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TECHNISCHES GEBIET
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, ein Kit und ein System zum Analysieren von Genen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Technik zum Nachweis von Genpolymorphismen, die in einem Zielgenbereich enthalten sind.
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HINTERGRUND
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DNA ist ein Polymermolekül, welches biogenetische Information trägt, und DNA-Sequenziertechniken haben sich als bevorzugte Techniken für die Life Sciences enorm weiterentwickelt, seit die Sanger-Methode als Verfahren zum Analysieren von DNA-Sequenzen entwickelt wurde. Die ”Didesoxymethode”, eine von Sanger et al. entwickelte Technik, ist ein Sequenzierverfahren, bei dem synthetische Reaktionen eingesetzt werden, die an den Positionen stoppen, an welchen Didesoxynukleotide (ddATP·ddGTP·ddCTP·ddTTP) aufgenommen werden, wenn sie einer DNA-Synthesereaktionslösung in niedriger Konzentration als Terminatoren beigegeben werden.
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Bei der anfänglichen DNA-Sequenziertechnik werden vier Typen von Didesoxynukleotiden mit ihren entsprechenden Radioisotopen markiert; eine DNA-Synthesereaktion wird separat in vier Gefäßen, die jeweils mit dem entsprechenden radioaktiv markierten Didesoxynukleotid gefüllt sind, gestartet; die Produkte jeder DNA-Synthesereaktion werden von anderen basierend auf den Längen der DNA-Fragmente mittels Acrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung einzelner Bahnen getrennt; und die Nukleotidsequenzen werden bestimmt, indem die Positionen, an welchen radioaktive Isotope gefunden werden, unter Einsatz von Autoradiographie detektiert werden.
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Danach ist ein Nukleotididentifizierungsverfahren entwickelt worden, bei dem vier Arten von fluoreszierenden Farbstoffen, die jeweils einem von vier Didesoxynukleotidtypen entsprechen, verwendet werden, um die vier Typen von Nukleotiden zusammen in einem Gemisch dieser nachzuweisen, was es ermöglicht, DNA-Sequenzen auf einer einzelnen Bahn eines Acrylamidgels zu analysieren. Überdies ist die Kapillarelektrophorese als Nachfolge-Elektrophoreseverfahren zur Acrylamid-Gelelektrophorese entwickelt worden. Eine DNA-Sequenziervorrichtung unter Verwendung von Kapillarelektrophorese ist ein System zur Analyse einer DNA-Probe, die mit vier fluoreszierenden Farbstoffen markiert ist, in einer einzelnen Kapillare unter Verwendung der Sanger-Methode. Eine DNA-Sequenziervorrichtung unter Verwendung von Kapillarelektrophorese, die es ermöglicht, eine Vielzahl von Proben gleichzeitig für eine kontinuierliche automatische Analyse schnell zu analysieren, hat stark zu den Gensequenzierprojekten großen Maßstabs beigetragen, z. B. dem humanen Genomprojekt, dessen Fertigstellung in 2003 berichtet wurde, und wird gegenwärtig am meisten verwendet.
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Das Prinzip der DNA-Sequenziervorrichtung zur Bestimmung der Gensequenzen von Zielproben beinhaltet die Schritte des Trennens der DNA-Fragmente basierend auf ihren Fragmentlängen mittels Elektrophorese und das Detektieren der fluoreszenzmarkierten Moleküle an den Trennpositionen. Die Nukleotide werden an den Koordinatenpositionen, an denen ihre Signalpeaks detektiert werden, durch das Mehrheitsprinzip basierend auf den Stärken der erhaltenen Fluoreszenzsignale oder der Flächen der Peaks abgeleitet.
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Es ist bekannt, dass die Genome der meisten lebenden Organismen, einschließlich des Menschen, die das bevorzugteste Ziel für die Analyse von Gensequenzen sind, diploid sind und ihre Genomsequenz Mutationen aufweist, die Einzelnukleotidpolymorphismen genannt werden. Diese Nukleotidpolymorphismen, auch Keimbahnpolymorphismen genannt, zeigen Eigenschaften, die von den Eltern zu den Nachfahren übertragen werden und in den Individuen oder Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins existieren. Wenn der Bereich, wo diese Nukleotidmorphismen existieren, mittels einer DNA-Sequenziervorrichtung analysiert werden, werden gleichzeitig zwei Arten von Fluoreszenz-Peaks an den Positionen, wo die Nukleotidpolymorphismen gefunden werden, detektiert.
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Da, wie vorstehend erwähnt, die Keimbahnpolymorphismen in einem Verhältnis von ein zu eins existieren, werden diese zwei Arten von Fluoreszenzsignalen grundsätzlich auch an den Positionen detektiert, wo die Keimbahnpolymorphismen in einem Verhältnis von eins zu eins angetroffen werden. Es kann jedoch sein, dass die Stärken der Signale an einigen Nukleotidpositionen die 1:1-Korrelation aufgrund eines Unterschieds der Lumineszenzeffizienz zwischen fluoreszierenden Substanzen oder einem Unterschied der Aufnahmeeffizienz zwischen den Positionen, an denen Polymorphismen gefunden werden, nicht anzeigen. Demgemäß haben konventionelle DNA-Sequenziertechniken einen Nachteil dahingehend, dass der Nachweis von Polymorphismen schwierig ist.
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Um dieses Problem anzusprechen, ist ein spezialisiertes Verfahren zum Analysieren der erhaltenen Fluoreszenzsignale entwickelt worden, um diese Polymorphismen nachzuweisen (Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-05508 ). Weiterhin kann eine Mobilitätsverschiebung zwischen den Peakpositionen von Chromatogrammen auftreten, wenn eine Differenz der Lumineszenzeffizienz zwischen fluoreszierenden Substanzen die Mobilität während der Elektrophorese beeinflusst. Ein Verfahren zum Bestimmen der Polymorphismen, deren Peakpositionen verschoben sind, ist ebenfalls entwickelt worden (Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2003-270206 ).
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Die Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-05508 und die Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2003-270206 offenbaren Verfahren zur Verbesserung der Bestimmungsgenauigkeit und -empfindlichkeit von Polymorphismen durch Bezugnahme auf existierende Chromatogrammdaten in einem Zielgenbereich. Durch diese Verfahren werden effektive Werkzeuge zur Bestimmung der Gensequenzen, einschließlich Keimbahnpolymorphismen, bereitgestellt, indem existierende Daten von der Sequenziervorrichtung mit hohem Genauigkeitsgrad analysiert werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Im Zuge der jüngeren Entwicklung der Genomanalysetechniken wurde die DNA-Sequenz des gesamten humanen Genoms in 2003 berichtet, und seitdem ist die Arzneimittelentwicklung proaktiv fortgeschritten, wobei Geninformationen ausgenutzt wurden. Insbesondere haben Krankenversicherungen Gentests an individuellen Patienten mit Krebserkrankungen durchgeführt, die durch genetische Abnormalitäten verursacht sein können, um einige therapeutische Arzneimittel auszuwählen und die Dosierungen mit diesen Arzneimitteln festzulegen.
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Genetische Störungen, die durch Erkrankungen induziert werden, wie z. B. Krebserkrankungen, werden somatische Mutationen genannt, im Unterschied zu den vorgenannten Keimbahnpolymorphismen. Die somatischen Mutationen, bei denen es sich um nach der Geburt auftretende genetische Abnormalitäten handelt, sind dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht von den Eltern an die Nachkommen weitergegeben werden, die Positionen auf dem Genom, wo Mutationen auftreten, nicht abgeschätzt werden können und der Existenzgrad von Polymorphismen in vivo oder in Geweben nicht abgeschätzt werden kann. Die Unfähigkeit, den Existenzgrad somatischer Mutationen abzuschätzen, ist zu einem großen Problem beim Nachweis dieser Polymorphismen geworden. Als Beispiel enthält das von einem Krebspatienten entnommene Krebsgewebe sowohl Krebszellen als auch normale Zellen und es wird eine Diversität in der genetischen Abnormalität unter den Krebszellen beobachtet, was zu einem niedrigen Existenzgrad der Zellen mit Polymorphismen im Zielbereich des Gewebes führt. Aus diesem Grund ist der Nachweis somatischer Mutationen schwieriger als der von Keimbahnpolymorphismen.
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Gegenwärtig werden das quantitative Polymerasekettenreaktionssystem (PCR) und DNA-Sequenziervorrichtungen zum Nachweis von somatischen Mutationen eingesetzt. Das quantitative PCR-System hat einen großen Vorteil des hochempfindlichen Nachweises. Es gibt jedoch auch einen Nachteil dahingehend, dass eine spezifische Detektionssonde für jeden Zielpolymorphismus erforderlich ist, um den Nachweis von Reaktionen unter Verwendung separater Sonden durchzuführen. Insbesondere für Krebszellen kann gegenwärtig nicht abgeschätzt werden, welche Typen genetischer Abnormalitäten auftreten können und wo. Demgemäß ist ein quantitatives PCR-System, für welches ein für den Zielpolymorphismus spezifisches Sondendesign erforderlich ist, für einen umfassenden Nachweis somatischer Mutationen nicht geeignet. Selbst wenn verschiedene Arten von Kombinationen von Detektionssonden erhältlich sind, wäre es in der Praxis aufgrund limitierter Testkosten und Menge der Analytproben schwierig, somatische Mutationen unter Verwendung all dieser Sonden nachzuweisen.
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Andererseits hat eine DNA-Sequenziervorrichtung auf Basis von Kapillarelektrophorese, was das gegenwärtig am meisten verwendete Sequenziersystem ist, die Fähigkeit, 500–700 bp zu bestimmen. Aus diesem Grund hat dieser Typ von Sequenziervorrichtung Vorteile gegenüber dem quantitativen PCR-System dahingehend, dass i) der Nachweis eines größeren Bereichs beim anfänglichen Testen möglich ist, und ii) die Bestimmung neuer somatischer Mutationen in dem vorgenannten Nukleotidsequenzbereich möglich ist. Weiterhin werden im quantitativen PCR-System Gensequenzen auf Basis der relativen Intensität zwischen Signalwerten für den Zielpolymorphismus bestimmt, während mit der DNA-Sequenziervorrichtung verifiziert werden kann, dass der unter Verwendung von Zielpolymorphismus-Information nachgewiesene genetische Polymorphismus wirklich von dem Zielgen stammt, was zu hochgradig verlässlichen Messergebnissen im Vergleich zu denen des quantitativen PCR-Systems führt. Eine hohe Messzuverlässigkeit ist ein vorteilhaftes Merkmal bei der medizinischen Diagnose, wo eine genaue Bestimmung erforderlich ist. Jedoch besteht bei der DNA-Sequenziervorrichtung, dem für die Gensequenzierung spezialisierten System, ein großes Problem einer unzureichenden Empfindlichkeit für den Nachweis kleinster somatischer Mutationen.
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Im Gegensatz dazu ist es mit der DNA-Sequenziervorrichtung auf Kapillarelektrophoresebasis möglich, Nukleotidsequenzen unter Verwendung von vier Arten fluoreszenzmarkierter Substanzen zu bestimmen, die je einem der vier Nukleotidtypen entsprechen. Im Allgemeinen erzeugt die fluoreszierende Substanz Lumineszenz über einen breiten Bereich von Wellenlängen, aber nicht bei einer einzelnen Wellenlänge.
2 zeigt die Wellenlängenbereiche von vier Typen von Allzweckfluoreszenzsubstanzen, die in der Nukleotidsequenzanalyse verwendet werden. Diese vier Typen von fluoreszierenden Substanzen haben unterschiedliche Peakwellenlängen (
2a–
2d), zeigen aber jeweils einen Crosstalk, wie aus
2 ersichtlich ist. Die DNA-Sequenziervorrichtung beinhaltet die Schritte der Trennung der markierten DNA-Moleküle basierend auf ihren DNA-Fragmentlängen mittels Elektrophorese; Messen der Signalstärken über die Peakwellenlängenbereiche und Identifizieren von Hauptfluoreszenzsignalen, um die Nukleotidsequenzen zu bestimmen. Demgemäß war die Existenz des vorstehend erwähnten Crosstalks kein Hauptproblem für eine solche beabsichtigte Verwendung. Um jedoch DNA-Moleküle mit somatischen Mutationen bei einem Existenzgrad von weniger als eins zu eins nachzuweisen, verhindert die Existenz eines Crosstalks, dass Signale, die von einer winzigen Menge eines DNA-Moleküls an der Position der gleichen DNA-Fragmentlänge erzeugt werden, nachgewiesen werden, was zu einer Verschlechterung der Empfindlichkeit des Nachweises von genetischen Mutationen führt. Beide Verfahren, welche in der vorgenannten Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-05508 und der Veröffentlichung der ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 2003-270206 offenbart sind, verwenden die Werte für die Signalausgabe von der Sequenziervorrichtung als Eingabeinformation. Dadurch konnten diese die verschlechterte Empfindlichkeit des Nachweises von genetischen Mutationen aufgrund der Existenz von Crosstalks nicht ausreichend verbessern, was wiederum verhinderte, dass genetische Mutationen von somatischen Mutationen ausreichend nachgewiesen werden.
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden, um mindestens eines der vorgenannten Probleme zu lösen, die Nukleinsäureproben für jeden der Nukleotidtypen markiert; die markierten Proben werden in separaten Strömungskanälen für jeden der Nukleotidtypen elektrophoriert; und genetische Mutationen werden basierend auf den Chromatogrammdaten, welche von dem markierten Signal für jeden der Nukleotidtypen erhalten werden, welche die individuellen Nukleinsäureproben, die durch Elektrophorese in dem entsprechenden der Mehrzahl von Strömungskanälen getrennt wurden, betreffen, nachgewiesen.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die in einem Zielgenbereich existierenden somatischen Mutationen mit hochgradiger Empfindlichkeit nachzuweisen. Andere Probleme und Konfigurationen als oben erwähnt werden in den folgenden Ausführungsformen erläutert.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist ein Diagramm, welches den Aufbau einer Messapparatur unter Verwendung individueller Strömungskanäle gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
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2 ist ein Diagramm, welches die Wellenlängen von mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Signalen zeigt, die im Allgemeinen für die DNA-Sequenzierung verwendet werden;
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3 ist ein Flussdiagramm, welches die Schritte der Peakdetektion, die Korrektur der Mobilität sowie Integrationsdaten von Strömungskanälen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert;
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4 ist ein Flussdiagramm, welches die Schritte der Peakdetektion, der Korrektur der Mobilität sowie Integrationsdaten von den Strömungskanälen gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert;
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5 ist ein Flussdiagramm, welches die Schritte der Peakdetektion, der Korrektur der Mobilität sowie Integrationsdaten von den Strömungskanälen gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert;
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6 ist ein Flussdiagramm, welches die Schritte der Peakdetektion, der Korrektur der Mobilität sowie Integrationsdaten von den Strömungskanälen gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert;
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7 ist eine Ansicht, welche die Darstellung der integrierten Chromatogrammdaten und Information über detektierte Polymorphismen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
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8 ist ein Diagramm, welches den Aufbau eines Gesamtsystems gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt; und
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9 ist ein Blockdiagramm, welches den Aufbau von Funktionen einer Datenanalyseeinrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Nachfolgend wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert. Es sei angemerkt, dass die beispielhaften Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die unten beschriebenen Ausführungsformen beinhalten, aber nicht auf diese eingeschränkt sind.
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Zunächst wird das Verfahren zum Nachweis von DNA-Molekülen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 1 erläutert. Das Verfahren wird begonnen, indem eine Ziel-DNA-Probe (Templat-DNA) 1a hergestellt wird. Im Allgemeinen wird die Templat-DNA durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR) verstärkt, welches spezifisch einen Zielgenbereich verstärkt, gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung des Templats jedoch nicht auf das PCR-Verfahren beschränkt.
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Ein Primer mit einer Sequenz, die zum Teil komplementär zur Templat-DNA ist, und DNA-Synthetase sowie dNTP und ddNTP als reaktive Substrate werden in eine Lösung gegeben, welche die Templat-DNA-Probe (1a) enthält, um eine Markierungsreaktion gemäß der Sanger-Methode hervorzurufen. Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Paar der Templat-DNA-Probe und des Primers mit vier verschiedenen reaktiven Lösungen (1b–1e), entsprechend den einzelnen Zielnukleotidtypen (A, G, C, T) markiert, um diese Zielnukleotidtypen (A, G, C, T) in den separaten Strömungskanälen (1f–1i) mittels Elektrophorese aufzutrennen und Messungen vorzunehmen.
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Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann entweder 1) die Farbstoffprimermethode, bei der der Primer i) markiert wird, oder 2) die Farbstoffterminatormethode, bei der ddNTP ii) markiert wird, zum Markieren synthetischer DNA-Moleküle verwendet werden. Überdies können Fluoreszenzfarbstoffe, chemische Lumineszenzsubstanzen und radioaktive Isotope als markierende Substanzen verwendet werden. Die heute im Handel erhältlichen Sequenzierkits markieren vier Typen von ddNTPs mit unterschiedlichen fluoreszierenden Substanzen; diese können bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung für die markierte DNA-Probe, enthaltend vier Typen von ddNTPs, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, angewandt werden. Es kann entweder die Farbstoffprimermethode oder die Farbstoffterminatormethode als Markierungsverfahren verwendet werden, weil vier Typen von ddNTPs, die mit einem einzigen Typ einer fluoreszierenden Substanz markiert sind, in den physikalisch separaten Strömungskanälen mittels Elektrophorese analysiert werden.
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Insbesondere mit der Farbstoffterminatormethode, wenn ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP mit unterschiedlichen fluoreszierenden Substanzen markiert werden, beeinflussen Unterschiede in der chemischen Struktur unter diesen verschiedenen fluoreszierenden Substanzen die Aufnahmeeffizienz während der Markierungsreaktion. Aus diesem Grund ist die Markierung der vier Nukleotidtypen mit einer einzigen Art einer fluoreszierenden Substanz zur korrekten Bestimmung des Existenzgrads gut geeignet. Überdies beeinflussen die Unterschiede unter den fluoreszierenden Substanzen auch die Mobilität der DNA-Fragmente während der Elektrophorese. Demgemäß ist eine Markierung der vier Typen von ddNTPs mit einer einzigen fluoreszierenden Substanz auch zur Korrektur der Mobilität der DNA-Fragmente gut geeignet.
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Zweitens werden die markierten DNA-Fragmente in den separaten Strömungskanälen (1f–1i) für jeden der vier Nukleotidtypen mittels Elektrophorese getrennt, um diese basierend auf der DNA-Fragmentlänge aufzutrennen. Da während der Elektrophorese das kürzere DNA-Fragment zuerst wandert, werden die Signalstärken über die Zeit unter Verwendung einer Messapparatur (1k) an einem Detektionsabschnitt (1j) gemessen, um zu ermöglichen, dass die Signale, die den existierenden Nukleotiden entsprechen, entsprechend der Nukleotidsequenz in den Zielproben gemessen werden. Ein Mikrokanal, der unter Verwendung einer Technik entwickelt wurde, die als Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) bezeichnet wird, kann zusätzlich zu den Strömungskanälen vom Kapillartyp verwendet werden, um die markierten DNA-Fragmente mittels Elektrophorese zu trennen und die Signale zu detektieren.
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Das Verfahren zur Analyse der DNA-Fragmente unter Verwendung von vier separaten Strömungskanälen ist in 1 beispielhaft gezeigt. Um die Genauigkeit der Analyse weiter zu verbessern, ist es effektiv, die Markierungsreaktion für jeden der vier Nukleotidtypen mit acht reaktiven Lösungen unter Verwendung von zwei Arten von Primern für ein Templat zu induzieren, um die markierten DNA-Fragmente als Reaktionsprodukte mittels Elektrophorese für den Nachweis zu trennen.
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Überdies können Strömungskanäle zum Beispiel in Abhängigkeit von anderen Anwendungen aufeinanderfolgend zugefügt werden, wie später unter Bezugnahme auf 4 erläutert ist.
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Nachfolgend wird ein Beispiel des Aufbaus des Gesamtsystems gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 8 erläutert. Das System gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist hauptsächlich aus einer Messapparatur (8a) aufgebaut, um die Signalwerte beim Nachweis der DNA-Fragmente zu messen, wie unter Bezugnahme auf 1 erläutert wurde, sowie einer Datenanalyseeinrichtung (8c) zum Korrigieren der von der Messapparatur erhaltenen Signalwerte und zum Anzeigen der Ergebnisse der Datenanalyse. In diesem Beispiel sind ein Kontrollsystem (8b), welches mit der Messapparatur (8a) verbunden ist, eine Referenzgendatenbank (8d), in welcher Information über die Zielgensequenz gespeichert ist, und eine Datenanalyseeinrichtung (8c), die mit einem externen Netzwerk (8e) verbunden ist, über Kommunikationsleitungen (8h) verbunden, und weiterhin kann das System eine DNA-Nachweisfunktion, eine Signalwertkorrekturfunktion und eine Ergebnisanzeigefunktion haben. Alternativ können die bei den Messapparaturen (8a) erhaltenen Signalwerte an einen externen Computer übertragen werden, der daran über das externe Netzwerk (8e) verbunden ist, um die Signalkorrekturfunktion durchzuführen. Es sei angemerkt, dass in dieser Abbildung Steuerungsleitungen und Informationsleitungen, die zur Erläuterung als notwendig angesehen werden, gezeigt sind, jedoch nicht immer sämtliche Steuerungsleitungen und Informationsleitungen, die tatsächlich mit dem Produkt verbunden sind, beinhaltet sind. Tatsächlich können fast alle Systemkomponenten miteinander verbunden sein.
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Nachfolgend werden die in der Datenanalyseeinrichtung (8c), die in 8 gezeigt ist, enthaltenen Funktionsteile bzw. Funktionsabschnitte unter Bezugnahme auf 9 erläutert. Um die in 9 gezeigten Funktionen an den Funktionsabschnitten in der Datenanalyseeinrichtung (8c) mittels Software durchzuführen, interpretiert ein Prozessor (9e) ein Programm zum Implementieren der Funktion, die in dem Speicher (9f) gespeichert ist, und führt dieses aus. Überdies übermittelt die Datenanalyseeinrichtung (8c) Informationen an ein externes Gerät, die Datenbank oder das Netzwerk über Schnittstellen bzw. Interfaces (9c, 9d) und empfängt diese. Weiterhin können der vorgenannten Aufbau, die vorgenannten Funktionsabschnitte, Prozessierabschnitte, Prozessierverfahren oder dergleichen mittels Hardware implementiert sein, zum Beispiel indem diese vollständig oder teilweise unter Verwendung eines integrierten Schaltkreises aufgebaut werden. Information, wie beispielsweise die Programme, Dateien und eine Datenbank, zum Durchführen der Funktionen können in Speichervorrichtungen gespeichert sein, wie z. B. einem Speicher, einer Festplatte und einem Solid-State-Drive (SSD) oder Speichermedien wie IC-Karten, SD-Karten und DVDs.
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Am Anfang trennen die Messapparaturen (8a, 8f) DNA-Fragmente basierend auf deren Fragmentlänge mittels Elektrophorese unter den Trenn-/Messbedingungen, die von den Steuerungssystemen (8b, 8g) empfangen werden, in separaten Strömungskanälen für jeden der in 1 gezeigten Nukleotidtypen in einem DNA-Fragmentlängen-Trennabschnitt (9a), und die markierten DNA-Moleküle werden in einem markierten DNA-Messabschnitt (9b) detektiert und gemessen.
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Anschließend werden die bei der Messapparatur (8a) gemessenen Signalwerte an die Datenanalyseeinrichtung (8c) übertragen. Die Datenanalyseeinrichtung (8c) zeichnet die gemessenen Werte nach Empfang in einem Messsignalwertspeicher (9j) auf. Dann werden unter Verwendung des später unter Bezugnahme auf 3, 4, 5 und 6 beschriebenen Verfahrens in einem Peakdetektionsabschnitt (9k) Peaks von den Signalwerten, die in dem Messsignalwertspeicher (9j) gespeichert sind, detektiert, und ein Möbilitätskorrektur- und Strömungskanalintegrierabschnitt (9l) korrigiert die Mobilität unter den Messergebnissen, die von einer Mehrzahl von Strömungskanälen, entsprechend den individuellen Zielproben, erhalten werden, und integriert die Daten von den Strömungskanälen. Anschließend zeichnet ein Integrationsprozessergebnisspeicher (9m) die Ergebnisse der Integration auf. Danach detektiert ein Haupt-/Mutationspeakdetektionsabschnitt (9o) Hauptpeaks und Mutationspeaks basierend auf dem Verfahren zur Detektion der Peaks, die in einem Peakdetektionslogikspeicher (9n) aufgezeichnet sind, und einer Bestimmungsanfrage, die von dem Anwender ausgegeben wird und die von einem Bestimmungsanfrage-Input (9h) empfangen wird, z. B. der Anfrage nach der Eingabe eines von einem Anfragenden spezifizierten Schwellwerts. In diesem Fall werden die Nukleotidtypen, die Signalwerte mit Stärken gleich oder höher als der Schwellwert zeigen, und die Koordinaten hiervon auf der Nukleotidsequenz aus den Signalwerten extrahiert, die in dem Integrationsprozessergebnisspeicher (9m) gespeichert sind, um Polymorphismen, die in dem Zielanalysebereich umfassend existieren, erschöpfend nachzuweisen.
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Dann empfängt eine Ergebnisausgabe (9i) Daten, die bei dem Haupt-/Mutationspeakdetektionsabschnitt (9o) erfasst werden, zeichnet die Daten in einem Sequenz/detektierte Mutation-Speicher (9g) auf und gibt die Daten an eine Anzeige (9f) aus. Die Anzeige (9f) wiederum zeigt Informationen über die Nukleotidsequenz und Mutationen sowie die Chromatogramme an, wie später unter Bezugnahme auf 7 beschrieben wird. Der Sequenz/detektierte Mutation-Speicher (9g) zeichnet die Messergebnisse auf, um eine Vergleichsanalyse mit den zuvor gemessenen Ergebnissen zu ermöglichen und zeichnet die Referenznukleotidsequenz des Zielgens auf, um eine Vergleichsanalyse zwischen den detektierten Ergebnissen und der Referenzsequenz zu ermöglichen. Das System ist beispielhaft in dem in 9 gezeigten Blockdiagramm angegeben. Demgemäß können die Funktionen des Steuerungssystems mit den Funktionen der Datenanalyseeinrichtung integriert sein, um auf dem gleichen Computer ausgeführt zu werden. Alternativ kann, wie in 8 gezeigt ist, eine Mehrzahl von Messapparaturen mit einer Datenanalyseeinrichtung verbunden sein, damit die von der Mehrzahl von Messapparaturen erhaltenen Ergebnisse zusammen auf einer Datenanalyseeinrichtung analysiert werden.
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Nachfolgend wird die Peakdetektionsfunktion, welche bei dem in 9 beschriebenen Peakdetektionsabschnitt (9k) durchgeführt wird, unter Bezugnahme auf 3, 4, 5 und 6 beschrieben, und es wird die Funktion zum Korrigieren der Mobilität und das Integrieren der Daten von den Strömungskanälen, was bei dem Mobilitätskorrektur- und Strömungskanalintegrierabschnitt (9l) durchgeführt wird, erläutert. Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Signalwerte (1l–1o), die von einem der Nukleotidtypen, die mit ihrer entsprechenden fluoreszierenden Substanz markiert sind, erzeugt werden, in dem entsprechenden Strömungskanal detektiert, da vier Nukleotidtypen in den separaten Strömungskanälen analysiert werden. Dadurch ist es unmöglich, die Gensequenz der Templat-DNA-Probe basierend auf den von jedem der Strömungskanäle erhaltenen Signale zu bestimmen. Um dieses Problem anzusprechen, ist ein Prozess (1p) des Integrierens der von der Mehrzahl von Strömungskanälen, entsprechend den Zielproben, erhaltenen Ergebnisse erforderlich, um die Ziel-DNA-Messergebnisse zu berechnen. Da eine Elektrophorese unter Verwendung separater Strömungskanäle durchgeführt wird und dies eine Mobilitätsdifferenz verursacht, ist eine Funktion zum Korrigieren und Integrieren der Mobilität des gemessenen Ziels erforderlich.
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Die Verfahren zum Korrigieren der Mobilität unter Verwendung der Signalwerte, die in jedem der Strömungskanäle an den Messapparaturen (8a, 8b) als Eingabeinformation gemessen werden, sind zum Beispiel i) ein in 3 gezeigtes Verfahren, bei dem die Mobilität korrigiert wird, indem die Erscheinungspositionen jedes Nukleotidtyps basierend auf bekannter Nukleotidsequenzinformation oder einer bekannten Referenzchromatogramminformation in dem Zielbereich mit den Positionen verglichen wird, an denen die Signale mit gleicher oder höherer Stärke als der Schwellwert gemessen werden, unter den Messergebnissen jedes Nukleotidtyps; ii) ein in 4 gezeigtes Verfahren, bei dem die Mobilität unter Verwendung entweder der Referenzchromatogramminformation oder Referenznukleotidsequenzinformation über die Zielproben als Referenzinformation, die durch Elektrophorese und Analyse an vier Nukleotidtypen der Zielproben in jedem der Strömungskanäle durch ein Standard-DNA-Sequenzierverfahren erhalten wird, zusätzlich zu der vorgenannten Messung für jeden der Nukleotidtypen, korrigiert wird, iii) ein in 5 gezeigtes Verfahren, bei dem die Mobilität korrigiert wird, indem die gemessenen Positionen von DNA-Markern als Referenzinformation verwendet wird, wobei diese durch Elektrophorese und Messung an den markierten DNA-Proben für jeden Nukleotidtyp, an den die markierende Substanz mit bekannter Fragmentlänge als DNA-Marker zugegeben worden war, erhalten wird; iv) ein in 6 gezeigtes Verfahren, bei dem die Positionen berechnet werden, an denen Signalstärken gleich oder höher als der Schwellwert erhalten werden, aus den Signalstärken für jeden der Nukleotidtypen, die von jedem der Strömungskanäle erhalten werden, und die Mobilität korrigiert wird, indem als Indikator die Eigenschaft eines kontinuierlichen Erscheinens der Signalwerte in jedem der Strömungskanäle mit den Stärken gleich oder höher als der Schwellwert verwendet wird, da die DNA-Moleküle Polymermoleküle sind, die aus kontinuierlichen Nukleotiden aufgebaut sind; und v) ein Verfahren, bei dem eine Kombination zweier oder mehrerer der vorgenannten Verfahren i) bis iv) durchgeführt wird. Nachfolgend werden diese Methoden erläutert.
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Das in 3 gezeigte Verfahren i) beinhaltet die Schritte des Detektierens der Signalpeaks für jeden der Nukleotidtypen aus den Messsignalwerten (3a), die von jedem der Strömungskanäle an den Messapparaturen (8a, 8b) erhalten werden (3b), Durchführen eines Fittens bzw. einer Anpassung durch Vergleichen der Erscheinungspositionen jedes Nukleotidtyps basierend auf der bekannten Nukleotidsequenzinformation oder bekannter Referenzchromatgramminformation, die in dem Sequenz/detektierte Mutation-Speicher (9g) gespeichert ist, mit der Information an den Positionen, an denen die Signale mit den Stärken gleich oder höher als der Schwellwert gemessen werden, aus den für jeden Nukleotidtyp gemessenen Signalen (3c); Korrigieren der Mobilität basierend auf den Ergebnissen der Anpassung (3d) und Integrieren der von jedem der Strömungskanäle erhaltenen Daten (3e).
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Das in 4 gezeigte Verfahren ii) beinhaltet die Schritte: Durchführen einer Elektrophorese und Analysieren der vier Nukleotidtypen in ihren entsprechenden separaten Strömungskanälen bei den Messapparaturen (8a, 8b) auf die gleiche Weise wie bei dem Sequenzierverfahren, zusätzlich zur Messung für jeden Nukleotidtyp (4a); Detektieren der Peaks für jeden Nukleotidtyp aus den Messsignalen (4a) von jedem der Strömungskanäle und der Peaks für alle Nukleotidtypen aus jedem der Strömungskanäle (4b); Durchführen einer Anpassung unter Verwendung von zumindest entweder der Referenzchromatogramminformation oder Referenznukleotidsequenzinformation über die Zielproben als Referenzinformation, die basierend auf den Ergebnissen der Peakdetektion für sämtliche vier Nukleotidtypen von jedem der Strömungskanäle erhalten wird (4c, 4d); Korrigieren und Integrieren der Mobilität basierend auf dem Ergebnis der Anpassung (4e) und Integrieren der Daten von jedem der Strömungskanäle (4f).
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Das in 5 gezeigte Verfahren iii) beinhaltet die Schritte: Durchführen einer Elektrophorese und Messung der DNA-Proben, in die jeweils ein markiertes DNA-Molekül mit bekannter Fragmentlänge als DNA-Marker zugemischt worden war, bei den Messapparaturen (8a, 8b) (5a); Detektieren der Peaks von Signalwerten, die von jedem der Strömungskanäle in 5a für jeden der Nukleotidtypen erhalten wurden (5b); Durchführen einer Anpassung unter Verwendung der Positionen der DNA-Markermessung als Referenzinformation (5c); Korrigieren der Mobilität basierend auf den Ergebnissen der Anpassung und Integrieren der Daten von jedem der Strömungskanäle (5e).
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Das in 6 gezeigte Verfahren iv) beinhaltet die Schritte: Detektieren der Peaks für jeden der Nukleotidtypen aus den Signalwerten (6a) von jedem der Strömungskanäle, gemessen bei den Messapparaturen (8a, 8b) (6b); Vergleichen der Positionen und Abstände der Peaks und Berechnen von Anpassungsbedingungen, unter welchen die Überlappungen der Positionen der detektierten Peaks für vier Nukleotidtypen bezüglich der Größe minimal sind und die Peakabstände egalisiert werden (6c); Korrigieren der Mobilität basierend auf den Ergebnissen der Anpassung (6d) und Integrieren der Daten von jedem der Strömungskanäle (6e).
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Wie oben erwähnt werden, nachdem die Mobilität der Messsignale der Zielproben korrigiert wurde und die Daten integriert wurden, die Typen von Nukleotiden, welche Signale mit einer gleichen oder höheren Stärke als der Schwellwert zeigen, und die Koordinaten der Signale auf der Nukleotidsequenz mittels des unter Bezugnahme auf 9 beschriebenen Verfahrens extrahiert, um die in dem Zielbereich vorliegenden Polymorphismen umfassend zu detektieren. Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Crosstalks aufgrund von Fluoreszenzfarbstoffen, die in konventionellen DNA-Sequenziervorrichtungen ein Problem verursachen, in den detektierten Signalwerten nicht angetroffen, da eine Trennung und Detektion jedes Nukleotidtyps in physikalisch getrennten Strömungskanälen durchgeführt wird. Demgemäß kann die Existenz von Polymorphismen mit einer höheren Größenordnung der Empfindlichkeit als bei herkömmlichen DNA-Sequenziervorrichtungen nachgewiesen werden.
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Überdies ist es möglich, einen Index für den Existenzgrad von Mutationen unter Verwendung des größten und des kleinsten der an den Koordinatenpositionen gemessenen Signalwerte zu berechnen. Um die prozentuale Identität zur Referenzsequenz, erhalten aus den Zielproben unter Bezugnahme auf Nukleotidsequenzinformation, zu berechnen, kann weiterhin der Nukleotidtyp, der das Signal mit der größten Stärke unter den Signalen zeigt, wobei die Stärken gleich oder höher als ein Schwellwert sind, die von den Zielproben erhalten werden, bestimmt werden, um einen Vergleich mit der Information über die bekannte Referenznukleotidsequenz in dem Zielbereich vorzunehmen.
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Nachfolgend wird ein Beispiel des Verfahrens zur Anzeige der Analyseergebnisse gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 7 erläutert. In der Figur zeigt 7a die beispielhafte integrierte Information von jedem der Strömungskanäle nach Korrektur der Mobilität an, einschließlich der Information über die Positionen, an denen die Signale jedes Nukleotidtyps und die Information über die Stärken der detektierten Signale (7b–7e) vorliegen. Ein schwaches Signal mit einer Stärke gleich oder höher als dem Schwellwert, welches an der gleichen Abszissenposition nach Beweglichkeitskorrektur für jeden der Strömungskanäle detektiert wird, gibt die Gegenwart eines Polymorphismus an der Position des Nukleotids an. In der Figur zeigen 7f–7h ein Beispiel für die Koordinatenpositionen, wo die Existenzen von Polymorphismen nachgewiesen wurden.
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In der Figur zeigt 7i eine beispielhafte Anzeige der Ergebnisliste eines umfassenden Nachweises der in dem Zielbereich existierenden Polymorphismen an, basierend auf den Messergebnissen, die durch Integration von Daten von jedem der Strömungskanäle (7a) erhalten wurden. Wie in 7i gezeigt ist, sind die Existenzgrade von vier Nukleotidtypen, die unter den berechneten Werten Signale mit höheren Stärken als der Schwellwert zeigen, in Form einer Liste angegeben, indem Information über die Referenznukleotidsequenz entlang der Abszissenachse und die Nukleotidtypen entlang der Ordinatenachse aufgezeichnet sind. Wie in 7f–7h der integrierten Chromatogramminformation (7a) gezeigt ist, zeigen die entlang der gleichen Abszissenachse detektierten Signale die Gegenwart der Polymorphismen an den Positionen der den Signalen entsprechenden Nukleotide an. Demgemäß ist es möglich, die Existenzgrade von Polymorphismen anzuzeigen, die durch Vergleich der Nukleotidtypen existierender Polymorphismen und der Stärken der Signale an den gleichen Koordinatenpositionen (7o–7q) berechnet werden. Weiterhin kann die prozentuale Identität der Nukleotidsequenz, die von den Zielproben mit Information über die Referenznukleotidsequenz erhalten wird, berechnet werden, indem der Nukleotidtyp, welcher das Signal mit der größten Stärke von den Stärken, die gleich oder größer als der Schwellwert an den Koordinatenpositionen sind, die von den Zielproben erhalten werden, bestimmt wird, und der ermittelte Nukleotidtyp mit der bekannten Information über die Referenznukleotidsequenz in dem Zielbereich (7r) verglichen wird. Die prozentuale Identität mit der Referenznukleotidsequenzinformation spielt eine bevorzugte Rolle als Indikator zur Bestimmung, ob der gemessene DNA-Bereich mit dem beabsichtigten, zu messenden Zielbereich übereinstimmt.
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Zusätzlich zur Angabe der Ergebnisse der Messung wie in 7i gezeigt, kann das System alternativ so aufgebaut sein, dass i) die Positionen, an denen Polymorphismen nachgewiesen werden, für die Anzeige extrahiert oder verstärkt werden; ii) die Positionen bekannter Polymorphismen, die mit Erkrankungen im Zusammenhang stehen, für die Anzeige extrahiert oder verstärkt werden; oder iii) die spezifischen Koordinatenpositionen, die von einer Testperson spezifiziert werden, für die Anzeige extrahiert oder verstärkt werden. Die umfangreiche Information über Polymorphismen, die von dem Zielbereich erhalten wird, zeigt die Existenzen von winzigen Mutationen in somatischen Zellen, die durch existierende DNA-Sequenziervorrichtungen und quantitative PCR-Geräte nicht erhalten werden können. Demgemäß ist diese bei der Analyse der Korrelation zwischen den Mutationen in somatischen Zellen und Erkrankungen und für die Behandlung dieser Erkrankungen nützlich.
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Wenn die Existenzen von Polymorphismen in dem Zielgenbereich und die Existenzgrade dieser als Indikatoren für die medizinische Verabreichung oder medizinische Behandlung dienen, können die vorgenannten Ergebnisse eines umfangreichen Polymorphismusnachweises effektiv auf den Analysevorrichtungen für die medizinische Verwendung angezeigt werden, da die Richtlinie, ob diese Arzneimittel verabreicht werden können, die Dosierungen dieser Arzneimittel und die medizinische Behandlung direkt bereitgestellt wird. Überdies können die Ergebnisse der umfangreichen Polymorphismusdetektion mit anderer klinischer Information und Therapieergebnissen verglichen werden, um weitere effektive Behandlungen auszuarbeiten.
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Überdies kann ein Kit zur Analyse von Genen, welches mit Reagenzien zum Genmutationsnachweis versehen ist, welche die Nukleinsäureproben für jeden Nukleotidtyp markieren, verwendet werden, um genetische Mutationen unter Verwendung des vorgenannten Systems nachzuweisen; wobei das Kit eine Elektrophorese in den separaten Kanälen für jeden Nukleotidtyp durchführt und genetische Mutationen für jede der Nukleinsäureproben basierend auf den Chromatogrammdaten, die von dem markierten Signal für jeden Nukleotidtyp von dem entsprechenden getrennten Strömungskanal erhalten werden, nachgewiesen werden.
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Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Durchführung einer Elektrophorese und Detektion für jeden Nukleotidtyp unter Verwendung separater Strömungskanäle den Nachweis der Polymorphismen in der somatischen Zelle, die in dem zu detektierenden Zielbereich existiert, mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad zu detektieren. Weiterhin ermöglicht ein Vergleich der detektierten Stärken von Signalen die Analyse von Existenzgraden der Mutationen in somatischen Zellen. Die erhaltene umfangreiche Information über Polymorphismen in dem Zielbereich zeigt die Existenzen winziger Mutationen in somatischen Zellen, was mit existierenden DNA-Sequenziervorrichtungen oder quantitativen PCR-Systemen nicht erhalten werden kann; sie ist nützlich für die Analyse der Korrelation zwischen den Mutationen in somatischen Zellen und Erkrankungen und deren medizinischer Behandlung. Überdies ermöglichen ein Vergleich der erhaltenen Information über die Polymorphismen in der somatischen Zelllinie mit existierender Information über die Polymorphismen in der somatischen Zelllinie, klinische Informationen und das Therapieergebnis das Ausarbeiten weiterer effektiver medizinischer Behandlungen.
