JP3889334B2 - 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 - Google Patents
化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被測定試料における化学反応に伴い発生する化学発光の経時変化と、その被測定試料への励起光の照射に伴い発生する蛍光の経時変化とを測定する測定装置および測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、生体関連物質等の測定においては、蛍光や化学発光を利用した測定方法が用いられている。たとえば、生体内情報伝達に関与していることが知られている細胞内カルシウムイオンは、その濃度を蛍光指示薬で検出、定量することが可能である。また、生体細胞の免疫や老化等に関与していることが知られている活性酸素、特にスーパーオキサイドや一重項酸素は、化学発光試薬による検出が可能であり、免疫系の細胞等が産生するスーパーオキサイドの検出がなされている。そして、このような免疫系細胞からの情報、たとえば細胞内カルシウムイオン濃度と細胞のスーパーオキサイド産生量とを同時に測定しようとした場合、蛍光と化学発光とを同時に検出することが必要となる。
【０００３】
免疫系の細胞として知られている白血球の一種であるヒト好中球により産生されるスーパーオキサイド（Ｏ2 -）は、人体に侵入した細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御において重要な役割を担っている。このスーパーオキサイドの産生には、好中球細胞内のカルシウムイオン濃度が関与していると考えられているが、このカルシウムの役割については不明な点が多い。このスーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、例えば、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法や、免疫や炎症等に関与する薬剤の作用機序の解明に役立つと期待される。
【０００４】
スーパーオキサイド産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い発生する化学発光を検出することにより可能である。また、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可能である。
【０００５】
蛍光及び化学発光それぞれを測定する技術としては、特許第３１８３８６３号公報記載の「化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法」がある。この発明は、被測定試料に励起光を繰り返しパルス的に照射して、励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出するものであり、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの経時変化を実時間で検出することができる。また、特開平１１−１４８９００号公報には、単一の検出光学系により蛍光及び化学発光それぞれの測定をすることが可能な「発光パターン読取装置」が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許第３１８３８６３号公報に記載の発明においては、蛍光を測定する蛍光検出光学系と、化学発光を測定する化学発光検出光学系とが分離されているため、蛍光及び化学発光それぞれを分光手段により分離する必要がある。このため、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合には、蛍光と化学発光との分離が困難なため、蛍光および化学発光の測定ができないという問題を有する。
【０００７】
また、特開平１１−１４８９００号公報に記載の発明は、蛍光及び化学発光それぞれを単一の検出器により測定するものであり、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても、蛍光及び化学発光それぞれの測定を行うことができる。しかし、本装置は、試料に励起光を照射して蛍光のみを測定し、蛍光の測定とは別に励起光の照射を停止して化学発光のみを測定するものであり、同一現象における蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を同時に測定することができない。よって、スーパーオキサイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な関係を検出することができないという問題を有する。
【０００８】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても、蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、（１）被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する励起手段と、（２）励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを選択して透過させる光選択手段と、（３）光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を出力する一の光検出手段と、（４）光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する経時変化測定手段と、を備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、被測定試料に励起光を励起手段によりパルス的に繰り返し照射して、励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを光選択手段により選択して透過させ、光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を一の光検出手段により出力し、光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する、ことを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置又は方法によれば、被測定試料は、励起手段により励起光がパルス的に繰り返し照射される。励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれは、光選択手段により選択されて透過される。そして、光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光が受光され、その受光量に応じて電気信号が一の光検出手段により出力され、光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとが求められる。さらに、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データが算出され、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化が測定され、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化が経時変化測定手段により測定される。このようにして、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの経時変化が実時間で検出される。
【００１２】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、被測定試料の温度を制御する温度制御手段を更に備えることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、化学発光および蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に被測定試料の温度を温度制御手段により制御することを特徴とする。
【００１４】
この場合には、被測定試料の温度が温度制御手段により制御されるので、例えば被測定試料が細胞である場合に好適である。
【００１５】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、被測定試料が液体であって、その被測定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、被測定試料が液体であって、化学発光および蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に被測定試料を攪拌手段により攪拌することを特徴とする。
【００１７】
この場合には、被測定試料が攪拌手段により攪拌されるので、被測定試料が懸濁液である場合に好適である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
まず、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の構成図である。経時変化測定装置１は、励起手段１０、光選択手段２０、光検出手段３０、経時変化測定手段４０、温度制御手段５０及び攪拌手段６０を備えている。
【００２０】
励起手段１０は、励起光源１１０、シャッタ１２０、チョッパ１３０、チョッパコントローラ１６０、集光レンズ１４０及び光ファイバ１５０を備え、被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する。
【００２１】
励起光源１１０は、被測定試料に予め導入された蛍光指示薬を励起して蛍光を発生させる波長の励起光を出力する。励起光源１１０から出力された励起光はシャッタ１２０、チョッパ１３０、集光レンズ１４０を経て光ファイバ１５０へ導かれる。光ファイバ１５０へ入射した励起光は光ファイバ１５０内を伝播し、サンプルホルダ７００内の被測定試料へ照射される。チョッパ１３０は、チョッパコントローラ１６０により制御されて回転し、励起光源１１０からの励起光の通過又は遮断の制御を行い、励起光を被測定試料にパルス的に照射するためのものである。シャッタ１２０は、開いているときに励起光を通過させる。
【００２２】
光選択手段２０は、フィルタ２１０、レンズ２２０及びレンズ２２１を備え、励起手段１０により励起光が被測定試料に照射されることにより測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを選択して透過させる。
【００２３】
フィルタ２１０は、バンドリジェクションフィルタ等が好適に用いられ、励起光の波長成分を選択的に除去するとともに、被測定試料で発生した蛍光及び化学発光を選択して透過させる。また、レンズ２２０およびレンズ２２１は、被測定試料で発生した蛍光および化学発光を光電子増倍管３１０の受光面に集光する。
【００２４】
光検出手段３０は、光電子増倍管３１０、高電圧電源３１１及びシャッタ３２０を備え、光選択手段２０により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光の光子の受光面への入射に応じたパルスを出力する。
【００２５】
シャッタ３２０は、開閉し、開いているときに被測定試料で発生した蛍光および化学発光それぞれを光電子増倍管３１０の受光面に入射させる。光電子増倍管３１０は、高電圧電源３１１から供給された高電圧により駆動され、蛍光又は化学発光の光子の受光面への入射に応じてパルスを出力する。
【００２６】
経時変化測定手段４０は、フォトンカウンタ４１０及びコンピュータ４２０を備え、光検出手段３０により出力されたパルスに基づいて、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する。
【００２７】
フォトンカウンタ４１０は、光電子増倍管３１０より出力されたパルスが入力される。また、フォトンカウンタ４１０は、ゲート回路を有し、このゲート回路に計測期間を制御する信号を入力することにより任意の計測期間を設定することができる。本実施形態においては、このゲート回路にチョッパコントローラ１６０による励起光の通過又は遮断の制御信号を入力する。そして、フォトンカウンタ４１０は、これらの信号に基づいて、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光子が光電子増倍管３１０の受光面に入射したという事象の数に応じたパルス数を計数して第１光強度データを求める。また、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光及び化学発光の光子が光電子増倍管３１０の受光面に入射したという事象の数に応じたパルス数を計数して第２光強度データを求める。さらに、フォトンカウンタ４１０は、第１光強度データ及び第２光強度データそれぞれをコンピュータ４２０へ出力する。
【００２８】
コンピュータ４２０は、フォトンカウンタ４１０から出力された第１光強度データ及び第２光強度データを入力し、第２光強度データから第１光強度データを減算し第３光強度データを算出する。そして、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する。
【００２９】
温度制御手段５０は、サーモバス５１０、配管５２０及び配管５２１を備え、被測定試料の温度を適切に制御する。
【００３０】
攪拌手段６０は、マグネティックスターラ及びマグネティックスターラコントローラ６１０を備え、マグネティックスターラは、サンプルホルダ７００に容れられた液体状の被測定試料を攪拌する。
【００３１】
さらに、被測定試料を容れるサンプルホルダ７００は、サーモバス５１０と配管５２０及び配管５２１を介して接続されている。そしてサンプルホルダ７００に容れられた被測定試料の温度は、サーモバス５１０により所定温度に制御される。また、被測定試料は、マグネティックスターラコントローラ６１０により制御されるマグネティックスターラにより攪拌される。さらに、サンプルホルダ７００は、被測定試料や試薬を導入するためのサンプルディスペンサ７１０と接続されている。
【００３２】
図２は、本実施形態における励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを示す図である。図２に基づいて励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを詳細に説明する。励起光は、チョッパ１３０により通過又は遮断の制御を受けて被測定試料に照射される。図２では、チョッパ１３０による励起光の通過時間と遮断時間との割合は１対９である。この時間割合は必要に応じて変化させることが出来る。この励起光が照射されている時間帯を除いて、第１光強度データが測定される。より詳細には、被測定試料に導入された蛍光指示薬の蛍光寿命時間（約５ｎｓ）、装置の応答時間（約１０ｎｓ）及びチョッパ１３０が励起光を遮断する際に励起光のビームを通過するのに必要な時間（約２０μｓ）の経過後から第１光強度データの測定を開始し、チョッパ１３０が回転することにより次に励起光がチョッパ１３０を通過する時刻の２０μｓ前に第１光強度データの測定を終了する。これにより、第１光強度データは、励起光の影響をまったく受けることなく化学発光の光強度のみを反映した値となる。
【００３３】
また、第２光強度データは、励起光照射を行っているときを含む期間内において測定され、第２光強度データの測定時間と第１光強度データの測定時間とを等しくすることにより、第２光強度データは、第１光強度データと同じ化学発光の光強度および蛍光の光強度を反映した値となる。よって、チョッパ１３０の通過／遮断周期における同一周期内において第２光強度データから第１光強度データを減算し第３光強度データを算出することにより蛍光強度のみを抽出することが出来る。
【００３４】
次に、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の動作について説明すると共に、化学発光および蛍光の経時変化測定方法についても説明する。以下の説明では具体的な実施例として被測定試料がヒト好中球様細胞である場合について説明する。ここで、ヒト好中球様細胞は、前骨髄芽球系株細胞HL-60 を1.2％DMSOを含むGIT mediumで細胞密度を３×１０5細胞／ｍｌに合わせ、これを４〜６日間３７℃で５％ＣＯ2存在下で培養したものである。
【００３５】
被測定試料である好中球様細胞は、予め、カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３（1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加されて、懸濁液とされる。この被測定試料は、ポリメチルメタクリレート製のセルに容れられてサンプルホルダ７００にセットされる。サンプルホルダ７００にセットされた被測定試料は、サーモバス５１０により一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラコントローラ６１０により制御されたマグネティックスターラにより攪拌される。
【００３６】
以上の測定準備が終了すると、チョッパ１３０はチョッパコントローラ１６０により制御されて一定速度で回転し、シャッタ１２０は開く。チョッパ１３０による励起光の通過、遮断の周期は、５０Hz〜２ｋHz程度であり、特に１００〜５００Hzが好ましい。本実施例では２５０Hzとしている。
【００３７】
励起光源１１０から出力された励起光は、チョッパ１３０に入射する。そして、チョッパ１３０に入射した励起光は、チョッパ１３０により通過又は遮断の制御を受け、集光レンズ１４０、光ファイバ１５０を通過して、サンプルホルダ７００に容れられた被測定試料にパルス的に照射される。励起光源１１０は、波長４７３ｎｍのレーザ光を出力するネオジウムドープヤグレーザ光源が用いられる。
【００３８】
被測定試料で発生した化学発光（波長３８５ｎｍ）は、レンズ２２０により集光され、フィルタ２１０、レンズ２２１およびシャッタ３２０を通過し、光電子増倍管３１０の受光面に入射する。この化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡとが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生する化学発光である。すなわち、化学発光強度は、スーパーオキサイド産生量を表している。
【００３９】
一方、被測定試料で発生した蛍光（波長５２３ｎｍ）は、同様にレンズ２２０により集光され、フィルタ２１０、レンズ２２１およびシャッタ３２０を透過し、光電子増倍管３１０の受光面に入射する。この蛍光は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３とが結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生する蛍光である。すなわち、蛍光強度は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンの濃度を表している。なお、励起光の散乱光は、フィルタ２１０により遮断されるので、光電子増倍管３１０の受光面に入射することはない。
【００４０】
光電子増倍管３１０からは、蛍光および化学発光の双方又は化学発光の光子の受光面への入射に応じたパルスが出力される。
【００４１】
光電子増倍管３１０から出力されたパルスは、フォトンカウンタ４１０に入力される。また、チョッパコントローラ１６０による励起光の通過、遮断の制御信号もフォトンカウンタ４１０に入力される。そして、フォトンカウンタ４１０により、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光子数が計数されて第１光強度データが求められ、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光子数が計数されて第２光強度データが求められる。そしてさらに、第２光強度データから第１光強度データが減算されて第３光強度データが算出される。
【００４２】
以上のように励起光照射、化学発光強度測定および蛍光強度測定を行いながら、サンプルディスペンサ７１０より刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）へ滴下される。刺激薬としては、例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用いられる。そして、コンピュータ４２０により、刺激薬の被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の間の因果関係や時間的関係が解析される。
【００４３】
図３は、「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。被測定試料は、上述したようなカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で処理され化学発光試薬ＣＬＡが添加された好中球様細胞を、１ｍＭの細胞外カルシウム溶液内に容れて懸濁液としたものである。測定開始後の２５０秒の時点で１μＭのｆＭＬＰで被測定試料を刺激したものである。「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化が実時間で検出できていることがわかる。
【００４４】
図４は、「化学発光強度」及び「蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。図４における「蛍光強度」は、図３における「化学発光強度及び蛍光強度」から「化学発光強度」を減算することにより算出した。
【００４５】
図４から判るように、ｆＭＬＰで被測定試料が刺激されると、直ちに蛍光強度が上昇し、その後に数秒遅れて、化学発光強度が上昇している。このことから、ｆＭＬＰ刺激により、細胞内カルシウム濃度が直ちに上昇し、その後に数秒遅れてスーパーオキサイドが産生されることが確認された。
【００４６】
以上、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置及び方法によれば、単一の光検出手段により化学発光及び蛍光それぞれの経時変化を同時に測定することができるため、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても同一現象における蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる。さらに、化学発光及び蛍光それぞれを分光手段により分離する必要が無いことにより光学系を単純化することができるため、装置の小型化及び光の利用効率の向上を図ることができる。
【００４７】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、ヒト好中球様細胞を被測定試料として、被測定試料においてスーパーオキサイド産生に伴い発生した化学発光およびカルシウム濃度変化に伴い発生した蛍光を測定する場合について説明したが、これに限られるものではない。
【００４８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したとおり、本発明によれば、蛍光波長及び化学発光波長が同一又は近接する場合であっても蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置の構成図である。
【図２】本実施形態における励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを示す図である。
【図３】「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。
【図４】「化学発光強度」及び「蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
１…経時変化測定装置、１０…励起手段、２０…光選択手段、３０…光検出手段、４０…経時変化測定手段、５０…温度制御手段、６０…攪拌手段、１１０…励起光源、１２０…シャッタ、１３０…チョッパ、１４０…集光レンズ、１５０…光ファイバ、１６０…チョッパコントローラ、２１０…フィルタ、２２０，２２１…レンズ、３１０…光電子増倍管、３１１…高電圧電源、３２０…シャッタ、４１０…フォトンカウンタ、４２０…コンピュータ、５１０…サーモバス、５２０，５２１…配管、７００…サンプルホルダ、７１０…サンプルディスペンサ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、被測定試料における化学反応に伴い発生する化学発光の経時変化と、その被測定試料への励起光の照射に伴い発生する蛍光の経時変化とを測定する測定装置および測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、生体関連物質等の測定においては、蛍光や化学発光を利用した測定方法が用いられている。たとえば、生体内情報伝達に関与していることが知られている細胞内カルシウムイオンは、その濃度を蛍光指示薬で検出、定量することが可能である。また、生体細胞の免疫や老化等に関与していることが知られている活性酸素、特にスーパーオキサイドや一重項酸素は、化学発光試薬による検出が可能であり、免疫系の細胞等が産生するスーパーオキサイドの検出がなされている。そして、このような免疫系細胞からの情報、たとえば細胞内カルシウムイオン濃度と細胞のスーパーオキサイド産生量とを同時に測定しようとした場合、蛍光と化学発光とを同時に検出することが必要となる。
【０００３】
免疫系の細胞として知られている白血球の一種であるヒト好中球により産生されるスーパーオキサイド（Ｏ2 -）は、人体に侵入した細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御において重要な役割を担っている。このスーパーオキサイドの産生には、好中球細胞内のカルシウムイオン濃度が関与していると考えられているが、このカルシウムの役割については不明な点が多い。このスーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、例えば、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法や、免疫や炎症等に関与する薬剤の作用機序の解明に役立つと期待される。
【０００４】
スーパーオキサイド産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い発生する化学発光を検出することにより可能である。また、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可能である。
【０００５】
蛍光及び化学発光それぞれを測定する技術としては、特許第３１８３８６３号公報記載の「化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法」がある。この発明は、被測定試料に励起光を繰り返しパルス的に照射して、励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出するものであり、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの経時変化を実時間で検出することができる。また、特開平１１−１４８９００号公報には、単一の検出光学系により蛍光及び化学発光それぞれの測定をすることが可能な「発光パターン読取装置」が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許第３１８３８６３号公報に記載の発明においては、蛍光を測定する蛍光検出光学系と、化学発光を測定する化学発光検出光学系とが分離されているため、蛍光及び化学発光それぞれを分光手段により分離する必要がある。このため、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合には、蛍光と化学発光との分離が困難なため、蛍光および化学発光の測定ができないという問題を有する。
【０００７】
また、特開平１１−１４８９００号公報に記載の発明は、蛍光及び化学発光それぞれを単一の検出器により測定するものであり、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても、蛍光及び化学発光それぞれの測定を行うことができる。しかし、本装置は、試料に励起光を照射して蛍光のみを測定し、蛍光の測定とは別に励起光の照射を停止して化学発光のみを測定するものであり、同一現象における蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を同時に測定することができない。よって、スーパーオキサイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な関係を検出することができないという問題を有する。
【０００８】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても、蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、（１）被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する励起手段と、（２）励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを選択して透過させる光選択手段と、（３）光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を出力する一の光検出手段と、（４）光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する経時変化測定手段と、を備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、被測定試料に励起光を励起手段によりパルス的に繰り返し照射して、励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを光選択手段により選択して透過させ、光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を一の光検出手段により出力し、光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する、ことを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置又は方法によれば、被測定試料は、励起手段により励起光がパルス的に繰り返し照射される。励起手段により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれは、光選択手段により選択されて透過される。そして、光選択手段により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光が受光され、その受光量に応じて電気信号が一の光検出手段により出力され、光検出手段により出力された電気信号に基づいて、励起手段により励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起手段により励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとが求められる。さらに、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データが算出され、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化が測定され、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化が経時変化測定手段により測定される。このようにして、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの経時変化が実時間で検出される。
【００１２】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、被測定試料の温度を制御する温度制御手段を更に備えることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、化学発光および蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に被測定試料の温度を温度制御手段により制御することを特徴とする。
【００１４】
この場合には、被測定試料の温度が温度制御手段により制御されるので、例えば被測定試料が細胞である場合に好適である。
【００１５】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、被測定試料が液体であって、その被測定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、被測定試料が液体であって、化学発光および蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に被測定試料を攪拌手段により攪拌することを特徴とする。
【００１７】
この場合には、被測定試料が攪拌手段により攪拌されるので、被測定試料が懸濁液である場合に好適である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
まず、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の構成図である。経時変化測定装置１は、励起手段１０、光選択手段２０、光検出手段３０、経時変化測定手段４０、温度制御手段５０及び攪拌手段６０を備えている。
【００２０】
励起手段１０は、励起光源１１０、シャッタ１２０、チョッパ１３０、チョッパコントローラ１６０、集光レンズ１４０及び光ファイバ１５０を備え、被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する。
【００２１】
励起光源１１０は、被測定試料に予め導入された蛍光指示薬を励起して蛍光を発生させる波長の励起光を出力する。励起光源１１０から出力された励起光はシャッタ１２０、チョッパ１３０、集光レンズ１４０を経て光ファイバ１５０へ導かれる。光ファイバ１５０へ入射した励起光は光ファイバ１５０内を伝播し、サンプルホルダ７００内の被測定試料へ照射される。チョッパ１３０は、チョッパコントローラ１６０により制御されて回転し、励起光源１１０からの励起光の通過又は遮断の制御を行い、励起光を被測定試料にパルス的に照射するためのものである。シャッタ１２０は、開いているときに励起光を通過させる。
【００２２】
光選択手段２０は、フィルタ２１０、レンズ２２０及びレンズ２２１を備え、励起手段１０により励起光が被測定試料に照射されることにより測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光それぞれを選択して透過させる。
【００２３】
フィルタ２１０は、バンドリジェクションフィルタ等が好適に用いられ、励起光の波長成分を選択的に除去するとともに、被測定試料で発生した蛍光及び化学発光を選択して透過させる。また、レンズ２２０およびレンズ２２１は、被測定試料で発生した蛍光および化学発光を光電子増倍管３１０の受光面に集光する。
【００２４】
光検出手段３０は、光電子増倍管３１０、高電圧電源３１１及びシャッタ３２０を備え、光選択手段２０により選択されて透過された蛍光および化学発光の双方又は化学発光の光子の受光面への入射に応じたパルスを出力する。
【００２５】
シャッタ３２０は、開閉し、開いているときに被測定試料で発生した蛍光および化学発光それぞれを光電子増倍管３１０の受光面に入射させる。光電子増倍管３１０は、高電圧電源３１１から供給された高電圧により駆動され、蛍光又は化学発光の光子の受光面への入射に応じてパルスを出力する。
【００２６】
経時変化測定手段４０は、フォトンカウンタ４１０及びコンピュータ４２０を備え、光検出手段３０により出力されたパルスに基づいて、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、第２光強度データと第１光強度データとに基づいて蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する。
【００２７】
フォトンカウンタ４１０は、光電子増倍管３１０より出力されたパルスが入力される。また、フォトンカウンタ４１０は、ゲート回路を有し、このゲート回路に計測期間を制御する信号を入力することにより任意の計測期間を設定することができる。本実施形態においては、このゲート回路にチョッパコントローラ１６０による励起光の通過又は遮断の制御信号を入力する。そして、フォトンカウンタ４１０は、これらの信号に基づいて、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光子が光電子増倍管３１０の受光面に入射したという事象の数に応じたパルス数を計数して第１光強度データを求める。また、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光及び化学発光の光子が光電子増倍管３１０の受光面に入射したという事象の数に応じたパルス数を計数して第２光強度データを求める。さらに、フォトンカウンタ４１０は、第１光強度データ及び第２光強度データそれぞれをコンピュータ４２０へ出力する。
【００２８】
コンピュータ４２０は、フォトンカウンタ４１０から出力された第１光強度データ及び第２光強度データを入力し、第２光強度データから第１光強度データを減算し第３光強度データを算出する。そして、第１光強度データに基づいて化学発光の経時変化を測定し、第３光強度データに基づいて蛍光の経時変化を測定する。
【００２９】
温度制御手段５０は、サーモバス５１０、配管５２０及び配管５２１を備え、被測定試料の温度を適切に制御する。
【００３０】
攪拌手段６０は、マグネティックスターラ及びマグネティックスターラコントローラ６１０を備え、マグネティックスターラは、サンプルホルダ７００に容れられた液体状の被測定試料を攪拌する。
【００３１】
さらに、被測定試料を容れるサンプルホルダ７００は、サーモバス５１０と配管５２０及び配管５２１を介して接続されている。そしてサンプルホルダ７００に容れられた被測定試料の温度は、サーモバス５１０により所定温度に制御される。また、被測定試料は、マグネティックスターラコントローラ６１０により制御されるマグネティックスターラにより攪拌される。さらに、サンプルホルダ７００は、被測定試料や試薬を導入するためのサンプルディスペンサ７１０と接続されている。
【００３２】
図２は、本実施形態における励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを示す図である。図２に基づいて励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを詳細に説明する。励起光は、チョッパ１３０により通過又は遮断の制御を受けて被測定試料に照射される。図２では、チョッパ１３０による励起光の通過時間と遮断時間との割合は１対９である。この時間割合は必要に応じて変化させることが出来る。この励起光が照射されている時間帯を除いて、第１光強度データが測定される。より詳細には、被測定試料に導入された蛍光指示薬の蛍光寿命時間（約５ｎｓ）、装置の応答時間（約１０ｎｓ）及びチョッパ１３０が励起光を遮断する際に励起光のビームを通過するのに必要な時間（約２０μｓ）の経過後から第１光強度データの測定を開始し、チョッパ１３０が回転することにより次に励起光がチョッパ１３０を通過する時刻の２０μｓ前に第１光強度データの測定を終了する。これにより、第１光強度データは、励起光の影響をまったく受けることなく化学発光の光強度のみを反映した値となる。
【００３３】
また、第２光強度データは、励起光照射を行っているときを含む期間内において測定され、第２光強度データの測定時間と第１光強度データの測定時間とを等しくすることにより、第２光強度データは、第１光強度データと同じ化学発光の光強度および蛍光の光強度を反映した値となる。よって、チョッパ１３０の通過／遮断周期における同一周期内において第２光強度データから第１光強度データを減算し第３光強度データを算出することにより蛍光強度のみを抽出することが出来る。
【００３４】
次に、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の動作について説明すると共に、化学発光および蛍光の経時変化測定方法についても説明する。以下の説明では具体的な実施例として被測定試料がヒト好中球様細胞である場合について説明する。ここで、ヒト好中球様細胞は、前骨髄芽球系株細胞HL-60 を1.2％DMSOを含むGIT mediumで細胞密度を３×１０5細胞／ｍｌに合わせ、これを４〜６日間３７℃で５％ＣＯ2存在下で培養したものである。
【００３５】
被測定試料である好中球様細胞は、予め、カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３（1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加されて、懸濁液とされる。この被測定試料は、ポリメチルメタクリレート製のセルに容れられてサンプルホルダ７００にセットされる。サンプルホルダ７００にセットされた被測定試料は、サーモバス５１０により一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラコントローラ６１０により制御されたマグネティックスターラにより攪拌される。
【００３６】
以上の測定準備が終了すると、チョッパ１３０はチョッパコントローラ１６０により制御されて一定速度で回転し、シャッタ１２０は開く。チョッパ１３０による励起光の通過、遮断の周期は、５０Hz〜２ｋHz程度であり、特に１００〜５００Hzが好ましい。本実施例では２５０Hzとしている。
【００３７】
励起光源１１０から出力された励起光は、チョッパ１３０に入射する。そして、チョッパ１３０に入射した励起光は、チョッパ１３０により通過又は遮断の制御を受け、集光レンズ１４０、光ファイバ１５０を通過して、サンプルホルダ７００に容れられた被測定試料にパルス的に照射される。励起光源１１０は、波長４７３ｎｍのレーザ光を出力するネオジウムドープヤグレーザ光源が用いられる。
【００３８】
被測定試料で発生した化学発光（波長３８５ｎｍ）は、レンズ２２０により集光され、フィルタ２１０、レンズ２２１およびシャッタ３２０を通過し、光電子増倍管３１０の受光面に入射する。この化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡとが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生する化学発光である。すなわち、化学発光強度は、スーパーオキサイド産生量を表している。
【００３９】
一方、被測定試料で発生した蛍光（波長５２３ｎｍ）は、同様にレンズ２２０により集光され、フィルタ２１０、レンズ２２１およびシャッタ３２０を透過し、光電子増倍管３１０の受光面に入射する。この蛍光は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３とが結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生する蛍光である。すなわち、蛍光強度は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンの濃度を表している。なお、励起光の散乱光は、フィルタ２１０により遮断されるので、光電子増倍管３１０の受光面に入射することはない。
【００４０】
光電子増倍管３１０からは、蛍光および化学発光の双方又は化学発光の光子の受光面への入射に応じたパルスが出力される。
【００４１】
光電子増倍管３１０から出力されたパルスは、フォトンカウンタ４１０に入力される。また、チョッパコントローラ１６０による励起光の通過、遮断の制御信号もフォトンカウンタ４１０に入力される。そして、フォトンカウンタ４１０により、励起光が被測定試料に照射されていない期間内において被測定試料で発生した化学発光の光子数が計数されて第１光強度データが求められ、励起光が被測定試料に照射されているときを含む期間内において被測定試料で発生した蛍光および化学発光の光子数が計数されて第２光強度データが求められる。そしてさらに、第２光強度データから第１光強度データが減算されて第３光強度データが算出される。
【００４２】
以上のように励起光照射、化学発光強度測定および蛍光強度測定を行いながら、サンプルディスペンサ７１０より刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）へ滴下される。刺激薬としては、例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用いられる。そして、コンピュータ４２０により、刺激薬の被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の間の因果関係や時間的関係が解析される。
【００４３】
図３は、「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。被測定試料は、上述したようなカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で処理され化学発光試薬ＣＬＡが添加された好中球様細胞を、１ｍＭの細胞外カルシウム溶液内に容れて懸濁液としたものである。測定開始後の２５０秒の時点で１μＭのｆＭＬＰで被測定試料を刺激したものである。「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化が実時間で検出できていることがわかる。
【００４４】
図４は、「化学発光強度」及び「蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。図４における「蛍光強度」は、図３における「化学発光強度及び蛍光強度」から「化学発光強度」を減算することにより算出した。
【００４５】
図４から判るように、ｆＭＬＰで被測定試料が刺激されると、直ちに蛍光強度が上昇し、その後に数秒遅れて、化学発光強度が上昇している。このことから、ｆＭＬＰ刺激により、細胞内カルシウム濃度が直ちに上昇し、その後に数秒遅れてスーパーオキサイドが産生されることが確認された。
【００４６】
以上、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置及び方法によれば、単一の光検出手段により化学発光及び蛍光それぞれの経時変化を同時に測定することができるため、蛍光波長及び化学発光波長が互いに同一又は近接する場合であっても同一現象における蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる。さらに、化学発光及び蛍光それぞれを分光手段により分離する必要が無いことにより光学系を単純化することができるため、装置の小型化及び光の利用効率の向上を図ることができる。
【００４７】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、ヒト好中球様細胞を被測定試料として、被測定試料においてスーパーオキサイド産生に伴い発生した化学発光およびカルシウム濃度変化に伴い発生した蛍光を測定する場合について説明したが、これに限られるものではない。
【００４８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したとおり、本発明によれば、蛍光波長及び化学発光波長が同一又は近接する場合であっても蛍光及び化学発光それぞれの経時変化を実時間で測定することができる化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置の構成図である。
【図２】本実施形態における励起光照射、第１光強度データ測定及び第２光強度データ測定それぞれの動作タイミングを示す図である。
【図３】「化学発光強度」並びに「化学発光強度及び蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。
【図４】「化学発光強度」及び「蛍光強度」それぞれの経時変化の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
１…経時変化測定装置、１０…励起手段、２０…光選択手段、３０…光検出手段、４０…経時変化測定手段、５０…温度制御手段、６０…攪拌手段、１１０…励起光源、１２０…シャッタ、１３０…チョッパ、１４０…集光レンズ、１５０…光ファイバ、１６０…チョッパコントローラ、２１０…フィルタ、２２０，２２１…レンズ、３１０…光電子増倍管、３１１…高電圧電源、３２０…シャッタ、４１０…フォトンカウンタ、４２０…コンピュータ、５１０…サーモバス、５２０，５２１…配管、７００…サンプルホルダ、７１０…サンプルディスペンサ。
Claims (6)
- 被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する励起手段と、
前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されることにより前記被測定試料で発生した蛍光および前記被測定試料で発生した化学発光それぞれを選択して透過させる光選択手段と、
前記光選択手段により選択されて透過された前記蛍光および前記化学発光の双方又は前記化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を出力する一の光検出手段と、
前記光検出手段により出力された前記電気信号に基づいて、前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されていない期間内において前記被測定試料で発生した前記化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されているときを含む期間内において前記被測定試料で発生した前記蛍光および前記化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、前記第２光強度データと前記第１光強度データとに基づいて前記蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、
前記第１光強度データに基づいて前記化学発光の経時変化を測定し、前記第３光強度データに基づいて前記蛍光の経時変化を測定する経時変化測定手段と、
を備えることを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定装置。 - 前記被測定試料の温度を制御する温度制御手段を更に備える、
ことを特徴とする請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。 - 前記被測定試料は液体であり、前記被測定試料を攪拌する攪拌手段を更に備える、
ことを特徴とする請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。 - 被測定試料に励起光を励起手段によりパルス的に繰り返し照射して、
前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されることにより前記被測定試料で発生した蛍光および前記被測定試料で発生した化学発光それぞれを光選択手段により選択して透過させ、
前記光選択手段により選択されて透過された前記蛍光および前記化学発光の双方又は前記化学発光を受光し、その受光量に応じて電気信号を一の光検出手段により出力し、
前記光検出手段により出力された前記電気信号に基づいて、前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されていない期間内において前記被測定試料で発生した前記化学発光の光強度に応じた第１光強度データと、前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射されているときを含む期間内において前記被測定試料で発生した前記蛍光および前記化学発光の光強度に応じた第２光強度データとを求め、前記第２光強度データと前記第１光強度データとに基づいて前記蛍光の光強度に応じた第３光強度データを算出し、
前記第１光強度データに基づいて前記化学発光の経時変化を測定し、前記第３光強度データに基づいて前記蛍光の経時変化を測定する、
ことを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定方法。 - 前記化学発光および前記蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に前記被測定試料の温度を温度制御手段により制御する、
ことを特徴とする請求項４記載の化学発光および蛍光の経時変化測定方法。 - 前記被測定試料は液体であり、前記化学発光および前記蛍光それぞれの経時変化を測定するとき更に前記被測定試料を攪拌手段により攪拌する、
ことを特徴とする請求項４記載の化学発光および蛍光の経時変化測定方法。
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