DE102006032394B4

DE102006032394B4 - Verfahren zur Diagnose und Differenzierung von Prostatakrebs

Info

Publication number: DE102006032394B4
Application number: DE102006032394A
Authority: DE
Inventors: Axel Dr. 01309 Meye; Susanne Dr. 01069 Füssel; Rainer Prof. Dr. 01445 Koch; Susanne Dr. 99425 Schneider; Manfred P. Prof. Dr. 01326 Wirth
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2011-07-07
Anticipated expiration: 2026-07-08
Also published as: DE102006032394A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Diagnose von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, die Nukleinsäure-Marker umfasst, bei dem eine Expressionsanalyse von mindestens der vier Markergene DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8, durchgeführt wird. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von TBP als Referenzmarker in den genannten Verfahren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur nicht invasiven Diagnose von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen in einem Säuger, indem mit einer dem Säuger entnommenen Probe, die Nukleinsäure-Marker umfasst, eine Expressionsanalyse von mindestens der vier Markergene DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8, durchgeführt wird. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von TBP als Referenzmarker in den genannten Verfahren.
Das Prostatakarzinom (PCa) ist bei Männern der westlichen Industrieländer die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache eines Krebstodes. Obwohl die 10-Jahres-Überlebensrate von radikal prostatektomierten Männern mehr als 90% beträgt, entwickeln 25–50% der Patienten innerhalb dieser Zeitspanne ein biochemisches Rezidiv, d. h. einen Wiederanstieg des Serumtumormarkers PSA (prostataspezifisches Antigen). Im Median geht ein solches PSA-Rezidiv einer Manifestation von Metastasen um ca. 8 Jahre voraus. Diese Metastasen verursachen unabhängig von der Therapieform in der Regel nach 2–5 Jahren einen PCa-bedingten Tod. Hinzu kommt, dass derzeit für hormonrefraktäre PCa, die nicht mehr auf eine Antiandrogenbehandlung reagieren, nur beschränkte Therapiemöglichkeiten existieren. Mikolajczyk et al. lehrt, dass durch die Bestimmung von PSA in Kombination mit der Bestimmung von anderen Biomarkern, insbesondere Kallikreinen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und zellulären Adhesionsfaktoren, die Diagnose von PCa verbessert werden kann (Mikolajczyk S. D. u. a.: Are multiple markers the future of prostate cancer diagnostics? Clin Biochem. (2004) 37(7) 519–28). Aus WO 2003/009814 A2 sind eine große Zahl von Einzelmarkern bekannt, die zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden können. US 2005/0032065 A1 lehrt die Verwendung von prognostischen Genen zur Diagnose und Prognose bei Prostatakrebspatienten. In US 2005/0095634 A1 wird die Verwendung von quantitativer Multiplex-RT-PCR zur Bestimmung von Expressionsprofilen von RNA beschrieben, wobei die RNA-Experessionsprofile zur Diagnose und Prognose bei Krebspatienten verwendet werden können.
Bei der Diagnose eines primären PCa werden zunächst der PSA-Wert im Serum, Ultraschalluntersuchungen sowie der digitale rektale Tastbefund ausgewertet, die jedoch häufig keinen zuverlässigen Tumornachweis bzw. die eindeutige Abgrenzung von einer gutartigen Prostatahyperplasie (BPH) ermöglichen.
Zur Ergänzung dieser unzulänglichen diagnostischen Methoden wurden in den letzten Jahren zunehmend Anstrengungen unternommen, neue molekulare Tumormarker zu identifizieren, die als zusätzliche Faktoren die Diagnose und Stratifizierung von Prostatakarzinomen erleichtern sollen. Die Evaluierung potenzieller Marker erfolgte anhand ihrer Expressionsmuster (Expressionshöhe und Verteilung) in Gewebeproben, die im Rahmen einer radikalen Prostatektomie (RPE) von Patienten mit primären PCa gewonnen wurden. Mit Hilfe von so genannten Microarrays wurden transkriptomweit die mRNA-Expressionsmuster unterschiedlicher Gruppen von Gewebeproben charakterisiert. Im Rahmen dieser Studien wurden beispielsweise spezifische Transkript-Signaturen bestehend aus mehreren Genen bzw. Gengruppen identifiziert, die zur Unterscheidung zwischen malignen und nicht-malignen Prostatageweben, zwischen primären und metastasierenden Tumorherden oder zwischen rezidivierenden und nicht rezidivierenden PCa herangezogen werden können. Anhand verschiedener unabhängiger Microarray-Analysen wurden u. a. folgende Kandidaten identifiziert (durch Schrägstrich gekennzeichnet sind synonym verwendete Namen): AibZIP/CREB3L4 (androgen-induced bZIP), AMACR (a-methylacyl-CoA racemace), DD3/PCA3 (differential display code 3/Prostatatakarzinom-Antigen 3), D-GPCR/OR51E1 (Dresden G Protein-coupled receptor), EZH2 (polycomb group enhancer of zeste homolog 2 gene), Hepsin, PCGEM1, PDEF (prostate-derived Ets factor), Prostein/PCANAP6ISLC45A3 (solute carrier family 45, member 3), PSGR/OR51E2 (prostate-specific G Protein-coupled receptor/olfacfory receptor, family 51, subfamily E, member 2), PSMA/FOLH1 (prostate-specific membrane antigen/folgte hydrolase), TMPRSS2 (transmembrane serine protease 2, hTMPRSS2, AC 075329) und TRPM8 (transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8). Diese Gene, die teilweise auch mit Hilfe anderer Expressionsanalyse-Methoden identifiziert wurden, besitzen auf die Prostata beschränkte und erhöhte Expression im PCa-Gewebe aus, so dass sie als molekulare PCa-Marker geeignet erscheinen.
Mit Hilfe der quantitativen ”real-time” PCR (qPCR), die eine höhere Sensitivität als Microarray-Analysen aufweist, wurden die Kandidaten-Gene in einer Vielzahl von Prostatagewebeproben untersucht und ihre Eignung als Transkript-Marker zur Detektion und Stratifizierung von PCa evaluiert. Aufgrund der bekannten tumorbiologischen Heterogenität des PCa ist die Identifizierung von einzelnen Markern mit eindeutiger und hinreichender diagnostischer Relevanz schwierig. Bisher sind nur wenige PCa-spezifische Transkripte beschrieben worden. Dazu gehört DD3/PCA3, das in verschiedenen Studien an Prostatageweben und Urinproben von PCa-Patienten als potenter Transkript-Marker erschien. Interessanterweise scheint DD3/PCA3 eine regulatorische RNA zu repräsentieren, die kein entsprechendes Protein kodiert.
Sämtliche Ansätze im Stand der Technik schlugen fehl, eine zuverlässige diagnostische Methode für Prostatakrebs zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist für eine Therapieentscheidung auch die diagnostische Klassifizierung als lokal begrenzter Tumor oder als systemische Erkrankung entscheidend, aber bisher technisch nicht realisierbar. Für die Etablierung effizienterer Therapieformen scheint es daher unabdingbar, Prognosefaktoren zu identifizieren, die über die heute bekannten hinaus eine zuverlässige Information über das konkrete maligne Potenzial des jeweiligen Tumors liefern. Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Prostatakrebs einfach, sicher und effektiv nachgewiesen werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche beinhalten bevorzugte Ausführungsformen. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe bereitgestellt, in dem eine Expressionsanalyse von mindestens der vier Markergene DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8, durchgeführt wird.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die Quantifizierung von ausgewählten PCa-spezifisch exprimierten Transkripten in einem hochsensitiven Tumornachweis resultiert, der sich durch eine deutlich erhöhte Sensitivität und Spezifität, als sie die bisher verwendeten Tumorparameter und Marker aufweisen, auszeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in Zukunft eine Unterscheidung von signifikanten und insignifikanten PCa, eine molekulargenetische Vorhersage der lokalen Tumorausbreitung sowie eine Abschätzung des Rezidiv- und Progressionsrisikos. Somit kann das Progressionsrisiko für den einzelnen Patienten präzise abgeschätzt und dann mit dem Patienten die unter den gegebenen Voraussetzungen (Alter, Allgemeinzustand, PSA-Wert, histopathologische Beurteilung der Biopsie) günstigste Strategie zur kurativen Behandlung entwickelt werden.
Biologische Proben können beispielsweise Zellen oder minimale Gewebemengen (wie z. B. Biopsien, eine diagnostische Prostata-Stanzbiopsie ist bspw. ausreichend) beinhalten und werden beispielsweise aus Prostata, Lymphknoten, Metastasen oder Körperflüssigkeiten (wie z. B. Urin, Prostatasekret und Blut sowie deren Bestandteile) gewonnen. Die Probennahme kann beispielsweise routinemäßig im Rahmen von Vorsorge- oder Screening-Untersuchungen, diagnostischen Maßnahmen oder im Einzelfall auch während bestimmter Therapiemaßnahmen beim männlichen Säuger gewonnnen werden. Vorzugsweise handelt es sich beim Säuger um einen Menschen.
Nachfolgende Standardverfahren, wie z. B. RNA-Isolation, cDNA-Synthese und anschließende quantitative PCR- oder Array-Verfahren, dienen dem Nachweis und der Quantifizierung der Transkriptzahl der ausgewählten Marker, die selektiv in der Prostata exprimiert und in Prostatakarzinomzellen gegenüber autologen Prostata-Epithelzellen überexprimiert sind.
Die gewonnenen Expressionswerte für Einzelmarker werden normiert, insbesondere auf die Expressionswerte von einem bzw. mehreren Referenz-Genen. Die Expressionswerte könnten aber auch anhand vorhandener Daten, wie z. B. einer Datenbibliothek normiert und/oder ausgewertet werden. Die entsprechend ermittelten relativen Expressionsraten werden mittels multivariater Berechnungsmodelle zur Vorhersage patientenspezifischer Parameter genutzt. Die multivariaten Modelle beinhalten vorzugsweise die relativen Expressionswerte folgender 10 humaner Transkripte oder eines Teils davon: DD3/PCA3, TRPM8, EZH2, AMACR, Hepsin, PSMA/FOLH1, PSGR/OR51E2, Prostein, PCGEM1, TMPRSS2. Diese werden anhand von zuvor festgelegten Schwellenwerten stratifiziert und dadurch in einzelne Risikoklassen unterteilt.
Die Marker für die Expressionsanalyse werden vorzugsweise so ausgewählt, dass der Gesamt-AUC-Wert (area-under-the-curve) von mindestens 0,9 in einer ROC-Kurve (receiver-operating characteristic) beträgt. Der Gesamt-AUC-Wert bezieht sich hierbei auf den AUC-Wert der Marker-Kombination. Die statistische Berechnungsmethode ist dem Fachmann bekannt (De Long et al. (1988) Biometrics 44, 837–845). AUC-Werte von 0,9 und größer werden durch bestimmte Markerkombinationen und Anzahl von Markern erreicht. Die Erfinder haben unerwartet gezeigt, dass mit der Expressionsanalyse der Marker DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8 eine besonders hohe Sensitivität und Spezifität erzielt werden kann. Für diese Kombination beträgt die Modell-Spezifität 61%, der positive Vorhersage-Wert 71% und der negative Vorhersage-Wert 93% bei einer beispielhaften Sensitivität von 95%. Damit ist nicht nur die Möglichkeit einer zuverlässigen, sondern auch einer Diagnose in einem frühen Stadium der Krankheit möglich.
Sofern die Diagnose ein Prostatakarzinom bestätigt, können sich weitere diagnostische und prognostische Verfahrensschritte anschließen. Es kann mit einer Wahrscheinlichkeit von >95% für diesen Patienten prognostiziert werden, ob der Tumor zum Untersuchungszeitpunkt auf die Prostata begrenzt ist (organconfined disease, OCD oder auch lokal begrenztes Wachstum genannt, das einem histopathologischen Stadium <=pT2b entspricht die Klassifizierung wurde anhand der TMN-Klassifizierung (UICC-System) vorgenommen). Weiterhin wird vorhergesagt, welche Prognose dem Patienten zuzuordnen ist sowie eine Indikation zur Therapie (neoadjuvant oder adjuvant) prognostiziert.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird in dem Verfahren auch eine Expressionsanalyse zur Differenzierung des Krankheitsstadiums durchgeführt. Neben der frühzeitigen Identifizierung therapiebedürftiger und insignifikanter PCa ist die Feststellung der Tumorausdehnung eine essenzielle Voraussetzung für eine Therapienentscheidung. Da vorwiegend Patienten mit einem auf die Prostata beschränkten PCa, d. h. bis zum Tumorstadium pT2, von einer RPE profitieren und Patienten mit organüberschreitenden PCa frühzeitig anderen Therapien unterzogen werden müssen, ist das ”tumor staging” von hoher Bedeutung für die PCa-Diagnose. Die Bestimmung von Expressionsprofilen im erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert die Diagnostik des Tumorstadiums gegenüber der von Prostata-Biopsien erheblich.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zwischen den Krankheitsstadien OCD (Organ-confined disease) und NOCD (non-Organ-confined disease) differenziert. Hierzu wird eine Expressionsanalyse von mindestens einem weiteren Marker, ausgewählt aus der Gruppe von AibZIP/CREB3L4, AMACR, D-GPCR, Hepsin, PCGEM1, PDEF, PSA, PSGR/OR51E2, PSMA/FOLH1 und TMPRSS2, durchführt. Das heißt, es wird zusätzlich mindestens ein Marker analysiert, der nicht der Expressionsanalyse im Rahmen der Diagnose unterzogen worden ist. Es ist bevorzugt, dass mindestens ein Marker aus der Teilmenge von D-GPCR und PSA analysiert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird zur Differenzierung der Marker D-GPCR analysiert, der einen kontinuierlichen Anstieg der Expression von OCD zu NOCD zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zur Differenzierung mindestens zwei Marker analysiert. Die Erfinder konnten überraschend feststellen, dass bei Verwendung von AMACR und DD3/PCA3 als Markern signifikante Unterschiede zwischen nicht-malignem Gewebe und Gewebeproben aus einem Tumor auftraten und eine Differenzierung zwischen OCD und NOCD möglich war.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Differenzierung der Krankheitsstadien PSA analysiert, wenn zuvor mindestens DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8 in die Diagnose involviert waren.
Es ist natürlich möglich, dass die Expressionsanalysen zur Diagnose und Differenzierung der Krankheitsstadien parallel bzw. in einem Ansatz durchgeführt werden. Ebenso ist es denkbar, dass einzelne oder alle Marker aus dem Diagnoseverfahren noch einmal zur Differenzierung zu analysieren, insbesondere wenn sich Parameter der Expressionsanalysen zur Diagnose von Parametern zur Differenzierung der Krankheitsstadien unterscheiden. Solche Parameter können beispielsweise die Primer, Temperatur, Puffer, Dauer und Anzahl der Reaktionszyklen, wie z. B. in der Amplifikation, und ähnliches umfassen.
Vorzugsweise wird die Expressionsanalyse zur Differenzierung von Krankheitsstadien mit mindestens drei Markern durchgeführt. Besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um die Marker PSA, Prostein und TRPM8. Diese Marker zeigen in den Gewebeproben von pT2-Tumoren eine signifikant höhere mRNA-Expression als in den Proben von pT3/pT4-Tumoren und den Proben der tumorfreien Areale. Daraus folgt, das im erfindungsgemäßen Verfahren eine Differenzierung anhand beliebiger Veränderungen der Expressionsniveaus der ausgewählten Marker geschehen kann. Eine direkte Proportionalität, wie sie z. B. D-GPCR aufweist, ist nicht erforderlich.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Differenzierung des Krankheitsstadiums von Prostatakrebs in einer biologischen Probe, indem man eine Expressionsanalyse von mindestens der vier Marker in der Probe DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8, durchführt.
Das Verfahren zur Differenzierung kann unabhängig von der Art des vorherigen Diagnoseverfahren angewendet werden. Sobald eine positive Diagnose auf das Vorhandensein von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen vorliegt, ermöglicht das vorliegende Verfahren eine Charakterisierung des Krankheitsverlaufs. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden die Marker PSA, Prostein und TRPM8 analysiert. In anderen Ausgestaltungen werden die Marker D-GPCR oder AMACR und DD3/PCA3 analysiert. Im Übrigen sind die vorherige Lehre der Erfindung und deren Ausführungsformen gültig und ohne Einschränkungen auf das Verfahren zur Differenzierung anwendbar, sofern es sinnvoll erscheint.
Wie bereits angedeutet, wird die Expressionsanalyse vorteilhaft im Beisein eines Referenzmarkers durchgeführt. Die Expressionsniveaus der ausgewählten Marker können in im Diagnose und/oder im Differenzierungsverfahren auf ein Referenz-Gen normiert werden. Bevorzugt werden beide Schritte normiert sowie mit dem selben Referenzmarker durchgeführt. Die Erfinder haben unerwartet gefunden, dass ausschließlich TBP (TATA-Box bindendes-Protein-Gen) vergleichbare Transkript-Mengen im Tumorgewebe verglichen mit dem korrespondierenden Normalgewebe gewährleistet, wohingegen andere häufig verwendete Referenz-Gene, wie z. B. GAPDH, HPRT und PBGD, im Tumor signifikant höher exprimiert werden.
Für die Expressionsanalysen kann erfindungsgemäß als Referenz auch eine Datenbibliothek verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von TBP als Referenzmarker in der Expressionsanalyse von Markern zur nicht invasiven Diagnose und/oder Differenzierung von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen.
Der diagnostische und prognostische Vorteil dieser molekulargenetischen Diagnostik und Prognostik i. S. d. Erfindung besteht in der hohen Sensitivität und Spezifität der Aussage, da alle einzelnen bekannten klinischen und molekulargenetischen Marker, wie z. B. Serum-PSA, vergleichsweise geringere Sensitivitäten und Spezifitäten für das PCa aufweisen. Die verschiedenen und klinisch signifikanten Kriterien – umfassend die molekulargenetische Diagnostik eines PCa, die molekulargenetische Diagnostik eines kurativ behandelbaren PCa, die molekulargenetische Prognoseabschätzung und die molekulargenetisch bestimmte Therapieindikation – werden von keinem anderen Marker oder diagnostischen/prognostischen und Therapie-entscheidenden Verfahren oder deren Kombination für das PCa gewonnen. In ihrer Breite ist diese Aussagekraft bedeutend und völlig unerwartet.
Gegenstand der Erfindung ist auch Verfahren zur Charakterisierung von Zellen in einer biologischen Probe, indem eine Expressionsanalyse von mindestens der vier Marker DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8, durchgeführt wird. [0028] Das Verfahren zur Charakterisierung von Zellen kann unter anderem zur Identifizierung von Zellen und damit auch von Geweben verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft die Charakterisierung von Prostatazellen, insbesondere primäre Prostatazellkulturen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Beispielen für konkrete Ausführungsformen näher erläutert. In den Beispielexperimenten werden Standardreagenzien und Puffer verwendet, die frei von Kontaminationen sind.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1
Es wurde an gepaarten Prostatagewebeproben von insgesamt 106 Patienten mit primären PCa eine vergleichende Studie zur Quantifizierung von 9 PCa-relevanten Transkript-Markern durchgeführt. Zuvor waren in diesen Proben die mRNA-Expressionsniveaus von 4 verschiedenen Referenz-Genen bestimmt worden, um ein geeignetes Referenz-Gen für diesen Gewebetyp zu finden. Interessanterweise zeigte nur TBP (TATA-Box bindendes Protein) vergleichbare Transkript-Mengen im Tumorgewebe verglichen mit dem korrespondierenden Normalgewebe, wohingegen die anderen häufig verwendeten Referenz-Gene GAPDH, HPRT und PBGD im Tumor signifikant höher exprimiert werden und somit nicht geeignet erscheinen (1).
Anschließend wurden die mRNA-Expressionsniveaus von 9 verschiedenen PCa-assoziierten Genen (AibZIP, D-GPCR, EZH2, DD3/PCA3, PDEF, Prostein, PSA, PSCA, TRPM8) quantitativ bestimmt und auf die TBP-Transkript-Mengen der jeweiligen Proben bezogen. Alle statistischen Berechnungen wurden mit diesen so genannten relativen Transkript-Mengen vorgenommen. Dabei zeigte sich für alle PCa-relevanten Gene außer PSCA eine signifikante Expressionserhöhung im Tumor im Vergleich zum korrespondierenden Normalgewebe, wobei für DD3/PCA3 mit einer >37-fachen Erhöhung im Median der größte Unterschied festgestellt wurde. Der Faktor der Überexpression in den Tumorproben betrug für TRPM8 im Median 3,7 sowie für AibZIP, D-GPCR, EZH2 und PDEF ca. 2 (1).
Für die PCa-relevanten Gene AMACR, Hepsin, PSGR und PSMA wurden qPCR-Assays etabliert und Expressionsanalysen an den RPE-Proben durchgeführt. Die vergleichenden Transkript-Messungen an 64 bzw. 75 Gewebepaaren zeigten, dass PSMA, PSGR, Hepsin und AMACR in den Tumorgeweben im Median 3,5- bis 9,5-fach höher exprimiert wurden als im korrespondierenden Normalgewebe (5).
Anhand der Werte für die Sensitivität und Spezifität für jedes einzelne Gewebepaar wurden für jeden Transkript-Marker so genannte ROC-Kurven (receiver-operating characteristic) zur Abschätzung seiner Eignung zum Tumornachweis berechnet. Die zugehörigen AUC-Werte (area-under-the-curve) spiegeln die Vorhersagekraft der einzelnen Marker wider, wobei DD3/PC3 mit einem AUC-Wert von 0,85 die größte prognostische Wertigkeit als Einzelmarker besitzt (3 und Tab. 3). Beispielsweise würden bei einer gewählten Sensitivität von 95% und unter Anwendung eines Ausschlusswertes von 0,4 zmol PCA3 je zmol TBP eine Spezifität von 46%, ein positiver Vorhersage-Wert von 64% und ein negativer Vorhersage-Wert von 91% resultieren. EZH2 und TRPM8 haben ebenso AUC-Werte von mehr als 0,8 (Tab. 3).
Über die Berechnung verschiedener Markerkombinationen konnte ein multivariates Logit-Modell erstellt werden, das unter Zuhilfenahme der relativen Transkript-Mengen von DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8 mit einer noch höheren Wahrscheinlichkeit die Vorhersage des Tumors im untersuchten Gewebestück erlaubt. Der entsprechende AUC-Wert von 0,90 verdeutlicht die hervorragende Eignung dieses Kombinationsmodells zum molekularen Tumornachweis (3 und Tab. 4). Anhand der entwickelten Kombinationsformel konnten für die 106 untersuchten Tumorproben mit einer mittleren Wahrscheinlichkeit von 75% das Vorhandensein von malignem Gewebe vorhergesagt werden.
In den RPE-Präparaten wurde nach Unterschieden in den Expressionsmustern der 9 gemessenen PCs-relevanten Transkript-Marker in Abhängigkeit vom Tumorstadium gesucht. Interessanterweise wiesen Prostein, PSA und TRPM8 in den Gewebeproben von pT2-Tumoren eine signifikant höhere mRNA-Expression als in den Proben von pT3/pT4-Tumoren und den Proben der tumorfreien Areale auf (4). Das relative Expressionsniveau von D-GPCR steigt kontinuierlich von OCD zum NOCD, wobei das geringste Transkript-Niveau in Tf-Gewebeproben gefunden wurde.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 2
Verfahren zum individuellen molekulargenetischen Nachweis eines Prostatakarzinoms und dessen Krankheitsverlaufes
Vorarbeiten: RPE-Biopsien
Ausgehend von den Untersuchungen und Ergebnissen zur Genexpression ausgewählter Markergene an gepaarten RPE-Gewebeproben [Schmidt U, Fuessel S, Koch R, Baretton GB, Lohse A, Tomasetti S, Unversucht S, Froehner M, Wirth MP, Meye A. Quantitative multi-gene expression profiling of primary prostate cancer. Prostate 2006; 66(14): 1521–34] wurden die etablierten Methoden in einem nächsten Schritt auf RPE-Biopsien übertragen. Dazu wurden aus operativ entfernten Organen von 11 Patienten (Tab. 5) Prostatabiopsien (simulierte Biopsien mit einem Stanzzylinder-Querschnitt von ca. 1 mm) entnommen.
Die Probenentnahme erfolgte im sofortigen Anschluss an die Operation und nach visueller Begutachtung durch einen Pathologen. Es wurden dabei je RPE-Explantat 3 vermutlich tumorhaltige bzw. visuell suspekte und in der Regel mindestens zwei vermutlich tumorfreie Stanzbiopsien (Normalgewebe) entnommen.
Die kryokonservierten Proben wurden im Anschluss aufgearbeitet (Kryomicrotom; 4 μm-Schnitte), wobei dann aus den entsprechenden Kryoschnitte die Isolation der RNA erfolgte. Über das gesamte Biopsie-Profil wurden 6 repräsentative Schnitte H&E-gefärbt und einem geschulten Pathologen zur Begutachtung vorgelegt. Somit war eine Einteilung in malignes bzw. Normal-Gewebe sowie die prozentuale Abschätzung des vorhandenen Tumorzell- und Stromalzellgehaltes möglich. Es konnten in die Studie insgesamt 26 tumorhaltige und 14 korrespondierende Normal-Gewebeproben einbezogen werden. Darüber hinaus war es möglich, die ermittelten relativen Expressionsniveaus der getesteten Transkriptmarker mit den jeweiligen Tumorstadium und der zur Studie relevanten Patientendaten in Korrelation zu bringen, die erste Aussagen über das diagnostische Potential der getesteten Transkriptmarker hinsichtlich der Vorhersage des Tumorstadiums lieferten. Außerdem konnten in den untersuchten RPE-Stanzbiopsien unter Verwendung des erstellten multivariaten Logitmodells [Schmidt U, Fuessel S, Koch R, Baretton GB, Lohse A, Tomasetti S, Unversucht S, Froehner M, Wirth MP, Meye A. Quantitative multi-gene expression profiling of primary prostate cancer. Prostate. 2006; 66(14): 1521–34] mit einer mittleren Wahrscheinlichkeit von 77% tumorhaltiges Gewebe vorhergesagt werden.
Basierend auf den Daten der genannten retrospektiven Multimarkerstudie an RPE-Gewebeproben wurden für die präsentierte Studie an simulierten Prostatabiopsien 9 Prostata- bzw. PCa-assoziierte Transkriptmarker (PSA, DD3/PCA3, TRPM8, EZH2, AMACR, Hepsin, PSMA/FOLH1, PSGR/OR51E2 und Prostein) und ein Referenzgen (TBP) ausgewählt (Tab. 6). Zur Quantifizierung der jeweiligen mRNA-Expressionsniveaus wurden die bereits etablierten qPCR-Assays herangezogen, wobei die Ergebnisse im Anschluss wiederum auf die TBP-Transkriptmenge bezogen wurden. Demnach erfolgte die statistische Auswertung auch in dieser Studie mit den so genannten relativen Transkriptmengen.
Es konnte beobachtet werden, dass mit zunehmendem prozentualem Tumorzellgehalt in den Gewebeproben eine Erhöhung der relativen mRNA-Expressionen zu detektieren war, wohingegen der zunehmende Stromazellgehalt einen entgegengesetzten Effekt hatte.
Zusammenfassend lässt sich in Bezug auf die quantifizierten mRNA-Expressionsniveaus sagen, dass für eine umfassende Auswertung aller 9 getesteten Prostata- bzw. PCa-assoziierter Markergene ausreichende Transkriptmengen in den simulierten Prostata-Biopsien zu detektieren waren.
Unterschiede gab es vor allem in der Konzentration, mit der ein Transkript in den jeweiligen Gewebeproben überexprimiert wurde. So konnten mit AMACR und PSA zwei Gene detektiert werden, deren Expression deutlich über der der anderen Transkriptmarker lag. EZH2 und Hepsin zeigten dagegen ein deutlich vermindertes Expressionsniveau. Weiterhin war für mindestens 7 Gene (AMACR, DD3/PCA3, EZH2, Hepsin, PSGR/OR51E2, PSMA/FOHL1 und TRPM8) ein signifikanter Unterschied zwischen tumorhaltigem (Tu) und tumorfreien (Tf) Gewebe erkennbar. So wurde bei AMACR im Tu-Gewebe im direkten Vergleich zum Normalgewebe eine 23fach höhere Expression detektiert (Tab. 5 und 7). Ähnlich signifikante Unterschiede wurden auch für PSMA/FOLH1 (10fach) und DD3/PCA3 (20fach) beobachtet (Tab. 5 und 7). Dies unterstreicht auch in dieser Studie das mögliche diagnostische Potenzial dieser Transkriptmarker. Prostein und Hepsin zeigten im Gegensatz dazu nur sehr geringe Expressionsunterschiede zwischen malignem vs. nicht-malignem Prostatagewebe. Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt ist die Korrelation der auf die Transkriptmenge des TBP normalisierten Expressionsniveaus der ausgewählten Transkriptmarker mit den entsprechenden pathologischen Tumorklassifizierungen der einzelnen Patienten. Dabei steht vor allem die Abgrenzung zwischen Tu- vs. korrespondierendem Tf-Geweben und die Unterscheidung zwischen organbegrenztem (OCD) und organüberschreitendem Tumorwachstum (NOCD) im Vordergrund. Mit AMACR und DD3/PCA3 konnten anhand der Untersuchungen an RPE-Stanzbiopsien zwei Transkriptmarker charakterisiert werden, mit denen solche Effekte ansatzweise gezeigt werden können (8, Schneider S, Fuessel S, Zenker M, Lohse-Fischer A, Haase M, Toma MI, Koch R, Meye A, Baretton GB, Wirth MP. Diagnostic potential of prostate cancer-associated transcript signatures in simulated prostate needle biopsies. Cancer letters. In Revision). Hier fällt vor allem der signifikante Unterschied zwischen nicht-malignem Gewebe und den Gewebeproben aus einem organbegrenztem PCa (OCD; pT2) auf. Nur eine Abgrenzung zwischen organbegrenztem Tumorwachstum und der Ausdehnung dieser Malignität über die Prostata hinaus konnte, zumindest bezüglich der Transkriptmarker als Einzelkandidaten, nicht gezeigt werden.
Ein nächster Schritt in der Etablierung der molekulargenetischen PCa-Diagnostik sieht die Übertragung der Methoden auf diagnostische Prostata-Biopsien vor. Diese werden dem Patienten in der Regel nach Detektion eines erhöhten Serum-PSA-Spiegels zum eindeutigen, pathologischen Tumornachweis entnommen. Dabei stehen der Vergleich der Quantifizierungen der Transkriptmengen geeigneter Markergene in diesen Gewebeproben mit den bereits erhaltenen Daten aus RPE-Geweben und – Stanzbiopsien sowie die Absicherung der bereits postulierten Potentiale zur Tumor-Vorhersagbarkeit auf der Grundlage des multivariaten Logit-Modells im Vordergrund.
Laufenden prospektive Untersuchungen mit diagnostischen Prostatabiopsien zeigen, dass dieses Verfahren parallel zur Histopathologie am identischen Probengut erfolgen kann, woraus ein additives molekulares Tumorstaging abgeleitet wird (unveröffentlichte Daten).
Darüberhinaus gibt es erste Hinweise, die Belegen, dass eine solche Transkriptquantifizierung auch zur Charakterisierung von primären Prostatazellkulturen, die im Rahmen von Prostatektomien oder Biopsienahmen angezüchtet werden können, geeignet ist (unveröffentlichte Daten).
In ihrer Gesamtheit bedeuten die bisher retrospektiv und prospektiv gewonnenen Daten eindeutig darauf hin, dass das postulierte Verfahren zum individuellen molekulargenetischen Nachweis eines Prostatakarzinoms sehr spezifisch und genau ist.
Figurenbeschreibung:
1 zeigt Boxplots von mRNA Expressionslevels verschiedener Referenzgene. Gezeigt ist die Verteilung der log-transformierten Transkriptionslevels von vier verschiedenen Referenzgenen (normalisiert auf den mRNA Gehalt) in korrespondierenden malignen (Tu) und nicht malignen (Tf) Prostatagewebeproben aus 106 Patienten mit primären PCa. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mittelwerte sind als Strichellinien und die Mediane als durchgezogenen Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen. Statistische Unterschiede wurden mit einem ungepaarten t-Test berechnet.
2 zeigt die unterschiedliche Expression von Prostata zugehörigen Genen in nicht malignen (Tf) und malignen Prostatageweben (Tu). Zur Bestimmung der individuellen Expression der Prostata zugehörigen Gene (normalisiert auf die Transkriptmenge TBP) wurde das Verhältnis Tu:Tf der gepaarten Gewebeproben berechnet. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mediane sind als durchgezogenen Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen.
3 zeigt den Vergleich des univarianten Modells für PCA3 mit dem Logit-Modell basierend auf 4 Genen. Die ROC-Kurven werden für PCA3 als Einzelmarker (AUC = 0,85) und im Vergleich dazu für das Multivarianten-Logit-Modell bestehend aus EHZ2, PCA3, Prostein und TRPM8 (AUC = 0,90) gezeigt.
4 zeigt die Korrelation der relativen mRNA Expressionslevel von Prostein, PSA und TRPM8 mit T Stadium (Tumor Stadium). Die log-transformierten relativen Expressionslevel von Prostein, PSA und TRPM wurden für Tf (n = 106), OCD (n = 59) und NOCD (n = 47) durch einen ungepaarten t-Test verglichen. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mittelwerte sind als Strichellinien und die Mediane als durchgezogenen Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen.
5 zeigt den Vergleich der relativen Transkript-Mengen von AMACAR, Hepsin, PSGR und PSMA in Prostatagewebe-Paaren. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mittelwerte sind als Strichellinien und die Mediane als durchgezogenen Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen. a) Dargestellt wurden die logarithmierten Werte der relativen Expressionsniveaus von AMACR, Hepsin, PSGR und PSMA (bezogen auf das Referenz-Gen TBP). Die relativen Transkript-Mengen der vier Marker sind im PCa-Gewebe (Tu) signifikant erhöht (gepaarter t-Test: p < 0,001). b) Beim paarweisen Vergleich über die Berechnung der Tu:Tf-Verhältnisses wurde im Median eine 9,5-, 6,2-, 6,1- bzw. 3,5-fache Expressionserhöhung im Tumor gemessen.
6 zeigt Beispiele der ermittelten Unterschiede der Expressionsmuster (relative Expressionswerte, normiert auf das Referenz-Gen TBP) für einzelne Transkripte, ermittelt an simulierten Stanzbiopsien am radikalen Prostatektomie-Präparat. Die Unterschiede zwischen organbegrenzten (organ-confined disease, CCD, <=pT2) und organüberschreitenden PCa (non-organ confined disease, NOCD, pT3 oder pT4) untereinander und im Vergleich zu den Ergebnissen der autologen tumorfreien (Tf) und der Gesamtheit der tumorhaltigen Biopsien (Tu).
7 zeigt die relative mRNA-Expressionen von AMACR, PSMA/FOLH1 und DD3/PCA3 in Tu- vs. Tf-Gewebeproben. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mediane sind als durchgezogene Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen.
8 zeigt die relative mRNA-Expressionen von AMACR und DD3/PCA3 in Abhängigkeit der Tumorklassifizierung. Die Boxen in den Boxplots repräsentieren die 25.–75. Perzentile. Die Mediane sind als durchgezogene Linien dargestellt. Weiße Kreise markieren Ausreißerwerte außerhalb der 10. und 90. Perzentilen.
Tabellenbeschreibung:
Tab. 1 zeigt eine Liste der verwendeten Hybridisierungsprimer und Hybridisierungssonden für das qPCR Assay. Abkürzungen: FL (Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein), Red640 (Fluoreszenzfarbstoff LC red640), PH (phosphoryliertes 3'-Ende), FAM (6-Carboxy-Fluorescein), XT (6-Carboxytetramethylrhodamin).
Tab. 2 zeigt die relativen Transkriptionslevel von Prostata zugehörigen Genen in Prostatagewebe und Prostatazelllinien. * Werte der Prostata zugehörigen Gene sind als gemessene relative Expressionslevel (zmol Gen/zmol TBP) angegeben. Abkürzungen: max – Maximum, min – Minimum, n. d. – (Transkript) nicht detektierbar
Tab. 3 zeigt die Berechnung der AUC Werte für relative Expressionslevel von Prostata zugehörigen Genen über die ROC-Analyse. * Werte der Prostata zugehörigen Gene sind als gemessene relative Expressionslevel (zmol Gen/zmol TBP) angegeben. Abkürzungen: s. e. – Standartfehler, 95% Cl–95% Vertrauensintervall
Tab. 4 zeigt die Diagnostischen Vorhersage von Prostata Tumoren mittels eines Logit-Modells. Es wird ein Rechenbeispiel für Patient #1 dargestellt. In diesem Fall ist die Wahrscheinlichkeit p für malignes Gewebe durch die folgende Transformation berechenbar. p = exp(logit)/[1 + exp(logit)] = exp(2,298)/[1 + exp(2,298)] = 0,909 = 90,9% * Verwendete Schnittpunkte sind als gemessene relative Expressionslevel (zmol Gen/zmol TBP) angegeben. Abkürzungen: s. e. – Standardfehler, p Ausläuferbereich der Wahrscheinlichkeit der Teststatistik, OR Chancen-Verhältnis 95%Cl–95% Vertrauensintervall
Tab. 5 zeigt ausgewählte Patienten mit primärem PCa

Tab. 6 zeigt die relativen Expressionsnivaus ausgewählter Prostata- bzw. PCa-assoziierter Markergene in RPE-Gewebeproben und in der PCa-Zellinie LNCap [zmol Gen/zmol TBP] Tabelle 1

Tabelle 3

Gen*	AUC	s. e.	95%Cl
AibZIP	0.767	0.078	0.615...0.919
D-GPCR	0.645	0.069	0.510...0.781
EZH2	0.814	0.082	0.654...0.974
PCA3	0.851	0.085	0.685...1.018
PDEF	0.765	0.078	0.612...0.918
prostein	0.554	0.059	0.438...0.669
PSA	0.630	0.066	0.501...0.760
PSCA	0.516	0.059	0.401...0.631
TRPM8	0.813	0.082	0.652...0.974

Tabelle 4

Tabelle 5

	Alter	PSA-Wert	TMN-Klassifizierung (UICC-System)	Gleason-Score
11 Patienten	51 bis 71 Jahre (Medien: 66 Jahre)	1,29 bis 24,32 ng/ml (Medien: 6,9 ng/ml)	7 Patienten: organbegrenztes Tumorwachstum (OCD; pT2) 4 Patienten: nicht-organbegrenztes Tumorwachstum (NOCD; pT3/pT4)	2 Patienten: GS 2 bis 6 (niedrig) 8 Patienten: GS 7 (mittel) 1 Patient: GS 8 bis 10 (hoch)

Tabelle 6

	Prostatagewebe		Prostatakaninom-Zelllinie
Markergene	tumorhaltig (Tu)	tumorfrei (Tf)	LNCaP
	Median (min. zu max.)	Median (min. zu max.)	Mittelwert
AMACR	2104.55 (25.42 to 4800.21)	91.65 (5.39 to 640.15)	25.83
EZH2	0.80 (0.13 to 1.81)	0.17 (0.00 to 1.22)	4.48
Hepsin	0.38 (0.20 to 1.08)	0.12 (0.00 to 0.80)	0.05
PSA	174.36 (26.79 to 1395.15)	78.18 (0,23 to 737,03)	5.38
PSGR/OR51E2	47.67 (2.15 to 222.90)	8.80 (0.18 to 313.41)	0.02
PSMA/FOLH1	25.87 (1.70 to 221.52)	2.49 (0.00 to 72.58)	24.83
DD3/PCA3	36.45 (5.39 to 166.30)	1.67 (0.04 to 34.36)	0.19
Prostein	8.74 (0.91 to 46.97)	6.99 (0.0 to 45.31)	1.54
TRPM8	31.71 (6.82 to 218.05)	6.95 (0.1 to 58.74)	1.99

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Detektion von Prostatakrebs und/oder Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, indem eine Expressionsanalyse mindestens der vier Markergene differential display code 3/Prostatakarzinom-Antigen 3 (DD3/PCA3), polycomb group enhancer of zeste homolog 2 gene (EZH2), Prostein und transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8 (TRPM8) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Körperflüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe eine Biopsie ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe aus Prostata, Lymphknoten oder Metastasen stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Urin, Prostatasekret, Blut oder Blutserum ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Expressionsanalyse eines Referenzmarkers durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Transkript des TATA-Box-bindendes-Protein-Gens (TBP) als Referenzmarker eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsanalysen parallel durchgeführt werden oder in einem Ansatz durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsanalysen mittels quantitativer PCR- oder Array-Verfahren durchgeführt werden.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Diagnose von Prostatakarzinom, zur Unterscheidung von signifikantem von insignifikantem Prostatakarzinom, zur Abschätzung des Rezidiv- und Progressionsrisikos, zur Charakterisierung von Prostatazellen, insbesondere primäre Prostatazellkulturen, und/oder zur Differenzierung von Krankheitsstadien des Prostatakarzinoms.
Kit für den Nachweis der Expressionsprodukte von DD3/PCA3, EZH2, Prostein und TRPM8 bestehend aus einem oder mehreren Primern und/oder Sonden ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäuren mit den SEQ ID Nr. 21–24, 25–27, 31–34 und 43–46, wobei die Nukleinsäuren die Modifikationen gemäß Tabelle 1 umfassen.
Kit nach Anspruch 11 zusätzlich enthaltend einen oder mehrere Primer und/oder Sonden ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäuren mit der SEQ ID Nr. 9–12, wobei die Nukleinsäuren die Modifikationen gemäß Tabelle 1 umfassen.