WO2007060002A2 - Verfahren zur individualisierten prognose, therapieempfehlung und/oder -verfolgung und/oder nachsorge einer tumorerkrankung - Google Patents

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    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a method for individualized prognosis, therapy recommendation and / or tracking and / or aftercare of a tumor disease of a patient. Such procedures are needed to obtain precise decision criteria for a given therapy or to resume therapy.
  • molecular gene expression profiles are already being used in the hospital to obtain decision criteria for a particular therapy, for example for or against cytostatic therapy or radiation therapy for a carcinoma, in particular a breast carcinoma.
  • the gene expression profile indicates which genes are activated in a tumor and which are not.
  • a therapy recommendation for the chemotherapeutic agent Hercpentin is already expressed in pressu- sion profiles.
  • tumor marker proteins of which it is known that their increased expression correlates with the occurrence of a primary tumor.
  • tumor marker genes are, for example, the genes for the estrogen receptor, the Her-2 gene as well as genes with regard to the profiling properties of the tumor.
  • Other relevant genes include dihydrofolate reductase (DHFR) for methotrexate therapy, dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD) for Xeloda therapy, and multidrug resistance genes such as MDR, ABCG2.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • DTYD dihydropyrimidine dehydrogenase
  • MDR multidrug resistance genes
  • the approach is identical for all patients or each tumor type, so due to the expression of a few predetermined tumor Markergene for all patients a consistent prognosis, therapy recommendation and the like is expressed.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the individualized prognosis, therapy recommendation and / or tracking and / or aftercare of a tumor disease of a patient. This object is achieved by the method according to claim 1.
  • a first expression profile or profile of the genomic DNA of a tumor tissue sample is now produced.
  • an overall profile is created over almost the entire or the entire human genome.
  • the inventors have an array as an examination system which makes it possible to detect the expression or the genome of approximately 28,600 human genes in which the function of the encoded protein is known.
  • a separate genome or expression profile can be created for each individual patient, which may include not only tumor marker genes but also non-tumor marker genes.
  • the profile may contain all or some of those genes or their expression from the gene expression profile first measured, which there have a gene expression that is above a predetermined threshold.
  • it is not limited to the conventional tumor marker genes, but advantageously also contains some or predominantly genes that are not considered tumor markers.
  • a further sample containing or consisting of bone marker, lymph node tissue and / or a body fluid, eg peripheral blood, urine, ascites, pleural effusion, of the patient will now be used for the prognosis, therapy recommendation and / or tracking and / or aftercare of the patient Patients studied on the profile according to the above selection.
  • a determination of the expression profile instead of the profile of the genomic DNA is always carried out in this step, while in the investigation of a tissue sample both the profiling of the genomic DNA and the expression is possible.
  • This profile can be compared to the snapshot of the biology of the tumor at the time of first diagnosis (ie, the selection from the first profile created), thus allowing individual meaningful and cost-effective follow-up of the patient.
  • a lack of further detection of the gene expression of this gene combination in the peripheral blood indicates a high probability of complete removal of the tumor.
  • a decrease in gene expression under adjuvant therapy indicates a high probability of sensitivity of the response of the therapy. If, on the other hand, gene expression is persistently or again demonstrated for a certain time for the selection of genes or a new genomic mutation associated with tumor formation, a relapse or a therapy failure is very likely to be assumed.
  • the detection of the genomic DNA profile or of the gene expression profile is carried out in principle by conventional methods described in the prior art, for example for the determination of the expression profile of the combination of a revascularized transcriptase and subsequent polymerase chain reaction after the sample has been closed. Also, the detection of individual mRNA or c-DNA thereof by means of a DNA probe array is well known in the art.
  • Figures 1 to 4 show the results of a selected example
  • FIG. 5 shows results of the same example as in FIG. 4;
  • FIG. 6 shows a report of findings and an individualized therapy recommendation resulting therefrom
  • Figure 7 shows the comparison of several measurements according to the present invention with each other.
  • FIGS. 1A to 4B show experimental measurement results for explaining the invention.
  • the figures IA, 2A, 3A and 4A are arranged side by side laterally, as well as the figures IB, 2B, 3B and 4B.
  • FIGS. 1B, 2B, 3B and 4B respectively set the columns of FIGS. 1A,
  • Figures 3A and 3B indicate the respective limits between the first and second thirds of the samples (second column in Figures 3A and 3B) and the threshold between the second third and the third third of the samples (column 3 in Figures 3A and 3B). All measured values here and also for the following figures were determined in each case according to the manufacturer-specific protocol for the named DNA array.
  • the following four columns are measurements on tissue samples of a patient.
  • the first of these four columns shows the corresponding measurements of a breast cancer specimen of the female patient from the primary tumor.
  • the dark shaded values are striking.
  • the composition of these dark-shaded markers then serves as a patient-specific expression profile in the following measurements.
  • this column is the diagnostic classification of the patient,
  • FIGS. 4A and 4B indicate the respective clinical significance for individual of these markers.
  • FIG. 5 shows the data shown in FIGS. 1 to 4 in a selection, with the expression of a gene in each of the individual FIGS. A to D being shown over the measurements t1 to t4 over time.
  • TAC therapy actually reduced its expression.
  • this does not apply to either c-erbB-2, thymidine synthetase or c-myc (see Figures 5B, 5C and 5D).
  • the mean values for a normal collective as well as the values for the patient sample are shown in these four figures.
  • FIG. 6 shows an example of how a finding report and a therapy recommendation can be determined from the determination of the gene expression status. That's how it became in the examples in FIG. 6 the hormone receptor status, the status of progression markers, the status of oncogenes such as Her-2, EGFR, c-myc etc. as well as markers for chemoresistance or for the sensitivity to specific therapeutics are investigated. From a particular expression pattern then follows a final recommendation regarding the recorded therapy, as shown under point 3 in Figure 6.
  • FIG. 7 shows that the values determined using the method according to the invention, in particular the values determined via the abovementioned DNA chip, are very reliable.
  • the same sample has been measured with respect to a total of 10 genes (PLCGl FOS), each with 5 DNA arrays. It turns out that after normalization to the signal intensity of the respective array (so-called array-normalized signal), the scattering of the measured values of the individual arrays is extremely low. In Figure 7, the two show the two show the
  • RT-PCR ribonucleic acid
  • This method is also sufficiently described in textbooks.
  • the evaluation of the DNA arrays used or the evaluation of a conventional RT-PCR thus described is carried out device-specific according to the manufacturer or also standardized according to textbook specifications.
  • RNA-stabilizing Lyser reagent Tempo Blood RNA Tube, Applied Biosystems
  • RNA isolation of the RNA is done with a 6100 workstation (Applied Biosystems) following the standard protocol given for this device.
  • the thus isolated mRNA is transcribed into cDNA by means of reverse transcriptase and amplified in a Taq-Man real-time PCR.
  • the genes selected in the original microarray analysis are those which have been found to be particularly strongly expressed in the primary tissue in the patient to be examined. It does not necessarily or necessarily only have to be marker genes / proteins known as tumor marker genes / proteins.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur individualisierten Prognose,- Therapieempfßhlung und/oder -Verfolgung und/oder Nachsorge einer Tumorerkrankung eines Patienten. Derartige Verfahren werden benötigt, um präzise Entscheidungskriterien für eine bestimmte Therapie bzw. die Wiederaufnahme einer Therapie zu erhalten. Erfindungsgemäß wird ein erstes Genomprofil oder Expressionsprofil einer ersten Probe enthaltend Tumorgewebe zum Zeitpunkt der Diagnose des Tumors erfasst wird, das den Genomstatus oder Expressionsstatus einer ersten Vielzahl menschlicher Gene enthält, für den jeweiligen Patienten für eine individuelle Auswahl an menschlichen Genen aus der Vielzahl von erfassten menschlichen Genen der Genomstatus oder Expressionsstatus gespeichert wird, zu einem späteren Zeitpunkt für die Gene der individuellen Auswahl ein weiteres Genomprofil oder Expressionsprofil einer zweiten Probe, enthaltend Lymphknotengewebe, Knochenmark und/oder eine Körperf lüssigkeit, erfasst und mit dem ersten Genomprofil oder Expressionsprofil verglichen, und aufgrund dieses Vergleichs eine Therapieempfehlung, eine Prognosebeurteilung oder eine Therapiebeurteilung durchgeführt.

Description

Verfahren zur individualisierten Prognose, Therapieempfehlung und/oder -Verfolgung und/oder Nachsorge einer Tumorerkrankung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur individualisierten Prognose, Therapieempfehlung und/oder -Verfolgung und/oder Nachsorge einer Tumorerkrankung eines Patienten. Derartige Verfahren werden benötigt, um präzise Entscheidungskriterien für eine bestimmte Therapie bzw. die Wiederaufnahme einer Therapie zu erhalten.
Heutzutage werden bereits in der Klinik molekulare Genexpressionsprofile verwendet, um Entscheidungskri- terien für eine bestimmte Therapie, beispielsweise für oder gegen eine zytostatische Therapie oder Strahlentherapie eines Karzinoms, insbesondere eines Mammakarzinoms, zu erhalten. Das Genexpressionsprofil gibt dabei an, welche Gene in einem Tumor aktiviert werden und welche nicht. Mittels derartiger Genex- pressionsprofile wird beispielsweise bereits eine Therapieempfehlung für das Chemotherapeutikum Hercεp- tin ausgesprochen.
Der gesamte Stand der Technik bezieht sich dabei durchgängig auf sog. Tumormarkerproteine, von denen bekannt ist, dass ihre erhöhte Expression mit dem Auftreten eines Primärtumors korreliert. Derartige Tumormarkergene sind beispielsweise die Gene für den Östrogenrezeptor, das Her-2-Gen sowie Gene bezüglich der Profilerationseigenschaften des Tumors. Weitere relevante Gene sind die Dihydrofolatreduktase (DHFR) für Methotrexattherapie, Dihydropyrimidin- Dehydrogenase (DPYD) für Xeloda-Therapie sowie die Multidrug-Resistance-Gene, wie beispielsweise MDR, ABCG2. Im folgenden wird eine Tabelle gegeben, die die Korrelation zwischen dem empfohlenen Therapeutikum und der Expression verschiedener Tumormarkergene angibt .
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Die Herangehensweise ist jedoch für sämtliche Patienten bzw. jeden Tumortyp identisch, so dass aufgrund der Expression einiger weniger vorbestimmter Tumor- markergene für sämtliche Patienten eine einheitliche Prognose, Therapieempfehlung und dergleichen ausgesprochen wird.
Dieser Ansatz wird jedoch der Vielfältigkeit des
Krankheitsgeschehens nicht gerecht und führt dazu, dass nur auf experimentellem Wege festgestellt werden kann, ob der jeweilige Patient auf die jeweilige vorgeschlagene Therapie auch reagiert.1
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur individualisierten Prognose, Therapieempfehlung und/oder -Verfolgung und/oder Nachsorge einer Tumorerkrankung eines Patienten zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst.
Erfindungsgemäß wird nun ein erstes Expressionsprofil oder Profil der genomischen DNA einer Tumorgewebepro- be erstellt. Idealerweise wird ein Gesamtprofil über nahezu das gesamte oder das gesamte Genom des Menschen erstellt. Hierzu steht den Erfindern ein Array als Untersuchungssystem zur Verfügung, das es erlaubt, die Expression bzw. das Genom von ca. 28.600 menschlichen Genen zu erfassen, bei denen die Funktion des codierten Proteins bekannt ist.
Auf diese Weise wird ein sehr komplexes Profil der biologischen Eigenschaften des jeweiligen Tumors er- mittelt.
Aus dieser Vielzahl von Genom- oder Expressionsinfor- mationen wird nun für eine individualisierte Therapie eine individuelle Auswahl an menschlichen Genen bzw. deren Expression erfasst. Auf diese Weise kann für jeden einzelnen Patienten ein eigenständiges Genom- oder Expressionsprofil erstellt werden, das nicht nur Tumormarkergene, sondern auch Nicht-Tumormarkergene umfassen kann. Das Profil kann sämtliche oder einige derjenigen Gene bzw. deren Expression aus dem zuerst gemessenen Genexpressionsprofil enthalten, die dort eine Genexpression aufweisen, die über einem vorbestimmten Schwellwert liegt. Insbesondere ist es nicht auf die herkömmli- chen Tumormarkergene begrenzt, sondern enthält vorteilhafterweise auch einige bzw. überwiegend Gene, die nicht als Tumormarker gelten.
Im folgenden wird nun für die Prognose, Therapieemp- fehlung und/oder -Verfolgung und/oder Nachsorge des Patienten jeweils eine weitere Probe enthaltend oder bestehend aus Knochenmarker, Lymphknotengewebe und/oder einer Körperflüssigkeit, z.B. peripheres Blut, Urin, Aszites, Pleuraerguss, des Patienten auf das Profil entsprechend der oben genannten Auswahl untersucht. Bei Untersuchung einer Blutprobe erfolgt in diesem Schritt immer eine Bestimmung des Expressi- onsprofils statt des Profils der genomischen DNA, während bei Untersuchung einer Gewebeprobe sowohl die Profilierung der genomischen DNA als auch der Expression möglich ist. Dieses Profil kann mit der Momentaufnahme der Biologie des Tumors zur Zeit der Erstdi- agnose (d.h. der Auswahl aus dem zuerst erstellten Profil) verglichen werden, und ermöglicht so eine in- dividuelle aussagekräftige und kostengünstige Nachsorge des Patienten. Dabei weist beispielsweise eine fehlende weitere Detektion der Gen-expression dieser Genkombination im peripheren Blut auf eine hohe Wahrscheinlichkeit für eine vollständige Entfernung des Tumors hin. Eine Abnahme der Genexpression unter adjuvanter Therapie spricht für eine hohe Wahrschein- lichkeit des Ansprechens der Therapie. Wird andererseits die Genexpression anhaltend bzw. nach einiger Zeit erneut für die Auswahl an Genen nachgewiesen o- der eine neue mit der Tumorbildung assoziierte geno- mische Mutation, so ist mit hoher Wahrscheinlichkeit von einein Rezidiv bzw. einem Therapieversagεn auszugehen.
Durch die Möglichkeit, das Profil einer Vielzahl von Genen (beispielsweise mittels eines High-Density Mic- roarrays mit ca. 36.500 DNA-Sonden) zu bestimmen, ist es nunmehr möglich, eine individualisierte Prognose, eine individualisierte Therapieempfehlung und/oder - Verfolgung und/oder eine individuelle Nachsorge durchzuführen. Ein derartiges Gesamtprofil eines Tumors bzw. einer Probe eines Patienten stellt zugleich auch eine Wissensbank für die Patientin dar, die für die Planung und Anwendung neuer Therapien in der Zukunft oder zu einem späteren Zeitpunkt zur Verfügung steh. Nicht zuletzt eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Targetidentifizierung neuer experimenteller Therapien.
Die Erfassung des genomischen DNA-Profils oder des Genexpressionsprofils erfolgt prinzipiell nach herkömmlichen, im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, beispielsweise für die Bestimmung des Expressionsprofils der Kombination aus einer revarsen Transkriptase und anschließenden Polymeraseketten- reaktion nach AufSchluss der Probe. Auch der Nachweis einzelner mRNA- bzw. c-DNA hiervon mittels eines DNA- Sondenarrays ist aus dem Stand der Technik ausreichend bekannt.
Im folgenden werden einige Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens an konkreten Patientendaten darge- stellt. Es zeigen
die Figuren 1 bis 4 die Ergebnisse eines ausgewählten Beispiels;
Figur 5 Ergebnisse desselben Beispiels wie in Figur 4;
Figur 6 einen Befundbericht und eine daraus sich εr- gebende individualisierte Therapieempfehlung sowie
Figur 7 den Vergleich mehrerer Messungen gemäß der vorliegenden Erfindung untereinander.
Die durch die Figuren IA bis 4B aufgebaute Tabelle zeigt experimentelle Messergebnisse zur Erläuterung der Erfindung. Dabei sind die Figuren IA, 2A, 3A und 4A seitlich nebeneinander angeordnet, ebenso die Figuren IB, 2B, 3B und 4B . Die Figuren IB, 2B, 3B und 4B setzen dabei jeweils die Spalten der Figuren IA,
2A, 3A und 4A nach unten fort. Die Zuordnung der einzelnen Zeilen ist über die Bezugszeichen 1 bis 4 in den jeweiligen Figuren angezeigt.
Erfindungsgemäß wurden mit dem DNA-Array insgesamt 93 Gene bezüglich ihrer Expression in Tumorgewebe untersucht. Die Spalten 1 bis 3 in den Figuren IA und IB sowie die nächste Spalte (Spalte 4} in der. Figuren 2A und 2B geben in dieser Reihenfolge den systematischen Namen, die Identifikationsnummer des untersuchten
Gens, das Symbol des Gens sowie das jeweilige Genprodukt an. Die folgenden drei Spalten (die ersten drei Spalten in den Figuren 3A und 3B) geben gemessene Werte für die Expression dieser Gene in Proben von insgesamt 23 Mammakarzinomen an. Die erste Spalte in den Figuren 3A und 3B gibt den Mittelwert für die Ex- pression jedes der Gene an, wobei diese Mittelwerte bereits bezüglich der unterschiedlichen Signalgrößen in verschiedenen verwendeten DNA-Arrays normiert wurden (array-normalisiertes Signal, gemäß Herstelleran- gaben ermittelt) . Sie stellen daher werte dar, die über verschiedene Arrays hinweg und auch zwischen verschiedenen Genen miteinander verglichen werden können. Die folgenden zwei Spalten in den Figuren. 3A und 3B geben die jeweiligen Grenzwerte zwischen dem ersten und dem zweiten Drittel der Proben (zweite Spalte in den Figuren 3A und 3B) und den Grenzwert zwischen dem zweiten Drittel und dem dritten Drittel der Proben (Spalte 3 in Figuren 3A und 3B) an. Sämtliche Messwerte hier und auch für die folgenden Figu- ren wurden jeweils nach dem herstellerspezifischen Protokoll für den genannten DNA-Array ermittelt.
Die folgenden vier Spalten (letzte vier Spalten in den Figuren 3A und 3B) sind Messwerte an Gewebeproben einer Patientin. In der ersten dieser vier Spalten (Probe E11709) sind die entsprechenden Messwerte einer Probe des Mammakarzinoms der Patientin aus dem Primärtumor dargestellt. Die dunkel unterlegten Werte sind auffällig. Die Zusammenstellung dieser dunkel unterlegten Marker dient anschließend bei den folgenden Messungen als Patienten-spezifisches Expressionsprofil. Oberhalb dieser Spalte befindet sich die diagnostische Einstufung der Patientin,
Im Anschluss an diese Messung der Probe aus dem Primärtumor wurde die Patientin in herkömmlicher weise mit dem TAC-Schema behandelt. Zum Zeitpunkt t2 (drittletzte Spalte in den Figuren 3A und 3B) wurde eine weitere Probe untersucht. Die entsprechenden Messwerte finden sich wiederum in der drittletzten
Spalte in den Figuren 3A und 3B . Dabei ist auffällig, dass bestimmte Markerproteine, wie beispielsweise ErbB2 zunehmend stärker εxprimiert wurden. Nach Durchführung dieser Messung' wurde zu einer Herceptin- Xeloda-Therapie gewechselt. Zu einem späteren Zeit- punkt t3 wurde wiederum Probenmaterial der Patientin untersucht, für das das Untersuchungsergebnis sich in der zweitletzten Spalte in den Figuren 3A und 3B findet. Es ist zu erkennen, dass die Herceptin-Xeloda- Therapie nicht zum gewünschten Erfolg führte (siehe beispielsweise der weitere Anstieg der Expression des ErbB2-Gens) und daher nach dieser Messung auch abgebrochen wurde. Daraufhin wurde zu einer Therapie mit dem bifunktionellen EGFR/Her2-Inhibitor gewechselt, wobei jedoch kein Therapieerfolg (siehe eben- beispielsweise die Expression des ErbB2-Gens) mehr beobachtet werden konnte, wie aus den in der letzten Spalte in den Figuren 3A und 3B zu einem Zeitpunkt t4 gemessenen Werten ersichtlich ist.
Figur 4A und Figur 4B geben für einzelne dieser Marker die jeweilige klinische Bedeutung an.
Es ist durch dieses Beispiel gezeigt, dass durch eine spezifische Auswahl von Markerproteinen bzw. deren Expression eine Aussage über die Prognose, den Therapieerfolg bzw. ganz allgemein eine Nachsorge zu einer Therapie durchgeführt werden kann. Da es sich hier um eine Studie zur prinzipiellen Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt, wurden alle Messungen (tl bis t4) mit den genannten DNA-Arrays durchgeführt. In der diagnostischen Anwendung in der Praxis werden jedoch nur die Gene des Expressionsprofils (das selbst erstmalig über ein DNA-Array ermittelt wird) wie oben beschrieben, beispielsweise mittels Multiplex-PCR, untersucht. Dies führt zu enormen Kosteneinsparungen ohne den Vorteil eines patientenspezifischen Profils aufzugeben.
Figur 5 zeigt die in den Figuren 1 bis 4 dargestellten Daten in einer Auswahl, wobei jeweils die Expres- sion eines Gens in den einzelnen Figuren A bis D im Zeitverlauf über die Messungen tl bis t4 dargestellt ist.
Für das Topoisomerase 2-alpha-Gen ist zu erkennen, dass durch die TAC-Therapie tatsächlich dessen Expression verringert werden konnte. Dies gilt jedoch weder für c-erbB-2, die Thymidin-Synthetase noch c-myc (s. Fign. 5B, 5C und 5D) . Dargestellt sind in diesen vier Figuren jeweils die Mittelwerte über ein normales Kollektiv als auch die Werte der Patienten- Probe.
Daraus lässt sich schließen, dass durch die ursprüngliche Therapie tatsächlich bestimmte Tumorklone the- rapiert wurden. Andere Klone wurden jedoch herausselektiert, wie am Verlauf der c-erbB-2-Kurve zu erkennen ist. Dort ist auch zu erkennen, dass die Hercep- tin-Therapie zwischen den Zeitpunkten t2 und t3 keinen weiteren Erfolg hatte. Der Wechsel zum bifunktio- nellen EGFR-Her2-Inhibiτ:or hatte zwar zur Wirkung, dass nunmehr der c-erbB-2-exprimierende Klon des Tumors unterdrückt wird, allerdings kann die Expression der Th*/midin—εyntheüase in zunehmenden Mengen bis zum Zeitpunkt t4 beobachtet werden. Dies gilt auch für das Gen c-myc. Im Ergebnis zeigte sich der Tumor zum Zeitpunkt: t4 therapieresiscenr gegen alle herkömmlichen Therapien.
Figur 6 zeigt ein Beispiel, wie aus der Ermittlung des Genexpressionsstatuses ein Befundbericht und eine Therapieempfehlung ermittelt werden können. So wurde bei den Beispielen in Figur 6 der Hormonrezeptorstatus, der Status der Progressionsinarker, der Status von Onkogenen, wie Her-2, EGFR, c-myc etc. sowie Mar- kεr für Chemoresistenz bzw. für die Sensitivität zu bestimmten Therapeutika untersucht. Aus einem bestimmten Expressionsmuster folgt dann eine abschließende Empfehlung bezüglich der aufzunehmenden Therapie, wie sie unter Punkt 3 in Figur 6 dargestellt ist.
Figur 7 zeigt, dass die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Werte, insbesondere die über den oben genannten DNA-Chip ermittelten Werte sehr zuverlässig sind. In Figur 7 ist dieselbe Probe in Bezug auf insgesamt 10 Gene (PLCGl FOS) mit jeweils 5 DNA-Arrays vermessen worden. Es zeigt sich, dass nach Normierung auf die Signalintensität des jeweiligen Arrays (sog. array-normalisiertes Signal) die Streuung der Messwerte der einzelnen Arrays ex- trem gering ist. In Figur 7 zeigen die beiden den
Mittelwert des Messergebnisses über die 6 Arrays und die Striche die Standardabweichung der einzelnen gemessenen Werte von diesem Mittelwert. Damit ist gezeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren über- aus zuverlässige Ergebnisse erzielt werden können.
Um den DNA-Array einzusetzen, ist es erforderlich, entweder gencraische DNA entsprechend aufzubereiten. Dies kann jedoch nach herkömmlichen Standardlaborme- thoden erfolgen. Zum anderen, sofern ein Expressionsprofil ermittelt werden soll, ist es notwendig, die mRNA auf cDNA umzuschreiben mittels einer reversen Transkription. Auch diese kann standardmäßig gemäß Lehrbuchverfahren erfolgen.
Wird als Probe mit einer Körperflüssigkeit gearbei- tet, so wird es für ein Expressionsprofil erforderlich sein, die zu dem individualisierten Patientenprofil gehörige mRNA zuvor zu amplifizieren (RT-PCR) . Auch dieses Verfahren ist in Lehrbüchern hinreichend beschrieben. Die Auswertung der verwendeten DNA- Arrays bzw. die Auswertung einer so beschriebenen herkömmlichen RT-PCR erfolgt gerätespezifisch nach Angaben des Herstellers bzw. ebenfalls standardisiert nach Lehrbuchvorgaben.
Im folgenden soll ein Beispiel für ein Nachsorgekonzept detailliert beschrieben werden.
Nachdem in einem ersten Schritt aus Primärgewebe mit- tels eines DNA-Mikroarrays ein Set von Markerprotein (Genprofil oder Expressionsprofil) bestimmt wurde, das im folgenden im Nachsorgeansatz untersucht werden soll, werden im Rahmen der Nachsorge der Patientin nach der Therapie in regelmäßigen Abständen (z.B. al- Ie drei Monate) wenige Milliliter Blut entnommen, um ein eventuelles Auftreten von Tumorzellen im Blut nachzuweisen und gegebenenfalls deren Veränderung zu erfassen. Die Blutentnahme erfolgt dabei direkt in Gefäße mit einem RNA-stabilisierenden Lyserreagenz (Tempus Blood RNA Tube, Applied Biosystems) . In diesen Gefäßen ist die RNA dann mehrere Tage bei Raumtemperatur, mehrere Wochen tiefgefroren transportfähig und haltbar.
Die Isolation der RNA erfolgt mit einer 6100 Workstation (Applied Biosystems) nachdem für dieses Gerät angegeben Standardprotokoll. Die so isolierte mRNA wird mittels reverser Transkriptasε in cDNA umgeschrieben und in einer Taq-Man Echt-Zeit PCR amplifi- ziert. Die bei der ursprünglichen Mikroarray-Analyse ausgewählten Gene (beispielsweise 4 bis 6 Gene) sind solche, die bei der zu untersuchenden Patientin im Pri- märgewebe besonders stark exprimiert gefunden wurden. Dabei muss es sich nicht notwendigerweise oder notwendigerweise ausschließlich um als Tumormarkerge- ne/Proteine bekannte Markergene/Proteine handeln.
Werden die genannten Gene (die insgesamt ein Profil bilden) bzw. deren Expression im Blut der Patientin im Lauf der einzelnen Probennahmen stärker exprimiert als im Blut von gesunden Kontrollpersonen, so deutet dies auf die Ausbreitung von Tumorzellen hin und be- einflusst das weitere Therapievorgehen.
Für die Blutentnahme und die RNA-Isolation wird im folgenden ein geeignetes Arbeitsprotokoll angegeben:
Blut Entnahme:
1) Blutentnahme (3 ml) direkt in die Tempus Blood RNA Tubes (enthalten Lyse-Puffer) ,
2) kräftig mischen für 20 sec,
3) bei Raumtemperatur bis zu 5 Tage lagern oder transportieren oder bei -20 0C für mehrere
Wochen lagern.
RNA-Isolation
6100 Workstation Protokoll „Tempus Blood RNA"
1) Blut mit Lyse-Puffer 1:1 mit PBS mischen in 50 ml-Röhrchen,
2) 30 sec vortεxen, 3) „Large Volume RNA Prep Filters" und 20 ml-Re- servoire auf der Adaptor-Platte zusammenset- zen und auf der „Waste Position" der Workstation platzieren, 4) verdünntes Blut in die Reservoirs geben und
80 % Vakuum für 500 sec anlegen, 5) frische 5 ml-Reservoirs aufsetzen und mit 4,5 ml Waschlösung 1 bis 80 % Vakuum waschen,
6) mit 4,5 ml Waschlösung 2 bis 80 % Vakuum waschen,
7) Schritte 5 + 6 wiederholen, bis alle Filter sauber gewaschen sind,
8) neues 5 ml-Reservoir aufsetzen und mit 350 μl AbsoluteRNA Waschlösung 15 min inkubieren,
9) mit Waschlösung 2 für 5 min inkubieren,
10) bei 80 % Vakuum 120 sec waschen, 11) noch zwei mal mit 3 ml Waschlösung 2 bei 80 %
Vakuum für 120 sec waschen,
12) 5 ml-Reservoir entfernen und bei 90 % Vakuum 400 sec trocknen,
13) Filterplatte in die „Collection Position" bringen,
14) mit 500 μl Elutionslösung 120 sec inkubieren,
15) bei 60 % Vakuum für 120 sec in 2 inl-Reakti- onsgefäße eluieren,
16) RNA gegebenenfalls aufkonzentrieren und Kon- zentration photometrisch messen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur individualisierten Prognose, Therapieverfolgung und/oder Nachsorge einer Tumorerkrankung eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes Genomprofil oder Expressionsprofil einer ersten Probe enthaltend Tumorgewebe zum Zeitpunkt der Diagnose des Tumors erfasst wird, das den Genomstatus oder Expressionsstatus einer ersten Vielzahl menschlicher Gene enthält, für den jeweiligen Patienten für eine individuelle Auswahl an menschlichen Genen aus der Vielzahl von erfassten menschlichen Genen der Genom- status oder Expressionsstatus gespeichert wird, zu einem späteren Zeitpunkt für die Gene der individuellen Auswahl ein weiteres Genomprofil oder Expressionsprofil einer zweiten Probe, enthaltend Lymphknotengewebe, Knochenmark und/oder eine Körperflüssigkeit, erfasst und mit dem ers- ten Genomprofil oder Expressionsprofil verglichen wird, und aufgrund dieses Vergleichs eine Therapieempfehlung, eine Prognosebeurteilung oder eine Therapiebeurteilung durchgeführt wird.
2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Genomprofil oder Expressionsprofil den Genomstatus oder Expressionsstatus von mehr als 8000 Genen, vorteilhafterweise mehr als 28000 Genen, vorteil- hafterweise mehr als 36000 Genen aufweist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Auswahl Tumormarkergene, keine Tumormarkergene oder sowohl Tumormarkergene als auch Gene aufweist, die keine Tumormarkergene sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich qualitativ und/oder quantitativ durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Genomprofil oder Expressionsprofil von Gewebe eines Primärtumors oder aus einer Probe vor Therapie der Tumorerkrankung ermittelt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Auswahl diejenigen Gene oder eine Teilmenge hiervon enthält oder daraus besteht, die gemäß dem ersten Genomprofil oder Expressionsprofil stark exprimiert werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Urin, Aszites oder Pleuraerguss enthält oder daraus besteht.
S. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gesamtpro- fil das Vorhandensein und/oder Fehlen und/oder der Allelstatus der einzelnen Gene, die in dem Genomprofil aufgenommen sind, enthält.
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