DE112017006899T5 - Analysesystem und Analyseverfahren - Google Patents

Analysesystem und Analyseverfahren Download PDF

Info

Publication number
DE112017006899T5
DE112017006899T5 DE112017006899.1T DE112017006899T DE112017006899T5 DE 112017006899 T5 DE112017006899 T5 DE 112017006899T5 DE 112017006899 T DE112017006899 T DE 112017006899T DE 112017006899 T5 DE112017006899 T5 DE 112017006899T5
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
time
series data
fluorescent substances
data
components
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE112017006899.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Takashi Anazawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi High Tech Corp
Original Assignee
Hitachi High Technologies Corp
Hitachi High Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi High Technologies Corp, Hitachi High Tech Corp filed Critical Hitachi High Technologies Corp
Publication of DE112017006899T5 publication Critical patent/DE112017006899T5/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8827—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors

Abstract

Ein Analysesystem beinhaltet einen Analysator, der ausgelegt ist, um eine Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, chromatographisch zu trennen und erste Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen zu erhalten, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erfasst werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist; und einen Computer, der ausgelegt ist, um die ersten Zeitreihendaten mit den zweiten Zeitreihendaten zu vergleichen und zu bestimmen, welche Arten von fluoreszierenden Substanzen der M Arten von fluoreszierenden Substanzen die Vielzahl von Komponenten einzeln markieren.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Analysesystem und ein Analyseverfahren.
  • Stand der Technik
  • Analyseverfahren, bei denen eine Vielzahl von Arten von Komponenten, die in Proben enthalten sind, einschließlich biologischer Proben wie DNA, Proteine und Zellen, mit einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert wird (wobei die Entsprechung nicht immer eine Eins-zu-Eins-Entsprechung ist), die von der Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz identifiziert wird und somit die Vielzahl von Arten von Komponenten analysiert wird, sind weit verbreitet. Beispiele für solche Analyseverfahren schließen Chromatographie, DNA-Sequenzierung, DNA-Fragmentanalyse, Durchflusszytometrie, PCR, HPLC, Western Blot, Northern Blot, Southern Blot und mikroskopische Untersuchung ein.
  • Im Allgemeinen weisen die Fluoreszenzspektren mit einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen Überlappungen untereinander auf (im Folgenden als spektrale Überlappungen bezeichnet). Die Fluoreszenzemissionen einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen weisen auch zeitliche oder räumliche Überlappungen untereinander auf (im Folgenden als Raum-Zeit-Überlappungen bezeichnet). In den Situationen, in denen die Überlappungen vorhanden sind, besteht Bedarf an einer Technik, die Fluoreszenz erfasst und identifiziert, die von einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen emittiert wird.
  • Als Nächstes wird diese Technik anhand eines Beispiels eines DNA-Sequenzierers unter Verwendung von Elektrophorese beschrieben. Erste Elektrophorese verwendende DNA-Sequenzierer gibt es seit den 80er Jahren mit Plattenelektrophorese und in den 90er und späteren Jahren wechselte das Verfahren zur Kapillarelektrophorese. Allerdings ändern sich Techniken, die die Probleme lösen, nicht grundlegend. 3 der Nichtpatentliteratur 1 zeigt ein Verfahren nach der Plattenelektrophorese. Zu beachten ist, dass die Technik auch bei der Kapillarelektrophorese eingesetzt wird. Die grundlegenden Prozesse der Technik bestehen aus den folgenden Prozessen (1) bis (4) unter der Bedingung, dass M ≤ N.
    1. (1) Ein Laserstrahl wird auf eine Probe gestrahlt, während diese mittels Elektrophorese getrennt wird, wobei die Probe M Arten von DNA-Fragmenten enthält, die mit M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, um die fluoreszierenden Substanzen zum Emittieren von Fluoreszenz zu veranlassen, wobei die Fluoreszenz in N Farben in N Arten von Wellenlängenbändern erfasst wird und somit Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von N Farben erhalten werden.
    2. (2) Die Farbkonversion wird für jeden Zeitpunkt der Zeitreihendaten (1) angewendet, um Zeitreihendaten von Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen zu erhalten, d. h. es werden M Arten von DNA-Fragmenten erhalten.
    3. (3) Eine Korrektur aufgrund des Unterschieds in der Mobilität von M Arten von fluoreszierenden Substanzen (im Folgenden Mobilitätskorrektur genannt) wird für jeden Zeitpunkt der Zeitreihendaten (2) angewendet, um mobilitätskorrigierte Zeitreihendaten der Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen zu erhalten, d. h. M Arten von DNA-Fragmenten werden erhalten.
    4. (4) Auf der Grundlage der Zeitreihendaten (3) erfolgt ein Base-Calling.
  • Auf der Grundlage der Prozesse (1) bis (4) wird 3 der Nichtpatentliteratur 1 detailliert beschrieben. Hier ist M = 4, N = 4. Im Folgenden wird der Fall beschrieben, bei dem eine einzelne Probe mit einem einzigen Elektrophoresekanal analysiert wird. In dem Fall, dass eine Vielzahl von Proben unter Verwendung einer Vielzahl von Elektrophoresekanälen analysiert wird, werden die folgenden Prozesse parallel ausgeführt.
  • Zunächst wird (1) beschrieben. Bei der Herstellung einer Kopie von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge für eine Matrizen-DNA mittels Sanger-Reaktion werden die DNA-Fragmente jeweils mit einer von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen entsprechend den terminalen Basenspezies C, A, G und T markiert (im Folgenden werden diese fluoreszierenden Substanzen vereinfachend als C, A, G und T bezeichnet). Während die mit den fluoreszierenden Substanzen markierten DNA-Fragmente durch Elektrophorese nach Längen separiert werden, wird nacheinander ein Laserstrahl darauf gestrahlt, damit die fluoreszierenden Substanzen Fluoreszenz emittieren. Die emittierte Fluoreszenz wird in vier Arten von Wellenlängenbändern b, g, y und r (im Folgenden als Vierfarbenerfassung bezeichnet) erfasst. Die Wellenlängenbänder können den maximalen Emissionswellenlängen von C, A, G und T entsprechen. Somit werden Teile der Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten I(b), I(g), I(y) und I(r) dieser vier Farben erhalten. 3A der Nichtpatentliteratur 1 sind diese Teile von Zeitreihendaten (auch als Rohdaten bezeichnet) dieser Farben, und I(b), I(g), I(y) und I(r) sind jeweils durch blau, grün, schwarz und rot angegeben.
  • Als Nächstes wird (2) beschrieben. Die Fluoreszenzintensitäten von vier Farben zu jedem Zeitpunkt werden durch die Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T zu diesem Zeitpunkt als Gleichung (1) ausgedrückt.
    [Gleichung 1] ( I ( b ) I ( g ) I ( y ) I ( r ) ) = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( yC ) w ( yA ) w ( yG ) w ( yT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) ( D ( C ) D ( A ) D ( G ) D ( T ) )
    Figure DE112017006899T5_0001
    Hier drücken Elemente w(XY) einer 4x4-Matrix W das auf spektraler Überlappung basierende Intensitätsverhältnis aus, bei dem eine fluoreszierende Substanz Y (C, A, G oder T) in einem Wellenlängenband X (b, g, y oder r) erfasst wird. w(XY) ist der Festwert, der nur durch die Eigenschaften der fluoreszierenden Substanz Y (C, A, G oder T) und des Wellenlängenbandes X (b, g, y oder r) bestimmt wird und während der Elektrophorese nicht verändert wird.
  • Daher werden die Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen zu jedem Zeitpunkt aus den Fluoreszenzintensitäten von vier Farben zu diesem Zeitpunkt als Gleichung (2) ermittelt.
    [Gleichung 2] ( D ( C ) D ( A ) D ( G ) D ( T ) ) = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( yC ) w ( yA ) w ( yG ) w ( yT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) − 1 ( I ( b ) I ( g ) I ( y ) I ( r ) )
    Figure DE112017006899T5_0002
    Wie vorstehend beschrieben, werden die Fluoreszenzintensitäten von vier Farben mit der inversen Matrix W-1 multipliziert und damit die spektrale Überlappung gelöst (im Folgenden wird dieser Prozess als Farbkonversion bezeichnet). So werden die Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, C, A, G und T, d. h. Teile der Zeitreihendaten der Konzentrationen der DNA-Fragmente mit vier Arten von Basen an den Enden erhalten.
  • 3B der Nichtpatentliteratur 1 zeigt diese Zeitreihendaten. Die Farbkonversion ist ungeachtet des Vorhandenseins oder Fehlens der Raum-Zeit-Überlappung möglich. Wie in 3B dargestellt, zeigt das Vorhandensein der Konzentrationen einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen zur gleichen Zeit das Vorhandensein der Raum-Zeit-Überlappung.
  • 3C der Nichtpatentliteratur 1 ist ein Prozess, der keinem von (1) bis (4) entspricht und nicht unbedingt durchgeführt wird. Die Zeitreihendaten in 3B werden durch Dekonvolution in einzelne Peaks aufgetrennt, d. h. Signale drücken die Konzentrationen der DNA-Fragmente einer einzelnen Länge aus, die mit einer der vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T markiert sind, und somit wird die Raum-Zeit-Überlappung gelöst.
  • Schließlich werden (3) und (4) beschrieben. Im Allgemeinen werden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, deren Längen sich um eine Base unterscheiden, durch Elektrophorese annähernd in regelmäßigen Abständen aufgetrennt. Der Einfluss der fluoreszierenden Substanz, mit der das DNA-Fragment markiert ist, verändert jedoch die Mobilität (Elektrophoresegeschwindigkeit), was die regelmäßigen Intervalle manchmal ungleich macht. Daher wird vorher die Größenkorrelation der Mobilität nach den zu markierenden Arten von fluoreszierenden Substanzen überprüft und die Zeitreihendaten in 3B oder 3C der Nichtpatentliteratur 1 werden basierend auf Informationen über die Größenkorrelation korrigiert. So werden Zeitreihendaten erhalten, in denen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, deren Längen sich um eine Base unterscheiden, annähernd in regelmäßigen Abständen angeordnet sind. 3D der Nichtpatentliteratur 1 zeigt diese Zeitreihendaten. Blaue, grüne, schwarze und rote Peaks drücken jeweils die Konzentrationen von DNA-Fragmenten einer Länge mit den endständigen Basenspezies C, A, G und T aus. In 3D sind die DNA-Fragmente in der Reihenfolge der Längen angeordnet, die sich um eine Base unterscheiden. Daher sind, wie in 3D dargestellt, die terminalen Basisspezies in Reihenfolge angeordnet und somit kann das Ergebnis des Base-Callings erhalten werden.
  • In den obigen Prozessen oder vor und nach den Prozessen werden die Zeitreihendaten manchmal auf geeignete Weise einer Verarbeitung unterzogen, wie z. B. Glättung, Rauschfilterung und Entfernung der Basislinie.
  • Im Farbkonversionsprozess in (2), wie durch Gleichung (1) ausgedrückt, werden die Unbekannten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T gefunden, indem vier gleichzeitige Gleichungen gelöst werden, die sich aus den bekannten Mengen von vier Arten von Fluoreszenzerfassungsintensitäten I(b), I(g), I(y) und I(r) in den Wellenlängenbändern b, g, y und r für jeden der Zeitpunkte zusammensetzen. Da dies im Allgemeinen der Lösung von M Arten von Unbekannten durch N gleichzeitige Gleichungen entspricht, ist die Bedingung M ≤ N notwendig, wie oben beschrieben. Wenn M > N, kann keine Lösung eindeutig gefunden werden (d. h., möglicherweise ist eine Vielzahl von Lösungen vorhanden), und daher ist die Farbkonversion (Gleichung (2)) nicht machbar.
  • Die Nichtpatentliteratur 2 beschäftigt sich mit der DNA-Sequenzierung mittels Elektrophorese, jedoch unter der Bedingung M > N, wobei M = 4, N = 3. Die Fluoreszenzemission wird in drei Arten von Wellenlängenbändern b, g und r erfasst (im Folgenden als Dreifarbenerfassung bezeichnet) und dann werden die Fluoreszenzintensitäten in vier Farben zu jedem Zeitpunkt in Gleichung (1) durch Fluoreszenzintensitäten von drei Farben zu jedem Zeitpunkt in Gleichung (3) ersetzt.
    [Gleichung 3] ( I ( b ) I ( g ) I ( r ) ) = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) ( D ( C ) D ( A ) D ( G ) D ( T ) )
    Figure DE112017006899T5_0003
    Zu diesem Zeitpunkt hat die Matrix W drei Zeilen und vier Spalten und hat keine inverse Matrix. Somit kann im Gegensatz zu Gleichung (2) keine der Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen eindeutig gefunden werden. Wie oben beschrieben, kann unter der Bedingung M > N in der Regel keine Lösung gefunden werden. Eine Lösung kann jedoch durch zusätzliche, wie unten beschriebene Vorbedingungen gefunden werden.
  • Im ersten Schritt wird angenommen, dass es bei einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen keine Raum-Zeit-Überlappung gibt, d. h., es wird angenommen, dass zu einem Zeitpunkt jeweils nur eine Art von fluoreszierender Substanz Fluoreszenz emittiert. Zu diesem Zeitpunkt kann Y (C, A, G oder T), bei dem das Verhältnis von drei Farben Fluoreszenzintensitäten (I(b) I(g) I(r))T und das Verhältnis von vier Spalten (w(bY) w(gY) w(rY))T der Matrix W zu jedem der Zeitpunkte am nächsten sind, gewählt werden. Mit anderen Worten, wenn eine Art von fluoreszierender Substanz in Gleichung (3) ausgewählt wird und die Konzentrationen der restlichen drei Arten von fluoreszierenden Substanzen Null sind, d. h. wenn (D(C) D(A) D(G) D(T))T (D(C) 0 0 0)T, (0 D (A) 0 0)T, (0 0 D (G) 0)T oder (000 D(T))T ist, wird D (Y) (Y ist C, A, G oder T), bei der die Differenz zwischen der linken und der rechten Seite die kleinste ist, individuell gefunden. So kann Y (C, A, G oder T), bei dem die Differenz zwischen der linken und der rechten Seite zu diesem Zeitpunkt die kleinste ist, gewählt werden. Wenn dabei die Differenz zwischen der linken und der rechten Seite in keinem Fall ausreichend klein ist, geht der Prozess zum nachfolgenden zweiten Schritt über.
  • Im zweiten Schritt wird davon ausgegangen, dass nur zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen gleichzeitig Fluoreszenz emittieren. Wenn nun zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen in Gleichung (3) ausgewählt werden und die Konzentrationen der verbleibenden zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen Null sind, d. h. wenn (D(C) D(A) D(G) D(T))T (D(C) D(A) 0 0)T, (D(C) 0 D(G) 0)T (D (C) 0 0 D(T))T, (0 D (A) D (G) 0)T, (0 D (A) 0 D(T))T oder (0 0 D(G) D(T))T ist, werden zwei Arten von D(Y) (Y ist C, A, G oder T), bei der die Differenz zwischen der linken und der rechten Seite die kleinste ist, einzeln gefunden. So können zwei Arten von Y (C, A, G oder T) gewählt werden, bei denen die Differenz zwischen der linken und der rechten Seite zu diesem Zeitpunkt die kleinste ist.
  • Auf diese Weise werden ähnlich wie beim Prozess (2) in der Nichtpatentliteratur 1 die Zeitreihendaten der Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. vier Arten von DNA-Fragmenten, erhalten. Danach werden Prozesse durchgeführt, die den Prozessen (3) und (4) in der Nichtpatentliteratur 1 entsprechen, und somit kann das Ergebnis des Base-Callings erhalten werden.
  • Um die Bedingungen der Durchführung des ersten und zweiten Schrittes in der Nichtpatentliteratur 2, d. h. die Annahme, dass nur eine oder zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen gleichzeitig Fluoreszenz emittieren, einzuhalten, ist es notwendig, eine kleine Raum-Zeit-Überlappung einzuhalten, d. h. die beiden folgenden Bedingungen.
    1. (a) In den Zeitreihendaten der Konzentrationen von vier Arten von DNA-Fragmenten ist eine Vielzahl von Peaks, die von den DNA-Fragmenten einzelner Längen abgeleitet sind, annähernd in regelmäßigen Abständen angeordnet.
    2. (b) In den Zeitreihendaten der Konzentrationen von vier Arten von DNA-Fragmenten sind zwei benachbarte Peaks, die sich von den DNA-Fragmenten ableiten, die sich um eine Basenlänge unterscheiden, hervorragend getrennt.
  • In der Nichtpatentliteratur 2 werden vier Arten von in der Sanger-Reaktion verwendeten Primern mit vier voneinander unterschiedlichen Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert (genau genommen wird ein Markierverfahren für drei Arten von fluoreszierenden Substanzen modifiziert), und der Unterschied in der Mobilität aufgrund des Einflusses der fluoreszierenden Substanz, mit der das DNA-Fragment markiert ist, wird ausreichend verkleinert. Darüber hinaus ist die Bedingung erfüllt, bei der die Trennleistung der Elektrophorese ausreichend hoch ist. Das heißt, die Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensität dreier Farben (I(b) I(g) I(r))T, bei der die Annahmen (a) und (b) eingehalten werden, werden erhalten (der obere Teil von 2 in Nichtpatenliteratur 2). Unter diesen Bedingungen werden der erste und der zweite Schritt durchgeführt. So werden die Zeitreihendaten der Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. vier Arten von DNA-Fragmenten, erhalten und das Ergebnis des Base-Callings wird erhalten (der untere Teil von 2 in Nichtpatentliteratur 2).
  • Literaturliste
  • Nichtpatentliteratur
    • Nichtpatentliteratur 1: Genom Res. S. 644-65, 8(6), Jun. 1998
    • Nichtpatentliteratur 2: Electrophoresis, S. 1403-14, 19(8-9), Jun. 1998
  • Kurze Darstellung der Erfindung
  • Technische Aufgabe
  • Ein RGB-Farbsensor ist ein zweidimensionaler Sensor mit drei Arten von angeordneten Pixeln, wobei der Sensor ausgelegt ist, um die Wellenlängenbänder von Rot (R), Grün (G) und Blau (B) zu erfassen, was den drei Grundfarben entspricht, die menschliche Augen identifizieren können. Der RGB-Farbsensor wird nicht nur in digitalen Spiegelreflexkameras und digitalen Kompaktkameras eingesetzt, sondern auch in Digitalkameras, die in diesen Jahren bei Smartphones installiert wurden, und seine Beliebtheit nimmt weltweit explosionsartig zu. Dadurch wird die Leistung deutlich verbessert, und auch der Preis wird deutlich gesenkt. Daher ist es äußerst nützlich, dass der RGB-Farbsensor auf das Analyseverfahren angewendet wird, bei dem die Fluoreszenz, die von der Vielzahl der Arten von fluoreszierenden Substanzen emittiert wird, erfasst und dabei identifiziert wird und eine Vielzahl von Arten von Komponenten erfasst wird. Da der RGB-Farbsensor jedoch nur drei Farben erkennen kann, ist es schwierig, die Fluoreszenzemissionen von vier Arten oder mehr fluoreszierenden Substanzen zu identifizieren. Wie vorstehend beschrieben, muss zur Identifizierung der Fluoreszenzemissionen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, wenn M Arten von fluoreszierenden Substanzen eine spektrale Überlappung und eine Raum-Zeit-Überlappung aufweisen, die Erfassung von N Farben in N Arten von Wellenlängenbändern durchgeführt werden, wo die Bedingung M ≤ N erfüllt ist.
  • Die Nichtpatentliteratur 2 löst das Problem für den Fall, dass die Fluoreszenzemissionen von M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen in N = drei Farben auf dem DNA-Sequenzierer unter Verwendung von Elektrophorese erfasst werden (d. h. M > N), indem Vorbedingungen für die Raum-Zeit-Überlappung bereitgestellt werden. Dies sind die Bedingungen, unter denen nur eine oder zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen gleichzeitig Fluoreszenz emittieren, d. h. die Bedingungen (a) und (b) werden eingehalten.
  • Im Allgemeinen werden die Bedingungen (a) und (b) jedoch in vielen Fällen nicht eingehalten. Auch in den Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von drei Farben (oben) und den Zeitreihendaten der Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen (unten) in 2 der Nichtpatentliteratur 2 in den durch Sterne gekennzeichneten Bereichen sind trotz der Trennleistung der Elektrophorese drei oder mehr Peaks, die jeweils von den DNA-Fragmenten einzelner Längen abgeleitet sind, aufgrund eines als Kompression bezeichneten Phänomens gedrängt. Somit wird die Bedingung (a) nicht eingehalten und somit wird kein korrektes Base-Calling erreicht. In der Endphase der Elektrophorese in 2 der Nichtpatentliteratur 2 ist die Trennleistung der Elektrophorese verringert. Da die Trennung von zwei benachbarten Peaks, die sich von den um eine Basenlänge unterschiedlichen DNA-Fragmenten ableiten, unzureichend ist, wird die Bedingung (b) nicht eingehalten und somit wird kein korrektes Base-Calling erreicht.
  • In der Nichtpatentliteratur 2 wird die Bedingung (a) unter Verwendung eines Primer-Markierungsverfahrens erreicht, bei dem vier Arten von Primern, die in der Sanger-Reaktion verwendet werden, mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert werden, die sich voneinander unterscheiden. Heute wird jedoch anstelle des Primer-Markierungsverfahrens hauptsächlich ein Terminator-Markierungsverfahren verwendet, bei dem vier Arten von Terminatoren, die in der Sanger-Reaktion verwendet werden, mit vier Arten von verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert werden. Bei dem Primer-Markierungsverfahren ist es notwendig, die Sanger-Reaktion unter Verwendung von vier Arten von Primern, d. h. in vier verschiedenen Probenröhrchen, getrennt durchzuführen. Andererseits kann bei dem Terminator-Markierungsverfahren die Sanger-Reaktion unter Verwendung von vier Arten von Terminatoren gemeinsam, d. h. in einem Probengefäß, durchgeführt werden. Daher kann das Terminator-Markierungsverfahren die Sanger-Reaktion erheblich vereinfachen.
  • Bei dem Primer-Markierungsverfahren ist der Unterschied in der Mobilität von mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markierten DNA-Fragmenten jedoch gering, während beim Terminator-Markierungsverfahren der Unterschied in der Mobilität von mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markierten DNA-Fragmenten groß ist und somit die Bedingung (a) nicht zwangsläufig eingehalten wird. Das heißt, nicht unbedingt nur eine oder zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen emittieren Fluoreszenz, und es besteht die Möglichkeit, dass manchmal drei Arten oder mehr fluoreszierende Substanzen gleichzeitig Fluoreszenz emittieren. Daher ist es schwierig, wenn mindestens die Terminator-Markierungsverfahren verwendet wird, die DNA-Sequenzierung mit dem Verfahren der Nichtpatentliteratur 2 durchzuführen.
  • Daher dient die vorliegende Erfindung dazu, eine Analysetechnik bereitzustellen, um M Arten von Komponenten durch eine Erfassung von N Farben in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in dem Zustand nachzuweisen, in dem die von M Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz eine spektrale Überlappung und eine Raum-Zeit-Überlappung aufweist.
  • Lösung der Aufgabe
  • Um das Problem zu lösen, werden zum Beispiel die in den Ansprüchen beschriebenen Konfigurationen übernommen. Die vorliegende Anmeldung schließt mehrere Schemata ein, die das Problem lösen. So wird beispielsweise ein Analysator, der ausgelegt ist, um eine Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, chromatographisch zu trennen und erste Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen zu erfassen, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erhalten werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist; eine Speichereinheit, die ausgelegt ist, um zweite Zeitreihendaten von einzelnen Modellfluoreszenzsignalen der Vielzahl von Komponenten zu speichern; und ein Computer bereitgestellt, der ausgelegt ist, um die ersten Zeitreihendaten mit den zweiten Zeitreihendaten zu vergleichen und zu bestimmen, welche Arten von fluoreszierenden Substanzen der M Arten von fluoreszierenden Substanzen einzeln die Vielzahl von Komponenten markieren.
  • Gemäß eines anderen Beispiels wird ein Analyseverfahren bereitgestellt, das Folgendes umfasst: Chromatographisches Auftrennen einer Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, und Erfassen erster Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erhalten werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist; und Bestimmen, welche Arten von fluoreszierenden Substanzen der M Arten von fluoreszierenden Substanzen einzeln die Vielzahl von Komponenten markieren, indem die ersten Zeitreihendaten mit zweiten Zeitreihendaten von einzelnen Modellfluoreszenzsignalen der Vielzahl von Komponenten verglichen werden.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Nach der vorliegenden Erfindung können M Arten von Komponenten selbst bei M > N in dem Zustand erfasst werden, in dem die von M Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz eine spektrale Überlappung und eine Raum-Zeit-Überlappung aufweist. Es ist zu beachten, dass sich weitere Merkmale in Bezug auf die vorliegende Erfindung aus der Beschreibung der vorliegenden Patentschrift und den beigefügten Abbildungen ergeben. Andere Aufgaben, Konfigurationen und Wirkungen als die oben beschriebenen ergeben sich aus der unten folgenden Beschreibung der Ausführungsformen.
  • Figurenliste
    • 1 ist ein Diagramm, das ein DNA-Sequenzierungsverfahren gemäß Nichtpatentliteratur 1 unter Verwendung von Modelldaten zeigt.
    • 2 ist ein Diagramm, das ein DNA-Sequenzierungsverfahren gemäß Nichtpatentliteratur 2 unter Verwendung von Modelldaten zeigt.
    • 3 ist ein Diagramm, das ein Beispiel eines DNA-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung von Modelldaten gemäß einer ersten Ausführungsform zeigt.
    • 4 ist ein Diagramm, das ein weiteres Beispiel eines DNA-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung von Modelldaten gemäß einer ersten Ausführungsform zeigt.
    • 5 ist ein Diagramm, das Prozessschritte und die Konfiguration eines Systems gemäß der ersten Ausführungsform zeigt.
    • 6 ist ein Diagramm, das Prozessschritte und die Konfiguration eines Systems gemäß der ersten Ausführungsform zeigt.
    • 7 ist ein Diagramm, das Prozessschritte und die Konfiguration eines Systems gemäß einer zweiten Ausführungsform zeigt.
    • 8 ist ein Diagramm, das Prozessschritte und die Konfiguration eines Systems gemäß einer dritten Ausführungsform zeigt (M = 4, N = 3).
    • 9 ist ein Diagramm, das Prozessschritte und die Konfiguration eines Systems gemäß einer vierten Ausführungsform zeigt (M = 4, N = 2).
    • 10 ist ein Blockdiagramm eines Kapillarelektrophoresegeräts.
    • 11 ist ein Blockdiagramm eines Mehrfarbenerfassungssystems eines Kapillarelektrophoresegeräts.
    • 12 ist ein Blockdiagramm eines Computers.
    • 13 zeigt eine fünfte Ausführungsform, bei der die DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Prozessschritte und Konfigurationen des in den 9 bis 12 dargestellten Systems durchgeführt wird.
    • 14 ist ein Diagramm, das Zeitreihendaten von zwei Farbfluoreszenzintensitäten von Modellpeaks von DNA-Fragmenten einzelner Länge zeigt, die mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, gemäß der fünften Ausführungsform.
    • 15 ist ein Diagramm, das den Prozess der DNA-Sequenzierung gemäß der fünften Ausführungsform veranschaulicht.
    • 16 ist ein Diagramm, das den Prozess der DNA-Sequenzierung gemäß der fünften Ausführungsform veranschaulicht.
    • 17 ist ein Diagramm, das die terminalen Basenspezies, die Anpassungsgenauigkeit und den QV (Quality Value = Qualitätswert) für Modellpeaks in 15 (5) in der zeitlichen Reihenfolge der Elektrophorese zusammenstellt.
    • 18 ist ein Diagramm, das die terminalen Basenspezies, die Anpassungsgenauigkeit und den QV (Quality Value) für Modellpeaks in 15 (6) in der zeitlichen Reihenfolge der Elektrophorese nach Korrektur zusammenstellt.
  • Beschreibung der Ausführungsformen
  • Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen beschrieben. Es ist zu beachten, dass die beigefügten Abbildungen spezifische Ausführungsformen gemäß dem Grundsatz der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Diese Abbildungen werden jedoch zum Verständnis der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und werden keinesfalls zur eingeschränkten Auslegung der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Die folgenden Ausführungsformen beziehen sich auf eine Vorrichtung, die zu identifizierende Fluoreszenzen aus einer Probe erfasst, die eine Vielzahl von Komponenten enthält, die mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, und somit die Komponenten analysiert. Die unten folgenden Ausführungsformen sind zum Beispiel für die Bereiche Chromatographie, DNA-Sequenzierung, DNA-Fragmentanalyse, Durchflusszytometrie, PCR, HPLC, Western Blot, Northern Blot, Southern Blot, mikroskopische Untersuchung und jegliches andere Verfahren anwendbar.
  • Erfolgt die Durchführung einer DNA-Sequenzierung mittels Elektrophorese, wird der Inhalt der Nichtpatentliteraturen 1 und 2 anhand der 1 bis 4 ausführlicher beschrieben.
  • 1 zeigt ein Verfahren der Nichtpatentliteratur 1. 1 (1) zeigt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von vier Farben I(b), I(g), I(y) und I(r), die durch Vierfarbenerfassung der Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T in vier Arten von Wellenlängenbändern b, g, y und r erhalten wurden. Die horizontale Achse in 1 drückt die Zeit aus, und die vertikale Achse die Fluoreszenzintensität.
  • 1 (W) zeigt die Elemente w(XY) in vier Zeilen und vier Spalten einer Matrix W. Zum Beispiel drücken vier schwarze Balkendiagramme von links w(bC), w(gC), w(yC) und w(rC) aus. Ebenso drücken horizontal gestreifte Balkendiagramme w(XA) (X ist b, g, y und r), schräg gestreifte Balkendiagramme w(XG) (X ist b, g, y und r) und karierte Balkendiagramme w(XT) (X ist b, g, y und r) aus. Die Diagramme w(bY), w(gY), w(yY) und w(rY) sind so normalisiert, dass w(bY) + w(gY) + w(yY) + w(yY) + w(rY) = 1 (Y ist C, A, G oder T).
  • Konkret sind die Matrix W und die inverse Matrix W-1 der Matrix W wie folgt.
    [Gleichung 4] W = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( yC ) w ( yA ) w ( yG ) w ( yT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) = ( 0.56 0.26 0.16 0.09 0.28 0.43 0.24 0.18 0.11 0.22 0.40 0.27 0.06 0.09 0.20 0.45 )
    Figure DE112017006899T5_0004
     W − 1 = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( yC ) w ( yA ) w ( yG ) w ( yT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) − 1 = ( 2.55 − 1.44 − 0.27 0.23 − 1.76 4.27 − 1.68 − 0.34 0.33 − 2.12 4.64 − 2.00 − 0.12 0.29 − 1.69 3.12 )
    Figure DE112017006899T5_0005
  • I(b), I(g), I(y) und I(r) zu jedem Zeitpunkt in 1 (1) werden mit der inversen Matrix W-1 der Matrix W multipliziert (d. h. durch Farbkonversion) und damit werden die Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T, d. h. vier Arten von DNA-Fragmenten mit den Basenspezies C, A, G und T an den Enden, wie in 1 (2) dargestellt erhalten.
  • In 1 (2) werden vier Peaks von C, A, G und T erhalten. Die Höhen der Peaks, d. h. die Konzentrationen (willkürliche Einheit), sind D (C) = 100, D (A) = 80, D (G) = 90 und D (T) = 80. Die Zeiten (willkürliche Einheit) der Peaks sind 30, 55, 60 und 75. Obwohl der Peak von A und der Peak von G eine große Raum-Zeit-Überlappung aufweisen, kann die Farbkonversion auch in diesem Fall jede der Konzentrationen korrekt finden.
  • 1 (3) zeigt mobilitätskorrigierte Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen oder DNA-Fragmenten, die basierend auf den Unterschieden der Mobilität aufgrund der Arten von zu markierenden fluoreszierenden Substanzen erhalten wurden, die im Voraus in den Ergebnissen in 1 (2) geprüft werden. Inbesondere da bekannt ist, dass die Mobilität der mit der fluoreszierenden Substanz A markierten DNA-Fragmente bezogen auf die Mobilitäten der mit den anderen fluoreszierenden Substanzen markierten DNA-Fragmente so verringert ist, dass sie um eine Dauer (willkürliche Einheit) von 10 verzögert ist. Daher wird eine Mobilitätskorrektur durchgeführt, bei der der Peakerfassungszeit (willkürliche Einheit) der mit der fluoreszierenden Substanz A markierten DNA-Fragmente um 10 vorangestellt ist. Das heißt, die Erfassungszeit (willkürliche Einheit) des Peaks von A wird in 1 (2) von 55 auf 45 korrigiert. Als Folge dieser Mobilitätskorrektur werden Zeitreihendaten erhalten, in denen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, deren Längen sich um eine Base unterscheiden, annähernd in regelmäßigen Abständen angeordnet sind.
  • 1 (4) zeigt die Ergebnisse des Base-Callings, das basierend auf 1 (3) durchgeführt wurde. Es ist schön, dass die markierenden fluoreszierenden Substanzspezies, zu denen die Peaks gehören, oder die terminalen Basenspezies der DNA-Fragmente in zeitlicher Reihenfolge ausgelesen werden.
  • 2 zeigt ein Verfahren der Nichtpatentliteratur 2. 2 (1) zeigt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von drei Farben I(b), I(g) und I(r), die durch Dreifarbenerfassung der Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T in drei Arten von Wellenlängenbändern b, g und r erhalten wurden.
  • In 2 (1) sind nur die Zeitreihendaten von I(y) aus 1 (1) entfernt, und die Zeitreihendaten von I(b), I(g) und I(r) sind in beiden Abbildungen gleich.
  • 2 (W) zeigt die Elemente w(XY) in drei Zeilen und vier Spalten einer Matrix W. Zum Beispiel drücken drei schwarze Balkendiagramme von links w(bC), w(gC) und w(rC) aus. Ebenso drücken horizontal gestreifte Balkendiagramme w(XA) (X ist b, g und r), schräg gestreifte Balkendiagramme w(XG) (X ist b, g, und r) und karierte Balkendiagramme w(XT) (X ist b, g und r) aus. w(bY), w(gY) und w(rY) sind so normalisiert, dass w(bY) + w(gY) + w(rY) = 1 (Y ist C, A, G oder T).
  • Konkret sieht die Matrix W wie folgt aus.
    [Gleichung 5] W = ( w ( bC ) w ( bA ) w ( bG ) w ( bT ) w ( gC ) w ( gA ) w ( gG ) w ( gT ) w ( rC ) w ( rA ) w ( rG ) w ( rT ) ) = ( 0.63 0.33 0.27 0.13 0.31 0.56 0.40 0.25 0.06 0.11 0.33 0.63 ) .
    Figure DE112017006899T5_0006
  • Als erster Schritt wird in 2 (1) unter Verwendung von 2 (W) der Fall betrachtet, bei dem zu einem Zeitpunkt nur eine Art von fluoreszierender Substanz Fluoreszenz emittiert. In 2 (1) weisen zwei auf der linken und rechten Seite beobachtete Peaks Verhältnisse der Fluoreszenzintensität der Farben (I(b) I(g) I(r))T nahe den Verhältnissen von (0,63 0,31 0,06)T bzw. (0,13 0,25 0,63)T auf. Somit können diese beiden Peaks als einzelne Peaks von C und T bestimmt werden. Die Höhen der Peaks dieser C und T, d. h. die Konzentrationen (willkürliche Einheit), sind D(C) = 100 und D(T) = 80, und die Zeiten (willkürliche Einheit) der Peaks dieser C und T sind jeweils 30 und 75.
  • Andererseits weist der in der Mitte von 2 (1) beobachtete Peak ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität der drei Farben (I(b) I(g) I(r))T auf, das keinem Verhältnis von (w(bY) w(gY) w(rY))T (Y ist C, A, G, oder T) nahe kommt. Daher wird als zweiter Schritt unter Verwendung von 2 (W) der Fall betrachtet, bei dem nur zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen Fluoreszenz emittieren. Hier kann die Lösung abgeleitet werden, dass die Peaks von A und G gleichzeitig erfasst werden. Insbesondere wenn die Höhen der Peaks, d. h. die Konzentrationen (willkürliche Einheit) D(A) = 80 und D(G) = 90 und die Zeiten (willkürliche Einheit) der Peaks 55 und 55 sind, wird der Unterschied zwischen der linken und der rechten Seite in Gleichung (3) verringert, und somit können die in der Mitte von 2 (1) beobachteten Peaks erklärt werden. Aus den obigen Ergebnissen werden Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T, d. h. vier Arten von DNA-Fragmenten mit den Basenspezies C, A, G und T an den Enden erhalten, wie in 2 (2) dargestellt.
  • Ähnlich wie in 1 (3) zeigt 2 (3) mobilitätskorrigierte Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen oder DNA-Fragmenten. Der Erfassungszeit (willkürliche Einheit) des Peaks von A wird 10 vorangestellt und von 55 auf 45 korrigiert. Um die Peakintervalle anzugleichen, wird die Erfassungszeit (willkürliche Einheit) des Peaks von G um fünf nach hinten verschoben und von 55 auf 60 korrigiert. Infolgedessen sind 2 (3) und 1 (3) gleich. 2 (4) zeigt die Ergebnisse eines Base-Callings ähnlich wie 1 und gleich wie 1 (4).
  • Andererseits zeigt 2, dass Prozesse von 2 (1) bis 2 (2) nicht in einer bestimmten Weise bestimmt werden. Obwohl der erste Schritt derselbe wie die obigen Prozesse ist, wird im zweiten Schritt eine andere Lösung abgeleitet und 2 (2)' anstelle von 2 (2) erhalten. Es kann nämlich die Lösung abgeleitet werden, dass die Peaks von A und T gleichzeitig erfasst werden. Insbesondere wenn die Höhen der Peaks, d. h. die Konzentrationen (willkürliche Einheit) D(A) = 107 und D(G) = 34 und die Zeiten (willkürliche Einheit) der Peaks 55 und 55 sind, wird der Unterschied zwischen der linken und der rechten Seite in Gleichung (3) verringert, und somit können die in der Mitte von 2 (1) beobachteten Peaks erklärt werden. Aus den obigen Ergebnissen werden Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T, d. h. vier Arten von DNA-Fragmenten mit den Basenspezies C, A, G und T an den Enden erhalten, wie in 2 (2)' dargestellt.
  • Weil in 2 (2)' jedoch G nicht erfasst wird, ist D(G) = 0. Ähnlich wie in 1 (3) zeigt 2 (3)' mobilitätskorrigierte Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen oder DNA-Fragmenten. Der Erfassungszeit (willkürliche Einheit) des Peaks von A wird 10 vorangestellt und von 55 auf 45 korrigiert. 2 (4)' zeigt die Ergebnisse des Base-Callings, das basierend auf 2 (3)' durchgeführt wurde. Obwohl die gleiche 2 (1) und 2 (W) verwendet werden, unterscheiden sich 2 (2), 2 (3) und 2 (4) völlig von 2 (2)', 2 (3)' und 2 (4)', und es werden unterschiedliche Ergebnisse des Base-Callings abgeleitet. Bei den hier verwendeten Modelldaten, zeigt 2 (4) korrekte Base-Calling-Ergebnisse, da die in 1 (4) dargestellten Base-Calling-Ergebnisse eine positive Lösung sind, aber 2 (4)' zeigt falsche Base-Calling-Ergebnisse.
  • Daher lassen sich mit dem Verfahren der Nichtpatentliteratur 2 möglicherweise eine Vielzahl von Lösungen aus den gleichen Messergebnissen abgeleitet, und es besteht die Gefahr, dass falsche Base-Calling-Ergebnisse oder allgemein falsche Analyseergebnisse abgeleitet werden.
  • Erste Ausführungsform
  • 3 ist ein Diagramm, das ein DNA-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von Modelldaten gemäß einer ersten Ausführungsform zeigt. 3 (1) zeigt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von drei Farben I(b), I(g), I(y) und I(r), die durch Dreifarbenerfassung der Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T in drei Arten von Wellenlängenbändern b, g und r erhalten wurden, was gleich 2 (1) ist.
  • 3 (5) zeigt Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten von drei Farben I(b), I(g) und I(r) eines Modellpeaks, der erhalten wird, wenn DNA-Fragmente einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz C markiert sind, in drei Farben erfasst werden. Die vertikale Achse in 3 (5) drückt die Fluoreszenzintensität aus, und die horizontale Achse ist die Zeit. Die Daten in 3 (5) drücken eine zeitliche Änderung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses zwischen den Modellpeaks von drei Fluoreszenzfarben (b, g und r) aus, wenn die mit der fluoreszierenden Substanz C markierten DNA-Fragmente einer einzelnen Länge erfasst werden. Hier ist das Fluoreszenzintensitätsverhältnis der drei Farben jederzeit (w(bC) w(gC) w(rC))T = (0,63 0,31 0,06)T der Matrix W in Gleichung (6). Ebenso zeigen die 3 (6), (7) und (8) Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten von drei Farben I(b), I(g) und I(r) von Modellpeaks, wenn DNA-Fragmente einer einzelnen Länge, die mit den fluoreszierenden Substanzen A, G und T markiert sind, in drei Farben erfasst werden. Die Fluoreszenzintensitätsverhältnisse der drei Farben in den 3 (6), (7) und (8) betragen jeweils (0,33 0,56 0,11)T, (0,27 0,40 0,33)T, (0,13 0,25 0,63)T.
  • Die Form jedes der Modellpeaks ist hier gaußförmig, und die Dispersion der gaußschen Verteilung entspricht der räumlichen Dispersion der DNA-Fragmente einer einzelnen Länge, die in Experimenten beobachtet wurden. Es ist zu beachten, dass die Formen der Modellpeaks für dieses Beispiel nicht einschränkend sind und die Formen der Modellpeaks andere Konfigurationen aufweisen können. Hier werden die Modellpeaks in den 3 (5), (6), (7) und (8) nur durch Ändern der Höhen und Zeiten der Modellpeaks an die Zeitreihendaten von 3 (1) angepasst. Ein Beispiel für den Anpassungsprozess wird mit Bezug auf 3 beschrieben. Zum Beispiel wird der Anpassungsprozess schrittweise vom linken Ende der Daten von 3 (1) ausgeführt. So werden beispielsweise die Höhe (Fluoreszenzintensität) und der Median (Elektrophoresezeit) der Gaußschen Verteilung in 3 (5) variiert. Es wird bestimmt, dass die Anpassung erreicht ist, wenn eine Differenz zu den Daten von 3 (1) kleiner als ein vorbestimmter Fehler ist. Das heißt, hier wird in den Daten von 3 (1) nach dem Ort gesucht, an dem die Fluoreszenzintensität und die Elektrophoresezeit am besten übereinstimmen. Es ist zu beachten, dass die Anpassung durchgeführt werden kann, während die Breite der Gaußschen Verteilung ebenfalls geändert wird. Für den Fall, dass in 3 (5) keine Anpassung erreicht wird, wird bestimmt, ob die Anpassung unter Verwendung anderer Daten (in 3 (6), (7) und (8)) oder der Kombination anderer Daten erreicht wird. Wie vorstehend beschrieben, erfolgt die Anpassung an die Daten von 3 (1) unter Verwendung jeglicher Daten der 3 (5), (6), (7) und (8) oder dieser Kombination dieser Datenteile. Der Fehler im Anpassungsprozess kann beispielsweise basierend auf der Differenz zwischen den Peakformen von 3 (1) und den Formen der Modellpeaks berechnet werden. Zum Berechnen des Fehlers können verschiedene öffentlich bekannte Verfahren angewendet werden. Es ist zu beachten, dass die Anpassung im Hinblick auf Effizienz vorzugsweise schrittweise beispielsweise vom Ende der Daten von 3 (1) erfolgt. Der Grund hierfür ist, dass, da das Verteilungsende (Tail) eines benachbarten Fluoreszenzpeaks in einen bestimmten Fluoreszenzpeak hineinläuft, die Durchführung der Anpassung vom Ende der Daten effizient die Anpassung unter Berücksichtigung des Hineinlaufens des benachbarten Peaks ermöglicht.
  • 3 (2) zeigt die Ergebnisse der Durchführung des Anpassungsprozesses. Zu diesem Zeitpunkt stellt die Peakform von C Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(b) mit 1/w(gC) = 1/0,63 = 1,59 multipliziert wird. Die Peakform von A stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(g) mit 1/w(gA) = 1/0,056 = 1,79 multipliziert wird. Die Peakform von G stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(g) mit 1/w(gG) = 1/0,04 = 2,50 multipliziert wird. Die Peakform von T stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(r) mit 1/w(gT) = 1/0,63 = 1,59 multipliziert wird.
  • Basierend auf diesen Ergebnissen ist 3 (2) die gleiche wie 1 (2). Ein Verfahren zum weiteren Erhalten der 3 (3) und (4) ist des Weiteren ähnlich dem Verfahren zum Erhalten der 1 (3) und (4). Da der Prozess, der 3 (2) aus 3 (1) ableitet, eindeutig bestimmt ist, können gemäß der Ausführungsform korrekte Base-Calling-Ergebnisse erhalten werden, wie in 3 (4) dargestellt.
  • Bei dem Verfahren der Nichtpatentliteratur 2 in 2, bei dem 2 (2) oder 2 (2)' aus 2 (1) abgeleitet werden, wird nur die in Gleichung (6) dargestellte Matrix W verwendet, d. h. die Fluoreszenzintensitätsverhältnisse der Erfassung der drei Farben der Fluoreszenzemissionen der fluoreszierenden Substanzen. Andererseits werden in der in 3 gezeigten Ausführungsform bei der Ableitung von 3 (2) aus 3 (1) zusätzlich zu der in Gleichung (6) gezeigten Matrix W, d. h., die Fluoreszenzintensitätsverhältnisse der Erfassung der drei Farben der Fluoreszenzemissionen aus den fluoreszierenden Substanzen, die Peakformen der Fluoreszenzemissionen aus den fluoreszierenden Substanzen verwendet, d. h., Informationen über die zeitliche Veränderung. Diese Unterschiede führen zu dem Unterschied, ob die Lösung eindeutig abgeleitet werden kann, d. h. korrekte Base-Calling-Ergebnisse erhalten werden können.
  • 4 zeigt ein Beispiel des Falls, dass die in 3 durchgeführte Dreifarbenerfassung weiter auf eine Zweifarbenerfassung eingeschränkt wird. 4 (1) zeigt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten zweier Farben I(b) und I(r), die durch Zweifarbenerfassung der Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T in zwei Arten von Wellenlängenbändern b und r erhalten wurden und es handelt sich um die Zeitreihendaten von 3 (1) aus denen die Zeitreihendaten von I(g) entfernt wurden.
  • 4 (5) zeigt Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten I(b) und I(r) zweier Farben eines Modellpeaks, wenn DNA-Fragmente in einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz C markiert sind, in zwei Farben erfasst werden, und stellt die Zeitreihendaten in 3 (5) dar, aus denen die Zeitreihendaten von I(g) entfernt werden. Ebenso zeigen 4 (6), (7) und (8) Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten I(b) und I(r) zweier Farben eines Modellpeaks, wenn DNA-Fragmente in einer einzelnen Länge, die mit den fluoreszierenden Substanzen A, G und T markiert sind, in zwei Farben erfasst werden, und stellen die Zeitreihendaten von 3 (6), (7) und (8) dar, aus denen I(g) entfernt werden.
  • Hier werden die Modellpeaks in den 4 (5), (6), (7) und (8) nur durch Ändern der Höhen und Zeiten der Modellpeaks an die Zeitreihendaten von 4 (1) angepasst. 4 (2) zeigt die Ergebnisse der Durchführung des Anpassungsprozesses. Die Peakform von C zu diesem Zeitpunkt stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(b) mit 1/w(bC) = 1/0,63 = 1,59 multipliziert wird. Die Peakform von A stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(b) mit 1/w(bA) = 1/0,33 = 3,03 multipliziert wird. Die Peakform von G stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(r) mit 1/w(rG) = 1/0,33 = 3,03 multipliziert wird. Die Peakform von T stellt Zeitreihendaten dar, bei denen die Höhe der Zeitreihendaten von I(r) mit 1/w(rT) = 1/0,63 = 1,59 multipliziert wird.
  • Basierend auf diesen Ergebnissen ist 4 (2) gleich 1 (2). Ein Verfahren zum weiteren Erhalten der 4 (3) und (4) ist ähnlich dem Verfahren zum Erhalten der 1 (3) und (4). Da der Prozess, der 4 (2) aus 4 (1) ableitet, gemäß der Ausführungsform eindeutig bestimmt ist, können korrekte Base-Calling-Ergebnisse erhalten werden, wie in 4 (4) dargestellt.
  • 5 zeigt Prozessschritte und eine Konfiguration eines Systems gemäß der Ausführungsform. Das System gemäß der ersten Ausführungsform beinhaltet einen Analysator 510, einen Computer 520 und eine Anzeigevorrichtung 530. Der Analysator 510 ist zum Beispiel eine Flüssigchromatographievorrichtung. Der Computer 520 kann zum Beispiel unter Verwendung eines Standardcomputers erreicht werden. Die Verarbeitungseinheit des Computers 520 kann als Funktionen von auf einem Computer ausgeführten Programmen erreicht werden. Der Computer beinhaltet mindestens einen Prozessor, wie etwa eine CPU (Central Processing Unit), und eine Speichereinheit, wie etwa einen Speicher. Der Prozess des Computers 520 kann erreicht werden, bei dem die den Programmcodes entsprechenden Prozesse im Speicher gespeichert werden und der Prozessor die Programmcodes ausführt.
  • In dieser Konfiguration trennt der Analysator 510 eine Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, mittels Chromatographie und erhält erste Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erfasst werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist. Die ersten Zeitreihendaten des Fluoreszenzsignals entsprechen den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 einer mit M Farben markierten Probe, wie nachfolgend beschrieben. Der Computer 520 beinhaltet eine Speichereinheit (z. B. einen Speicher und eine Festplatte). Die Speichereinheit speichert im Voraus zweite Zeitreihendaten von einzelnen Modellfluoreszenzsignalen der Vielzahl von Komponenten. Die zweiten Zeitreihendaten der einzelnen Modellfluoreszenzsignale der Vielzahl von Komponenten entsprechen den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 eines einzelnen Peaks von jedem der mit M Farbmarker, wie nachfolgend beschrieben. Der Computer 520 vergleicht die ersten Zeitreihendaten mit den zweiten Zeitreihendaten und bestimmt, welche Art von fluoreszierenden Substanzen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen jede der Vielzahl von Komponenten einzeln markieren. Die Anzeigevorrichtung 530 zeigt dritte Zeitreihendaten von Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, die zu den Fluoreszenzsignalen beitragen. Die dritten Zeitreihendaten der Konzentrationen der fluoreszierenden Substanzen entsprechen den nachfolgend beschriebenen Zeitreihendaten der M Farbmarker 523. Im Folgenden werden die Prozesse spezifischer beschrieben.
  • Zunächst wird die mit M Farben markierte Probe 501, die die Vielzahl von mit M Arten von fluoreszierenden Substanzen markierten Komponenten enthält, in den Analysator 510 injiziert. Anschließend wird im Analysator 510 ein Trennungsanalyseprozess 511 der Vielzahl der in der Probe 501 enthaltenen Komponenten durchgeführt. Der Analysator 510 erfasst Fluoreszenzemissionen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern (Erfassung von N Farben) und erfasst die Zeitreihendaten der Erfassung der N Farben (Zeitreihendaten der Fluoreszenzerfassung) 513 der mit M Farben markierten Probe. Dabei ist die Vielzahl der Komponenten nicht immer hervorragend getrennt. Das heißt, die Fluoreszenz eines Teils verschiedener Komponenten, die mit verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, wird in einem Zustand der Raum-Zeit-Überlappung erfasst. Der Analysator 510 gibt die Zeitreihendaten der Erfassung der N Farben 513 an den Computer 520 aus.
  • Anschließend erhält der Computer 520 als Eingangsinformation die Zeitreihendaten der Erfassung der N Farben 513 und die Zeitreihendaten der Erfassung der N-Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker, d. h. die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben einer einzelnen Komponente, die mit einer beliebigen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert ist. Die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker sind Daten, die zum Beispiel 3 (5), (6), (7) und (8) entsprechen. Zu beachten ist, dass die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker im Voraus in einer ersten Datenbank 540 gespeichert sind.
  • Anschließend führt der Computer 520 einen Vergleichsanalyseprozess 521 zwischen den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 und den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker durch. Als Folge erhält der Computer 520 die Zeitreihendaten der M Farbmarker 523, d. h. die Zeitreihendaten der erfassten Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. die Konzentrationen von Komponenten, die mit M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Die Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523 sind Daten, die zum Beispiel 3 (2) entsprechen. Schließlich führt die Anzeigevorrichtung 530 einen Anzeigeprozess 531 der Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523 durch.
  • 6 ist ein Diagramm, das die Vergleichsanalyse auf dem Computer 520 in 5 darstellt. Der Computer 520 führt als Vergleichsanalyse einen Anpassungsanalyseprozess 522 an den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 unter Verwendung der Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker durch. Als Folge erhält der Computer 520 Anpassungsfehlerdaten (oder Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524, die die Differenz zwischen den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 und ihrem Anpassungsergebnis zusammen mit den Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523 sind. Die Anzeigevorrichtung 530 führt den Anzeigeprozess 531 für die Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523 und/oder die Anpassungsfehlerdaten 524 durch.
  • Zweite Ausführungsform
  • 7 zeigt die Prozessschritte und eine Konfiguration eines Systems für den Fall, dass die vorliegende Erfindung auf eine Elektrophoreseanalyse von DNA-Fragmenten angewendet wird. Eine Vielzahl von Komponenten, die analytische Ziele sind, können Nukleinsäurefragmente unterschiedlicher Länge oder unterschiedlicher Zusammensetzung sein und die Chromatographie kann Elektrophorese sein.
  • Ein Analysator 510 ist ein Elektrophoresegerät. Zunächst wird die mit M Farben markierte DNA-Probe 502, die die Vielzahl von mit M Arten von fluoreszierenden Substanzen markierten Komponenten enthält, in den Analysator 510 injiziert. Anschließend wird im Analysator 510 ein Trennungsanalyseprozess 512 der Vielzahl der in der DNA-Probe enthaltenen Arten von DNA-Fragmenten durchgeführt. Der Analysator 510 erfasst die Fluoreszenzemissionen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern (Erfassung von N Farben) und erhält Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513. Dabei ist die Vielzahl der Arten von DNA-Fragmenten nicht immer hervorragend getrennt. Das heißt, die Fluoreszenz eines Teils verschiedener Arten von DNA-Fragmenten, die mit verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, wird in einem Zustand der Raum-Zeit-Überlappung erfasst. Der Analysator 510 gibt die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 an den Computer 520 aus.
  • Anschließend erhält der Computer 520 als Eingangsinformation die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 und die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 eines einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker, d. h. die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben einer einzelnen Komponente, die mit einer beliebigen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert ist. Anschließend führt der Computer 520 einen Vergleichsanalyseprozess 521 zwischen den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 und den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker durch. Genauer gesagt, führt der Computer 520 einen Anpassungsanalyseprozess 522 an den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 und den Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker durch. Als Folge erhält der Computer 520 die Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523, d. h. die Zeitreihendaten der erfassten Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. die Konzentrationen der DNA-Fragmente, die mit M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Gleichzeitig erhält der Computer 520 Anpassungsfehlerdaten (oder Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524.
  • Dabei wird die Mobilität von DNA-Fragmenten mittels Elektrophorese durch M Arten von fluoreszierenden Substanzen beeinflusst, die markiert werden sollen. Um den Einfluss zu verringern, führt der Computer 520 daher einen Prozess unter Verwendung von Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der mit M Farben markierten Proben durch, die den Unterschied in der Mobilität aufgrund von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, die markiert werden sollen, anzeigen. Die Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der mit M Farben markierten Proben werden im Voraus in einer zweiten Datenbank 550 gespeichert. Der Computer 520 führt einen Mobilitätskorrekturprozess 525 an den Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523 unter Verwendung der Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der mit M Farben markierten Proben durch und erhält Daten 526, dass die Mobilität an den Zeitreihendaten von M Farbmarkern korrigiert ist (im Folgenden als korrigierte Daten bezeichnet). Die korrigierten Daten 526 sind Daten, die zum Beispiel 3 (3) entsprechen.
  • Schließlich führt die Anzeigevorrichtung 530 einen Anzeigeprozess 531 für einen Teil oder alle Zeitreihendaten von M Farbmarkern 523, Anpassungsfehlerdaten (oder Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524 und den korrigierten Daten 526 durch.
  • Dritte Ausführungsform
  • 8 zeigt die Prozessschritte und eine Konfiguration eines Systems für den Fall, dass die vorliegende Erfindung auf eine DNA-Sequenzierung mittels Elektrophorese angewendet wird. In 8 sind N = 3 und M = 4. Ein Analysator 510 ist ein DNA-Sequenzierer.
  • Zunächst wird eine mit vier Farben markierte DNA-Sequenzierungsprobe 503 hergestellt. Die mit vier Farben markierte DNA-Sequenzierungsprobe 503 enthält vier Arten von DNA-Fragmenten, die durch ein Sänger-Verfahren unter Verwendung einer Ziel-DNA als Matrize hergestellt und mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert werden, die vier Arten von terminalen Basenspezies entsprechen. Die mit vier Farben markierte DNA-Sequenzierungsprobe 503 wird in den Analysator 510 injiziert. Anschließend wird im Analysator 510 ein Elektrophoresetrennungsanalyseprozess 512 an vier Arten von DNA-Fragmenten durchgeführt, die in der DNA-Sequenzierungsprobe enthalten sind. Der Analysator 510 erfasst Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen in drei Arten von Wellenlängenbändern und erhält Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 513. Dabei sind vier Arten von DNA-Fragmenten nicht immer hervorragend getrennt. Das heißt, die Fluoreszenz eines Teils der DNA-Fragmente verschiedener Länge, die mit verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, wird in einem Zustand der Raum-Zeit-Überlappung erfasst. Der Analysator 510 gibt die Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 513 an den Computer 520 aus.
  • Anschließend erhält der Computer 520 als Eingangsinformation die Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 513 und die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 eines einzelnen Peaks von jedem der vier Farbmarker, d. h. die Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung der DNA-Fragmente einer einzelnen Länge, die mit den vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Die Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 541 des einzelnen Peaks von jedem der vier Farbmarker werden im Voraus in einer ersten Datenbank 540 gespeichert. Der Computer 520 führt eine Vergleichsanalyse zwischen den Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 513 und den Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 541 des einzelnen Peaks von jedem der vier Farbmarker durch. Insbesondere führt der Computer 520 einen Anpassungsanalyseprozess 522 an den Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 513 der mit vier Farben markierten DNA-Sequenzierungsprobe unter Verwendung der Zeitreihendaten der Dreifarbenerfassung 541 des einzelnen Peaks von jedem der vier Farbmarker durch. Infolgedessen erhält der Computer 520 die Zeitreihendaten von vier Farbmarkern 523, d. h. die Zeitreihendaten der erfassten Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. die Konzentrationen von vier Arten von DNA-Fragmenten, die unterschiedliche terminale Basenspezies aufweisen und die mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Gleichzeitig erhält der Computer 520 die Anpassungsfehlerdaten (oder die Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524.
  • Dabei wird die Mobilität von DNA-Fragmenten durch Elektrophorese durch vier Arten von fluoreszierenden Substanzen beeinflusst, die markiert werden sollen. Um den Einfluss zu verringern, wird daher ein Prozess durchgeführt, bei dem die Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der vier Farbmarker verwendet werden, die den Unterschied in der Mobilität aufgrund von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, die markiert werden sollen, angeben. Die Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der vier Farbmarker werden im Voraus in einer zweiten Datenbank 550 gespeichert. Der Computer 520 führt einen Mobilitätskorrekturprozess 525 an den Zeitreihendaten von vier Farbmarkern 523 unter Verwendung der Mobilitätsunterschiedsdaten 551 der vier Farbmarker durch und erhält korrigierte Daten 526 (im Folgenden als korrigierte Daten bezeichnet) der Zeitreihendaten von vier Farbmarkern.
  • Der Computer 520 führt einen DNA-Basensequenzbestimmungsprozess 528 unter Verwendung der korrigierten Daten 526 durch. Andererseits erhält der Computer 520 Basensequenzbestimmungsfehlerdaten (oder Basensequenzbestimmungsgenauigkeitsdaten) 527 für jede Base der bestimmten DNA-Basensequenz unter Verwendung der Anpassungsfehlerdaten (oder Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524.
  • Schließlich führt die Anzeigevorrichtung 530 einen Anzeigeprozess 531 für einen Teil oder alle Zeitreihendaten von vier Farbmarkern 523, Anpassungsfehlerdaten (oder Anpassungsgenauigkeitsdaten) 524, den korrigierten Daten 526, der Ergebnisse der DNA-Basensequenzbestimmung und der Basensequenzbestimmungsfehlerdaten (oder Basensequenzbestimmungsgenauigkeitsdaten) 527 durch.
  • Vierte Ausführungsform
  • 9 zeigt die Prozessschritte und eine Konfiguration eines Systems für den Fall, dass die Konfiguration von 8 unter den Bedingungen N = 2 und M = 4 substituiert ist. Die Prozessschritte und die Konfiguration des Systems sind ähnlich wie in 8, sodass die Beschreibung entfällt.
  • 10 ist ein Blockdiagramm eines Kapillarelektrophoresegeräts, das ein Beispiel für den Analysator 510 ist. Ein Kapillarelektrophoresegerät 100 wird zum Beispiel als DNA-Sequenzierer und als DNA-Fragmentanalysevorrichtung eingesetzt. Das Innere einer Kapillare 1 ist mit einem elektrolythaltigen elektrophoretischen Trennmedium gefüllt, und ein Probeninjektionsende 2 und ein Probenelutionsende 3 der Kapillare 1 sind jeweils in eine kathodenseitige Elektrolytlösung 4 bzw. eine anodenseitige Elektrolytlösung 5 eingetaucht. Eine negative Elektrode 6 wird in die kathodenseitige Elektrolytlösung 4 und eine positive Elektrode 7 in die anodenseitige Elektrolytlösung 5 eingetaucht. Ein Hochspannungsnetzteil 8 legt eine Hochspannung an die negative Elektrode 6 und die positive Elektrode 7 an, sodass eine Elektrophorese durchgeführt wird.
  • Die Probeninjektion in die Kapillare 1 erfolgt, bei der das Probeninjektionsende 2 und die negative Elektrode 6 in eine Probenlösung 9 eingetaucht werden und die Hochspannungsversorgung 8 kurzzeitig eine Hochspannung an die negative Elektrode 6 und die positive Elektrode 7 anlegt. Die Probenlösung 9 enthält eine Vielzahl von Arten von Komponenten, die mit einer Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Nach der Probeninjektion werden das Probeninjektionsende 2 und die negative Elektrode 6 wieder in die kathodenseitige Elektrolytlösung 4 eingetaucht, eine Hochspannung über die negative Elektrode 6 und die positive Elektrode 7 angelegt und damit die Elektrophorese durchgeführt.
  • Negativ geladene Komponenten, die in der Probe enthalten sind, z. B. DNA-Fragmente, werden elektrophoretisch vom Probeninjektionsende 2 bis zum Probenelutionsende 3 in der Kapillare 1 in eine durch einen Pfeil angegebene Elektrophoreserichtung 10 migriert. Durch den Unterschied in der Mobilität aufgrund der Elektrophorese wird die Vielzahl der in der Probenlösung 9 enthaltenen Arten von Komponenten sukzessive getrennt. An einer Position (einer Laserstrahlbestrahlungsposition 15), an der die Komponenten um einen bestimmten Abstand in der Kapillare 1 elektrophoretisch migriert sind, wird ein von einer Laserlichtquelle 11 emittierter Laserstrahl 12 eingestrahlt. Wenn die Komponenten die Laserstrahlbestrahlungsposition 15 passieren, wird die Fluoreszenzemission 13 aus der Vielzahl von Arten von fluoreszierenden Substanzen, die auf den Komponenten markiert sind, induziert. Die Fluoreszenz 13, die sich im Laufe der Zeit der Elektrophorese ändert, wird durch ein Mehrfarbenerfassungssystem 14 gemessen, das die optische Erfassung in einer Vielzahl von Arten von Wellenlängenbändern durchführt. Obwohl in 10 nur eine Kapillare 1 dargestellt ist, kann ein Elektrophoresegerät mit mehreren Kapillaren verwendet werden, die die Elektrophoreseanalyse parallel unter Verwendung einer Vielzahl von Kapillaren 1 durchführt.
  • 11 zeigt ein Beispiel eines Mehrfarbenerfassungssystems eines Elektrophoresegeräts mit mehreren Kapillaren. Die Laserstrahlbestrahlungspositionen 15 einer Vielzahl von Kapillaren 1 sind in regelmäßigen Abständen auf der gleichen Ebene angeordnet. Die linke Abbildung in 11 ist eine Querschnittsansicht senkrecht zur Hauptachse der Vielzahl von Kapillaren 1, und die rechte Abbildung in 11 ist eine Querschnittsansicht parallel zur Hauptachse einer gegebenen Kapillare 1.
  • Der Laserstrahl 12 wird entlang der Anordnungsebene der Vielzahl von Kapillaren 1 eingestrahlt. Somit wird der Laserstrahl 12 gleichzeitig auf die Vielzahl der Kapillaren 1 gestrahlt. Die von jeder der Kapillaren 1 emittierte Fluoreszenz 13 wird parallel durch separate Linsen 16 kondensiert. Die kondensierten Strahlen gelangen direkt in einen zweidimensionalen Farbsensor 17. Der zweidimensionale Farbsensor 17 ist ein RGB-Farbsensor, der die Dreifarbenerfassung in drei Arten von Wellenlängenbändern durchführen kann. Die von den Kapillaren 1 emittierte Fluoreszenz 13 bildet jeweils an verschiedenen Positionen auf dem zweidimensionalen Farbsensor 17 Punkte und so kann die Fluoreszenz 13 unabhängig in drei Farben erfasst werden.
  • 12 zeigt eine beispielhafte Konfiguration eines Computers 520. Wie in den 5 bis 9 dargestellt, ist der Computer 520 mit dem Analysator 510 verbunden. Der Computer 520 kann nicht nur die in den 5 bis 9 beschriebene Datenanalyse steuern, sondern auch den Analysator 510. In den 5 bis 9 sind eine Anzeigevorrichtung 530 und die Datenbanken 540 und 550 auf der Außenseite des Computers 520 dargestellt. Die Datenbanken 540 und 550 können jedoch im Computer 520 enthalten sein.
  • Der Computer 520 schließt eine CPU (Prozessor) 1201, einen Speicher 1202, eine Anzeigeeinheit 1203, eine Festplatte 1204, eine Eingabeeinheit 1205 und eine Netzwerkschnittstelle (NIF) 1206 ein. Die Anzeigeeinheit 1203 ist beispielsweise eine Anzeige und kann als Anzeigevorrichtung 530 verwendet werden. Die Eingabeeinheit 1205 ist ein Eingabegerät, das zum Beispiel eine Tastatur und eine Maus ist. Ein Benutzer kann die Bedingungen der Datenanalyse und die Bedingungen für die Steuerung des Analysators 510 über die Eingabeeinheit 1205 einstellen. Die vom Analysator 510 ausgegebenen Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 513 werden nacheinander in dem Speicher 1202 gespeichert.
  • Die HDD 1204 kann die Datenbanken 540 und 550 beinhalten. Die HDD 1204 kann Programme beinhalten, die den Anpassungsanalyseprozess, den Mobilitätskorrekturprozess, den DNA-Basensequenzbestimmungsprozess und jeden anderen Prozess des Computers 520 durchführen. Der Prozess des Computers 520 kann erreicht werden, bei dem Programmcodes entsprechende Prozesse in dem Speicher 1202 gespeichert werden und die CPU 1201 die Programmcodes ausführt.
  • So werden zum Beispiel die Zeitreihendaten der Erfassung von N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der der auf der HDD 1204 gespeicherten M Farbmarker in dem Speicher 1202 gespeichert, und die CPU 1201 führt den Vergleichsanalyseprozess unter Verwendung der Zeitreihendaten der Erfassung der N Farben 513 und der Zeitreihendaten der Erfassung der N Farben 541 des einzelnen Peaks von jedem der M Farbmarker durch. Die Anzeigeeinheit 1203 zeigt die analysierten Ergebnisse an. Zu beachten ist, dass die analysierten Ergebnisse gegen Informationen in einem Netzwerk über die NIF 1206 überprüft werden können.
  • Fünfte Ausführungsform
  • 13 bis 18 zeigen eine fünfte Ausführungsform, bei der die DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Prozessschritte und der Konfigurationen des in den 9 bis 12 dargestellten Systems durchgeführt wird.
  • Als mit vier Farben markierte DNA-Sequenzierungsprobe wurde eine Probe durch Auflösen von 3500/3500xL Sequenzierungsstandards, BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific) in 300 µl Formamid hergestellt. Diese Probe enthält vier Arten von DNA-Fragmenten mit den terminalen Basenspezies C, A, G und T, die mit vier Arten von fluoreszierenden Substanzen dROX (eine maximale Emissionswellenlänge von 618 nm), dR6G (eine maximale Emissionswellenlänge von 568 nm), dR110 (541 nm) bzw. dTAMRA (eine maximale Emissionswellenlänge von 595 nm) markiert sind.
  • Es gibt vier Kapillaren 1 mit einem Außendurchmesser von 360 µm, einem Innendurchmesser von 50 µm, einer Gesamtlänge von 56 cm und einer effektiven Länge von 36 cm. Als elektrophoretisches Trennmedium wurde POP-7 (Thermo Fisher Scientific), also eine Polymerlösung, verwendet. Bei der Elektrophorese wurde die Kapillare 1 auf eine Temperatur von 60 °C und die elektrische Feldstärke auf 182 V/cm eingestellt. Die Probeninjektion erfolgte durch elektrokinetische Injektion mit einer elektrischen Feldstärke von 27 V/cm über acht Sekunden. Der Laserstrahl 12 lag bei einer Wellenlänge von 505 nm und einer Leistung von 20 mW. Zwischen der Linse 16 und dem zweidimensionalen Farbsensor wurde ein Langpassfilter verwendet, der den Laserstrahl 12 blockierte.
  • 13 (1) entspricht 4 (1) und stellt Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung dar, die während der Elektrophorese durch den RGB-Farbsensor durch das Erfassen der Fluoreszenz 13 erhalten werden, die eine von vier Kapillaren 1 emittiert hat. Der in der Ausführungsform verwendete RGB-Farbsensor kann eine Dreifarbenerfassung mit drei Arten von Wellenlängenbändern r, g und b entsprechend R (rot), G (grün) und B (blau) durchführen. Die Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen wurden jedoch selten im Wellenlängenband b und nur in den Wellenlängenbändern r und g erfasst. So zeigt 13 (1) eine Zeitreihe der Fluoreszenzintensität I(r) und I(g) in diesen beiden Farben. Die horizontale Achse drückt einen Zeitablauf (Elektrophoresezeit) ab Beginn der Elektrophorese in Sekundeneinheiten aus, und die vertikale Achse drückt die Fluoreszenzintensität in willkürlicher Einheit aus.
  • 14 (1) entspricht 4 (5) und stellt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten zweier Farben I(g) und I(r) eines Modellpeaks dar, wenn DNA-Fragmente mit terminaler Basenspezies C und einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz dROX markiert sind, in zwei Farben erfasst wurden. Dabei ist das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der zwei Farben zu jedem Zeitpunkt (w(gC) w(rC))T = (0,02 0,98)T. Ebenso entspricht 14 (2) 4 (6) und stellt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten zweier Farben I(g) und I(r) eines Modellpeaks dar, wenn DNA-Fragmente mit terminaler Basenspezies A und einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz dR6G markiert sind, in zwei Farben erfasst wurden. Dabei ist das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der beiden Farben (w(gA) w(rA))T = (0,50 0,50)T. 14 (3) entspricht 4 (7) und stellt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten zweier Farben I(g) und I(r) eines Modellpeaks dar, wenn DNA-Fragmente mit terminaler Basenspezies G und einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz dR110 markiert sind, in zwei Farben erfasst wurden. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der beiden Farben beträgt (w(gG) w(rG))T = (0,71 0,29)T. 14 (4) entspricht 4 (8) und stellt Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten zweier Farben I(g) und I(r) eines Modellpeaks dar, wenn DNA-Fragmente mit terminaler Basenspezies T und einer einzelnen Länge, die mit der fluoreszierenden Substanz dTAMRA markiert sind, in zwei Farben erfasst wurden. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der beiden Farben beträgt (w(gT) w(rT))T = (0,16 0,84)T. Formen, Versätze und Standardabweichungen der Modellpeaks waren gaußförmig, Null bzw. eine Sekunde. Dies ist das Ergebnis, das mit der Peakform von DNA-Fragmenten in einer einzelnen Länge, gemessen unter den aktuellen Elektrophoresebedingungen, verglichen wurde.
  • Die Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung von vier Arten von Modellpeaks, die in den 14 (1) bis (4) dargestellt sind, wurden nacheinander an die Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung angepasst, die durch Elektrophoreseanalyse in 13 (1) erhalten wurden. Bei der Anpassung wurden nur Mediane (Elektrophoresezeiten) und Höhen (Fluoreszenzintensitäten) der in 14 (1) bis (4) dargestellten Gaußschen Verteilungen variiert, während die beiden Fluoreszenzintensitätsverhältnisse der zwei Farben und Standardabweichungen der Gaußschen Verteilungen erhalten blieben und die Mediane und die Höhen wurden so bestimmt, dass die Fehler aus den Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung in 13 (1) minimiert wurden.
  • 13 (2) ist das Ergebnis, dass der Modellpeak von G (dR110) in 14 (3) exakt an den Peak von g angepasst wurde, der ganz links in 13 (1) beobachtet wurde. 13 (3) ist das Ergebnis, dass der Modellpeak von T (dTAMRA) in 14 (4) exakt an den Peak von r auf der rechten Seite des obigen Peaks von g in 13 (1) angepasst wurde. 13 (4) ist das Ergebnis, dass der Modellpeak von C (dROX) in 14 (1) exakt an den Peak von r auf der rechten Seite des obigen Peaks von r in 13 (1) angepasst wurde. 13 (5) sind die Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung, die die in 13 (2), (3) und (4) aufsummieren, d. h. Zeitreihendaten, die I(g) und I(r) in 13 (2), (3) und (4) addiert haben. Wie in 13 (5) dargestellt, wurden die entsprechenden Abschnitte in 13 (1) originalgetreu wiedergegeben.
  • Der Anpassungsfehler und die Anpassungsgenauigkeit wurden wie folgt bestimmt. Der Anpassungsfehler wurde gefunden, indem die Standardabweichung der Differenz zwischen einem Anpassungsmodellpeak und den entsprechenden gemessenen Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung in einem Abschnitt von zwei Sekunden Dauer (zweifache Standardabweichung der Gaußschen Verteilung), dessen Mittelpunkt die Zeit der Spitze des Anpassungsmodellpeaks ist, durch einen größeren Wert der gemessenen Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung zum Zeitpunkt der Spitze des Modellpeaks dividiert wurde. Die Anpassungsgenauigkeit wurde durch Subtraktion des Anpassungsfehlers von eins erhalten. Die Anpassungsgenauigkeit beträgt 100 %, wenn die Anpassung perfekt mit der Messung übereinstimmt. Dann nimmt die Anpassungsgenauigkeit mit der Abweichung ab und wird 0 %, wenn die Abweichung größer oder gleich dem größeren Wert der gemessenen Fluoreszenzintensitäten der beiden Farben ist. In der Ausführungsform sind Anpassungsfehler und Genauigkeit wie oben beschrieben definiert. Andere Definitionen als diese sind jedoch natürlich in Ordnung.
  • Die Anpassungsgenauigkeit des Modellpeaks von T in 13 (3) allein betrug nur 43,41 %. Die Anpassungsgenauigkeit des Modellpeaks von T, wenn die Modellpeaks von G, T und C aufsummiert wurden, betrug jedoch 95,56 %, wie in 13 (5) dargestellt. Das bedeutet, dass es bei Vorhandensein der Raum-Zeit-Überlappung wichtig ist, eine Anpassung benachbarter Modellpeaks zusammen und nicht nur eines Modellpeaks allein durchzuführen.
  • Auf ähnliche Weise wurden die in 14 (1) bis (4) dargestellten Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung von vier Arten von Modellpeaks nacheinander an alle Peaks von g und r in 13 (1) angepasst. 13 (6) zeigt Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung, in denen die einzelnen Anpassungsmodellpeaks aufsummiert sind. Wie in 13 (6) dargestellt, wurden alle Anpassungsmodellpeaks in 13 (1) originalgetreu reproduziert.
  • 15 (1) zeigt Zeitreihendaten der Konzentration der fluoreszierenden Substanz dR110, d. h. der Konzentration von DNA-Fragmenten der terminalen Basenspezies G, erhalten durch Summierung von I(g) und I(r) in 13 (2). 15 (2) zeigt Zeitreihendaten der Konzentration der fluoreszierenden Substanz dTAMRA, d. h. der Konzentration von DNA-Fragmenten der terminalen Basenspezies T, erhalten durch Summierung von I(g) und I(r) in 13 (3). 15 (3) zeigt Zeitreihendaten der Konzentration der fluoreszierenden Substanz dROX, d. h. die Konzentration von DNA-Fragmenten der terminalen Basenspezies C, die durch Summierung von I(g) und I(r) in 13 (4) erhalten wurden. Ebenso zeigt 15 (5) Zeitreihendaten von Konzentrationen von DNA-Fragmenten der terminalen Basenspezies C, A, G und T, die von allen Anpassungsmodellpeaks in 13 (6) erhalten wurden.
  • 17 zeigt eine Liste, die die terminalen Basenspezies, die Anpassungsgenauigkeit und den QV (Quality Value) aller Modellpeaks in 15 (5) in der zeitlichen Reihenfolge der Elektrophorese zusammenfasst. Dabei ergibt sich QV aus QV = -10*Log(1-S), wo die Anpassungsgenauigkeit S ist. In 200 Sekunden von der Elektrophoresezeit 1100 Sekunden bis 1300 Sekunden werden 76 Arten von DNA-Fragmenten gemessen, deren Längen sich um eine Base unterscheiden, und ihre terminalen Basenspezies werden einzeln identifiziert.
    Da die Anpassungsgenauigkeit im Mittel 94,72 % und der QV im Mittel 13,95 beträgt, wird eine hochgenaue Anpassung erreicht. Zu beachten ist, dass der Computer 520 Daten in 17 berechnen kann und die Anzeigevorrichtung 530 Daten in 17 anzeigen kann.
  • 15 (6) zeigt korrigierte Zeitreihendaten von Konzentrationen der DNA-Fragmente der terminalen Basenspezies C, A, G und T, die durch die Anwendung einer Mobilitätskorrektur auf 15 (5) erhalten wurden, basierend auf dem Unterschied in der Mobilität aufgrund der Unterschiede zwischen vier Arten von fluoreszierenden Substanzen. Insbesondere wurden die Elektrophoresezeiten der Mediane der Modellpeaks der terminalen Basenspezies G in 15 (5) um 1,6 Sekunden nach hinten verschoben, die Elektrophoresezeiten der Mediane der Modellpeaks der terminalen Basenspezies T in 15 (5) um 1,1 Sekunden nach vorne verschoben und die Modellpeaks der terminalen Basenspezies C und A nicht korrigiert. Als ein obiges Ergebnis wurden die Peaks der DNA-Fragmente, deren Längen sich um eine Base unterscheiden, annähernd in regelmäßigen Abständen in kürzerer Längenordnung angeordnet. Insbesondere die Messreihenfolge der DNA-Fragmente der terminalen Basenspezies G und der terminalen Basenspezies T sind wegen des Einflusses des Mobilitätsunterschieds aufgrund des Unterschieds in den fluoreszierenden Substanzen (d. h. lange DNA-Fragmente überholen kurze DNA-Fragmente in der Elektrophorese) umgekehrt, wie in 15 (5) dargestellt, während sie hervorragend korrigiert ist, wie in 15 (6) dargestellt.
  • 18 zeigt eine Liste, die die terminalen Basenspezies, die Anpassungsgenauigkeit und den QV (Quality Value) aller Modellpeaks in 15 (6) in der korrigierten zeitlichen Reihenfolge der Elektrophorese zusammenfasst. 18 ist die Liste, die 17 neu anordnet, und die verwendeten Zahlenwerte sind die gleichen. Die Anordnung der terminalen Basenspezies in 18 liefert DNA-Sequenzierungsergebnisse (Base-Calling-Ergebnisse). Anpassungsgenauigkeit und QV der Basen sind Indizes, die mit der Genauigkeit der Basensequenzbestimmung korrelieren, aber nicht mit der Genauigkeit der Basensequenzbestimmung identisch sind. Im Allgemeinen wird erwartet, dass die Genauigkeit der Basensequenzbestimmung größer ist als die Anpassungsgenauigkeit. Tatsächlich betrug die Genauigkeit der DNA-Sequenzierungsergebnisse in 18 100 %. Zu beachten ist, dass der Computer 520 die Daten in 18 berechnen kann und die Anzeigevorrichtung 530 die Daten in 18 anzeigen kann.
  • 16 fasst die Prozesse der DNA-Sequenzierung gemäß der Ausführungsform zusammen. 16 (1) ist die Gleiche wie 15 (1) und stellt die Zeitreihendaten der Zweifarbenerfassung dar, die durch Elektrophoreseanalyse entsprechend 4 (1) erhalten wurden. 16 (2) ist die Gleiche wie 15 (5) und stellt die Zeitreihendaten von Konzentrationen der DNA-Fragmente der terminalen Basenspezies C, A, G und T dar, entsprechend 4 (2). 16 (3) ist die Gleiche wie 15 (6) und stellt die korrigierten Zeitreihendaten von Konzentrationen der DNA-Fragmente der terminalen Basenarten C, A, G und T dar, die durch Mobilitätskorrektur erhalten wurden, entsprechend 4 (3). Schließlich zeigt 16 (4) die Ergebnisse der Durchführung von Base-Calling basierend auf den Ergebnissen in 16 (3), entsprechend 4 (4). Die Base-Calling-Ergebnisse in 16 (4) stimmen mit den Basensequenzen der Ziel-DNA überein.
  • Die Schemata und die Wirkungen der ersten bis fünften Ausführungsformen werden zusammengefasst. Gemäß der vorstehenden Ausführungsformen können Analyseverfahren bereitgestellt werden, in denen M Arten von Komponenten durch Erfassung von N Farben in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in dem Zustand identifiziert und erfasst werden, in dem die von M Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz spektrale Überlappungen und Raum-Zeit-Überlappungen aufweist. Im Folgenden wird der Nichtpatentliteratur 2 folgend ein Schema auf einem DNA-Sequenzierer unter Verwendung von Elektrophorese beschrieben, das Fluoreszenzemissionen von M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen in N = drei Farben erfasst.
  • Der Analysator 510 erfasst die Fluoreszenzemissionen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T in drei Farben in drei Arten von Wellenlängenbändern b, g und r. Der Prozess ist ähnlich wie in Nichtpatentliteratur 2 bis zu dem Prozess, bei dem die Fluoreszenzintensitäten der drei Farben in Gleichung (3) zu jedem Zeitpunkt erhalten werden. Hier speichert die Festplatte (die Speichereinheit) 1204 des Computers 520 vier Arten von Modellpeakdaten, d. h. vier Arten von Zeitreihendaten, wenn DNA-Fragmente einzelner Länge, die mit den vier Arten von fluoreszierenden Substanzen C, A, G und T markiert sind, in drei Farben erfasst werden. Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis der drei Farben der Modellpeakdaten der mit der fluoreszierenden Substanz Y (C, A, G oder T) markierten DNA-Fragmente ist (w(bY) w((gY) w(rY))T)T. Daher beinhalten die Modellpeakdaten Informationen, die der Matrix W entsprechen. Darüber hinaus beinhalten die Modellpeakdaten Informationen über die Formen der Peaks, d. h. Zeitreiheninformationen.
  • In der Nichtpatentliteratur 2 werden zu jedem Zeitpunkt eine oder zwei Arten von fluoreszierenden Substanzen ausgewählt, die Fluoreszenz emittieren, und ihre Konzentrationen werden unter Verwendung der Matrix W ermittelt. Andererseits führt der Computer 520 in den vorgenannten Ausführungsformen den Anpassungsanalyseprozess an den Zeitreihendaten der durch Gleichung (3) ausgedrückten Fluoreszenzintensitäten der drei Farben unter Verwendung der Modellpeakdaten von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen durch. Selbst wenn die Fluoreszenz, die von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen emittiert wird, eine spektrale und eine Raum-Zeit-Überlappung aufweist, kann der Computer 520 den Anpassungsanalyseprozess durchführen. Zum Beispiel ist es kein Problem, wenn drei Arten oder mehr fluoreszierende Substanzen gleichzeitig Fluoreszenz emittieren. Die Anpassungsergebnisse, die sich aus den Modellpeakdaten von C, A, G und T zusammensetzen, drücken die Zeitreihendaten der Konzentrationen D(C), D(A), D(G) und D(T) von C, A, G und T aus. Das heißt, obwohl keine Farbkonversion durchgeführt wird, können die Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. die Zeitreihendaten der Konzentration von vier Basenspezies, die der Gleichung (2) der Nichtpatentliteratur 1 entsprechen, mit den Zeitreihendaten der Fluoreszenzintensitäten der drei Farben erhalten werden. Im Gegensatz zur Nichtpatentliteratur 2 weisen die vorgenannten Ausführungsformen signifikante Merkmale auf, die Zeitreiheninformationen über die Konzentrationen von vier Arten von fluoreszierenden Substanzen nutzen. Danach führt der Computer 520 Prozesse durch, die den Prozessen (3) und (4) in der Nichtpatentliteratur 1 entsprechen, und somit kann der Computer 520 die Ergebnisse des Base-Callings erhalten.
  • Gemäß den vorstehenden Ausführungsformen erfolgt die Anpassung an den Zeitreihendaten von Fluoreszenzintensitäten von N Farben, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern durch Erfassung von N Farben in dem Zustand erhalten werden, in dem die von M Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz spektrale Überlappungen und Raum-Zeitüberlappungen aufweist, unter Verwendung der Modellpeakdaten von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, und somit können die Zeitreihendaten der Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, d. h. M Arten von Komponenten analysiert werden.
  • Um eine Analyse durchzuführen, bei der M Arten von Komponenten durch Erfassung von N Farben in N Arten von Wellenlängenbändern in dem Zustand identifiziert und erfasst werden, in dem die von M Arten von fluoreszierenden Substanzen emittierte Fluoreszenz eine spektrale Überlappung und eine Raum-Zeit-Überlappung aufweist, sind die notwendigen Bedingungen üblicherweise M ≤ N. Gemäß den vorstehenden Ausführungsformen kann eine Analyse ebenso durchgeführt werden, bei der M Arten von Komponenten selbst bei M > N identifiziert und erfasst werden. Das heißt, es wird die Wirkung ausgeübt, bei der eine ähnliche Analyse durch eine viel einfachere, kleinere und kostengünstigere Vorrichtungskonfiguration erreicht werden kann. So ist zum Beispiel bei N = Dreifarbenerfassung unter Verwendung eines RGB-Farbsensors, dessen Leistung verbessert wird und dessen Kosten rasch verringert werden, eine Analyse machbar, bei der M = vier Arten oder mehr Komponenten, die mit M = vier Arten oder mehr fluoreszierenden Substanzen markiert sind, identifiziert und erfasst werden. Aus den oben genannten Ergebnissen ist eine Analyse durch eine hochgenaue und kostengünstige Mehrfarbenerfassung möglich. So wird zum Beispiel eine N = Dreifarbenerfassung unter Verwendung eines kostengünstigen RGB-Farbsensors durchgeführt, während M = vier Arten von DNA-Fragmenten, die mit M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen durch die Sanger-Reaktion markiert sind, einer Elektrophorese unterzogen werden. Obwohl also die mit M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen markierten DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge im gemischten Zustand gemessen werden, können die Zeitreihendaten der Konzentrationen von M = vier Arten von DNA-Fragmenten erhalten und damit die DNA-Sequenzierung hervorragend durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die vorgenannten Ausführungsformen, einschließlich verschiedener beispielhafter Modifizierungen. Die vorgenannten Ausführungsformen werden zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben und sind nicht unbedingt auf solche mit allen Konfigurationen beschränkt. Ein Teil der Konfiguration einer Ausführungsform kann durch die Konfiguration einer anderen Ausführungsform ersetzt werden. Zu der Konfiguration einer Ausführungsform kann die Konfiguration einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Die anderen Konfigurationen können hinzugefügt, entfernt oder durch einen Teil der Konfiguration der Ausführungsformen ersetzt werden.
  • Die Konfigurationen, Funktionen, Verarbeitungseinheiten und Verarbeitungsschemata zum Beispiel des Computers 520 können durch Hardware erreicht werden, indem zum Beispiel ein Teil oder alle Teile davon unter Verwendung einer integrierten Schaltung entworfen werden. Die Konfigurationen, Funktionen und jede andere Komponente können durch Software von einem Prozessor erreicht werden, der Programme interpretiert und ausführt, die die Funktionen implementieren. Informationen, wie Programme, Tabellen und Dateien, die die Funktionen erreichen, können auf verschiedenen Arten von computerlesbaren Medien gespeichert werden. Beispiele für die nicht flüchtigen computerlesbaren Medien, die verwendet werden, schließen eine flexible Diskette, CD-ROM, DVD-ROM, Festplatte, optische Diskette, magnetooptische Diskette, CD-R, Magnetband, nichtflüchtige Speicherkarte und ROM ein.
  • In den vorstehenden Ausführungen werden Steuer- und Informationsleitungen dargestellt, die als notwendige Leitungen für die Beschreibung angesehen werden. Alle Kontroll- und Informationsleitungen von Produkten sind nicht unbedingt dargestellt. Alle Konfigurationen können miteinander verbunden werden.
  • Bezugszeichenliste
    • c
    im Wellenlängenband c erfasstes Fluoreszenzsignal
    g
    im Wellenlängenband g erfasstes Fluoreszenzsignal
    y
    im Wellenlängenband y erfasstes Fluoreszenzsignal
    r
    im Wellenlängenband r erfasstes Fluoreszenzsignal
    C
    fluoreszierende Substanz C oder Basenspezies C
    A
    fluoreszierende Substanz A oder Basenspezies A
    G
    fluoreszierende Substanz G oder Basenspezies G
    T
    fluoreszierende Substanz T oder Basenspezies T
    1
    Kapillare
    2
    Probeninjektionsende
    3
    Probenelutionsende
    4
    kathodenseitige Elektrolytlösung
    5
    anodenseitige Elektrolytlösung
    6
    negative Elektrode
    7
    positive Elektrode
    8
    Hochspannungsnetzteil
    9
    Probenlösung
    10
    Elektrophoreserichtung
    11
    Laserlichtquelle
    12
    Laserstrahl
    13
    Fluoreszenz
    14
    Mehrfarbenerfassungssystem
    15
    Laserstrahlbestrahlungsposition
    16
    Linse
    17
    zweidimensionaler Farbsensor
    510
    Analysator
    520
    Computer
    530
    Anzeigevorrichtung
    540, 550
    Datenbank

Claims (16)

  1. Analysesystem, umfassend: einen Analysator, ausgelegt, um eine Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, durch Chromatographie zu trennen und erste Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen zu erhalten, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erfasst werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist; eine Speichereinheit, ausgelegt um zweite Zeitreihendaten von einzelnen Modellfluoreszenzsignalen der Vielzahl von Komponenten zu speichern, und einen Computer, ausgelegt, um die ersten Zeitreihendaten mit den zweiten Zeitreihendaten zu vergleichen und zu bestimmen, welche Art von fluoreszierender Substanz von M Arten von fluoreszierenden Substanzen jede der Vielzahl von Komponenten einzeln markiert.
  2. Analysesystem nach Anspruch 1, wobei die zweiten Zeitreihendaten Daten sind, die eine zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zwischen N Arten von Fluoreszenzen von Modellpeaks zum Ausdruck bringen, wenn eine mit jeder der fluoreszierenden Substanzen markierte Komponente erfasst wird.
  3. Analysesystem nach Anspruch 1, wobei der Computer dritte Zeitreihendaten von Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, die zu den Fluoreszenzsignalen beitragen, ausgibt, indem er die zweiten Zeitreihendaten an die ersten Zeitreihendaten anpasst.
  4. Analysesystem nach Anspruch 3, wobei die Speichervorrichtung Mobilitätsunterschiedsdaten speichert, die sich auf Unterschiede in der Mobilität aufgrund von Unterschieden in den M Arten von fluoreszierenden Substanzen beziehen, und der Computer die Unterschiede in der Mobilität in den dritten Zeitreihendaten basierend auf den Mobilitätsunterschiedsdaten korrigiert.
  5. Analysesystem nach Anspruch 3, wobei der Computer Anpassungsfehlerdaten oder Anpassungsgenauigkeitsdaten ausgibt, die sich auf eine Differenz zwischen den ersten Zeitreihendaten und einem Ergebnis der Anpassung an jeder der Vielzahl von Komponenten beziehen.
  6. Analysesystem nach Anspruch 5, des Weiteren umfassend eine Anzeige, die ausgelegt ist, um mindestens eines der Folgenden anzuzeigen i) das Ergebnis der Anpassung in Bezug auf jede der Vielzahl von Komponenten, ii) Anpassungsfehlerdaten oder Anpassungsgenauigkeitsdaten in Bezug auf jede der Vielzahl von Komponenten und iii) die dritten Zeitreihendaten.
  7. Analysesystem nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Komponenten Nukleinsäurefragmente unterschiedlicher Länge oder unterschiedlicher Zusammensetzung sind und die Chromatographie Elektrophorese ist.
  8. Analysesystem nach Anspruch 7, wobei die Vielzahl von Komponenten DNA-Fragmente sind, die endständig mit M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen gemäß der terminalen Basenspezies markiert sind und die durch ein Sanger-Verfahren unter Verwendung einer Ziel-DNA als Matrize hergestellt wurden; die ersten Zeitreihendaten Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen sind, die in N = drei Arten oder zwei Arten von Wellenlängenbändern erfasst werden, und der Computer eine Basensequenz der Ziel-DNA bestimmt.
  9. Analyseverfahren, umfassend: Auftrennen einer Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, die mit den M Arten von fluoreszierenden Substanzen markiert sind, durch Chromatographie und Erhalten erster Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen, die in N Arten (M > N) von Wellenlängenbändern in einem Zustand erfasst werden, in dem mindestens ein Teil der Vielzahl von Komponenten nicht vollständig getrennt ist, und Bestimmen, welche Art von fluoreszierender Substanz von M Arten von fluoreszierenden Substanzen jede der Vielzahl von Komponenten einzeln markiert, indem die ersten Zeitreihendaten mit den zweiten Zeitreihendaten von einzelnen Modellfluoreszenzsignalen der Vielzahl von Komponenten verglichen werden.
  10. Analyseverfahren nach Anspruch 9, wobei die zweiten Zeitreihendaten Daten sind, die Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zwischen N Arten von Fluoreszenzen von Modellpeaks ausdrücken, wenn jede der fluoreszierenden Substanzen allein Fluoreszenz emittiert.
  11. Analyseverfahren nach Anspruch 9, wobei das Bestimmen die Ausgabe von dritten Zeitreihendaten von Konzentrationen von M Arten von fluoreszierenden Substanzen, die zu den Fluoreszenzsignalen beitragen, durch Anpassen der zweiten Zeitreihendaten an die ersten Zeitreihendaten beinhaltet.
  12. Analyseverfahren nach Anspruch 11, wobei das Bestimmen das Korrigieren der Unterschiede in der Mobilität in den dritten Zeitreihendaten basierend auf Mobilitätsunterschiedsdaten, die sich auf Unterschiede in der Mobilität aufgrund von Unterschieden in den M Arten von fluoreszierenden Substanzen beziehen, einschließt.
  13. Analyseverfahren nach Anspruch 11, wobei das Bestimmen die Ausgabe von Anpassungsfehlerdaten oder Anpassungsgenauigkeitsdaten einschließt, die sich auf eine Differenz zwischen den ersten Zeitreihendaten und einem Ergebnis der Anpassung von jeder der Vielzahl von Komponenten beziehen.
  14. Analyseverfahren nach Anspruch 13, des Weiteren umfassend das Anzeigen von mindestens einem der Folgenden (i) das Ergebnis der Anpassung in Bezug auf jede der Vielzahl von Komponenten, (ii) Anpassungsfehlerdaten oder Anpassungsgenauigkeitsdaten in Bezug auf jede der Vielzahl von Komponenten und (iii) die dritten Zeitreihendaten.
  15. Analyseverfahren nach Anspruch 9, wobei die Vielzahl von Komponenten Nukleinsäurefragmente unterschiedlicher Länge oder unterschiedlicher Zusammensetzung sind und die Chromatographie Elektrophorese ist.
  16. Analyseverfahren nach Anspruch 15, wobei die Vielzahl von Komponenten DNA-Fragmente sind, die endständig mit M = vier Arten von fluoreszierenden Substanzen gemäß der terminalen Basenspezies markiert sind und die durch ein Sanger-Verfahren unter Verwendung einer Ziel-DNA als Matrize hergestellt wurden; die ersten Zeitreihendaten Zeitreihendaten von Fluoreszenzsignalen sind, die in N = drei Arten oder zwei Arten von Wellenlängenbändern erfasst werden, und das Bestimmen das Bestimmen einer Basensequenz der Ziel-DNA beinhaltet.
DE112017006899.1T 2017-02-20 2017-02-20 Analysesystem und Analyseverfahren Pending DE112017006899T5 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2017/006030 WO2018150559A1 (ja) 2017-02-20 2017-02-20 分析システム及び分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE112017006899T5 true DE112017006899T5 (de) 2019-10-10

Family

ID=63170153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112017006899.1T Pending DE112017006899T5 (de) 2017-02-20 2017-02-20 Analysesystem und Analyseverfahren

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11860094B2 (de)
JP (1) JP6740443B2 (de)
CN (2) CN110291382B (de)
DE (1) DE112017006899T5 (de)
GB (1) GB2573692B (de)
WO (1) WO2018150559A1 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10349589B2 (en) 2016-09-08 2019-07-16 Hemex Health, Inc. Diagnostics systems and methods
KR102291911B1 (ko) 2016-09-08 2021-08-23 헤멕스 헬스, 인크. 진단 시스템 및 방법
SG11202101607UA (en) * 2018-08-31 2021-03-30 Life Technologies Corp Methods and apparatus for extended dynamic range from single exposures in capillary electrophoresis
JP7224207B2 (ja) * 2019-03-05 2023-02-17 株式会社日立ハイテク 遺伝子型解析装置及び方法
CN113840902A (zh) * 2019-05-22 2021-12-24 株式会社日立高新技术 分析装置以及分析方法
WO2020264182A1 (en) * 2019-06-25 2020-12-30 Hemex Health, Inc. Diagnostics systems and methods

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3563140B2 (ja) 1995-01-19 2004-09-08 株式会社日立製作所 キャピラリーアレイ電気泳動装置
US6017434A (en) * 1995-05-09 2000-01-25 Curagen Corporation Apparatus and method for the generation, separation, detection, and recognition of biopolymer fragments
US6680377B1 (en) * 1999-05-14 2004-01-20 Brandeis University Nucleic acid-based detection
JP4459390B2 (ja) * 2000-06-08 2010-04-28 浜松ホトニクス株式会社 蛍光測定方法、蛍光測定装置及びそれを用いた試料評価装置
US20030207310A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-06 Zhaowei Liu System and method for determining the sizes and quantity of polynucleotides with capillary array electrophoresis
JP3889334B2 (ja) * 2002-07-31 2007-03-07 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法
EP1612541A1 (de) * 2003-04-04 2006-01-04 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Quantitatives reaktionsmittel, verfahren und geräte einer substanz unter verwendung der fluoreszenzlebensdauer
WO2005008212A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-27 The Regents Of The University Of California Modulated excitation fluorescence analysis
WO2005064336A1 (en) * 2003-12-09 2005-07-14 Molecular Probes, Inc. Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
JP2007093370A (ja) * 2005-09-28 2007-04-12 Olympus Corp 蛍光分光分析装置
US7629124B2 (en) 2006-06-30 2009-12-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Real-time PCR in micro-channels
US8703422B2 (en) * 2007-06-06 2014-04-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
CN101464411A (zh) 2009-01-15 2009-06-24 浙江大学 毛细管阵列分析仪
JP5337676B2 (ja) * 2009-06-25 2013-11-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 蛍光分析装置および蛍光検出装置
JP2012173252A (ja) * 2011-02-24 2012-09-10 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd 蛍光分析装置および蛍光分析方法
WO2012133292A1 (ja) * 2011-03-29 2012-10-04 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
CN103765197B (zh) * 2011-08-30 2016-03-02 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
DE112012005966T5 (de) * 2012-10-19 2014-12-11 Hitachi, Ltd. Verfahren, System und Kit zur Analyse von Genen
JP6087128B2 (ja) * 2012-12-17 2017-03-01 株式会社日立ハイテクノロジーズ 遺伝子型解析装置及び遺伝子型解析方法
JP5789720B2 (ja) * 2013-07-31 2015-10-07 株式会社日立製作所 遺伝子変異分析装置、遺伝子変異分析システム及び遺伝子変異分析方法
JP5973404B2 (ja) 2013-09-25 2016-08-23 株式会社日立ハイテクノロジーズ 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
JP2017078724A (ja) * 2014-01-27 2017-04-27 株式会社日立ハイテクノロジーズ 多色蛍光画像分析装置

Also Published As

Publication number Publication date
GB2573692B (en) 2022-02-16
CN110291382B (zh) 2022-11-22
US20240085329A1 (en) 2024-03-14
CN115808461A (zh) 2023-03-17
GB2573692A (en) 2019-11-13
JPWO2018150559A1 (ja) 2019-11-21
US11860094B2 (en) 2024-01-02
CN110291382A (zh) 2019-09-27
GB201910590D0 (en) 2019-09-04
US20190383742A1 (en) 2019-12-19
JP6740443B2 (ja) 2020-08-12
WO2018150559A1 (ja) 2018-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112017006899T5 (de) Analysesystem und Analyseverfahren
DE102004015018B4 (de) Verfahren zum Identifizieren von Ionen aus Chromatographie-Massenspektral-Datensätzen, die überlappende Komponenten enthalten
DE102017111067B4 (de) Isomeren-Analyse in TIMS-Q-q-TOF Massenspektrometern
EP0014857B1 (de) Verfahren zum automatischen Markieren von Zellen und zur Bestimmung der Merkmale von Zellen aus zytologischen Abstrichpräparaten
DE60212620T2 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Analysieren eines Probenstoffgemischs
DE60114245T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur identifizierung und quantifizierung chemischer komponenten einer mischung
DE10047088C2 (de) Medium für analytische und präparative Elektrophorese
DE102018122961A1 (de) Chromatographische datensystemverarbeitungseinrichtung
EP2446460A1 (de) Funktionskontrolle bzw. varianzenkompensation in der massenspektrometrie
WO2008107476A1 (de) Verfahren zur normierung der konzentration von analyten in einer urinprobe
DE102004037512A1 (de) Massenspektrometrische Gewebezustandsdifferenzierung
DE112015006100T5 (de) Mehrfarbenerfassungsvorrichtung
DE102005020134A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines parallelen und simultanen Mehrfachprozesses der trägerfreien isoelektrischen Fokussierung
DE112014003992T5 (de) Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen und Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen
DE102004051043B4 (de) Angleichung von Flugzeitmassenspektren
DE112020006681T5 (de) Elektrophoresesystem
JP7050122B2 (ja) キャピラリ電気泳動装置
EP0993609B1 (de) Verfahren zur bestimmung der anzahl von komponenten in peaks, banden und signalen von chromatogrammen, elektrogrammen und spektrogrammen aller art
WO2009071241A1 (de) Verfahren zur auswertung analytbezogener signale aus einem mittels der ionenbeweglichkeitsspektrometrie aufgenommenen ims-chromatogramm
DE19831210A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen
DE4405251A1 (de) Verfahren zur Verarbeitung von elektrophoretischen Daten
DE112020002033T5 (de) Analysesystem und Analyseverfahren
DE4307736A1 (en) Sequence to process electrophoresic sample of human serum quickly - comprises normalisation of measuring sample derived from electrophoresic processing compared to ref. prod., fractionating sample on basis of derived fractionating point, etc.
DE4100279C2 (de) Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzermittlung
DE112020006697T5 (de) Elektrophoresevorrichtung und analyseverfahren

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R081 Change of applicant/patentee

Owner name: HITACHI HIGH-TECH CORPORATION, JP

Free format text: FORMER OWNER: HITACHI HIGH-TECHNOLOGIES CORPORATION, TOKYO, JP

R082 Change of representative

Representative=s name: MERH-IP MATIAS ERNY REICHL HOFFMANN PATENTANWA, DE