JPH09318600A - Dna塩基配列決定装置 - Google Patents

Dna塩基配列決定装置

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JPH09318600A
JPH09318600A JP8160859A JP16085996A JPH09318600A JP H09318600 A JPH09318600 A JP H09318600A JP 8160859 A JP8160859 A JP 8160859A JP 16085996 A JP16085996 A JP 16085996A JP H09318600 A JPH09318600 A JP H09318600A
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JP
Japan
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gel
optical system
fluorescence
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fluorescent
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Withdrawn
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JP8160859A
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English (en)
Inventor
Hideji Fujiwake
秀司 藤分
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Shimadzu Corp
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Shimadzu Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光検出光学系の走査を不要にし、かつプリ
ズムよりも製作コストを引き下げる。 【解決手段】 発光点6で発生した蛍光は結像レンズ3
2の作用で平行光となり、分光フィルタ34a〜34d
のそれぞれの位置を特定の波長のみが通過する。波長の
異なる蛍光はミラ−38a〜38dでそれぞれ異なった
角度で反射され、結像レンズ40の異なった部分に入射
して二次元検出器42上に像を結ぶ。発光点6は紙面垂
直方向に複数個が発生するので、複数の発光点に対して
同時に検出され、検出器42上では(C)に示されるよ
うな像が検出される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は蛍光物質により標識
されたDNA断片(フラグメント)からなる複数の試料
を泳動媒体の異なる位置で同時に電気泳動させ、所定の
泳動位置で、泳動方向に直交する一直線上での蛍光を検
出してDNAの塩基配列を決定するオンライン方式のD
NAシーケンサに関し、特に、複数の蛍光標識を用いて
DNAの塩基配列を効率的に、かつ、迅速に決定する装
置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】DNAの塩基配列を決定する方法とし
て、蛍光プライマー(標識として螢光物質を化学結合さ
せたプライマー)を用いサンガーの方法で前処理された
DNA断片からなる試料を泳動媒体の異なる位置で同時
に電気泳動させる電気泳動装置が用いられる。泳動媒体
としてスラブ型ゲルを用いるものの他、ゲルを充填した
キャピラリーを複数本配列したマルチキャピラリーDN
Aシーケンサも提案されている。
【0003】その際用いる蛍光標識の種類は、1種類の
場合と複数種類の場合がある。1種類の蛍光標識の場合
は、その末端塩基の種類A(アデニン)、G(グアニ
ン)、T(チミン)、C(ヒトシン)に応じて別々の泳
動レーン又は別々のキャピラリーで泳動させる。
【0004】蛍光波長の異なる複数種類の蛍光標識を用
いた多重標識の場合には、各末端塩基別に異なる蛍光色
素で標識するか、2種類の標識色素の比率を変えること
によってコード化し、4種類の末端塩基別の試料が識別
できるようにした状態で、4種類のDNA断片を含む試
料をそれぞれの泳動レーン又はキャピラリーに注入し、
複数の泳動レーン又はキャピラリーで複数種類の試料を
同時に泳動させる。具体的には、末端塩基の異なるDN
A断片を識別するための標識物質としては、FAM、J
OE、TAMRA及びROXの4種類の発蛍光団を標識
として用いる方法(Anal. Chem. 1994, 66, 1021-1026
(以下、引用例1という)参照)や、FAMとJOEの
2種類を比率を異ならせ結合させることによりコード化
して4種類のDNA断片を識別する方法(Anal. Chem.
1992, 64, 2149-2154(以下、引用例2という)参照)
が提案されている。
【0005】複数種類の蛍光標識を用いた場合、すなわ
ち多重標識されたDNA断片を泳動させた場合、検出し
た蛍光からそれがどのDNAプラグメントに対応するも
のであるかを識別するために、従来はバンドパスフィル
タなどの光学フィルタにより蛍光を分離したり、分光器
を用いることによって蛍光のスペクトルを測定する方法
が行なわれている。
【0006】図1には光学系を走査する方式のDNAシ
ーケンサを概略的に示す。簡単のために、波長の異なる
2種類の蛍光標識を使用した場合について説明する。標
識されたDNA断片試料が泳動するスラブ型ゲル2が2
枚のガラス板の間に挾まれて形成されている。そのゲル
2に対し、レ−ザ光源4からのレ−ザ光6が照射され
る。その照射された位置をDNA断片試料8が移動した
ときに蛍光が発生する。その蛍光は、2種類の波長λ1
とλ2をそれぞれ透過させるフィルタ10aと10bに
2分割された円盤上フィルタ10を通して集光用レンズ
12で検出器14に集光されて検出される。レ−ザ光6
が照射する位置と蛍光を検出する光学系は泳動方向と直
交する方向に走査される。
【0007】この装置では、レ−ザ光6によりゲル2を
照射し、発生した蛍光を同じ側に配置された蛍光検出装
置で受光する。蛍光は2分割されたフィルタ10a,1
0bの一方を通過し、レンズ12で検出器14上に集光
される。分光フィルタ10は回転され、波長λ1とλ2
蛍光がフィルタ10aと10bを交互に通過する。
【0008】また、最近では分光フィルタの代わりにポ
リクロメ−タで蛍光を分光し、分光した蛍光を一度に二
次元検出器で検出する方式も採用されている。ただし、
この場合も泳動レ−ン全ての信号を検出するためには、
蛍光を検出する位置を泳動方向と直交する方向に走査す
る必要はある。
【0009】図2はプリズムを用いて波長分割する方式
のDNAシーケンサを概略的に示したものである。この
場合も簡単のために、波長の異なる2種類の蛍光標式を
使用した場合について説明する。スラブ型ゲル2中をD
NA断片試料が泳動し、励起光のレ−ザビ−ムはゲル2
の側面から泳動方向と直交する方向に入射させる。励起
光のライン上でDNA断片から発生した蛍光は像分割プ
リズム20で波長に応じて屈折され、分光フィルタ−2
2a,22bの特定部分(波長λ1の部分とλ2の部分)
を通過する。通過した蛍光はレンズ24の作用で二つの
検出器26a,26b上に結像し、検出される。図2の
例では、紙面垂直方向(泳動方向と直交する方向)に検
出器を複数配列することによって、走査することなしに
複数の泳動レ−ンについて同時に検出することができ
る。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】図1の検出系を走査す
る方式は、走査のための機構が必要であり、走査のため
に泳動速度を速くすることができない。図2のプリズム
で分割する方式は、プリズムでの分光により蛍光強度が
低下する。またこのようなプリズムは高価であり、装置
全体のコストを引き上げる。
【0011】本発明は蛍光検出光学系の走査を行なわな
いとともに、分光像を分割する手段としてプリズムより
光量の減少の少ない光学系を用いることにより蛍光強度
の低下を防ぎ、さらにプリズムよりも製作コストを引き
下げることを目的とするものである。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明では、ゲルからの
蛍光を検出する手段として、励起光学系により照射され
たゲルの一直線上からの光を平行光とする光学系と、そ
の平行光中で泳動方向に並列に配置された透過波長特性
の異なる複数の蛍光用分光フィルタと、分光された複数
の蛍光像をそれぞれに分割して結像する結像光学系と、
結像された各蛍光像を同時に検出する二次元的光検出装
置とを備えたものを使用する。
【0013】
【実施例】図3(A)は一実施例を概略的に表したもの
である。泳動ゲル2としてはスラブ型ゲルを用い、ポリ
アクリルアミドゲルを使用する。泳動ゲル2の上下両端
は電極槽(図示略)に浸され、両電極槽には電解液が収
容され、両電極槽間には泳動電源(図示略)によって泳
動電圧が印加される。
【0014】泳動ゲル2の一端には試料を注入するため
のサンプル投入スロットが設けられており、各サンプル
投入スロットには異なるDNA試料が投入される。DN
A試料は、例えば引用例1のように末端塩基別に異なる
蛍光物質FAM、JOE、TAMRA及びROXにより
標識された4種類のDNA断片、又は引用例2のように
2種類の蛍光物質FAM及びJOEを用いて4種類が識
別できるようにコードされた4種類のDNA断片を含む
DNA試料である。
【0015】泳動ゲル2の所定の泳動位置で、泳動方向
に直交する一直線上で、泳動ゲル2にライン状の励起光
が照射される。その励起光学系としては、次のようなも
のを使用することができる。第1の例は、励起光ビーム
がその一直線上を通過するように、泳動ゲル2の側面か
ら入射させるものである。第2の例は、励起光ビームを
ビームエキスパンダーで広げた後、シリンドリカルレン
ズにより泳動ゲル2の一直線上にライン状に収束させる
ものである。
【0016】第3の例は、励起光ビームが泳動ゲル2の
一直線に沿うように、ガルバノミラー又はポリゴンミラ
ーにより走査し、その走査された励起光ビームをfθレ
ンズによって泳動ゲル2に垂直方向から入射させるもの
である。励起光ビームを発生するために、光源としてア
ルゴンイオンレーザと、非線形光学結晶を装備したYA
Gレーザとを備えて、ダイクロイックミラーにより両レ
ーザからのレーザ光が同じ光軸上の励起光ビームとなる
ように配置する。その場合、励起光ビームを発生する方
法としては、アルゴンイオンレーザからは488nmの
レーザ光を発振させ、非線形光学結晶を装備したYAG
レーザからは532nmのレーザ光を発振させて2種類
の波長を含むレーザ光を励起光ビームとする方法と、ア
ルゴンイオンレーザのみを用い、その488nmと51
4.5nmの2種類の波長のレーザ光を同時に発振させ
て励起光ビームとする方法がある。
【0017】スラグ型ゲル2の複数のレ−ンにDNA断
片試料が注入され、同時に泳動する。試料は4種類の蛍
光色素で標識されているものとし、励起光ビームをゲル
の横方向から泳動方向に直交する方向(紙面垂直方向)
に入射させるものとする。ゲル2中を泳動してきた試料
は、ゲルの横方向から入射した励起光ビームにより発光
点6の位置で発光する。発光点6は励起光ビームが通過
する一直線上に複数存在する。
【0018】発光点6から発生した蛍光30を平行光に
するために結像レンズ32が配置されている。結像レン
ズ32は励起光ビームの通過する方向(紙面垂直方向)
に対しては集光せず、紙面内の方向で集光するものであ
り、発光点6が焦点となる位置に配置される。結像レン
ズ32によって平行光とされた蛍光中に、泳動方向に沿
って波長特性の異なる4種類の分光フィルタ34a〜3
4dが並らべられたフィルタ34が配置されている。フ
ィルタ34は図3(B)に示されたように、4種類の波
長特性の異なるものが帯状に並列配置されたものであ
る。各フィルタ34a〜34dの透過波長は塩基A,
G,C,Tを標識している蛍光色素の発光波長に対応し
たものであり、例えば波長λ1がA、λ2がG、λ3
C、λ4がTというように対応している。
【0019】フィルタ34を通過した蛍光をそれぞれ異
なった角度で反射させるミラ−38a〜38dが配置さ
れ、それらのミラ−38a〜38dで反射された蛍光を
二次元検出器42の異なった位置に結像させるために結
像レンズ40が配置されている。結像レンズ40の異な
った部分に入射した蛍光は、結像レンズ40の作用で二
次元検出器42上の異なった位置に像を結ぶ。二次元検
出器42としては、イメ−ジインテンシファイヤ−の付
いたCCDカメラ、冷却型CCDカメラ、又はCCDラ
インセンサを複数個配置したものなどを使用することが
できる。
【0020】図3の実施例の動作を説明する。発光点6
で発生した蛍光は結像レンズ32の作用で平行光とな
り、分光フィルタ34a〜34dのそれぞれの位置を特
定の波長のみが通過する。波長の異なる蛍光はミラ−3
8a〜38dでそれぞれ異なった角度で反射され、結像
レンズ40の異なった部分に入射して二次元検出器42
上に像を結ぶ。発光点6は紙面垂直方向に複数個が発生
するので、複数の発光点に対して同時に検出され、検出
器42上では図3(C)に示されるような像が検出され
る。
【0021】ミラ−38a〜38dは最適の位置を電気
的に決定できるように角度を電気駆動できるようにして
もよい。また、図3の実施例では、ミラ−38a〜38
dを4個別個に設けているが、これらを4つの曲率の異
なる部分を備えた一体ミラ−としてもよい。
【0022】
【発明の効果】本発明では蛍光検出光学系の走査を行な
わないので、機械的な走査機構が必要なく、安価にな
る。複数の測定点を同時に、かつ複数の波長を同時に検
出できるので、泳動速度に制限がない。また検出器で利
用できる光量も多い。プリズム分割方式に比べ、画像分
割系が簡単で、プリズムよりも安価に実現することがで
きる。蛍光標識の種類を5以上にして5以上の波長での
同時検出にも簡単に対応することができる。その場合に
は、1つのレ−ンに2種類以上の試料を同時に泳動させ
ることもできるようになり、より大量の試料を処理でき
るようになる。また、二次元的検出器の任意の位置に任
意の波長イメ−ジをもってくることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】従来の走査方式のDNAシーケンサを示す概略
斜視図である。
【図2】従来のプリズム分割方式のDNAシーケンサを
示す概略側面図である。
【図3】一実施例を示す図であり、(A)は全体の概略
側面図、(B)は分光フィルタを示す平面図、(C)は
二次元検出器上の結像状態を示す平面図である。
【符号の説明】
2 スラブ型ゲル 6 発光点 32 結像レンズ 34a〜34d 分光フィルタ 38a〜38d ミラ− 40 結像レンズ 42 二次元検出器

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 複数の蛍光物質により標識されたDNA
    断片からなる複数の試料を同時に電気泳動させる複数の
    泳動路を有するスラブ型ゲルを備えた電気泳動装置と、
    前記電気泳動装置の所定の泳動位置で、泳動方向に直交
    する一直線上で前記ゲルにライン状の励起光を照射する
    励起光学系と、前記励起光学系により照射されたゲルの
    一直線上を通過するDNA断片から発生する蛍光を検出
    して電気信号に変換する蛍光検出手段とを備え、その検
    出した電気信号に基づいてDNAの塩基配列を決定する
    DNA塩基配列決定装置において、 前記蛍光検出手段は、前記励起光学系により照射された
    ゲルの一直線上からの光を平行光とする光学系と、 その平行光中で泳動方向に並列に配置された透過波長特
    性の異なる複数の蛍光用分光フィルタと、 分光された複数の蛍光像をそれぞれに分割して結像する
    結像光学系と、 結像された各蛍光像を同時に検出する二次元的光検出装
    置とを備えていることを特徴とするDNA塩基配列決定
    装置。
JP8160859A 1996-05-31 1996-05-31 Dna塩基配列決定装置 Withdrawn JPH09318600A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014061146A1 (ja) * 2012-10-19 2014-04-24 株式会社日立製作所 遺伝子分析方法および遺伝子分析装置および分析用キット

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014061146A1 (ja) * 2012-10-19 2014-04-24 株式会社日立製作所 遺伝子分析方法および遺伝子分析装置および分析用キット
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Date Code Title Description
A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20040218