DE112020006697T5 - Elektrophoresevorrichtung und analyseverfahren - Google Patents

Abstract

Eine Elektrophoresevorrichtung der vorliegenden Offenbarung enthält einen Elektrophoresepfad einer Probe, ein Dispersionselement zum Streuen von Licht von der Probe innerhalb des Elektrophoresepfades, einen Photodetektor zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts und eine Berechnungseinheit zum Bestimmen eines Spektrums des Lichts auf der Basis eines Signals aus dem Photodetektor, und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Berechnungseinheit das Spektrum unter Verwendung von für jede Wanderungsbedingung oder jeden Fluoreszenzfarbstoff bestimmten Korrekturfaktoren korrigiert.

Description

• Technisches Gebiet
• Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf eine Elektrophoresevorrichtung und ein Analyseverfahren.
• Stand der Technik
• Als ein Verfahren zur Analyse der Basensequenz oder der Basenlänge einer DNA ist ein Elektrophoreseverfahren weithin bekannt. Als eines der Analyseverfahren, die Elektrophorese verwenden, gibt es die Kapillarelektrophorese. Die Kapillarelektrophorese ist eine Technologie, in der ein feines Röhrchen, das als Kapillare bezeichnet wird, mit einem Trennmedium wie z. B. Acrylamid gefüllt wird, um die Elektrophorese auszuführen. Genauer gesagt bewegt sich, wenn eine Probe, die eine DNA enthält, an einem Ende der Kapillare angeordnet ist und in diesem Zustand eine hohe Spannung an beiden Enden der Kapillare angelegt wird, die DNA, die ein geladenes Teilchen ist, das negativ geladen ist, zur Seite des Pluspols innerhalb der Kapillare, abhängig von der eigenen Größe, nämlich der Basenlänge. Durch Messen der Zeit, die die Probe benötigt, um eine konstante Strecke zu durchwandern (im Normalfall vom Probeneinfüllende der Kapillare bis zu einer Signaldetektionseinheit), kann auch die Basenlänge der DNA analysiert werden. Jede DNA ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, und die Fluoreszenz wird durch Bestrahlung mit Anregungslicht erzeugt. Die Fluoreszenz wird durch einen Photodetektor detektiert.
• In einer Analyse der DNA durch Kapillarelektrophorese gibt es einen Fall mit Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe, um die Analyse zu beschleunigen. Die mehreren Fluoreszenzfarbstoffe erzeugen bei Bestrahlung mit Anregungslicht jeweils unterschiedliche Fluoreszenz. Ein Spektrum, das durch Dispersion dieser Fluoreszenz und deren Erfassen mit einem Photodetektor erhalten wird, wird als ein Fluoreszenzspektrum bezeichnet. Obwohl jeder Fluoreszenzfarbstoff ein anderes Fluoreszenzspektrum aufweist, sind sie nicht deutlich, und die Fluoreszenzspektren der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe überlappen einander. Deshalb wird in einem Photodetektor, wenn DNA-Fragmente, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, die eine etwa gleiche Fragmentlänge aufweisen, ein durch einen Photodetektor erhaltenes Fluoreszenzspektrum zu einer linearen Summe, und zwar einer gewichteten Summe der Fluoreszenzspektren mehrerer Arten von Fluoreszenzfarbstoffen. Um die Signalstärke (Fluoreszenzstärke) jedes Fluoreszenzfarbstoffs aus diesem Zustand zu erhalten, kann ein linearer Koeffizient, und zwar ein gewichteter Wert eines Spektrums jedes Fluoreszenzfarbstoffs, der ein Spektrum konfiguriert, aus dem durch einen Photodetektor erhaltenen Spektrum erhalten werden.
• Um diesen gewichteten Wert zu erhalten, sollte jedes Fluoreszenzspektrum im Voraus bekannt sein. Jedes Fluoreszenzspektrum ist an sich einheitlich durch einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Trennmedium zu bestimmen, ohne von einer Vorrichtung abhängig zu sein. In einer tatsächlichen Vorrichtung ändert sich das Fluoreszenzspektrum jedoch aus verschiedenen Gründen. Ein gut bekannter davon ist die Positionsbeziehung zwischen einer Kapillare und einem Photodetektor. Deshalb ist, wenn die Kapillare ersetzt werden soll, bevor eine Probe eines Analyseobjekts (im Folgenden als „eigentliche Probe“ bezeichnet) der Elektrophorese unterzogen wird, eine Operation zum Erhalten eines Fluoreszenzspektrums in der Vorrichtung und der Kapillare im Voraus erforderlich. Diese Operation wird als „Spektralkalibrierung“ bezeichnet. Außerdem ist es, wenn die Elektrophorese für mehrere Proben gleichzeitig unter Verwendung einer Kapillaranordnung, in der mehrere Kapillaren angeordnet sind, ausgeführt wird, erforderlich, das Fluoreszenzspektrum für jede Kapillare zu erhalten.
• Hier wird ein Beispiel für die Spektralkalibrierung in Bezug auf den Stand der Technik erläutert.
• 1 ist ein Beugungsgitterbild (unten), das in einem Photodetektor einer Multikapillarelektrophoresevorrichtung aufgenommen ist, und eine Zeichnung (oben), die die Signalstärkeverteilung einer Kapillare, die der A-A'-Richtung des Beugungsgitterbildes entspricht, zeigt. Die Multikapillarelektrophoresevorrichtung trennt die von jedem der Fluoreszenzfarbstoffe emittierte Fluoreszenz, indem sie Laserlicht mit einer spezifischen Wellenlänge auf die Kapillare in der Wellenlängenrichtung mit Hilfe eines Beugungsgitters einstrahlt und das getrennte Licht mit einem Photodetektor wie z. B. einem CCD detektiert, um ein Beugungsgitterbild zu erfassen. Außerdem wird die Signalstärkenverteilung (Spektrum) des Beugungsgitterbildes erfasst.
• Der untere Teil von 1 ist ein Beugungsgitterbild, wenn Laserlicht auf eine Kapillare eingestrahlt wird, in der vier Einheiten von Kapillaren angeordnet sind. Die vertikale Achse zeigt die Sequenzrichtung der Kapillare, und die horizontale Achse zeigt die Wellenlängenrichtung. In dem oberen Teil von 1 zeigt die vertikale Achse die Signalstärke (Helligkeitswert (RFU)), und die horizontale Achse zeigt die Wellenlänge. Ferner können es, obwohl 1 ein Beispiel für das kontinuierliche Messen eines Spektrums (tatsächlich diskret für jedes Pixel) unter Verwendung eines Beugungsgitters zeigt, auch Daten sein, die durch Abtasten des vorstehend beschriebenen Spektrums mit einem großen Wellenlängenintervall erhalten werden. Beispielsweise kann, wie in dem Beugungsgitterbild von 1 dargestellt, für jede Kapillare nur die Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis λ(19) erfasst werden. Es kann auch ein arithmetisches Mittel der Signalstärke in der Nähe jeder der Wellenlängen λ(0) bis λ(19) genommen werden.
• 2 ist ein Ablaufplan, der ein Spektralkalibrierungsverfahren aus dem Stand der Technik zeigt.
• In Schritt S101 führt ein Betreiber eine Elektrophorese eines Matrixstandards aus. Der Matrixstandard ist ein Reagenz zum Erfassen eines Fluoreszenzspektrums und zum Erhalten einer nachstehend beschriebenen Matrix. Der Matrixstandard enthält vier Arten von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Informationen über die Länge oder die Reihenfolge der Länge des jedem Fluoreszenzfarbstoff entsprechenden DNA-Fragments sind bekannt.
• 3A ist eine Zeichnung, die eine Wellenform einer Signalstärke, die durch das Ausführen einer Elektrophorese des Matrixstandards erhalten wurde, zeigt, wobei die vertikale Achse die Signalstärke zeigt und die horizontale Achse die Zeit zeigt. In Schritt S101 ist angenommen, dass die Fluoreszenzspektren von vier Arten von Fluoreszenzfarbstoffen (ROX, TMR, R110 und R6G) erhalten werden, und 3A zeigt einen Zustand, in dem die Signalstärkewellenform jedes Fluoreszenzfarbstoffs in einem Diagramm dargestellt ist. Wie in 3A gezeigt, erscheint ein scharfer Peak zu einem Zeitpunkt, der der Länge des mit jedem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Fragments entspricht. Da das DNA-Fragment mit unterschiedlicher Länge jeweils durch einen anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, erzeugt jeder Fluoreszenzfarbstoff isoliert Licht zu jedem Peak-Zeitpunkt (tO, t1, t2 und t3). Durch das Erfassen eines Spektrums zu dem Zeitpunkt, zu dem nur ein spezifischer Fluoreszenzfarbstoff Licht erzeugt (t0, t1, t2, t3 und t4 in 3A), wird das Fluoreszenzspektrum jedes Fluoreszenzfarbstoffs erhalten.
• Wieder in 2 berechnet in Schritt S102 eine Berechnungssteuerungsschaltung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung die Fluoreszenzstärke aus dem Spektrum jedes Zeitpunkts der in Schritt S101 erhaltenen Signalstärke. Die Verarbeitung des vorliegenden Schritts kann für jede Abtastzeit ausgeführt werden und kann nach der Akkumulation von Spektraldaten eines Abschnitts eines konstanten Zeitintervalls ausgeführt werden.
• In Schritt S103 erfasst die Berechnungssteuerungsschaltung die Peak-Zeit der Signalstärkewellenform von 3A. Da, wie vorstehend beschrieben, die Reihenfolge des Auftretens des Peaks, der der Länge des mit jedem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Fragments entspricht, bekannt ist, kann die Art des Fluoreszenzfarbstoffs anhand der Zeit des Auftretens des Peaks identifiziert werden. 3A zeigt die Situationen, in denen ROX Licht zum Zeitpunkt t0 erzeugt, TMR Licht zum Zeitpunkt t1 erzeugt, R110 Licht zum Zeitpunkt t2 erzeugt und R6G Licht zum Zeitpunkt t3 erzeugt, jeweils isoliert. Das Spektrum jeder Zeit entspricht jedem Fluoreszenzspektrum. Das heißt, jedes Fluoreszenzspektrum ist durch das Erfassen des Spektrums jeder Peak-Zeit bekannt.
• 3B ist das Fluoreszenzspektrum, das aus der Signalstärkewellenform von 3A erfasst wurde, wobei die vertikale Achse die Fluoreszenzstärke zeigt und die horizontale Achse die Wellenlänge zeigt. Wie in 3B gezeigt ist, erfasst die Berechnungssteuerungsschaltung das Fluoreszenzspektrum jedes Fluoreszenzfarbstoffs basierend auf der Signalstärkenwellenform.
• Zurück zu 2 erfasst in Schritt S104 die Berechnungssteuerungsschaltung eine Matrix M unter Verwendung jedes Fluoreszenzspektrums. Der nachstehend beschriebene mathematische Ausdruck 1 zeigt ein Beispiel für die Matrix M für einen Fall, in dem die Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis A(19) erfasst wird. Das Element der Matrix M entspricht dem Stärkenverhältnis der Signalstärke jedes Fluoreszenzfarbstoffs zu jedem Zeitpunkt und in jeder Wellenlänge. Dieses Verhältnis ist beispielsweise ein Anteil in Bezug auf einen Maximalwert der Wellenlänge jedes Fluoreszenzfarbstoffs. Beispielsweise ist ein Element WX1 des mathematischen Ausdrucks 1 ein Verhältnis der Fluoreszenzstärke des Fluoreszenzfarbstoffs ROX zum Zeitpunkt t0 und an der Wellenlänge λ(1). Das bedeutet, dass dann, wenn dieser Wert größer ist, der Beitrag zur Fluoreszenzstärke der Wellenlänge stärker ist. Die Matrix M wird verwendet, um jede Fluoreszenzstärke aus der durch den Photodetektor erhaltenen Spektrumswellenform zu erhalten. $$\text{M}=\left[\begin{array}{llllll}{W}_{X0}\hfill & W_{X1}\hfill & W_{X2}\hfill & \hfill & W_{X18}\hfill & W_{X19}\hfill \\ W_{T0}\hfill & W_{T1}\hfill & W_{T2}\hfill & \begin{array}{l}\\ \cdots \cdots \end{array}\hfill & W_{T18}\hfill & W_{T19}\hfill \\ W_{R0}\hfill & W_{R1}\hfill & W_{R2}\hfill & \hfill & W_{R18}\hfill & W_{R19}\hfill \\ W_{G0}\hfill & W_{G1}\hfill & W_{G2}\hfill & \hfill & W_{G18}\hfill & W_{G19}\hfill \end{array}\right]$$

  

  
  X ⇒ ROX
  T ⇒ TMR
  R ⇒ R110
  G ⇒ R6G
• Die vorstehend beschriebene Operation von Schritt S101 bis S104 ist die Spektralkalibrierung. Wenn mehr als eine der Kapillaren existiert, ist es erforderlich, die Matrix M für jede Kapillare zu erfassen. Es ist außerdem erforderlich, die Spektralkalibrierung jedes Mal auszuführen, wenn die Kapillare entsorgt wird, die Komponente ersetzt wird, und so weiter.
• Die bei der Spektralkalibrierung erhaltene Matrix M wird auch als ein Referenzspektrum bezeichnet und ist im Idealfall gleich dem Fluoreszenzspektrum einer eigentlichen Probe. In der Praxis tritt jedoch möglicherweise eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auf. Wenn die Abweichung auftritt, wird ein gewichteter Wert nicht korrekt berechnet, und es wird eine fehlerhafte Fluoreszenzstärke aufgezeichnet. In einem schwerwiegenden Fall erscheint ein Pseudo-Peak zu einem Zeitpunkt, der mit dem Zeitpunkt des Haupt-Peaks übereinstimmt.
• 4 ist ein Fluoreszenzspektrum, in dem ein Pseudo-Peak erscheint. Der Pseudo-Peak tritt möglicherweise durch Überlappung des Fluoreszenzspektrums jeder Farbe auf, und der Effekt dieser Überlappung wird vor allem dann beobachtet, wenn eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auftritt. Außerdem wird, wenn mehrere Haupt-Peaks vorhanden sind, dieser Pseudo-Peak in allen Haupt-Peaks beobachtet.
• Die Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe tritt im Allgemeinen aufgrund des Unterschieds im Fluoreszenzfarbstoff und der Elektrophoresebedingung zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Elektrophorese der eigentlichen Probe auf. Das heißt, da es erforderlich ist, dass der Betreiber die Spektralkalibrierung jedes Mal wiederholt, wenn der Fluoreszenzfarbstoff und die Elektrophoresebedingung, die für eine tatsächliche Probe verwendet werden, geändert werden, steigen der Arbeitsaufwand und die Kosten.
• Patentliteratur 1 offenbart eine Genanalysevorrichtung, „characterized by acquiring a reference fluorescence spectrum by using an allelic ladder and a size standard that is known information for a DNA fragment used in electrophoresis of an actual sample, and is characterized in that, on capillaries not using an allelic ladder, the spectral calibration is performed by detecting an amount of shift in the fluorescence spectrum of the size standard and calculating the fluorescence spectrum by shifting the reference fluorescence spectrum using the amount of shift“ (dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Referenzfluoreszenzspektrum unter Verwendung einer Allel-Leiter und eines Größenstandards, der eine bekannte Information für ein DNA-Fragment ist, das in der Elektrophorese einer eigentlichen Probe verwendet wird, erfasst wird, und dadurch gekennzeichnet ist, dass bei Kapillaren, die keine Allel-Leiter verwenden, die Spektralkalibrierung ausgeführt wird, indem ein Verschiebungsbetrag im Fluoreszenzspektrum des Größenstandards erfasst wird und das Fluoreszenzspektrum durch Verschieben des Referenzfluoreszenzspektrums unter Verwendung des Verschiebungsbetrags berechnet wird) (siehe Zusammenfassung der Literatur). Somit kann, da es nicht erforderlich ist, eine Elektrophorese unter Verwendung eines speziellen Matrixstandards auszuführen, die Spektralkalibrierung in kurzer Zeit und zu geringen Kosten erreicht werden.
• Der Größenstandard ist eine Mischung aus bekannten DNA-Fragmenten, die mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Die Allel-Leiter ist eine Mischung aus bekannten DNA-Fragmenten, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der dem der eigentlichen Probe entspricht, markiert sind. In einer in Patentliteratur 1 beschriebenen Operation ist der Größenstandard für alle Proben zum Zeitpunkt der Elektrophorese gemischt. Außerdem wird die Allel-Leiter in einer von der eigentlichen Probe getrennten Kapillare analysiert.
• Entgegenhaltungsliste
• Patentliteratur
• Patentliteratur 1: JP-A Nr. 2014-117222
• Zusammenfassung der Erfindung
• Technische Aufgabe
• In der Patentliteratur 1 wird jedoch der Betrag der Verschiebung des Fluoreszenzspektrums zwischen den Kapillaren unter Verwendung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoffs berechnet, und es ist kein Fall angenommen, in dem der vorstehend beschriebene Betrag der Verschiebung je nach Fluoreszenzfarbstoff unterschiedlich ist. Deshalb gibt es je nach Fluoreszenzfarbstoff einen Fall, in dem kein geeignetes Referenzspektrum erhalten wird, eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auftritt und ein Pseudo-Peak auftritt. Außerdem wird in dem Beispiel 3 von Patentliteratur 1 ein Beispiel für das Ausführen der Spektralkalibrierung für jede Kapillare angeführt. Zu diesem Zweck wird jedoch ein Peak, der aus einem Fluoreszenzfarbstoff einer einzigen Farbe gebildet wird, benötigt. Deshalb gibt es einen Fall, in dem in einer solchen Probe, bei der sich mehrere Peaks überlappen, kein Referenzspektrum erhalten werden kann. Als ein Ergebnis tritt möglicherweise eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auf. Aufgrund des Vorstehenden ist es, da das Verfahren von Patentliteratur 1 kaum auf einen beliebigen Fluoreszenzfarbstoff und eine beliebige Probe angewandt wird, erforderlich, die Spektralkalibrierung jedes Mal zu wiederholen, wenn die Elektrophoresebedingung und der Fluoreszenzfarbstoff geändert werden. Deshalb steigen der Arbeitsaufwand des Betreibers und die Kosten.
• Deshalb stellt die vorliegende Offenbarung eine Elektrophoresevorrichtung und ein Analyseverfahren bereit, die den Arbeitsaufwand des Betreibers und die Kosten reduzieren.
• Lösung der Aufgabe
• Um die vorstehend beschriebene Aufgabe zu lösen, enthält eine Elektrophoresevorrichtung der vorliegenden Offenbarung einen Elektrophoresepfad einer Probe, ein Dispersionselement zum Streuen von Licht von der Probe innerhalb des Elektrophoresepfades, einen Photodetektor zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts und eine Berechnungseinheit zum Bestimmen des Spektrums des Lichts auf der Basis eines Signals aus dem Photodetektor, und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Berechnungseinheit das Spektrum unter Verwendung von Korrekturfaktoren, die für jede Elektrophoresebedingung oder jeden Fluoreszenzfarbstoff bestimmt werden, korrigiert.
• Außerdem enthält eine weitere Elektrophoresevorrichtung der vorliegenden Offenbarung einen Elektrophoresepfad einer Probe, ein Dispersionselement zum Streuen von Licht von der Probe innerhalb des Elektrophoresepfades, einen Photodetektor zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts und eine Berechnungseinheit zum Berechnen der Signalstärke des Lichts auf der Basis eines Signals des Photodetektors und ist dadurch gekennzeichnet, dass der Photodetektor das Signal mit einer Signalerfassungsbreite erfasst, die so eingestellt ist, dass ein Korrelationskoeffizient zwischen Spektren mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe gleich einem oder größer als ein vorbestimmter Wert wird.
• Andere zu der vorliegenden Offenbarung gehörende Merkmale werden durch die Beschreibung der vorliegenden Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen verdeutlicht. Außerdem werden Aspekte der vorliegenden Offenbarung durch Elemente und Kombinationen verschiedener Elemente, die nachstehende ausführliche Beschreibung und Aspekte der beigefügten Ansprüche erreicht und verwirklicht.
• Die Beschreibung der vorliegenden Beschreibung ist nur ein typisches Beispiel und schränkt die Ansprüche oder das Anwendungsbeispiel der vorliegenden Offenbarung in keiner Weise ein.
• Vorteilhafte Effekte der Erfindung
• Gemäß der vorliegenden Offenbarung ist es nicht erforderlich, die Spektralkalibrierung jedes Mal zu wiederholen, wenn die Elektrophoresebedingung und der Fluoreszenzfarbstoff geändert werden. Als ein Ergebnis werden der Arbeitsaufwand des Betreibers und die Kosten reduziert. Andere als die oben beschriebenen Aufgaben, Konfigurationen und Effekte werden durch die Erläuterung der nachstehend beschriebenen Ausführungsformen verdeutlicht.
• Figurenliste
• 1 ist eine Zeichnung, die die Signalstärke der Fluoreszenz, die durch eine Multikapillarelektrophoresevorrichtung detektiert wird (oben) und die Wellenlänge (unten) zeigt.
• 2 ist ein Ablaufplan, der ein herkömmliches Spektralkalibrierungsverfahren zeigt.
• 3A ist eine Zeichnung zum Erläutern einer Zusammenfassung der Spektralkalibrierung in Bezug auf den Stand der Technik.
• 3B ist eine Zeichnung zum Erläutern einer Zusammenfassung der Spektralkalibrierung in Bezug auf den Stand der Technik.
• 4 ist eine Zeichnung zum Erläutern eines Pseudo-Peaks.
• 5 ist eine schematische Ansicht, die eine Multikapillarelektrophoresevorrichtung im Zusammenhang mit einer ersten Ausführungsform zeigt.
• 6 ist eine schematische Ansicht, die eine Konfiguration eines optischen Systems in einem Behälter mit konstanter Temperatur zeigt.
• 7 ist ein Ablaufplan, der ein Berechnungsverfahren eines Korrekturfaktors im Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform zeigt.
• 8A ist eine Zeichnung zum Erläutern einer Zusammenfassung der Berechnung einer Matrix M' in der ersten Ausführungsform.
• 8B ist eine Zeichnung zum Erläutern einer Zusammenfassung der Berechnung einer Matrix M' in der ersten Ausführungsform.
• 9 ist ein Ablaufplan, der ein Anwendungsverfahren eines Korrekturfaktors bei der Elektrophorese einer eigentlichen Probe zeigt.
• 10 ist ein Ablaufplan eines Elektrophoreseverfahrens für eine eigentliche Probe.
• 11 ist eine Zeichnung zur Erläuterung von Gauß-Fitting.
• 12 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit einer zweiten Ausführungsform zeigt.
• 13 ist eine Zeichnung, die ein Ergebnis des Versuchsbeispiels 1 zeigt.
• 14 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit einer dritten Ausführungsform zeigt.
• 15A ist eine Zeichnung, die einen in einem Versuchsbeispiel 2 verwendeten Fluoreszenzfarbstoff zeigt.
• 15B ist eine Zeichnung, die ein Ergebnis des Versuchsbeispiels 2 zeigt.
• 16 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit einer fünften Ausführungsform zeigt.
• 17A ist ein in einem Versuchsbeispiel 3 erfasstes Fluoreszenzspektrum.
• 17B ist ein in einem Kontrollversuch des Versuchsbeispiels 3 erfasstes Fluoreszenzspektrum.
• 18 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit einer sechsten Ausführungsform zeigt.
• Beschreibung von Ausführungsformen
• Die Ausführungsformen werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. In den beigefügten Zeichnungen ist auch ein Fall vorhanden, in dem ein Element mit gleicher Funktion durch ein gleiches Bezugszeichen ausgedrückt wird. Ferner, obwohl die beigefügten Zeichnungen Ausführungsformen und Implementierungsbeispiele im Einklang mit dem technischen Prinzip der vorliegenden Offenbarung zeigen, dienen sie dem Verständnis der vorliegenden Offenbarung und sind keineswegs zu verwenden, die Technologie der vorliegenden Offenbarung in einer einschränkenden Weise zu interpretieren. Die Beschreibung der vorliegenden Beschreibung ist nur ein typisches Beispiel und schränkt die Ansprüche oder das Anwendungsbeispiel der vorliegenden Offenbarung in keiner Weise ein.
• In den vorliegenden Ausführungsformen ist es zu verstehen, dass, obwohl ihre Erklärung im Einzelnen so vorgenommen ist, dass sie für einen normalen Fachmann ausreichend ist, um die vorliegende Offenbarung zu implementieren, andere Implementierungen und Aspekte ebenfalls möglich sind und das Ändern der Konfiguration und Konstruktion und das Ersetzen verschiedener Elementen möglich sind, ohne von dem Schutzbereich und dem Geist des technischen Gedankens der vorliegenden Offenbarung abzuweichen. Daher ist die nachstehende Beschreibung nicht so interpretieren, dass sie sich darauf beschränkt.
• [Erste Ausführungsform]
• Wie für den Stand der Technik beschrieben ist, wird dann, wenn eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auftritt, kein wahrer gewichteter Wert berechnet, und es wird eine fehlerhafte Fluoreszenzstärke aufgezeichnet. Diese Abweichung tritt hauptsächlich auf, weil sich das Spektrum hauptsächlich durch die Denaturierung des Fluoreszenzfarbstoffs ändert. Die Denaturierung des Fluoreszenzfarbstoffs tritt durch einen ungeeigneten pH-Wert, Lagerung bei ungeeigneter Temperatur und übermäßige Anregung des Farbstoffs auf. Ferner tritt eine Denaturierung des Fluoreszenzfarbstoffs möglicherweise auch dann auf, wenn die Wanderungsspannung zum Zeitpunkt der Spektralkalibrierung und zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich ist. In einer Elektrophoresevorrichtung, die mehrere Kapillaren enthält, tritt möglicherweise eine Abweichung auf, da die Stärke des Anregungslichts in jeder Kapillare unterschiedlich ist. Es wird auch darauf hingewiesen, dass der Grad der Denaturierung je nach Fluoreszenzfarbstoff in jedem der vorstehend genannten Beispiele unterschiedlich ist. Ferner tritt selbstverständlich auch dann, wenn die eigentliche Probe mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff als der Matrixstandard markiert ist, eine Abweichung auf.
• Deshalb wird in der ersten Ausführungsform eine Erläuterung für den Betrieb für einen Fall gegeben, in dem die Wanderungsspannung zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung durch einen Betreiber, der die Multikapillarelektrophoresevorrichtung gekauft hat, und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe abweicht (Korrektur des Fluoreszenzspektrums). In der vorliegenden Beschreibung gibt es außerdem einen Fall, in dem die Spektralkalibrierung, die durch einen Hersteller einer Multikapillarelektrophoresevorrichtung vor der Auslieferung der Vorrichtung implementiert wird, als „die erste Spektralkalibrierung“ bezeichnet ist und die Spektralkalibrierung durch einen Betreiber, der die Multikapillarelektrophoresevorrichtung gekauft hat, als „die zweite Spektralkalibrierung“ bezeichnet ist.
• <Konfigurationsbeispiel für die Multikapillarelektrophoresevorrichtung>
• 5 ist eine schematische Ansicht, die eine Konfiguration einer Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 im Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform zeigt. Wie in 5 gezeigt, enthält die Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 einen Vorrichtungskörper 501 und einen Steuercomputer 502.
• Der Vorrichtungskörper 501 enthält eine Berechnungssteuerungsschaltung 503, einen Photodetektor 504, einen Behälter 505 mit konstanter Temperatur, eine Kapillaranordnung 506, eine Lichtquelle 507, eine Lichtbestrahlungseinheit 508, einen Ladekopf 509, einen Minuspol-Pufferbehälter 511, einen Probenbehälter 512, eine Polymerpatrone 513, einen Pluspol-Pufferbehälter 514, einen Pluspol 515, eine Hochspannungsstromquelle 516, einen Anordnungskopf 517, eine Beförderungseinrichtung 518, einen Spritzenmechanismus 520, einen Heiz/Kühlmechanismus 523 und ein Beugungsgitter 524.
• Der Vorrichtungskörper 501 ist kommunikationstechnisch mit dem Steuercomputer 502 verbunden. Ein Betreiber kann jede in dem Vorrichtungskörper 501 enthaltene Einheit durch Bedienen des Steuercomputers 502 bedienen. Der Steuercomputer 502 empfängt die durch den Vorrichtungskörper 501 erfassten Daten (z. B. ein Detektionssignal des Photodetektors 504). Der Steuercomputer 502 enthält eine Anzeigevorrichtung, die die empfangenen Daten anzeigt. Außerdem kann der Steuercomputer 502 in den Vorrichtungskörper 501 integriert sein.
• Die Berechnungssteuerungsschaltung 503 führt eine Berechnungsverarbeitung eines Messwertes (Fluoreszenzstärke) basierend auf einem Detektionssignal des Photodetektors 504 aus und führt eine Korrektur des Messwertes (Fluoreszenzstärke) aus. Außerdem steuert die Berechnungssteuerungsschaltung 503 den Vorrichtungskörper 501 gemäß einer Eingabe und einem Befehl von dem Steuercomputers 502.
• Der Photodetektor 504 ist ein Lichtsensor, der Fluoreszenz detektiert, die durch Laserlicht als Anregungslicht, das von der Lichtquelle 507 auf die Kapillaranordnung 506 eingestrahlt wird, erzeugt wird. Als Lichtquelle 507 können Flüssigkeitslaser, Gaslaser, Halbleiterlaser und dergleichen auf geeignete Weise verwendet werden, alternativ kann auch eine LED verwendet werden. Die Lichtquelle 507 kann konfiguriert sein, Anregungslicht von beiden Seiten einer Anordnung der Kapillaranordnung 506 einzustrahlen, und sie kann konfiguriert sein, Anregungslicht im Zeitraster einzustrahlen.
• Der Behälter 505 mit konstanter Temperatur ist ein Temperatursteuermechanismus zum Steuern der Temperatur der Kapillaranordnung 506. Der Behälter 505 mit konstanter Temperatur ist mit einem wärmeisolierenden Material bedeckt, um die Temperatur innerhalb des Behälters konstant zu halten, und die Temperatur wird durch den Heiz/Kühlmechanismus 523 gesteuert. Somit kann die Temperatur eines Hauptabschnitts der Kapillaranordnung 506 auf einer konstanten Temperatur von beispielsweise etwa 60 °C gehalten werden.
• Die Kapillaranordnung 506 ist durch Anordnen mehrerer Kapillaren 519 (Elektrophoresepfade) (vier in einem Beispiel von 5) konfiguriert. Die Kapillaranordnung 506 kann als Ersatzelement konfiguriert sein, das bei Bedarf durch ein neues ersetzt werden kann, wenn eine Beschädigung oder eine qualitative Verschlechterung bestätigt worden sind. Außerdem kann die Kapillaranordnung 506 durch eine separate Kapillaranordnung, die gemäß einer Messung eine Kapillare mit unterschiedlicher Stückzahl und Länge enthält, ersetzt werden.
• Jede der mehreren Kapillaren 519, die die Kapillaranordnung 506 konfigurieren, kann aus einem Glasrohr mit einem Innendurchmesser von mehreren zehn bis mehreren hundert µm und einem Außendurchmesser von mehreren hundert µm konfiguriert sein. Um die Festigkeit zu erhöhen, kann die Oberfläche des Glasrohrs auch von einer Polyimidbeschichtung bedeckt sein. An der Position, an der Laserlicht eingestrahlt wird, und deren Nähe wird jedoch die Polyimidbeschichtung auf der Oberfläche der Kapillaren 519 entfernt. Das Innere der Kapillaren 519 ist mit einem Trennmedium zum Trennen von DNA-Molekülen in einer biologischen Probe (Probe) gefüllt. Hier soll ein für den Gebrauch in der Elektrophorese handelsübliches Trenngel auf Polyacrylamidbasis (wird im Folgenden als „Polymer“ bezeichnet) verwendet werden.
• Die Lichtbestrahlungseinheit 508 ist in einem Abschnitt der Kapillaranordnung 506 angeordnet. Wie nachstehend beschrieben, ist die Lichtbestrahlungseinheit 508 so konfiguriert, dass sie in der Lage ist zu bewirken, dass das Laserlicht (Anregungslicht) aus der Lichtquelle 507 in die Kapillaren 519 mehrerer Elemente gemeinsam einzutreten und die von den Kapillaren 519 mehrerer Elemente erzeugte Fluoreszenz in den Photodetektor 504 einzuleiten. Genauer gesagt, um Laserlicht, das Messlicht ist, auf einen in der Kapillaranordnung 506 angeordneten Lichtbestrahlungsabschnitt zu strahlen, enthält die Lichtbestrahlungseinheit 508 ein optisches Projektionssystem wie z. B. einen Lichtleiter und eine Linse. Das Beugungsgitter 524 (Dispersionselement) streut das Licht aus den Kapillaren 519 und bewirkt, dass es in den Photodetektor 504 eintritt.
• Obwohl in der vorliegenden Offenbarung ein Beispiel zum Detektieren von Fluoreszenz eines Fluoreszenzfarbstoffs durch Bestrahlung mit Anregungslicht durch den Photodetektor 504 erläutert ist, ist das detektierte Licht nicht auf Fluoreszenz beschränkt und kann absorbiertes Licht, erzeugtes Licht und dergleichen sein.
• Der Ladekopf 509 ist an einem Ende der Kapillaranordnung 506 angeordnet. Der Ladekopf 509 funktioniert als ein Minuspol, an den eine negative Spannung zum Einleiten der biologischen Probe (Probe) in die Kapillaren 519 angelegt wird. An dem anderen Ende der Kapillaranordnung 506 ist der Anordnungskopf 517 angeordnet, und der Anordnungskopf 517 bündelt die mehreren Kapillaren 519 zu einer. Außerdem enthält der Anordnungskopf 517 einen spitzen Abschnitt 521 zum Einführen in die Polymerpatrone 512 in der Unterseite des Anordnungskopfes 517.
• Die Beförderungseinrichtung 518 ist konfiguriert, den Minuspol-Pufferbehälter 511, den Probenbehälter 512, die Polymerpatrone 513 und den Pluspol-Pufferbehälter 514 auf der Oberseite der Beförderungseinrichtung 518 zu montieren und zu befördern. Als ein Beispiel enthält die Beförderungseinrichtung 518 drei Motoren und Linearaktoren und kann sich in drei axialen Richtungen nach oben und nach unten, nach links und nach rechts sowie nach vorne und nach hinten bewegen.
• Der Minuspol-Pufferbehälter 511 und der Pluspol-Pufferbehälter 514 sind Behälter, die einen Puffer für die Wanderung enthalten, und der Probenbehälter 512 ist ein Behälter, der eine Probe des Messobjekts (Probe) enthält.
• Die Polymerpatrone 513 ist ein Behälter, der ein Polymer für die Wanderung enthält. Die Polymerpatrone 513 ist an einem oberen Abschnitt 522 mit einem Rohmaterial mit hoher Plastizität wie z. B. Gummi oder Silikon abgedichtet und ist mit dem Spritzenmechanismus 520 zum Einfüllen des Polymers und mit der Beförderungseinrichtung 518 verbunden.
• Prozeduren zum Einfüllen des Polymers in die Kapillaren 519 aus der Polymerpatrone 513 sind wie in den nachstehenden Punkten (1) bis (3).
1. (1) Die Beförderungseinrichtung 518 wird betätigt, und der Anordnungskopf 517 bewegt sich zu der Oberseite der Polymerpatrone 513.
2. (2) Der spitze Abschnitt 521 des Anordnungskopfes 517 durchdringt den oberen Abschnitt 522 der Polymerpatrone 513. Da zu diesem Zeitpunkt der obere Abschnitt 522 der Polymerpatrone 513der eine hohe Plastizität aufweist, den spitzen Abschnitt 521 des Anordnungskopfes 517 umschließt, sind beide eng miteinander verbunden, und die Polymerpatrone 513 und die Kapillaren 519 sind in einem abgedichteten Zustand miteinander verbunden.
3. (3) Der Spritzenmechanismus 520 drückt das Polymer aus dem Inneren der Polymerpatrone 513 nach oben und gießt das Polymer in die Kapillaren 519.
• In dem Pluspol-Pufferbehälter 514 ist der Pluspol 515, der eine positive Spannung für die Wanderung anlegt, so angeordnet, dass er mit dem Puffer in Kontakt ist. Die Hochspannungsstromquelle 516 ist zwischen dem Pluspol 515 und dem Ladekopf 509 als Minuspol verbunden.
• Die Beförderungseinrichtung 518 befördert den Minuspol-Pufferbehälter 511 und den Probenbehälter 512 zu einem Minuspol-Ende 510 der Kapillaren 519. Zu diesem Zeitpunkt bewegt sich der Pluspol-Pufferbehälter 514 ineinandergreifend zum spitzen Abschnitt 521, der einem Pluspol-Ende der Kapillaren 519 entspricht.
• Der Probenbehälter 512 enthält Probenröhrchen mit einer Stückzahl gleich derjenigen der Kapillaren 519. Der Bediener verteilt die DNA auf die Probenröhrchen.
• Die Berechnungssteuerungsschaltung 503 (Berechnungseinheit) enthält eine Messwertberechnungseinheit 5032, eine Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033, eine Korrekturfaktordatenbank 5034 und eine Korrektureinheit 5035.
• Die Messwertberechnungseinheit 5032 berechnet einen Messwert (Fluoreszenzstärke) basierend auf einem Detektionssignal des Photodetektors 504. Die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 berechnet einen Korrekturfaktor zum Korrigieren des durch die Messwertberechnungseinheit 5032 berechneten Messwerts. Die Korrekturfaktordatenbank 5034 speichert den durch die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 berechneten Korrekturfaktor. Außerdem berechnet die Korrektureinheit 5035 einen korrigierten Messwert durch Anwenden des in der Korrekturfaktordatenbank 5034 gespeicherten Korrekturfaktors auf den Messwert der Messwertberechnungseinheit 5032. Die Berechnungsverarbeitung jeder Einheit der vorstehend beschriebenen Berechnungssteuerungsschaltung 503 kann dadurch erreicht werden, dass ein Prozessor wie z. B. eine CPU und eine MPU beispielsweise ein Programm ausführt.
• 6 ist eine schematische Ansicht, die eine Konfiguration eines optischen Systems innerhalb eines Behälters 505 mit konstanter Temperatur zeigt. Wie in 6 gezeigt ist, enthält die Lichtbestrahlungseinheit 508 mehrere Reflexionsspiegel 602 (in 6 zwei) und eine Kondensorlinse 603 als ein Beispiel. Der Reflexionsspiegel 602 ändert die Ausbreitungsrichtung des Laserlichts 601 aus der Lichtquelle 507. Außerdem kondensiert die Kondensorlinse 603 das Laserlicht auf einen Lichtbestrahlungsabschnitt der Kapillaranordnung 506. So tritt das Laserlicht 601 nacheinander in die mehreren Kapillaren 519 ein. Der Fluoreszenzfarbstoff in jeder Kapillare 519 wird durch das Laserlicht 601 angeregt und erzeugt Informationslicht (Fluoreszenz mit einer von der Probe abhängigen Wellenlänge). Dieses Informationslicht wird durch das Beugungsgitter 524 in eine Wellenlängenrichtung gestreut. Das gestreute Informationslicht wird durch den Photodetektor 504 detektiert. Zu diesem Zeitpunkt soll, obwohl der Photodetektor 504 kontinuierlich ein Spektrum messen kann (tatsächlich diskret für jedes Pixel), in der vorliegenden Ausführungsform als ein Beispiel nur die Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis λ(19) erfasst werden.
• Somit wird durch Beobachten der Fluoreszenzstärke der Fluoreszenz, die durch das Eintreten des Laserlichts 601 durch den Photodetektor 504 erzeugt wird, eine Analyse der DNA während der Elektrophorese ermöglicht. Elektrophorese bedeutet das Trennen einer Probe durch einen Unterschied der Beweglichkeit, der von der Eigenschaft einer Probe abhängt, wobei sich die Beweglichkeit einer Probe in einer Kapillare 119 durch die Wirkung eines elektrischen Feldes, das zwischen Minuspol- und Pluspol-Puffern erzeugt wird, ergibt. Hier wird eine Erläuterung anhand des Beispiels für einen Fall gegeben, bei dem die Probe eine DNA ist.
• Die DNA besitzt eine negative elektrische Ladung in dem Polymer durch eine Phosphodiesterbindung, die dem Gerüst einer Doppelhelix entspricht. Deshalb bewegt sich die DNA in einem elektrischen DNA-Feld zur Seite des Pluspols. Zu diesem Zeitpunkt hängt die Beweglichkeit der DNA, da das Polymer eine netzartige Struktur aufweist, von der Leichtigkeit beim Durchgang durch das Netz ab, nämlich von der Größe der DNA. Eine DNA mit einer kurzen Basenlänge geht leicht durch die netzartige Struktur, und die Beweglichkeit wird hoch. Die Ergebnisse einer DNA mit einer langen Basenlänge sind entgegengesetzt. Da die DNA im Voraus mit einer fluoreszierenden Substanz (Fluoreszenzkörper) markiert wird, detektiert der Photodetektor 504 die DNA optisch der Reihe nach, beginnend mit einer DNA mit einer kurzen Basenlänge. Normalerweise werden die Messzeit und die Zeit, in der die Spannung angelegt ist, in Übereinstimmung mit einer Probe mit der längsten Wanderungszeit eingestellt.
• <Berechnungsverfahren für den Korrekturfaktor>
• Wie vorstehend beschrieben, schlägt die vorliegende Ausführungsform ein Korrekturverfahren für das Fluoreszenzspektrum in einem Fall vor, in dem die Wanderungsspannung zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich ist. Der Hersteller des Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 erhält einen Korrekturfaktor zum Korrigieren des Fluoreszenzspektrums, das zum Zeitpunkt der Wanderung einer eigentlichen Probe erfasst wird, und trägt den Korrekturfaktor vor der Auslieferung der Vorrichtung in die Korrekturfaktordatenbank 5034 der Berechnungssteuerungsschaltung 503 ein.
• 7 ist ein Ablaufplan, der ein Berechnungsverfahren für einen Korrekturfaktor zeigt. Das Berechnungsverfahren für den Korrekturfaktor wird zusammengefasst. Zuerst führt der Hersteller in Schritt S1 die Spektralkalibrierung unter Verwendung eines Matrixstandards aus und erfasst eine Matrix M, die zu einer Referenz wird, durch die Berechnungssteuerungsschaltung 503. Als Nächstes wird in Schritt S2 eine Matrix M', die zur Korrektur verwendet wird, durch die Berechnungssteuerungsschaltung 503 erfasst. Schließlich wird in Schritt S3 eine Korrekturfaktormatrix K durch die Berechnungssteuerungsschaltung 503 erfasst.
• (Schritt S1)
• In Schritt S1 führt der Hersteller die Spektralkalibrierung unter Verwendung eines Matrixstandards, der ein mit einem beliebigen Fluoreszenzfarbstoff markiertes DNA-Fragment enthält, aus (die erste Spektralkalibrierung). In der vorliegenden Ausführungsform werden als ein Beispiel ROX, TMR, R110 und R6G als der Fluoreszenzfarbstoff verwendet. Die Wanderungsspannung sollte mit einer Wanderungsspannung in der nachstehend beschriebenen Spektralkalibrierung vor der Wanderung der eigentlichen Probe (der zweiten Spektralkalibrierung) übereinstimmen. In der vorliegenden Ausführungsform wird die Wanderungsspannung zwar als Beispiel auf 15 kV festgelegt, die Wanderungsspannung jedoch nicht darauf beschränkt.
• Der Hersteller trägt die Art des Fluoreszenzfarbstoffs und die Wanderungsspannung in die Berechnungssteuerungsschaltung 503 ein, indem er eine Eingabevorrichtung des Steuercomputers 502 bedient. Die Messwertberechnungseinheit 5032 dient dazu, die Matrix M mit dieser Bedingung zu erhalten.
• Hier besteht eine der in der vorliegenden Offenbarung zu lösenden Aufgaben darin, dass eine Abweichung zwischen dem Referenzspektrum und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe auftritt, wenn die Wanderungsspannung zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung durch einen Betreiber und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich ist. Die Wanderungsspannung beeinflusst die für die Elektrophorese benötigte Zeit und die Trennkapazität, die einer der wichtigen Qualitätsindikatoren in einer Analyse ist. Deshalb ändert ein Betreiber bei der Verwendung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung häufig die Wanderungsspannung der eigentlichen Probe, je nach Bedarf. Außerdem muss der Betreiber die Spektralkalibrierung bei jeder Änderung der Wanderungsspannung der eigentlichen Probe mit der gleichen Wanderungsspannung wie bei der eigentlichen Probe wiederholen.
• Um diese Aufgabe zu lösen, schlägt die vorliegende Ausführungsform vor, die erste Spektralkalibrierung mit verschiedenen Wanderungsspannungen vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung auszuführen, die dort gefundene Abweichung zwischen den Spektren zu quantifizieren und dadurch einen solchen Korrekturfaktor einzutragen, um die Abweichung in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 im Voraus zu minimieren. Der Korrekturfaktor wird zusammen mit den Informationen wie z. B. dem Fluoreszenzfarbstoff und der Wanderungsspannung, die verwendet wurden, eingetragen.
• Der Betreiber, der die Vorrichtung erworben hat, wählt eine beliebige Wanderungsspannung aus den in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 eingetragenen aus, führt die zweite Spektralkalibrierung aus und kann danach eine eigentliche Probe mit einer beliebigen Wanderungsspannung, die in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 eingetragen worden ist, auf ähnliche Weise wandern lassen. Das bedeutet, dass der Betreiber die Spektralkalibrierung nicht jedes Mal wiederholen muss, selbst wenn die Wanderungsspannung einer eigentlichen Probe beliebig oft innerhalb eines in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 eingetragenen Bereichs geändert werden kann.
• Wenn die vorstehend beschriebene Operation angenommen wird, sollte der Hersteller in Schritt S1 die Wanderung des Matrixstandards nicht nur mit 15 kV, sondern auch mit mehreren Spannungen ausführen. Außerdem sollte die gesamte erfasste Matrix M zusammen mit den Informationen über die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 eingetragen werden.
• Das Berechnungsverfahren für die Matrix M ist das gleiche wie vorstehend beschrieben.
• (Schritt S2)
• In Schritt S2 lässt der Hersteller den Matrixstandard mit einem Fluoreszenzfarbstoff und unter Wanderungsbedingungen, die denen einer eigentlichen Probe entsprechen, wandern. Hier soll die eigentliche Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, der gleich dem in Schritt S1 verwendeten Matrixstandard ist, und soll veranlasst werden, mit 7,5 kV zu wandern. Zu diesem Zeitpunkt trägt der Hersteller durch Bedienen einer Eingabevorrichtung des Steuercomputers 502 die Art des Fluoreszenzfarbstoffs und die Wanderungsspannung in die Berechnungssteuerungsschaltung 503 ein.
• Wie vorstehend beschrieben produziert, da der Matrixstandard DNA-Fragmente mit unterschiedlicher Länge, die jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert worden sind, jeder Fluoreszenzfarbstoff isoliert Licht zu jedem Peak-Zeitpunkt (t0', t1', t2' und t3'). Außerdem kann, da die Reihenfolge des Auftretens der jedem Fluoreszenzfarbstoff entsprechenden Peak-Zeit bekannt ist, die Art des Fluoreszenzfarbstoffs, der jeder Peak-Zeit entspricht, identifiziert werden.
• 8A ist eine Zeichnung, die eine Wellenform einer Signalstärke, die durch das Ausführen einer Elektrophorese des Matrixstandards erhalten wurde, zeigt, wobei die vertikale Achse die Signalstärke zeigt und die horizontale Achse die Zeit zeigt. Wie in 8A gezeigt ist, erzeugt ROX Licht zum Zeitpunkt t'0, TMR erzeugt Licht zum Zeitpunkt t'1, R110 erzeugt Licht zum Zeitpunkt t'2 und R6G erzeugt Licht zum Zeitpunkt t'3, jeweils isoliert. Das Spektrum jedes Zeitpunkts entspricht dem Fluoreszenzspektrum jedes Fluoreszenzfarbstoffs. Deshalb erfasst die Berechnungssteuerungsschaltung 503 das Fluoreszenzspektrum jedes Fluoreszenzfarbstoffs durch Erfassen des Spektrums zu jeder Peak-Zeit.
• 8B ist das Fluoreszenzspektrum, das aus der Signalstärkewellenform von 8A erfasst wurde, wobei die vertikale Achse die Fluoreszenzstärke zeigt und die horizontale Achse die Wellenlänge zeigt.
• Die Messwertberechnungseinheit 5032 berechnet die Matrix M' unter Verwendung jedes Fluoreszenzspektrums. Der nachstehend beschriebene mathematische Ausdruck 2 zeigt ein Beispiel für die Matrix M' in einem Fall, in dem die Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis λ(19) erfasst wird. Das Element der Matrix M' entspricht dem Stärkenverhältnis jedes Fluoreszenzfarbstoffs zu jeder Peak-Zeit (t'0, t'1, t'2 und t'3) und jeder Wellenlänge. Beispielsweise ist ein Element W'X1 des mathematischen Ausdrucks 2 ein Verhältnis der Fluoreszenzstärke des Fluoreszenzfarbstoffs ROX zum Zeitpunkt t'0 und der Wellenlänge λ(1).
  [Math. 2] $$\text{M}\text{'}=\left[\begin{array}{llllll}W{\text{'}}_{X0}\hfill & W{\text{'}}_{X1}\hfill & W{\text{'}}_{X2}\hfill & \hfill & W{\text{'}}_{X18}\hfill & W{\text{'}}_{X19}\hfill \\ W{\text{'}}_{T0}\hfill & W{\text{'}}_{T1}\hfill & W{\text{'}}_{T2}\hfill & \begin{array}{l}\\ \cdots \cdots \end{array}\hfill & W{\text{'}}_{T18}\hfill & W{\text{'}}_{T19}\hfill \\ W{\text{'}}_{R0}\hfill & W{\text{'}}_{R1}\hfill & W{\text{'}}_{R2}\hfill & \hfill & W{\text{'}}_{R18}\hfill & W{\text{'}}_{R19}\hfill \\ W{\text{'}}_{G0}\hfill & W{\text{'}}_{G1}\hfill & W{\text{'}}_{G2}\hfill & \hfill & W{\text{'}}_{G18}\hfill & W{\text{'}}_{G19}\hfill \end{array}\right]$$

  

  
  X ⇒ ROX
  T ⇒ TMR
  R ⇒ R110
  G ⇒ R6G
• Ferner wird in Schritt S2 auch aufgrund des in Schritt S1 beschriebenen Grundes in einer tatsächlichen Operation der Matrixstandard dazu gebracht, mit mehreren Spannungen, die 7,5 kV enthalten, zu wandern, und alle erfassten Matrizen M' werden in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 zusammen mit den Informationen wie z. B. der Wanderungsspannung und dem Fluoreszenzfarbstoff eingetragen.
• (Schritt S3)
• Zurück zu 7 überträgt in Schritt S3 die Messwertberechnungseinheit 5032 die berechneten Matrizen M und M'an die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033. Die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 erfasst die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Für den Fluoreszenzfarbstoff i und die Wellenlänge j ist das Element der Korrekturfaktormatrix K definiert als das Element k(ij) der Korrekturfaktormatrix k(ij)=w'(ij)/w(ij). Wie bereits beschrieben, sind der Fluoreszenzfarbstoff und die Wanderungsspannung, die in Schritt S2 verwendet werden, in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 eingetragen worden. Deshalb kann k(ij) in der Korrekturfaktordatenbank 5034 zusammen mit den Informationen über die Wanderungsbedingung und den Fluoreszenzfarbstoff; die für die Berechnung verwendet worden sind, gesammelt werden. Zu diesem Zeitpunkt berechnet, wie in den Schritten S1 und S2 beschrieben, wenn die Matrizen M und M' mit mehreren Wanderungsspannungen erfasst worden sind, die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K in allen Kombinationen davon und trägt diese in die Korrekturfaktordatenbank 5034 zusammen mit den Informationen über die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff ein.
• <Analyseverfahren durch Elektrophorese der eigentlichen Probe>
• 9 ist ein Ablaufplan, der ein Anwendungsverfahren eines Korrekturfaktors bei der Elektrophorese einer eigentlichen Probe durch einen Betreiber zeigt.
• (Schritt S11)
• Die vorstehend beschriebenen Schritte S1 bis S3 sind zu dem Zeitpunkt, zu dem der Betreiber die Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 erworben hat, bereits fertiggestellt. Der Betreiber muss nur die Operationen von Schritt S11 und danach ausführen. Es ist außerdem angenommen, dass die Kapillaren zum Zeitpunkt des Kaufs (nach Schritt S3) zum Zweck des Transports der Vorrichtung entfernt und angebracht wurden und sich die Positionsbeziehung zwischen dem Photodetektor 504 und den Kapillaren 519 geändert hat. Das heißt, die Vorrichtung befindet sich in einem Zustand, der eine erneute Spektralkalibrierung erfordert.
• In Schritt S11 führt der Betreiber die Spektralkalibrierung unter Verwendung des Matrixstandards in ähnlicher Weise wie in Schritt S1 aus. Der Einfachheit halber ist die durch den Betreiber ausgeführte Spektralkalibrierung als „die zweite Spektralkalibrierung“ bezeichnet. Die Wanderungsspannung in der zweiten Spektralkalibrierung kann beliebig ausgewählt werden, sofern es sich um eine in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragene Wanderungsspannung handelt. In der vorliegenden Ausführungsform soll die Wanderung als Beispiel mit 15 kV durchgeführt werden. Außerdem ist in Bezug auf den Fluoreszenzfarbstoff angenommen, dass der Matrixstandard mit ROX, TMR, R110 und R6G markiert worden ist. Die durch die Messwertberechnungseinheit 5032 in der zweiten Spektralkalibrierung von Schritt S11 erfasste Matrix M wird zu einer Matrix M(r).
• (Schritt S12)
• In Schritt S12 führt der Betreiber die Wanderung der eigentlichen Probe aus. Obwohl die eigentliche Probe eine unbekannte Probe ist, sind die Art des Fluoreszenzfarbstoffs und die Wanderungsspannung als bekannt angenommen. Die Wanderungsbedingung der eigentlichen Probe ist 7,5 kV, die in Schritt S2 verwendet wurde. Hinsichtlich des Fluoreszenzfarbstoffs ist angenommen, dass die eigentliche Probe ebenfalls mit ROX, TMR, R110 und R6G in ähnlicher Weise wie der Matrixstandard markiert worden ist.
• 10 ist ein Ablaufplan eines Elektrophoreseverfahrens der eigentlichen Probe in Schritt S12. Wie in 10 gezeigt, enthält die grundlegende Prozedur der Elektrophorese die Probenvorbereitung (Schritt S121), den Start der Analyse (Schritt S122), das Einfüllen des Trennmediums (Schritt S123), die vorbereitende Wanderung (Schritt S124), das Einbringen der Probe (Schritt S125) und die Wanderungsanalyse (Schritt S126).
• (Schritt S121)
• In Schritt S121 legt der Betreiber als Probe zur Vorbereitung vor dem Beginn der Analyse die Probe und das Reagenz für die Multikapillarelektrophoresevorrichtung fest. Genauer gesagt füllt der Betreiber zuerst die in 5 gezeigten Minuspol-Pufferbehälter 511 und Pluspol-Pufferbehälter 514 mit einer Pufferlösung, die einen Teil eines Spannungsanlegungspfades bildet. Als Pufferlösung kann beispielsweise ein handelsübliches Elektrolytfluid für die Elektrophorese verwendet werden. Außerdem verteilt der Betreiber die eigentliche Probe, die das Analyseobjekt ist, in die Vertiefung des Probenbehälters 512. Die eigentliche Probe ist beispielsweise ein PCR-Produkt einer DNA. Außerdem gießt der Bediener ein Trennmedium zum Bewirken der Elektrophorese der Probe in den Spritzenmechanismus 520. Als das Trennmedium ist das vorstehend beschriebene Polymer zu verwenden. Außerdem tauscht der Bediener die Kapillaranordnung 506 aus, wenn eine Verschlechterung der Kapillaren 519 vermutet wird oder wenn die Länge der Kapillaren 519 geändert werden soll.
• (Schritt S122)
• In Schritt S122 trägt der Betreiber durch Betätigung einer Eingabevorrichtung des Steuercomputers 502 die Art des Fluoreszenzfarbstoffs und die Wanderungsspannung, die für die eigentliche Probe verwendet werden, in die Berechnungssteuerungsschaltung 503 ein. Außerdem gibt der Betreiber eine Anweisung zum Beginnen der Analyse in den Steuercomputer 502 ein. Wenn die Anweisung zum Beginnen der Analyse eingegeben wird, überträgt der Steuercomputer 502 die Anweisung an den Vorrichtungskörper 501. Somit beginnt der Vorrichtungskörper 501 mit einer Analyse.
• (Schritt S123)
• In Schritt S123 beginnt der Vorrichtungskörper 501 mit dem Einfüllen des Polymers in die Kapillaren 519. Das Einfüllen des Polymers ist eine Prozedur zum Einfüllen von neuem Polymer in die Kapillaren 519, um einen Wanderungspfad zu bilden.
• Beim Einfüllen des Polymers in der vorliegenden Ausführungsform wird zuerst der Minuspol-Pufferbehälter 511 durch die in 5 gezeigten Beförderungseinrichtung 518 bis direkt unter den Ladekopf 509 befördert, um das aus dem Minuspol-Ende 510 der Kapillaren 519 austretende verbrauchte Polymer aufnehmen zu können. Außerdem wird der Spritzenmechanismus 520 angesteuert, um die Kapillaren 519 mit neuem Polymer zu füllen, und das verbrauchte Polymer wird entsorgt. Schließlich wird, um ein Austrocknen des Trennmediums zu verhindern, das Minuspol-Ende 510 in die Pufferlösung im Negativpol-Pufferbehälter 511 getaucht.
• (Schritt S124)
• In Schritt S124 führt der Vorrichtungskörper 501 eine vorbereitende Wanderung aus. Die vorbereitende Wanderung ist ein Verfahren zum Anlegen einer vorbestimmten Spannung an das Polymer, um einen für die Elektrophorese geeigneten Zustand des Polymers zu erreichen.
• Bei der vorbereitenden Wanderung in der vorliegenden Ausführungsform wird zuerst das Minuspol-Ende 510 durch die Beförderungseinrichtung 518 in die Pufferlösung in dem Negativpol-Pufferbehälter 511 getaucht, und der Spannungsanlegungspfad wird gebildet. Außerdem wird durch die Hochspannungsquelle 516 eine Spannung von etwa einigen bis einigen zehn kV für einige bis einige zehn Minuten an das Polymer angelegt, um einen für die Elektrophorese geeigneten Zustand des Polymers zu erreichen. Schließlich wird, um ein Austrocknen des Polymers zu verhindern, das Minuspol-Ende 510 in die Pufferlösung in dem Negativpol-Pufferbehälter 511 getaucht.
• (Schritt S125)
• In Schritt S125 führt der Gerätekörper 501 eine Probenkomponente in den Wanderungspfad ein. Dieser Schritt kann automatisch ausgeführt werden oder kann oder dadurch ausgeführt werden, dass von Zeit zu Zeit ein Steuersignal von dem Steuercomputer 502 übertragen wird.
• Bei der Einführung der Probe in der vorliegenden Ausführungsform wird zuerst das Minuspol-Ende 510 in die Probe, die sich in der Vertiefung des Probenbehälters 512 befindet, durch die Beförderungseinrichtung 518 getaucht. Auf diese Weise wird ein Spannungsanlegungspfad gebildet und ein Zustand erreicht, der das Einführen der Probenkomponente in den Wanderungspfad ermöglicht. Außerdem wird durch die Hochspannungsquelle 518 eine Impulsspannung an den Spannungsanlegungspfad angelegt, um die Probenkomponente in den Wanderungspfad einzuführen. Schließlich wird, um ein Austrocknen des Polymers zu verhindern, das Minuspol-Ende 510 in die Pufferlösung in dem Negativpol-Pufferbehälter 511 getaucht.
• (Schritt S126)
• In Schritt S126 führt der Vorrichtungskörper 501 eine Wanderungsanalyse aus. Bei der Wanderungsanalyse wird jede in der Probe enthaltene Probenkomponente durch Elektrophorese getrennt und analysiert.
• Bei der Wanderungsanalyse in der vorliegenden Ausführungsform wird zuerst das Minuspol-Ende 510 durch die Beförderungseinrichtung 518 in die Pufferlösung in dem Negativpol-Pufferbehälter 511 getaucht, und der Spannungsanlegungspfad wird gebildet. Als Nächstes wird eine Hochspannung von 7,5 kV durch die Hochspannungsquelle 516 an den Spannungsanlegungspfad angelegt, um ein elektrisches Feld in dem Wanderungspfad zu erzeugen. Durch das erzeugte elektrische Feld bewegt sich jede Probenkomponente innerhalb des Wanderungspfads mit einer von der Eigenschaft jeder Probenkomponente abhängigen Geschwindigkeit zu der Lichtbestrahlungseinheit 508. Das bedeutet, dass die Probenkomponente durch den Unterschied ihrer Bewegungsgeschwindigkeit getrennt wird. Außerdem führt der Photodetektor 504 eine Detektion in der Reihenfolge der Probenkomponente, die die Lichtbestrahlungseinheit 508 erreicht hat, durch.
• Wenn die Probe beispielsweise viele DNAs mit unterschiedlichen Basenlängen enthält, tritt ein Unterschied in der Bewegungsgeschwindigkeit je nach ihrer Basenlänge auf, und die DNA erreicht die Lichtbestrahlungseinheit 508 in der Reihenfolge ab einer DNA mit kurzer Basenlänge. An jede DNA ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der einem Analyseobjekt entspricht, gebunden. Wenn Anregungslicht von der Lichtquelle 507 auf die Lichtbestrahlungseinheit 508 eingestrahlt wird, wird Informationslicht (Fluoreszenz mit einer von einer Probe abhängigen Wellenlänge) von der Probe erzeugt und nach außen abgegeben. Dieses Informationslicht wird durch das Beugungsgitter 524 in der Wellenlängenrichtung gestreut und wird durch den Photodetektor 504 detektiert. 1 ist ein Beispiel für die durch den Photodetektor 504 detektierten Bilder. Während der Wanderungsanalyse wird dieses Informationslicht in dem Photodetektor 504 in einem konstanten Zeitintervall detektiert, und die Bilddaten werden an die Berechnungssteuerungsschaltung 503 übertragen. Alternativ kann der Photodetektor 504 auch, um die zu übertragende Informationsmenge zu reduzieren, nicht die Bilddaten, sondern die Helligkeit (Signalstärke) nur eines Teils der Gebiete in den Bilddaten übertragen. Beispielsweise kann für jede Kapillare nur die Stärke einer Wellenlängenposition eines konstanten Intervalls übertragen werden.
• Wie in der Erläuterung zu 1 dargelegt, sind in der vorliegenden Ausführungsform aus den vorstehend beschriebenen Bilddaten nur die Signalstärkedaten in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis λ(19) für jede Kapillare an die Berechnungssteuerungsschaltung 503 zu übertragen. Die Signalstärkedaten drücken ein Spektrum jeder DNA-Probe in jeder Kapillare aus, und dieses Spektrum wird in der Messwertberechnungseinheit 5032 gespeichert. In der Messwertberechnungseinheit 5032 werden die Spektren aller Kapillaren 519 zu allen Detektionszeitpunkten während der vorstehend beschriebenen Wanderungsanalyse gespeichert. Ferner können, obwohl die Spektren aller Detektionszeitpunkte in der Messwertberechnungseinheit 5032 gespeichert werden können, dann, wenn nur eine vorbestimmte Peak-Zeit für einen Betreiber wichtig ist, nur die Spektren in der Nähe des vorbestimmten Zeitpunkts gespeichert werden,.
• (Schritt S127)
• In Schritt S127 hält der Vorrichtungskörper 501, wenn die geplante Erfassung der Bilddaten abgeschlossen ist, das Anlegen der Spannung an, und die Wanderungsanalyse ist beendet.
• Das Vorstehende ist ein Beispiel für die Verarbeitung der Elektrophoreseverarbeitung (Schritt S12) in 9. Die Schritte S123 bis S127 können auch automatisch durch den Vorrichtungskörper 501 ausgeführt werden und können dadurch, dass der Steuercomputer 502 von Zeit zu Zeit ein Steuersignal überträgt, ausgeführt werden.
• (Schritt S13)
• Zurück zu 9, ruft in Schritt S13 die Korrektureinheit 5035 eine Korrekturfaktormatrix K mit einer Kombination derselben Wanderungsspannung und desselben Fluoreszenzfarbstoffs wie zum Zeitpunkt der Erfassung der Matrix M(r) und der eigentlichen Probe von Schritt S12 aus der Korrekturfaktordatenbank 5034 auf und berechnet eine Matrix M(r)k durch Multiplikation jedes Elements der Matrix M(r) und jedes Elements k(ij) der Matrix K.
• (Schritt S14)
• In Schritt S14 berechnet die Korrektureinheit 5035 die Fluoreszenzstärke. Genauer gesagt, berechnet die Korrektureinheit 5035 die Stärke jedes Fluoreszenzfarbstoffs aus den Bilddaten, die bei der vorstehend beschriebenen Elektrophoreseverarbeitung (Schritt S12) erhalten wurden. In dem vorliegenden Schritt S14 muss nur das Stärkeverhältnis jedes Fluoreszenzfarbstoffs in den Wellenlängen λ(0) bis λ(19) mit dem Spektrum jeder Kapillare 519 zu jedem Zeitpunkt multipliziert und addiert werden. Wenn dies durch eine Matrix ausgedrückt wird, ist das Ergebnis gemäß dem nachstehenden mathematischen Ausdruck 3. $$\text{c}=\text{M}\left(\text{r}\right)\text{k f}$$

  

  $$\text{c}=\left[\begin{array}{cccc}{c}_X& c_T& c_R& c_G\end{array}\right]$$

  

  $$\text{f}=\left[\begin{array}{llllll}{ƒ}_0\hfill & {ƒ}_1\hfill & {ƒ}_2\hfill & \cdots \cdots \hfill & {ƒ}_{18}\hfill & {ƒ}_{19}\hfill \end{array}\right]$$

  

  $$\text{M}\left(\text{r}\right)\text{k}=\left[\begin{array}{llllll}w{\left(r\right)}_{X0}{k}_{\left(X0\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{X1}{k}_{\left(X1\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{X2}{k}_{\left(X2\right)}\hfill & \hfill & w{\left(r\right)}_{X18}{k}_{\left(X18\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{X0}{k}_{\left(X0\right)}\hfill \\ w{\left(r\right)}_{T0}{k}_{\left(T0\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{T1}{k}_{\left(T1\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{T2}{k}_{\left(T2\right)}\hfill & \begin{array}{l}\\ \cdots \cdots \end{array}\hfill & w{\left(r\right)}_{T18}{k}_{\left(T18\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{T18}{k}_{\left(T18\right)}\hfill \\ w{\left(r\right)}_{R0}{k}_{\left(R0\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{R1}{k}_{\left(R1\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{R2}{k}_{\left(R2\right)}\hfill & \hfill & w{\left(r\right)}_{R18}{k}_{\left(R18\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{R19}{k}_{\left(R18\right)}\hfill \\ w{\left(r\right)}_{G0}{k}_{\left(G0\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{G1}{k}_{\left(G1\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{G2}{k}_{\left(G2\right)}\hfill & \hfill & w{\left(r\right)}_{G18}{k}_{\left(G18\right)}\hfill & w{\left(r\right)}_{G18}{k}_{\left(G19\right)}\hfill \end{array}\right]$$

  

  
  X ⇒ ROX
  T ⇒ TMR
  R ⇒ R110
  G ⇒ R6G
• Hier drückt der Vektor C die Fluoreszenzstärke jedes verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs aus. Daher drücken die Elemente C_X, C_T, C_R und C_G des Vektors C die Fluoreszenzstärke von ROX, TMR, R110 bzw. R6G aus. Der Vektor f drückt die durch den Photodetektor 504 beobachtete Signalstärke aus. Die Elemente f₀ bis f₁₉ des Vektors f drücken jeweils die Signalstärke in den Wellenlängen λ(0) bis λ(19) aus. Die Elemente f₀ bis f₁₉ können jeweils ein arithmetisches Mittel und dergleichen der Signalstärke der Nähe der Wellenlängen λ(0) bis λ(19) sein.
• Außerdem ist in dem Messsignal jeder der durch Photodetektor 504 detektierten Wellenlängen λ(0) bis λ(19) ist zusätzlich zu einem Signal durch den Fluoreszenzfarbstoff auch Raman-Streulicht von dem in die Kapillaren 519 gefüllten Polymer als Basisliniensignal enthalten. Deshalb ist es bei der Berechnung des Vektors f erforderlich, vorher dieses Basisliniensignal zu entfernen.
• Als Beispiel für das Verfahren zur Entfernung des Basisliniensignals wird das Spektrum des Raman-Streulichts im Voraus vor der Auslieferung der Vorrichtung erhalten, und das Spektrum wird in der Berechnungssteuerungsschaltung 503 als das Basisliniensignal gespeichert. Außerdem wird das Signal durch einen Fluoreszenzfarbstoff durch Abzug des Basisliniensignals von dem Messsignal zu jedem Zeitpunkt erhalten, und es kann zum Vektor f gemacht werden. Alternativ kann der Minimalwert in der Nähe jedes Zeitpunkts zum Basisliniensignalwert zu diesem Zeitpunkt gemacht werden.
• Bei der Umsetzung des Messvektors f in einen Fluoreszenzstärkenvektor wird die Matrix M(r)k verwendet.
• Die Korrektureinheit 5035 berechnet die Fluoreszenzstärke jedes Fluoreszenzfarbstoffs aus dem Messspektrum mit dem vorstehend beschriebenen mathematischen Ausdruck 3. Durch Ausführen dieser Verarbeitung des Spektrums jeder Kapillare 519 für jeden Zeitpunkt können die Zeitreihendaten der Fluoreszenzstärke jeder Kapillare 519 erhalten werden. Diese Zeitreihendaten der Fluoreszenzstärke sind im Folgenden als Fluoreszenzstärkenwellenform bezeichnet.
• (Schritt S15)
• In Schritt S15 führt die Korrektureinheit 5035 eine Peak-Detektion in Bezug auf die vorstehend beschriebene Fluoreszenzstärkenwellenform aus. Bei der Peak-Detektion sind hauptsächlich die Mittenposition des Peaks (Peak-Zeit), die Höhe des Peaks und die Breite des Peaks wichtig. Die Mittenposition des Peaks entspricht der Länge des DNA-Fragments. Die Höhe des Peaks wird zur Qualitätsbewertung der Größe der DNA-Dichte in der Probe und so weiter verwendet. Die Breite des Peaks ist ebenfalls wichtig für die Bewertung der Qualität der Probe und des Elektrophoreseergebnisses. Als eines der Verfahren zum Schätzen eines Peak-Parameters solcher tatsächlicher Daten kann Gauß-Fitting, die eine bekannte Technologie ist, verwendet werden.
• 11 ist eine Zeichnung, die ein Konzept des Gauß-Fitting zeigt. Wie in 11 gezeigt, dient Gauß-Fitting der Berechnung solcher Parameter (Mittelwert µ, Standardabweichung σ und maximaler Amplitudenwert A), so dass die Gauß-Funktion g die tatsächlichen Daten in Bezug auf die tatsächlich Daten einem konstanten Intervall am besten annähert. Als Indikator für den Grad der Annäherung an die tatsächlichen Daten wird häufig der kleinste quadratische Fehler zwischen den tatsächlichen Daten und dem Wert der Gauß-Funktion verwendet. Als numerisches Wertberechnungsverfahren zur Minimierung dieses kleinsten quadratischen Fehlers kann der Parameter mit unter Verwendung eines Verfahrens wie z. B. dem Gauß-Newton-Verfahren optimiert werden. Alternativ kann ein solches Verfahren angewandt werden, in dem die Genauigkeit in einem Fall, in dem zwei oder mehr Peak-Wellenformen gemischt sind, in einem Fall, in dem die Daten in der Nähe des Peaks unsymmetrisch sind, und so weiter verbessert wird. Außerdem wird, wenn die Varianz σ der Gauß-Funktion g bestimmt wird, die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) mit dem in 11 dargestellten Ausdruck erhalten. Dieser Wert kann zur Peak-Breite gemacht werden.
• Somit erhält die Korrektureinheit 5035 den Peak-Parameter in Bezug auf die Fluoreszenzstärkenwellenform aller Fluoreszenzfarbstoffe. Zu diesem Zeitpunkt können, wenn die Breite des Peaks und die Höhe des Peaks einen vorbestimmten Schwellenwert nicht erfüllen, sie aus dem Peak entfernt werden.
• Durch die vorstehend beschriebene Operation wird die Signalstärke der eigentlichen Probe, die durch die Wanderung mit 7,5 kV erhalten wurde, unter Verwendung der mit der Wanderungsspannung von 15 kV erhaltenen Matrix M genau berechnet. Obwohl in der vorliegenden Ausführungsform eine Kombination aus einer vorbestimmten Wanderungsspannung beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis die Wanderungsspannung der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig auswählen.
• <Technische Effekte>
• Wie vorstehend beschrieben, wird in der ersten Ausführungsform vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 die Wanderung unter denselben Bedingungen wie die erste Spektralkalibrierung und die eigentliche Probe mit mehreren Wanderungsspannungen ausgeführt, und die Korrekturfaktormatrix K zur Korrektur der Abweichung des Spektrums wird für jede Kombination der Wanderungsspannung erfasst und in der Korrekturfaktordatenbank 5034 zusammen mit den Informationen über den Fluoreszenzfarbstoff eingetragen. Ein Betreiber, der das Gerät erworben hat, kann die zweite Spektralkalibrierung und die Wanderung der eigentlichen Probe mit einer Kombination der in der Korrekturfaktor-Datenbank 5034 eingetragenen optionalen Wanderungsspannung ausführen. Außerdem weichen, selbst wenn der Betreiber die Spannung zur Zeit der Wanderung der eigentlichen Probe möglicherweise ändert, das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, so dass auch dann, wenn die zweite Spektralkalibrierung nicht wiederholt wird, eine korrekte Fluoreszenzstärke erfasst werden kann.
• [Zweite Ausführungsform]
• Obwohl die Matrix M' in der ersten Ausführungsform unter Verwendung des Matrixstandards erfasst wird, schlägt die zweite Ausführungsform ein Verfahren zum Erfassen der Matrix M' unter Verwendung einer bekannten DNA-Probe vor. Die bekannte DNA-Probe ist ein PCR-Produkt einer DNA, eine im Handel erhältliche Standardprobe und so weiter. In der vorliegenden Ausführungsform sind der Matrixstandard, die bekannte DNA-Probe und die eigentliche Probe mit ROX, TMR, R110 und R6G zu markieren. Auch die Zeiten (t0', t1', t2' und t3'), zu denen jeder Fluoreszenzfarbstoff während der Wanderung der bekannten DNA-Probe isoliert Licht erzeugt, müssen bekannt sein.
• 12 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit der zweiten Ausführungsform zeigt.
• In Schritt S21 führt der Hersteller in ähnlicher Weise wie in Schritt S1 eine Spektralkalibrierung unter Verwendung des Matrixstandards aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M. Die Migrationsspannung wird auf 15 kV eingestellt.
• In Schritt S22 veranlasst der Hersteller, dass die bekannte DNA-Probe wandert.
• In Schritt S23 erfasst die Messwertberechnungseinheit 5032 ein Spektrum zu dem Zeitpunkt (t0', t1', t2' und t3'), zu dem jeder Fluoreszenzfarbstoff isoliert Licht erzeugt, und erzeugt die Matrix M' aus dem Stärkeverhältnis jedes Fluoreszenzfarbstoffs. Die Migrationsspannung wird auf 7,5 kV eingestellt.
• In Schritt S24 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 in ähnlicher Weise wie in Schritt S3 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wie in Schritt S1 der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S21 und S21 mit verschiedenen Wanderungsspannungen ausgeführt, und die mehreren Matrizen M und M' werden erfasst. Wenn die Wanderung mit mehreren Spannungen durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• In ähnlicher Weise wie bei der ersten Ausführungsform sind die Schritte S21 bis S24 durch die Herstellerseite vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 ausgeführt worden, und die Korrekturfaktormatrix K ist bereits in die Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden. Die durch den Betreiber, der das Gerät erworben hat, tatsächlich ausgeführte Arbeit wird zum nächsten Schritt S25 und danach. Hier ist angenommen, dass nach Schritt S24 die Kapillaren 519 zum Zeitpunkt des Transports entfernt und angebracht wurden und sich die Positionsbeziehung zwischen dem Photodetektor 504 und den Kapillaren 519 verändert hat. Wenn das Entfernen und Anbringen der Kapillaren 519 in Schritt S24 und danach nicht ausgeführt worden ist, kann aus den in Schritt S21 erhaltenen Matrizen M eine mit einer Wanderungsspannung ausgewählt werden, die mit der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S21) übereinstimmt, um zu der nachstehend beschriebene Matrix M(r)k gemacht zu werden.
• In Schritt S25 führt der Betreiber die zweite Spektralkalibrierung in ähnlicher Weise wie in Schritt S11 aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M(r). Obwohl die Wanderungsspannung in Schritt S25 als Beispiel 15 kV beträgt, kann in einer tatsächlichen Operation eine beliebige Spannung aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen Wanderungsspannungen ausgewählt werden.
• In Schritt S26 führt der Betreiber in ähnlicher Weise wie in Schritt S12 eine Wanderung der eigentlichen Probe aus. Obwohl die Wanderungsspannung hier beispielhaft als 7,5 kV eingestellt ist, kann die Wanderungsspannung in der Praxis beliebig aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen Spannungen ausgewählt werden.
• Da die Schritte S27 bis S29 den in der ersten Ausführungsform erläuterten Schritten S13 bis S15 (9) ähnlich sind, wird ihre Erläuterung weggelassen.
• Durch die vorstehend beschriebene Operation weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn die Wanderungsspannung zwischen dem Zeitpunkt der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S21) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S25) unterschiedlich ist, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus einer vorbestimmten Wanderungsspannung beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis die Wanderungsspannung der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S25) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S26) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktor-Datenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig auswählen.
• <Technischer Effekt>
• Wie vorstehend beschrieben, kann der Betreiber, der die Vorrichtung erworben hat, in der zweiten Ausführungsform in ähnlicher Weise wie in der ersten Ausführungsform die zweite Spektralkalibrierung und Wanderung der eigentlichen Probe mit einer Kombination beliebiger Wanderungsspannungen, die in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden sind, ausführen. Außerdem weichen, selbst wenn der Betreiber die Spannung zur Zeit der Wanderung der eigentlichen Probe möglicherweise ändert, das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, so dass auch dann, wenn die zweite Spektralkalibrierung nicht wiederholt wird, eine korrekte Fluoreszenzstärke erfasst werden kann.
• <Versuchsbeispiel 1>
• Der Effekt der zweiten Ausführungsform wurde durch eine nachstehend beschriebene Prozedur bestätigt.
• (Probe)
• Als Matrixstandard für den Zeitpunkt der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S21) wurde BigDye (eingetragenes Warenzeichen) Terminator v3.1 Matrix Standards (Dye Set Z) (hergestellt von Applied Biosystems) verwendet. Sowohl für die bekannte DNA-Probe (Schritt S22) als auch für die eigentliche Probe (Schritt S26) wurden 3500/3500×L Sequencing Standards, BigDye (eingetragenes Warenzeichen) Terminator v3.1 (hergestellt von Applied Biosystems) verwendet. Für alle vorstehend beschriebenen Proben werden ROX, TMR, R110 und R6G als Fluoreszenzfarbstoff verwendet.
• (Analyseprozedur)
• In dem Versuchsbeispiel 1 wurden als eine Verifikation der zweiten Ausführungsform die Schritte S21 bis S26 in der in den Schritten S1, S12, S2, S3, S11 bzw. S12 beschriebenen Weise ausgeführt. Die Kapillarlänge zum Zeitpunkt der Wanderung war 36 cm, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt des Eingießens der Probe war 1,6 kV, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt der Wanderung war 15 kV zum Zeitpunkt der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S21), und die Spannung zum Zeitpunkt der Wanderung der bekannten Probe und der Wanderung der eigentlichen Probe war 7,5 kV.
• Als Nächstes wurden die Schritte S27 bis S29 in der in den Schritten S13 bis S15 beschriebenen Weise ausgeführt.
• Zur Kontrolle der zweiten Ausführungsform wurden die Berechnung der Lichtintensität und die Peak-Detektion der eigentlichen Probe nicht mit Anwendung der Korrekturfaktormatrix K, sondern unter Verwendung der Matrix M ausgeführt. Zwischen der zweiten Ausführungsform und ihrer Kontrolle wurde die Signalstärke des Pseudo-Peaks verglichen.
• (Versuchsergebnis)
• 13 ist eine Zeichnung, die das Ergebnis des Versuchsbeispiels 1 zeigt. In 3 sind die Matrix M, die Matrix M' und die Korrekturfaktormatrix K, die durch die Schritte S21, S23 und S24 erhalten wurden, gezeigt.
• In Bezug auf die Grafik in 13 zeigt die horizontale Achse die Peak-Zeit, und die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenzstärke. Obwohl der Pseudo-Peak bei der Kontrolle bestätigt wird, ist es offensichtlich, dass der Pseudo-Peak in dem Verfahren der zweiten Ausführungsform reduziert ist.
• [Dritte Ausführungsform]
• Obwohl in der ersten und zweiten Ausführungsform ein Fall erläutert wurde, in dem die Wanderungsspannung zwischen dem Zeitpunkt der zweiten Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich war, wird in der dritten Ausführungsform ein Fall erläutert, in dem der Fluoreszenzfarbstoff unterschiedlich ist. In der vorliegenden Ausführungsform ist der in der ersten Spektralkalibrierung verwendete Matrixstandard beispielsweise mit FAM, JOE, TMR und CXR zu markieren. Außerdem ist die eigentliche Probe mit R6G, R110, TMR und ROX zu markieren.
• 14 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe in Bezug auf die dritte Ausführungsform zeigt.
• In Schritt S31 führt der Hersteller in ähnlicher Weise wie in Schritt S1 die Spektralkalibrierung unter Verwendung des Matrixstandards aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M. Für die Probe wird jedoch ein Matrixstandard verwendet, der mit FAM, JOE, TMR und CXR markiert ist.
• In Schritt S32 erfasst der Hersteller die Matrix M' in ähnlicher Weise wie in Schritt S1. Für die Probe wird jedoch ein Matrixstandard verwendet, der mit R6G, R110, TMR und ROX markiert ist.
• In Schritt S33 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 in ähnlicher Weise wie in Schritt S3 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wie in Schritt S1 der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S31 und S32 mit einer Kombination aus verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ausgeführt, und die mehreren Matrizen M und M' werden erfasst. Wenn die Wanderung mit einer Kombination mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• In ähnlicher Weise wie bei der ersten Ausführungsform sind die Schritte S31 bis S33 durch die Herstellerseite vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 ausgeführt worden, und die Korrekturfaktormatrix K ist bereits in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden. Die durch den Betreiber, der das Gerät erworben hat, tatsächlich ausgeführte Arbeit wird zum nächsten Schritt S34 und danach. Hier ist angenommen, dass nach Schritt S33 die Kapillaren 519 zum Zeitpunkt des Transports gelöst und angebracht wurden und sich die Positionsbeziehung zwischen dem Photodetektor 504 und den Kapillaren 519 verändert hat. Wenn das Entfernen und Anbringen der Kapillaren 519 in Schritt S33 und danach nicht ausgeführt worden ist, kann aus den in Schritt S31 erhaltenen Matrizen M eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt werden, der gleich dem bei der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S35) ist, um zu der nachstehend beschriebene Matrix M(r)k gemacht zu werden.
• In Schritt S34 führt der Betreiber die zweite Spektralkalibrierung in ähnlicher Weise wie in Schritt S11 aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M(r). Obwohl der Fluoreszenzfarbstoff in Schritt S34 in der vorliegenden Ausführungsform FAM, JOE, TMR und CXR verwendet, kann in einer tatsächlichen Operation ein beliebiger aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen Fluoreszenzfarbstoffen ausgewählt werden.
• In Schritt S35 führt der Betreiber in ähnlicher Weise wie in Schritt S12 eine Wanderung der eigentlichen Probe durch. Beispielsweise ist die eigentliche Probe mit R6G, R110, TMR und ROX zu markieren. In einer tatsächlichen Operation kann jedoch ein beliebiger aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen Fluoreszenzfarbstoffen ausgewählt werden.
• Da die Schritte S36 bis S38 den in der ersten Ausführungsform erläuterten Schritten S13 bis S15 (9) ähnlich sind, wird ihre Erläuterung weggelassen.
• Durch die vorstehend beschriebene Operation weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S31) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S35) unterschiedlich sein können, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus einem vorbestimmten Fluoreszenzfarbstoff beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis den Fluoreszenzfarbstoff der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S34) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S35) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktor-Datenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern.
• <Technischer Effekt>
• Wie vorstehend beschrieben wird in der dritten Ausführungsform vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 eine Wanderung unter denselben Bedingungen wie bei der ersten Spektralkalibrierung und der eigentlichen Probe unter Verwendung einer Probe, die mit einer Gruppe unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, ausgeführt, und die Korrekturfaktormatrix K zum Korrigieren der Abweichung des Spektrums wird für jede Kombination des Fluoreszenzfarbstoffs erfasst und in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Der Betreiber, der die Vorrichtung erworben hat, kann die zweite Spektralkalibrierung und die Wanderung der eigentlichen Probe mit einer Kombination aus beliebigen in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen Fluoreszenzfarbstoffen ausführen. Außerdem weichen, selbst wenn der Betreiber den Fluoreszenzfarbstoff zur Zeit der Wanderung der eigentlichen Probe möglicherweise ändert, das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, so dass auch dann, wenn die zweite Spektralkalibrierung nicht wiederholt wird, eine genaue Fluoreszenzstärke erfasst werden kann.
• <Versuchsbeispiel 2>
• Der Effekt der dritten Ausführungsform wurde durch eine nachstehend beschriebene Prozedur bestätigt.
• (Probe)
• Als Matrixstandard für den Zeitpunkt der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S31) wurde PowerPlex (eingetragenes Warenzeichen) 4C Matrix Standards (hergestellt von Promega Corporation) verwendet. Zur Erfassung der Matrix M' (Schritt S32) wurde BigDye (eingetragenes Warenzeichen) Terminator v3.1 Matrix Standards (Dye Set Z) (hergestellt von Applied Biosystems) verwendet. Für die eigentliche Probe (Schritt S35) wurden 3500/3500×L Sequencing Standards, BigDye (eingetragenes Warenzeichen) Terminator v3.1 (hergestellt von Applied Biosystems) verwendet.
• 15A ist eine Zeichnung, die einen in dem Versuchsbeispiel 2 verwendeten Fluoreszenzfarbstoff zeigt. Wie in 15A gezeigt ist, werden für den Matrixstandard (Schritt S31) FAM, JOE, TMR und CXR als Fluoreszenzfarbstoff verwendet. Außerdem werden ROX, TMR, R110 und R6G für die beiden Schritte S32 und S35 als Fluoreszenzfarbstoff verwendet.
• (Analyseprozedur)
• In dem Versuchsbeispiel 2 wurden zur Verifikation der dritten Ausführungsform die Schritte S31, S32, S33 und S34 in der in den Schritten S1, S1, S3 bzw. S11 beschriebenen Weise ausgeführt. Die Kapillarlänge zum Zeitpunkt der Wanderung war 36 cm, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt des Eingießens der Probe war 1,6 kV, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt der Wanderung war 15 kV bei allen Schritten zum Zeitpunkt der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S31).
• Als Nächstes wurden die Schritte S35 bis S38 in der in den Schritten S12 bis S15 beschriebenen Weise ausgeführt.
• Zur Kontrolle der dritten Ausführungsform wurden die Berechnung der Lichtintensität und die Peak-Detektion der eigentlichen Probe nicht mit Anwendung der Korrekturfaktormatrix K, sondern unter Verwendung der Matrix M ausgeführt. Zwischen der dritten Ausführungsform und ihrer Kontrolle wurde die Signalstärke des Pseudo-Peaks verglichen.
• (Versuchsergebnis)
• 15B ist eine Zeichnung, die das Ergebnis des Versuchsbeispiels 2 zeigt. In 15B sind die Matrix M, die Matrix M' und die in den Schritten S31 bis S33 erhaltene Korrekturfaktormatrix K gezeigt.
• In Bezug auf die Grafik in 15B zeigt die horizontale Achse die Peak-Zeit, und die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenzstärke. Obwohl der Pseudo-Peak bei der Kontrolle bestätigt wird, ist es offensichtlich, dass der Pseudo-Peak in dem Verfahren der dritten Ausführungsform reduziert ist.
• [Vierte Ausführungsform]
• In der ersten Ausführungsform wurde die in einer vorbestimmten Vorrichtung erhaltene Korrekturfaktormatrix K auf Daten der eigentlichen Probe, die in demselben Vorrichtung erhalten wurden, angewandt. Die vierte Ausführungsform schlägt ein Verfahren zum Anwenden der in einer vorbestimmten Vorrichtung erhaltenen Korrekturfaktormatrix K auf die in einer separaten Vorrichtung erhaltenen Daten der eigentlichen Probe vor.
• In der vorliegenden Ausführungsform wird als Beispiel eine Erläuterung vorgenommen, die einen Fall als Beispiel darstellt, in dem der Fluoreszenzfarbstoff in ähnlicher Weise wie bei der dritten Ausführungsform (14) unterschiedlich ist. Als ein Beispiel ist der in der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S31) verwendete Matrixstandard mit FAM, JOE, TMR und CXR zu markieren. Außerdem ist die eigentliche Probe mit R6G, R110, TMR und ROX zu markieren.
• Die erste Spektralkalibrierung (Schritt S31), die Erfassung der Matrix M' (Schritt S32) und die Berechnung der Korrekturfaktormatrix K (Schritt S33) werden in ähnlicher Weise wie in der dritten Ausführungsform durch die Herstellerseite mit einer vorbestimmten Multikapillarelektrophoresevorrichtung A ausgeführt. Die Vorrichtung A überträgt die Korrekturfaktormatrix K an eine andere Vorrichtung (mehrere Vorrichtungen), beispielsweise über ein Netz, und veranlasst, dass die Korrekturfaktormatrix K in der Korrekturfaktordatenbank 5034 jeder Vorrichtung eingetragen wird. Beispielsweise kann die Korrekturfaktormatrix K in allen Multikapillarelektrophoresevorrichtungen, die vor der Auslieferung stehen, eingetragen werden.
• Schritt 34 und danach können in einer beliebigen Vorrichtung, in der die gleiche Korrekturfaktormatrix K wie der Vorrichtung A eingetragen worden ist, ausgeführt werden.
• <Technischer Effekt>
• Wie vorstehend beschrieben, wird in der vierten Ausführungsform die Korrekturfaktormatrix K, die unter Verwendung einer vorbestimmten Multikapillarelektrophoresevorrichtung erfasst wurde, auch in anderen Vorrichtungen eingetragen. Da es nicht erforderlich ist, die Korrekturfaktormatrix K in jeder Vorrichtung zu messen, reduzieren sich die Kosten und der Arbeitsaufwand auf Seiten des Herstellers.
• [Fünfte Ausführungsform]
• In der ersten Ausführungsform wurde durch Multiplikation der Korrekturfaktormatrix K mit der in der zweiten Spektralkalibrierung erhaltenen Matrix M(r) eine Abweichung zwischen der Matrix M(r) und dem Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe verhindert. Die fünfte Ausführungsform schlägt ein Verfahren zum Verhindern einer Abweichung durch Ändern der Wellenlängenbreite (Signalerfassungsbreite) eines durch den Photodetektor detektierten Signals vor. In Bezug auf eine ähnliche Verarbeitung wie die der ersten Ausführungsform wird die Erläuterung weggelassen.
• 16 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit der fünften Ausführungsform zeigt.
• In der vorliegenden Ausführungsform dient der Photodetektor 504 der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 zum Messen der Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen λ(0) bis λ(19) bei dem Abtasten der Daten. Obwohl die zwanzig Wellenlängen hier nur als Beispiel angeführt wurden, kann in der Praxis ein arithmetisches Mittel der Signalstärke in der Nähe jeder der Wellenlängen λ(0) bis λ(19) genommen werden. Außerdem ist der Matrixstandard mit CXR zu markieren, und die eigentliche Probe ist mit ROX zu markieren. Die Fluoreszenzspektren dieser Fluoreszenzfarbstoffe sind bekannt und stimmen nicht miteinander überein.
• Da der Photodetektor 504 der vorliegenden Ausführungsform nur zwanzig Wellenlängen detektiert, wird das Fluoreszenzspektrum von CXR durch einen aus zwanzig Elementen gebildeten Vektor Vm ausgedrückt, und das Fluoreszenzspektrum von ROX wird durch einen aus zwanzig Elementen gebildeten Vektor Vs ausgedrückt.
• In Schritt S51 definiert die Messwertberechnungseinheit 5032 die zwanzig Wellenlängen (Signalerfassungsbreite) so, dass der Korrelationskoeffizient des Vektors Vm und des Vektors Vs maximiert wird. Zu diesem Zeitpunkt kann für das lokale Maximum oder seine Umgebung des Spektrums ein Gewicht vergeben werden. Ferner muss der Korrelationskoeffizient, wenn es sich nicht um eine Vorgabe in einer tatsächlichen Praxis handelt, nur ausreichend hoch gemacht werden, und es ist nicht notwendigerweise erforderlich, dass er zu einem Maximalwert gemacht wird. Das heißt, die Breite der Signalerfassung ist so definiert, dass der Korrelationskoeffizient zu einem vorbestimmten Wert oder höher wird.
• In Schritt S52 führt der Betreiber die Spektralkalibrierung in ähnlicher Weise wie in Schritt S1 aus. Zu diesem Zeitpunkt berechnet die Messwertberechnungseinheit 5032 einen Vektor Vc, der aus zwanzig Elementen gebildet wird.
• In Schritt S53 führt der Betreiber in ähnlicher Weise wie in Schritt S12 eine Wanderung der eigentlichen Probe aus. Hier drückt das durch die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasste Spektrum f die durch den Photodetektor 504 beobachtete Signalstärke aus. Die Elemente f0 bis f19 davon drücken jeweils die Signalstärke in den Wellenlängen λ(0) bis λ(19) aus.
• In Schritt S54 berechnet die Korrektureinheit 5035 die Fluoreszenzstärke. Spezifischer muss in Bezug auf das Spektrum jeder der Kapillaren 519 zu jedem Zeitpunkt das Stärkeverhältnis jedes Fluoreszenzfarbstoffs in jeder der Wellenlängen λ(0) bis λ(19) nur multipliziert und addiert werden. Der Ausdruck davon durch eine Matrix entspricht dem nachstehenden mathematischen Ausdruck 4. $$\begin{array}{l}\text{c}=\text{Vmf}\\ \text{f}=\left[{\text{f}}_0{\text{ f}}_1{\text{ f}}_2\cdots \cdots {\text{f}}_{18}{\text{f}}_{19}\right]\\ \text{Vm}=\left[{\text{w}}_0{\text{w}}_1{\text{w}}_2\cdots \cdots {\text{w}}_{18}{\text{w}}_{19}\right]\end{array}$$

  
• Der Vektor c ist ein Fluoreszenzstärkespektrum. Der Vektor f drückt die durch den Photodetektor 504 detektierte Signalstärke aus. Seine Elemente f₀ bis f₁₉ drücken jeweils die Signalstärke in den Wellenlängen λ(0) bis λ(19) aus.
• Außerdem ist, wie in Schritt S14 der ersten Ausführungsform beschrieben, in dem Messsignal jeder der durch Photodetektor 504 detektierten Wellenlängen λ(0) bis λ(19) zusätzlich zu einem Signal durch den Fluoreszenzfarbstoff ein Raman-Streulicht von dem in die Kapillare gefüllten Polymer als Basisliniensignal enthalten. Bei der Berechnung des Vektors f ist es daher erforderlich, vorher dieses Basisliniensignal zu entfernen. Die Entfernung der Basislinie durch ein in Schritt S14 beschriebenes Verfahren ausgeführt werden.
• In Schritt S55 führt die Korrektureinheit 5035 die Peak-Detektion in ähnlicher Weise wie in Schritt S15 aus.
• Durch die vorstehend beschriebene Operation weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein können, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet.
• <Technischer Effekt>
• Wie vorstehend beschrieben detektiert der Photodetektor 504 in der fünften Ausführungsform Licht aus den Kapillaren 519 mit einer solchen Wellenlänge, dass der Korrelationskoeffizient der Fluoreszenzspektren der mehreren Fluoreszenzfarbstoffe groß wird. Somit kann, da die Matrix M(r)k zum Zeitpunkt der Wanderung nicht erforderlich ist, die für die Analyse benötigte Zeit verkürzt werden, und eine Belastung der Berechnungssteuerungsschaltung 503 kann reduziert werden.
• <Versuchsbeispiel 3>
• Der Effekt der fünften Ausführungsform wurde durch eine nachstehend beschriebene Prozedur bestätigt.
• (Vorrichtung)
• Die in der ersten Ausführungsform erläuterte Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 (5) kann verwendet werden. In der vorliegenden Ausführungsform dient der Photodetektor 504 jedoch beispielsweise dazu, die Signalstärke in den zwanzig Wellenlängen zwischen 520 nm und 690 nm zu detektieren. In dem vorliegenden Versuchsbeispiel 3 muss die Signalerfassungsbreite bekannt sein, damit ein wechselseitiger Korrelationskoeffizient von zwei Spektren ausreichend hoch wird. Die zwanzig Wellenlängen, ausgedrückt durch einen Vektor, werden zu λ_test. Außerdem wird als Kontrolle ein Fall angenommen, in dem die Signale in gleichen Abständen von 8,9 nm im selben Abschnitt erfasst werden, und die Wellenlängen des Abschnitts dieser zwanzig Elemente werden durch einen Vektor als λ_ctrl ausgedrückt. Der nachstehende mathematische Ausdruck 5 zeigt die Elemente von λ_test und λ_ctrl. $$\begin{array}{l}\mathrm{\lambda }\text{test}=\\ (520529538547557583602627634640646653659665\\ 671678684690)\\ \mathrm{\lambda }\text{ctrl}=(520529538547556565\text{ 574 }583592601605618627636645654\\ 663672680690)\end{array}$$

  
• (Probe)
• Als Matrixstandard für den Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S52) wurde aus den vier in PowerPlex (eingetragenes Warenzeichen) 4C Matrix Standards (hergestellt von Promega Corporation) enthaltenen Peaks einer verwendet, der mit CXR markiert war. Für die Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S53) wurde aus den vier Peaks, die in den BigDye (eingetragenes Warenzeichen) Terminator v3.1 Matrix Standards (Dye Set Z) (hergestellt von Applied Biosystems) enthalten sind, einer verwendet, der mit ROX markiert war.
• (Analyseprozedur)
• In dem Versuchsbeispiel 3 wurden als Verifikation der fünften Ausführungsform die Schritte S52 und S53 in einer in den Schritten S11 bzw. S12 beschriebenen Weise ausgeführt. Die Kapillarlänge zum Zeitpunkt der Wanderung war 36 cm, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt des Eingießens der Probe war 1,6 kV, die angelegte Spannung zum Zeitpunkt der Wanderung war 15 kV sowohl für den Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S52) als auch für den Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S53).
• (Versuchsergebnis)
• 17A ist ein Fluoreszenzspektrum, das in dem Versuchsbeispiel 3 erfasst wurde. In 17A ist ein mit λ_test erhaltenes Fluoreszenzspektrum gezeigt. Der nachstehende mathematische Ausdruck 6 zeigt die Signalstärke des Vektors Vm und des Vektors Vs in λ_test. Wie in dem mathematischen Ausdruck 6 gezeigt, wurde der Korrelationskoeffizient (corr.) des Vektors Vm und des Vektors Vs in einem Fall der Anwendung von λ_test (die fünfte) Ausführungsform zu 0,998. $$\begin{array}{l}\text{Vm}=\\ (0.010.020.02\text{ 0}\text{.03 }0.040.060.060.161.000.860.710.580.430.350.29\\ 0.240.210.190.17)\\ \text{Vs}=\\ (0.010.020.02\text{ 0}\text{.02 }0.020.040.040.091.000.890.750.620.460.360.29\\ 0.240.210.190.17)\\ corr=0.998\end{array}$$

  
• 17B ist ein Fluoreszenzspektrum, das in einem Kontrollversuch des Versuchsbeispiels 3 erfasst wurde. In 17B ist ein mit λ_ctrl erhaltenes Fluoreszenzspektrum gezeigt. Der nachstehende mathematische Ausdruck 7 zeigt die Signalstärke des Vektors Vm und des Vektors Vs in λ_ctrl. Wie in dem mathematischen Ausdruck 7 gezeigt, wurde der Korrelationskoeffizient (corr.) des Vektors Vm und des Vektors Vs in einem Fall von λ_ctrl zu 0,986. $$\begin{array}{l}\text{Vm}=\\ (0.010.020.02\text{ 0}\text{.03 }0.040.060.060.16\text{ 0}.380.70\text{ 1}.000.990.790.590.39\\ 0.300.230.200.17)\\ \text{Vs}=\\ (0.010.020.02\text{ 0}\text{.02 }0.020.040.040.09\text{ 0}.240.540.87\text{ 1}.000.830.620.42\\ 0.300.230.200.17)\\ corr=0.986\end{array}$$

  
• Wie aus den mathematischen Ausdrücken 6 und 7 hervorgeht, ist bekannt, dass der wechselseitige Korrelationskoeffizient bei der Anwendung von λ_test, nämlich bei der fünften Ausführungsform, höher wurde als bei der Kontrolle (λ_ctrl).
• [Sechste Ausführungsform]
• In der ersten bis dritten Ausführungsform wurde ein Fall erläutert, in dem die Wanderungsspannung oder der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der zweiten Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich waren. In der sechsten Ausführungsform wird ein Fall erläutert, in dem sowohl die Wanderungsspannung als auch der Fluoreszenzfarbstoff unterschiedlich sind. In der vorliegenden Ausführungsform ist der in der ersten Spektralkalibrierung verwendete Matrixstandard beispielsweise mit FAM, JOE, TMR und CXR zu markieren. Außerdem ist die eigentliche Probe mit R6G, R110, TMR und ROX zu markieren. Die Wanderungsspannung zum Zeitpunkt der Spektralkalibrierung ist auf 15 kV eingestellt, und die Wanderungsspannung zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe ist auf 7,5 kV eingestellt.
• 18 ist ein Ablaufplan, der ein Analyseverfahren einer Probe im Zusammenhang mit der sechsten Ausführungsform zeigt.
• In Schritt S61 führt der Hersteller in ähnlicher Weise wie in Schritt S1 die Spektralkalibrierung unter Verwendung des Matrixstandards aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M. Die Migrationsspannung ist auf 15 kV eingestellt.
• In Schritt S62 erfasst der Hersteller die Matrix M' in ähnlicher Weise wie in Schritt S2. Für die Probe wird jedoch ein Matrixstandard verwendet, der mit R6G, R110, TMR und ROX markiert ist. Die Wanderungsspannung zu diesem Zeitpunkt ist 7,5 kV.
• In Schritt S63 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 in ähnlicher Weise wie in Schritt S3 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wie in Schritt S1 der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S61 und S62 mit verschiedenen Kombinationen der Wanderungsspannung und des Fluoreszenzfarbstoffs ausgeführt, und die mehreren Matrizen M und M' werden erfasst. Wenn die Wanderung mit mehreren Wanderungsspannungen und mehreren Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• In ähnlicher Weise wie bei der ersten Ausführungsform sind die Schritte S61 bis S63 durch die Herstellerseite vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 ausgeführt worden, und die Korrekturfaktormatrix K ist bereits in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden. Die durch den Betreiber, der das Gerät erworben hat, tatsächlich ausgeführte Arbeit wird zum nächsten Schritt S64 und danach. Hier ist angenommen, dass nach Schritt S63 die Kapillaren 519 zum Zeitpunkt des Transports gelöst und angebracht wurden und sich die Positionsbeziehung zwischen dem Photodetektor 504 und den Kapillaren 519 verändert hat. Wenn das Entfernen und Anbringen der Kapillaren 519 in Schritt S63 und danach nicht ausgeführt worden ist, kann aus den in Schritt S61 erhaltenen Matrizen M eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der gleich wie bei der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S65) ist, ausgewählt werden, um zu der nachstehend beschriebene Matrix M(r)k gemacht zu werden.
• In Schritt S64 führt der Betreiber die zweite Spektralkalibrierung in ähnlicher Weise wie in Schritt S11 aus, und die Messwertberechnungseinheit 5032 erfasst die Matrix M(r). Obwohl die Wanderungsspannung und der Fluoreszenzfarbstoff in Schritt S64 beispielsweise so eingestellt sein können, dass sie gleich denen der ersten Spektralkalibrierung (Schritt S61) sind, können in der Praxis beliebige aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen ausgewählt werden.
• In Schritt S65 führt der Betreiber die Wanderung der eigentlichen Probe aus. Obwohl die Wanderungsspannung und der Fluoreszenzfarbstoff, die hier verwendet sind, beispielsweise die gleichen sind wie die zum Zeitpunkt der Erfassung der Matrix M' (Schritt S62), können in der Praxis beliebige aus den in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenen ausgewählt werden.
• Da auch die Schritte S66 bis S68 den in der ersten Ausführungsform erläuterten Schritten S13 bis S15 (9) ähnlich sind, wird ihre Erläuterung weggelassen.
• Durch die vorstehend beschriebene Operation weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn sowohl der Fluoreszenzfarbstoff als auch die Wanderungsspannung, die zu verwenden sind, zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S61) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S65) unterschiedlich sein können, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus einem vorbestimmten Fluoreszenzfarbstoff und der Wanderungsspannung beispielhaft dargestellt wurde, kann der Betreiber in der Praxis die Wanderungsspannung und den Fluoreszenzfarbstoff der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S64) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S65) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern.
• <Technischer Effekt>
• Wie vorstehend beschrieben werden in der sechsten Ausführungsform vor der Auslieferung der Multikapillarelektrophoresevorrichtung 500 die erste Spektralkalibrierung und die Wanderung der eigentlichen Probe mit unterschiedlichen Wanderungsspannungen unter Verwendung einer Probe, die mit einer Gruppe unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, ausgeführt, und die Korrekturfaktormatrix K zum Korrigieren der Abweichung des Spektrums wird für jede Kombination des Fluoreszenzfarbstoffs und der Wanderungsspannung erfasst und wird in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Der Betreiber, der die Vorrichtung erworben hat, kann die zweite Spektralkalibrierung und die Wanderung der eigentlichen Probe mit einer Kombination aus beliebigen in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragenem Fluoreszenzfarbstoff und Wanderungsspannung ausführen. Somit verbessert sich gemäß der vorliegenden Ausführungsform der Freiheitsgrad des Fluoreszenzfarbstoffs und der Wanderungsspannung, die durch einen Betreiber verwendet werden, im Vergleich mit der ersten bis dritten Ausführungsform.
• [Siebte Ausführungsform]
• Obwohl in der ersten bis dritten Ausführungsform eine Erläuterung für den Fall vorgenommen wurde, in dem die Wanderungsspannung oder der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der zweiten Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich sind, wird in der siebten Ausführungsform der Fall erläutert, in dem sich die chemische Eigenschaft oder die Zusammensetzung des Polymers unterscheidet. Da das Polymer, wie vorstehend beschrieben, nur ein Beispiel für ein Trennmedium ist, ist es unnötig zu erwähnen, dass die gleiche Operation auch auf andere Trennmedien als das Polymer angewandt werden kann.
• Da das zur siebten Ausführungsform gehörende Analyseverfahren beispielsweise durch einen Ablauf ähnlich dem der ersten Ausführungsform ausgeführt werden kann, werden im Folgenden nur die unterschiedlichen Punkte erläutert.
• In der siebten Ausführungsform soll das bei der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) verwendete Polymer beispielsweise 4 % Polyacrylamid enthalten. Außerdem soll das zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritte S2 und S12) verwendete Polymer 7 % Polyacrylamid enthalten. Sowohl der Matrixstandard als auch die eigentliche Probe sind mit R6G, R110, TMR und ROX zu markieren, und die Wanderungsspannung für beide ist auf 15 kV einzustellen.
• Wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S1 und S2 mit Kombinationen verschiedener Arten von Polymeren ausgeführt, und es werden mehrere Matrizen M und M' erfasst. Die hier erwähnten verschiedenen Arten des Polymers bedeuten ein Polymer, das beispielsweise Polyacrylamid in verschiedenen Konzentrationen enthält.
• In Schritt S3 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird in der Korrekturfaktordatenbank 5034 zusammen mit den Informationen über die Art des Polymers und so weiter eingetragen. Wenn die Wanderung unter Verwendung mehrerer Polymere durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der Zusammensetzung des Polymers zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination der vorbestimmten Zusammensetzung beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis die chemische Eigenschaft des Polymers der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern. Ferner kann das Verfahren der vorliegenden Ausführungsform auch auf einen Fall, in dem die Zusammensetzung des Polymers unterschiedlich ist, angewandt werden.
• [Achte Ausführungsform]
• Obwohl in der ersten bis dritten Ausführungsform eine Erläuterung für den Fall vorgenommen wurde, in dem die Wanderungsspannung oder der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich sind, wird in der achten Ausführungsform ein Fall erläutert, in dem die Kapillaren 519 unterschiedlich sind..
• Da das zur achten Ausführungsform gehörende Analyseverfahren beispielsweise durch einen Ablauf ähnlich dem der ersten Ausführungsform ausgeführt werden kann, werden im Folgenden die unterschiedlichen Punkte erläutert.
• In der achten Ausführungsform beträgt die Kapillarlänge zum Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) beispielsweise 50 cm, und die Kapillarlänge zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritte S2 und S12) beträgt 36 cm.
• Wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S1 und S2 mit Kombinationen verschiedener Kapillarlängen ausgeführt, und es werden mehrere Matrizen M und M' erfasst.
• In Schritt S3 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über die Kapillarlänge in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wenn die Wanderung mit mehreren Kapillarlängen durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn die Kapillarlänge zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus der vorbestimmten Länge beispielhaft dargestellt wurde, kann der Betreiber in der Praxis die Kapillarlänge der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern.
• [Neunte Ausführungsform]
• Obwohl in der ersten bis dritten Ausführungsform eine Erläuterung für den Fall vorgenommen wurde, in dem die Wanderungsspannung oder der Fluoreszenzfarbstoff zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe unterschiedlich sind, wird in der neunten Ausführungsform ein Fall erläutert, in dem die Zusammensetzung oder die chemische Eigenschaft des Pluspol-Puffers unterschiedlich ist.
• Da das zur neunten Ausführungsform gehörende Analyseverfahren beispielsweise durch einen Ablauf ähnlich dem der ersten Ausführungsform ausgeführt werden kann, werden im Folgenden die unterschiedlichen Punkte erläutert.
• In der neunten Ausführungsform soll beispielsweise der pH-Wert des in der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) verwendeten Pluspol-Puffers 7,5 sein. Der pH-Wert des Pluspol-Puffers zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritte S2 und S12) soll 8,0 sein.
• Wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S1 und S2 mit Kombinationen des Pluspol-Puffers mit verschiedenen pH-Werten ausgeführt, und es werden mehrere Matrizen M und M' erfasst.
• In Schritt S3 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über den pH-Wert des Pluspol-Puffers in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wenn die Wanderung unter Verwendung der Pluspol-Puffer mit mehreren pH-Werten durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der pH-Wert des Pluspol-Puffers zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus dem vorbestimmten pH-Wert des Pluspol-Puffers beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis den pH-Wert des Pluspol-Puffers der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern. Ferner kann das Verfahren der vorliegenden Ausführungsform auch auf einen Fall, in dem die Zusammensetzung des Pluspol-Puffers unterschiedlich ist, angewandt werden.
• [Zehnte Ausführungsform]
• Obwohl in der neunten Ausführungsform ein Fall erläutert wurde, in dem sich die chemische Eigenschaft des Pluspol-Puffers unterscheidet, wird in der zehnten Ausführungsform ein Fall erläutert, in dem sich die Zusammensetzung oder die chemische Eigenschaft eines Minuspol-Puffers unterscheidet.
• In der zehnten Ausführungsform soll beispielsweise der pH-Wert des in der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) verwendeten Minuspol-Puffers 7,5 sein. Der pH-Wert des Minuspol-Puffers zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritte S2 und S12) soll 8,0 sein. Da die anderen Punkte der neunten Ausführungsform ähnlich sind, wird deren Erläuterung weggelassen.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der pH-Wert des Minuspol-Puffers zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination aus dem vorbestimmten pH-Wert beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis den pH-Wert des Pluspol-Puffers der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktor-Datenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern. Ferner kann das Verfahren der vorliegenden Ausführungsform auch auf einen Fall, in dem die Zusammensetzung des Minuspol-Puffers unterschiedlich ist, angewandt werden.
• [Elfte Ausführungsform]
• Obwohl in der neunten Ausführungsform ein Fall erläutert wurde, in dem sich die chemische Eigenschaft des Pluspol-Puffers unterscheidet, und in der zehnten Ausführungsform ein Fall erläutert wurde, in dem sich die chemische Eigenschaft des Minuspol-Puffers unterscheidet, wird in der elften Ausführungsform ein Fall erläutert, in dem sich die chemische Eigenschaft oder die Zusammensetzung einer Probenlösung unterscheidet.
• Da das zur der elften Ausführungsform gehörende Analyseverfahren beispielsweise durch einen Ablauf ähnlich dem der ersten Ausführungsform ausgeführt werden kann, werden im Folgenden die unterschiedlichen Punkte erläutert.
• In der elften Ausführungsform soll beispielsweise der pH-Wert einer Lösung des Matrixstandards, die in der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) verwendet wird, 7,5 sein. Der pH-Wert einer Lösung der eigentlichen Probe, die in den Schritten S2 und S12 verwendet wird, soll 8,0 sein.
• Wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S1 und S2 mit Kombinationen der Proben mit unterschiedlichem pH-Wert ausgeführt, und es werden mehrere Matrizen M und M' erfasst.
• In Schritt S3 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird zusammen mit den Informationen über den pH-Wert der Probenlösung in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen. Wenn die Wanderung unter Verwendung der Proben mit mehreren pH-Werten durchgeführt wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K registriert.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn der pH-Wert der Probenlösung zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine Kombination der Probenlösung mit einem vorbestimmten pH-Wert beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis den pH-Wert der Probenlösung der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktordatenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern. Ferner kann das Verfahren der vorliegenden Ausführungsform auch auf einen Fall, in dem die Zusammensetzung der Probenlösung unterschiedlich ist, angewandt werden.
• [Zwölfte Ausführungsform]
• In der zwölften Ausführungsform wird ein Fall erläutert, in dem die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur unterschiedlich ist.
• Da das zur zwölften Ausführungsform gehörende Analyseverfahren beispielsweise durch einen Ablauf ähnlich dem der ersten Ausführungsform ausgeführt werden kann, werden im Folgenden die unterschiedlichen Punkte erläutert.
• In der zwölften Ausführungsform soll die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur zum Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritte S1 und S11) beispielsweise 42 °C sein. Außerdem soll die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur zum Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritte S2 und S12) 60 °C sein.
• Wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, werden in einer tatsächlichen Operation die Schritte S1 und S2 mit Kombinationen verschiedener Temperaturen ausgeführt, und es werden mehrere Matrizen M und M' erfasst.
• In Schritt S3 berechnet die Korrekturfaktorberechnungseinheit 5033 die Korrekturfaktormatrix K basierend auf den Matrizen M und M'. Die Korrekturfaktormatrix K wird in der Korrekturfaktordatenbank 5034 zusammen mit den Informationen über die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur eingetragen. Wenn die Wanderung so ausgeführt wird, dass die der Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur an mehreren Temperaturen gehalten wird, werden alle Korrekturfaktormatrizen K eingetragen.
• Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Ausführungsform weichen das Referenzspektrum und das Fluoreszenzspektrum der eigentlichen Probe nicht voneinander ab, selbst wenn die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur zwischen dem Zeitpunkt der Spektralkalibrierung (Schritt S1) und dem Zeitpunkt der Wanderung der eigentlichen Probe (Schritt S12) unterschiedlich sein kann, und die Fluoreszenzstärke der eigentlichen Probe wird genau berechnet. Obwohl hier eine vorbestimmte Kombination der Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur beispielhaft dargestellt ist, kann der Betreiber in der Praxis die Temperatur des Behälters 505 mit konstanter Temperatur der zweiten Spektralkalibrierung (Schritt S11) und der eigentlichen Probenwanderung (Schritt S12) innerhalb eines Bereichs, der in der Korrekturfaktor-Datenbank 5034 eingetragen worden ist, beliebig ändern.
• [Zur Manifestation]
• Als Beispiel für ein Verfahren zum Bestätigen einer Verletzung der vorliegenden Offenbarung kann die nachstehend beschriebene Verifikation angeführt werden. Die Erläuterung erfolgt anhand von 9.
• In der Vorrichtung des Objekts wird der Schritt S11 (Spektralkalibrierung) ausgeführt. Obwohl die Wanderungsspannung zu diesem Zeitpunkt 15 kV ist, wird die Analyse in der Praxis mit einer solchen Wanderungsgeschwindigkeit durchgeführt, bei der die Wanderungsspannung äquivalent zu 7,5 kV wird. Die Wanderungsgeschwindigkeit kann durch Hinzufügen eines Salzes in geeigneter Menge zu der Probe angepasst werden. Alternativ kann die Wanderung in der Praxis auch mit einer Wanderungsspannung von 7,5 kV durchgeführt werden, obwohl die Wanderungsspannung hinsichtlich der Vorrichtung mit 15 kV eingetragen ist. Danach wird gemäß dem Verfahren der ersten Ausführungsform die eigentliche Probe analysiert (Schritte S13 bis S15). Zu diesem Zeitpunkt ist es, wenn der Pseudo-Peak im Vergleich zum Zeitpunkt der ersten Ausführungsform ansteigt, sehr gut möglich, dass die Vorrichtung des Objekts den für jede Wanderungsspannung bestimmten Korrekturfaktor auf das Fluoreszenzspektrum des Matrixstandards angewandt hat.
• Auch eine Verifikation wie nachstehend beschrieben ist möglich. Die Erläuterung erfolgt anhand von 14. In diesem Fall wird in Schritt S31 ein anderer Fluoreszenzfarbstoff als der tatsächliche Fluoreszenzfarbstoff eingetragen. Wenn das Hochziehen im Vergleich zu der dritten Ausführungsform nach der Analyse der eigentlichen Probe (Schritte S34 bis S36) zunimmt, ist es gut möglich, dass der für jeden Fluoreszenzfarbstoff bestimmte Korrekturfaktor auf das Fluoreszenzspektrum des Matrixstandards angewandt worden ist.
• [Modifikation]
• Die vorliegende Offenbarung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt und enthält verschiedene Modifikationen. Beispielsweise wurden die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen zum leichteren Verständnis der vorliegenden Offenbarung ausführlich erläutert, und es ist nicht unbedingt erforderlich, alle erläuterten Konfigurationen aufzunehmen. Auch kann ein Teil einer Ausführungsform durch eine Konfiguration anderer Ausführungsformen ersetzt werden. Außerdem kann eine Konfiguration einer Ausführungsform zu einer Konfiguration anderer Ausführungsformen hinzugefügt werden. Ferner ist es in Bezug auf einen Teil der Konfiguration jeder Ausführungsform möglich, einen Teil einer Konfiguration anderer Ausführungsformen hinzuzufügen, zu löschen oder zu ersetzen.
• Bezugszeichenliste

101

Vorrichtungskörper,

102

Steuercomputer,

103

Berechnungssteuerungsschaltung

104

Photodetektor,

105

Behälter mit konstanter Temperatur,

106

Kapillaranordnung,

107

Lichtquelle,

108

Lichtbestrahlungseinheit,

109

Ladekopf,

110

Minuspol-Ende,

111

Minuspol-Pufferbehälter

112

Probenbehälter,

113

Polymerpatrone,

114

Pluspol-Pufferbehälter,

115

Pluspol,

116

Gleichstromquelle,

117

Anordnungskopf,

118

Beförderungseinrichtung,

119

Kapillare,

120

Spritzenmechanismus,

121

spitzer Abschnitt,

122

oberer Abschnitt der Polymerpatrone,

123

Heiz/Kühlungsmechanismus,

201

Laserlicht,

202

Reflexionsspiegel,

203

Kondensorlinse

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• JP 2014117222 A [0021]

Claims (12)

1. Elektrophoresevorrichtung, die umfasst: einen Elektrophoresepfad einer Probe; ein Dispersionselement zum Streuen von Licht aus der Probe innerhalb des Elektrophoresepfades; einen Photodetektor zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts; und eine Berechnungseinheit zum Bestimmen eines Spektrums des Lichts auf der Basis eines Signals aus dem Photodetektor, wobei die Berechnungseinheit das Spektrum unter Verwendung von für jede Elektrophoresebedingung oder jeden Fluoreszenzfarbstoff bestimmten Korrekturfaktoren korrigiert.
2. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Korrekturfaktor für jede Spannung zum Zeitpunkt der Elektrophorese der Probe bestimmt wird.
3. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Korrekturfaktor für jeden pH-Wert eines Puffers zum Zeitpunkt der Elektrophorese der Probe oder für jeden pH-Wert einer Lösung der Probe bestimmt wird.
4. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Korrekturfaktor für jede Länge des Elektrophoresepfads bestimmt wird
5. Elektrophoresevorrichtung Anspruch 1, die ferner umfasst: einen Behälter mit konstanter Temperatur, der den Elektrophoresepfad aufnimmt, wobei der Korrekturfaktor für jede eingestellte Temperatur des Behälters mit konstanter Temperatur bestimmt wird.
6. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Korrekturfaktor unter Verwendung der vorbestimmten Elektrophoresevorrichtung erfasst wird.
7. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Korrekturfaktor für jede Zusammensetzung oder chemische Eigenschaft eines Trennmediums innerhalb des Elektrophoresepfads bestimmt wird.
8. Elektrophoresevorrichtung Anspruch 1, die ferner umfasst: mehrere Elektrophoresepfade, wobei die Berechnungseinheit den Korrekturfaktor für jeden der mehreren Elektrophoresepfade einstellt.
9. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Berechnungseinheit einen numerischen Wert berechnet, der die relative Beziehung zwischen einem ersten Spektrum eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs und einem zweiten Spektrum eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs als den Korrekturfaktor ausdrückt, und die Berechnungseinheit durch Anwenden des Korrekturfaktors auf ein drittes Spektrum eines dritten Fluoreszenzfarbstoffs, der gleich dem ersten Fluoreszenzfarbstoff ist, das dritte Spektrum gemäß der relativen Beziehung korrigiert.
10. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Berechnungseinheit einen numerischen Wert berechnet, der die relative Beziehung zwischen einem ersten Spektrum, das durch eine erste Wanderungsbedingung erfasst wird, und einem zweiten Spektrum, das durch eine zweite Wanderungsbedingung erfasst wird, als den Korrekturfaktor ausdrückt, und die Berechnungseinheit durch Anwenden des Korrekturfaktors auf ein drittes Spektrum, das durch eine dritte Wanderungsbedingung, die gleich der ersten Wanderungsbedingung ist, erfasst wird, das dritte Spektrum gemäß der relativen Beziehung korrigiert.
11. Elektrophoresevorrichtung, die umfasst: einen Elektrophoresepfad einer Probe; ein Dispersionselement zum Streuen von Licht aus der Probe innerhalb des Elektrophoresepfads; einen Photodetektor zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts; und eine Berechnungseinheit zum Berechnen der Signalstärke des Lichts auf der Basis eines Signals aus dem Photodetektor, wobei der Photodetektor das Signal mit einer Signalerfassungsbreite erfasst, die so eingestellt ist, dass ein Korrelationskoeffizient zwischen den Spektren mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe gleich einem oder größer als ein vorbestimmter Wert wird.
12. Analyseverfahren, das umfasst: einen Schritt der Elektrophorese einer Probe in einem Elektrophoresepfad; einen Schritt zum Streuen von Licht von der Probe innerhalb des Elektrophoresepfads durch ein Dispersionselement; einen Schritt zum Detektieren des durch das Dispersionselement gestreuten Lichts durch einen Photodetektor; und einen Schritt zum Bestimmen eines Spektrums des Lichts auf der Basis eines Signals aus dem Photodetektor durch eine Berechnungseinheit, wobei der Schritt zum Bestimmen eines Spektrums des Lichts einen Schritt zum Korrigieren des Spektrums durch die Berechnungseinheit unter Verwendung eines für jede Wanderungsbedingung oder jeden Fluoreszenzfarbstoff bestimmten Korrekturfaktors enthält.

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