das Störrauschen das von der Base abgeleiteten Fluoreszenzintensitätssignal überlagern und wird detektiert, da die zeitliche Information im detektierten Signal im Grunde die gleiche wie bei der Basen-Elektrophorese ist, bei der die Base kontinuierlich gelesen wird. Die Identifizierung der Lichtemission der anderen Substanz als der markierten fluoreszierenden Substanz, die Einstellung ihres Fluoreszenzprofils und die Durchführung einer Umrechnungsoperation unter der Annahme, dass die Fluoreszenz der markierten fluoreszierenden Substanz und der anderen fluoreszierenden Substanz Licht emittiert, ermöglicht die Trennung der Intensität der markierten fluoreszierenden Substanz von der Intensität der anderen fluoreszierenden Substanz, wodurch eine genauere Berechnung der Basensorte sichergestellt wird.
• Dementsprechend ermöglicht die Anwendung des Verfahrens der Offenbarung die Entfernung des Störrauschens in einem anderen Verfahren als der Elektrophorese, ähnlich wie im Fall der Elektrophorese.
• (ii) Während die Ausführungsform am Beispiel von DNA beschrieben wurde, ist das Verfahren der Offenbarung auf Biopolymere, wie Polysaccharide, Proteine (Enzym, Peptid) und Nukleinsäuren (DNA, RNA) anwendbar.
• (iii) In der Ausführungsform werden das Profil vom Q-Typ (Q ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) der markierten fluoreszierenden Substanz, die in dem Biopolymer verwendet werden, und das Profil der nicht markierten fluoreszierenden Substanz (z.B. ein Störrauschen) als R-Typ (R ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) der fluoreszierenden Substanz, die sich von der markierten fluoreszierenden Substanz unterscheidet, voreingestellt und in dem Speicher 102 und der Speichervorrichtung 103 gehalten. Unter Verwendung eines Messverfahrens, wie der Elektrophorese, wird die zeitliche Änderung der Intensitäten der mehreren Wellenlängenbanden erfasst. Dann liest die Datenverarbeitungseinheit (z. B. der Prozessor) 101 das Profil der markierten fluoreszierenden Substanz und das Profil der nicht markierten fluoreszierenden Substanz aus dem Speicher 102 und dergleichen aus und identifiziert Q+R-Typen der fluoreszierenden Substanzen unter Anwendung der zeitlichen Änderung der Intensitäten der mehreren Wellenlängenbanden, des Profils des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz und des Profils des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz. Ferner analysiert die Datenverarbeitungseinheit 101 das Biopolymer aus den Daten des identifizierten Q-Typs der fluoreszierenden Substanz. Die Analyse wird unter Verwendung eines bekannten Verfahrens durchgeführt. Durch Einführung des Profils der nicht markierten fluoreszierenden Substanz wird somit die Berechnung der Intensität der markierten fluoreszierenden Substanz selbst, ohne den Einfluss des Störrauschens, der durch die Verunreinigungen verursacht wird, ermöglicht, wodurch eine genaue Detektion und Identifizierung der Komponente des Biopolymers sichergestellt wird.
• In der Ausführungsform wird der Detektionswellenlängenbereich von einer vorbestimmten Breite (beispielsweise 520 nm bis 700 nm) eingestellt, der Detektionswellenlängenbereich wird in P (P ist eine positive ganze Zahl: beispielsweise zwanzig Unterteilungen) Wellenlängenbanden unterteilt, und die zeitliche Änderung (s (p, t)) der Intensitäten der mehreren fluoreszierenden Substanzen wird detektiert. Auf diese Weise, da die Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten der jeweiligen markierten fluoreszierenden Substanz in den einzelnen Wellenlängenbanden unterschiedlich sind, können die markierte fluoreszierende Substanz und die nicht markierte fluoreszierende Substanz genau und effizient detektiert und getrennt werden.
• Insbesondere kann die Ausführungsform die markierte fluoreszierende Substanz und die nicht markierte fluoreszierende Substanz in zwei Verfahren identifizieren. Eines ist das Verfahren, das die Operation f (q, t) aus, zum Beispiel, der oben beschriebenen Formel (1) (oder Formel (3)) ausführt, und den Q-Typ der fluoreszierenden Substanz anhand der erhaltenen f (q, t) (des Analyseverfahrens 1) identifiziert. Das andere ist das Verfahren, das die Operation n (r, t) aus Formel (1) ausführt, die Fluoreszenzintensität der nicht markierten fluoreszierenden Substanz basierend auf n (r, t) durch Subtrahieren der Detektionswellenlängenbandkomponente aus dem s (p, t) entfernt und den Q-Typ der fluoreszierenden Substanz unter Verwendung der zeitlichen Änderung der Intensitäten der mehreren fluoreszierenden Substanzen identifiziert, von denen die nicht markierte fluoreszierende Substanz entfernt wird (das Analyseverfahren 2).
• Darüber hinaus kann in der Ausführungsform der Grad der Zuverlässigkeit des Messergebnisses weiter bewertet werden, indem bestimmt wird, ob mindestens eine der Auftrittsfrequenz des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz und die Intensität der nicht markierten fluoreszierenden Substanz gleich oder größer als die voreingestellten Schwellenwerte sind oder nicht. Auf diese Weise kann ein Bediener bestimmen, ob die Messung erneut ausgeführt werden sollte.
• (iv) Die Offenbarung ist nicht auf die oben beschriebene Ausführungsform und die Beispiele beschränkt, sondern umfasst verschiedene Modifikationen. Die Beschreibungen der Ausführungsform und der Beispiele sind ausführlich beschrieben, um das Verfahren der Offenbarung deutlich zu beschreiben, und dienen notwendigerweise nicht zur Einschränkung, um alle beschriebenen Konfigurationen zu umfassen. Es ist möglich, einen Teil der Konfiguration einer bestimmten Ausführungsform durch eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform auszutauschen, und es ist auch möglich, eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform zu einer Konfiguration einer bestimmten Ausführungsform hinzuzufügen. Eine andere Konfiguration kann hinzugefügt, gelöscht und ersetzt werden durch einen Teil der Konfiguration jedes Beispiels.
• Außer der vier bis sechs Arten sind verschiedene Arten der markierten fluoreszierenden Substanzen anwendbar. Es ist auch möglich, außer einer Art und zwei Arten von fluoreszierenden Störsubstanzen mehrere Arten einzustellen. Bei den Kombinationen der fluoreszierenden Substanzen sind neben der Beispielbeschreibung verschiedene Arten von Kombinationen möglich. Für die Einstellung des Detektionswellenlängenbandes kann die Anzahl der Unterteilungen größer gewählt werden. Durch die Einstellung der jeweiligen Fluoreszenzprofile, die diesen Kombinationen entsprechen, wird eine vergleichbare Analyse sichergestellt. Während die DNA ferner im oben beschriebenen Beispiel das Messziel ist, ist es auch auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum separaten Nachweis eines biologisch relevanten Elements, wie eines Proteins, anwendbar, und die Messung, die unempfindlich gegenüber der von Verunreinigungen stammenden fluoreszierenden Komponenten ist oder die Messung mit geringerer Auswirkung, kann auf ähnliche Weise durchgeführt werden.
• Bezugszeichenliste

1

Kapillarenanordnung

2

Negative Elektrode

3

Pufferflüssigkeit auf der negativen Elektrodenseite

4

Gelblock

5

Gelblockkopplungsabschnitt

6

Ventil

7

Masseelektrode

8

Lichtbestrahlungsposition

9

Laserlicht

10

Spritze

11

Ofen

12

Pufferflüssigkeit auf der Masseelektrodenseite

15

Anordnungsplattform

16

Kapillare

20

Lichtquelle

21

Hochspannungsnetzteil

22

Probeneinführungsabschnitt

23

Erster Pufferbehälter

24

Fließmedium-Einspritzmechanismus

25

Zweiter Pufferbehälter

26

Detektor

31

Fluoreszenz-Kondensorlinse

32

Gitter

33

Fokuslinse

34

Zweidimensionaler Detektor

35

Lichtemission vom Kapillarenabschnitt

36

Lichtstrom aus der Lichtemission des Kapillarenabschnitts, parallelisiert durch die Fluoreszenzkondensorlinse

37

Detektionsmechanismuseinheit von Fluoreszenz

100

Kapillarelektrophoresevorrichtung

101

Datenverarbeitungseinheit

102

Speicher

103

Speichervorrichtung

104

Eingabevorrichtung

105

Ausgabevorrichtung

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• JP 2011030502 [0008]
• JP 2004144479 [0008]

Claims (18)

1. Biopolymer-Analyseverfahren zum Analysieren eines Biopolymers unter Verwendung des Biopolymers als Probe und mehreren fluoreszierenden Substanztypen als Marker und Detektieren der jeweiligen Fluoreszenzintensitäten, wobei das Biopolymer-Analyseverfahren umfasst: Einstellen eines Profils vom Q-Typ (Q ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) der markierten fluoreszierenden Substanz, die in der Probe verwendet wird; Einstellen eines Profils einer nicht markierten fluoreszierenden Substanz als R-Typ (R ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) der fluoreszierenden Substanz, die sich von der markierten fluoreszierenden Substanz unterscheidet; Detektieren einer Fluoreszenzintensität aus der Probe unter Verwendung eines vorbestimmten Messverfahrens; und Identifizieren von Q+R-Typen der fluoreszierenden Substanzen unter Verwendung der Fluoreszenzintensität, des Profils des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz und des Profils des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz.
2. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend Analysieren des Biopolymers aus Daten des identifizierten Q-Typs der fluoreszierenden Substanz.
3. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 1, wobei bei der Detektion der Fluoreszenzintensität aus der Probe ein Detektionswellenlängenbereich mit einer vorbestimmten Breite eingestellt wird, und der Detektionswellenlängenbereich in P (P ist eine positive ganze Zahl) Wellenlängenbanden unterteilt und detektiert wird.
4. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 3, wobei, wenn eine Detektionsintensität je unterteiltem Wellenlängenband s (p, t) ist, das Profil des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz x (q, p) ist, das Profil des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz y (r, p) ist, eine Hintergrundintensität während einer Messung b (p, t) ist, eine Fluoreszenzintensität aus der markierten fluoreszierenden Substanz f (q, t) ist und eine Fluoreszenzintensität aus der nicht markierten fluoreszierenden Substanz n (r, t) ist, werden die Q+R-Typen der fluoreszierenden Substanzen anhand der folgenden Formel identifiziert. $$\left(\begin{array}{l}s\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ s\left(\mathrm{\rho -1}\mathrm{.}t\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccc}x\left(\mathrm{0,0}\right)& x\left(\mathrm{1,0}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,0}\right)\\ x\left(\mathrm{0,1}\right)& x\left(\mathrm{1,1}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,1}\right)\\ x\left(\mathrm{0,2}\right)& x\left(\mathrm{1,2}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ x\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& x\left(\mathrm{1,}\mathrm{\rho -}1\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }-1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}t\left(0.t\right)\hfill \\ t\left(1.t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ t\left(0-1.t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{ccccc}y\left(\mathrm{0,0}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,0}\right)\\ y\left(\mathrm{0,1}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,1}\right)\\ y\left(\mathrm{0,2}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ y\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}n\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ n\left(R-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{l}b\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ b\left(\mathrm{\rho }-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)$$

   

   oder $$\left(\begin{array}{l}s\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ s\left(\mathrm{\rho -1}\mathrm{.}t\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccc}x\left(\mathrm{0,0}\right)& x\left(\mathrm{1,0}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,0}\right)\\ x\left(\mathrm{0,1}\right)& x\left(\mathrm{1,1}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,1}\right)\\ x\left(\mathrm{0,2}\right)& x\left(\mathrm{1,2}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ x\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& x\left(\mathrm{1,}\mathrm{\rho -}1\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }-1\right)\end{array}\begin{array}{ccccc}y\left(\mathrm{0,0}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,0}\right)\\ y\left(\mathrm{0,1}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,1}\right)\\ y\left(\mathrm{0,2}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ y\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}t\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ t\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ t\left(0-\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ n\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ n\left(R-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{l}b\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ b\left(\mathrm{\rho }-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)$$

   

   Wobei, hier t die Zeit ist, p eine Zahl des unterteilten Wellenlängenbandes (p = 0, 1, ..., P-1) ist, q eine Zahl einer markierten fluoreszierenden Substanzart (q = 0,1, ..., Q-1) ist, und r eine Zahl der nicht markierten fluoreszierenden Substanz (r = 0, 1, ..., R-1) ist.
5. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 4, wobei f (q, t) anhand der Formel berechnet wird, und der Q-Typ der fluoreszierenden Substanz identifiziert wird.
6. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 4, umfassend: Berechnen von n (r, t) anhand der Formel und Subtrahieren einer durch n (r, t) verursachten Signalintensität aus dem s (p, t), um eine Detektionsintensität je unterteiltem Wellenlängenband zu berechnen, aus dem die nicht markierte fluoreszierende Substanz entfernt wird; und Identifizieren des Q-Typs der fluoreszierenden Substanz.
7. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 1, umfassend Elektrophorese der Probe in einer Kapillare oder sequentielles Reagieren der Probe.
8. Biopolymer-Analyseverfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend Bewerten eines Grades der Zuverlässigkeit eines Messergebnisses durch das vorbestimmte Messverfahren, in dem bestimmt wird, ob mindestens eines von einer Auftrittsfrequenz des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz und einer Intensität der nicht markierten fluoreszierenden Substanz gleich oder größer als ein vorläufig eingestellter Schwellenwert ist oder nicht.
9. Biopolymer-Analysevorrichtung zum Analysieren eines Biopolymers unter Verwendung des Biopolymers als eine Probe und mehreren Arten von fluoreszierenden Substanzen als Marker und zum Detektieren der jeweiligen Fluoreszenzintensitäten, wobei die Biopolymer-Analysevorrichtung umfasst: eine Messeinheit, die die Fluoreszenzintensität der Probe unter Verwendung eines vorbestimmten Messverfahrens detektiert; einen Speicher, der ein Profil vom Q-Typs (Q ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) der markierten fluoreszierenden Substanz, die in der Probe verwendet wird, und ein Profil einer nicht markierten fluoreszierenden Substanz als R-Typ (R ist eine ganze Zahl von eins oder mehr) einer anderen fluoreszierenden Substanz als die markierte fluoreszierende Substanz speichert; und eine Datenverarbeitungseinheit, die das Profil des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz und das Profil des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz aus dem Speicher ausliest und die Q+R-Typen der fluoreszierenden Substanzen anhand der Detektionsintensität, des Profils des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz und des Profils des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz identifiziert.
10. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Datenverarbeitungseinheit ferner das Biopolymer anhand der Daten des identifizierten Q-Typs der fluoreszierenden Substanz analysiert.
11. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Messeinheit einen voreingestellten Detektionswellenlängenbereich einer vorbestimmten Breite in P (P ist eine positive ganze Zahl) Wellenlängenbanden unterteilt und detektiert.
12. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 11, wobei, wenn eine Detektionsintensität je unterteiltem Wellenlängenband s (p, t) ist, das Profil des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz x (q, p) ist, das Profil des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz y (r, p) ist, eine Hintergrundintensität während einer Messung b (p, t) ist, eine Fluoreszenzintensität aus der markierten fluoreszierenden Substanz f (q, t) ist und eine Fluoreszenzintensität aus der nicht markierten fluoreszierenden Substanz n (r, t) ist, die Datenverarbeitungseinheit die Q+R-Typen der fluoreszierenden Substanzen anhand der folgenden Formel identifiziert. $$\left(\begin{array}{l}s\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ s\left(\mathrm{\rho -1}\mathrm{.}t\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccc}x\left(\mathrm{0,0}\right)& x\left(\mathrm{1,0}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,0}\right)\\ x\left(\mathrm{0,1}\right)& x\left(\mathrm{1,1}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,1}\right)\\ x\left(\mathrm{0,2}\right)& x\left(\mathrm{1,2}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ x\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& x\left(\mathrm{1,}\mathrm{\rho -}1\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }-1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}t\left(0.t\right)\hfill \\ t\left(1.t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ t\left(0-1.t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{ccccc}y\left(\mathrm{0,0}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,0}\right)\\ y\left(\mathrm{0,1}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,1}\right)\\ y\left(\mathrm{0,2}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ y\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}n\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ n\left(R-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{l}b\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ b\left(\mathrm{\rho }-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)$$

    

    oder $$\left(\begin{array}{l}s\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ s\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ s\left(\mathrm{\rho -1}\mathrm{.}t\right)\hfill \end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccccc}x\left(\mathrm{0,0}\right)& x\left(\mathrm{1,0}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,0}\right)\\ x\left(\mathrm{0,1}\right)& x\left(\mathrm{1,1}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,1}\right)\\ x\left(\mathrm{0,2}\right)& x\left(\mathrm{1,2}\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ .& .& .& .& .& .\\ x\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& x\left(\mathrm{1,}\mathrm{\rho -}1\right)& .& .& .& x\left(0-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }-1\right)\end{array}\begin{array}{ccccc}y\left(\mathrm{0,0}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,0}\right)\\ y\left(\mathrm{0,1}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,1}\right)\\ y\left(\mathrm{0,2}\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,2}\right)\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ .& .& & & .\\ y\left(\mathrm{0,}\mathrm{\rho }-1\right)& .& .& .& y\left(R-\mathrm{1,}\mathrm{\rho }1\right)\end{array}\right)\left(\begin{array}{l}t\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ t\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ t\left(0-\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ n\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ n\left(R-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)+\left(\begin{array}{l}b\left(\mathrm{0,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{1,}t\right)\hfill \\ b\left(\mathrm{2,}t\right)\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ .\hfill \\ b\left(\mathrm{\rho }-\mathrm{1,}t\right)\hfill \end{array}\right)$$

    

    Wobei, hier t die Zeit ist, p eine Zahl des unterteilten Wellenlängenbandes (p = 0, 1, ..., P-1) ist, q eine Zahl eines markierten fluoreszierenden Substanztyps (q = 0, 1, ..., Q-1) ist, und r eine Zahl der nicht markierten fluoreszierenden Substanz (r = 0, 1, ..., R-1) ist.
13. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Datenverarbeitungseinheit anhand der Formel f (q, t) berechnet und den Q-Typ der fluoreszierenden Substanz identifiziert.
14. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 12, wobei durch Berechnen von n (r, t) anhand der Formel und Subtrahieren einer Signalintensität, die durch das n (r, t) verursacht wird, aus dem s (p, t), die Datenverarbeitungseinheit eine Funktion aufweist, um eine Detektionsintensität je unterteiltem Wellenlängenband, aus dem die nicht markierte fluoreszierende Substanz entfernt wird, zu berechnen und die Intensität anzuzeigen.
15. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Datenverarbeitungseinheit ferner eine Funktion zur Bewertung eines Grades der Zuverlässigkeit eines Messergebnisses durch das vorbestimmte Messverfahren aufweist, indem bestimmt wird, ob mindestens eine von einer Auftrittsfrequenz des R-Typs der nicht markierten fluoreszierenden Substanz und eine Intensität der nicht markierten fluoreszierenden Substanz gleich oder größer als ein zuvor eingestellter Schwellenwert ist oder nicht.
16. Biopolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 9, ferner umfassend eine Elektrophoresemechanismuseinheit, mit der die Probe elektrophoretisch aufgetrennt wird, oder eine sequentielle Reaktionsmechanismuseinheit, mit der die Probe sequentiell umgesetzt wird.
17. Biopolymer-Analyseverfahren zum Analysieren einer Basensequenz und/oder eines Fragmenttyps durch Markieren einer Biopolymerprobe wie DNA und/oder Oligonukleotid mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Substanz je Basensorte oder Analysefragment und Detektieren der Fluoreszenz aus der Probe, wobei das Biopolymer-Analyseverfahren umfasst Einstellen eines Fluoreszenzprofils vom Q-Typ der markierten fluoreszierenden Substanz, die in der Probe verwendet wird, und R-Typ (R ist einer oder mehrere) des Fluoreszenzprofils, das ein anderes Fluoreszenzprofil als das Fluoreszenzprofil der markierten fluoreszierenden Substanz aufweist, und Identifizieren des Q-Typs der fluoreszierenden Substanz aus der erfassten Fluoreszenzintensität und der Q+R-Typen der Fluoreszenzprofile.
18. Biopolymer-Analysevorrichtung zur Analyse einer Basensequenz und/oder eines Fragmenttyps durch Markierung einer Biopolymerprobe wie DNA und/oder Oligonukleotid mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Substanz je Basensorte oder Analysefragment und Detektieren der Fluoreszenz aus der Probe, wobei die Biopolymer-Analysevorrichtung umfasst eine Datenverarbeitungseinheit, die den Q-Typ der fluoreszierenden Substanz aus einem Fluoreszenzprofil des Q-Typs der markierten fluoreszierenden Substanz, die in der Probe verwendet wird, den R-Typ (R ist einer oder mehrere) des Fluoreszenzprofils, das ein anderes Fluoreszenzprofil als das Fluoreszenzprofil der markierten fluoreszierenden Substanz aufweist, und die detektierte Fluoreszenzintensität identifiziert.

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