DE69919005T2

DE69919005T2 - Methode zur erhaltung von menschlichen dna hautproben mittels einer adhesiven folie

Info

Publication number: DE69919005T2
Application number: DE69919005T
Authority: DE
Inventors: Bo Yeon CHUNG; Hong Choon HWANG; Young Eun KIM
Original assignee: I D Gene Inc
Current assignee: I D Gene Inc
Priority date: 1998-09-23
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: DE69919005D1; EP1115883A1; WO2000017396A1; AU5763999A; ATE272124T1; ES2226434T3; KR20000023256A; EP1115883B1; KR100326937B1; US6355439B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Verfahren zur Erhaltung von DNA-Proben unter Verwendung einer adhäsiven Folie und im Besonderen ein Verfahren zur Erhaltung von DNA-Proben aus menschlichen Epidermisfragmenten, die mit Hilfe einer adhäsiven Folie entnommen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch kombinierte Folien zur Aufbewahrung von DNA sowie eine Ausrüstung zur Erhaltung von DNA aus Epidermisfragmenten.
BISHERIGER STAND DER TECHNIK
Das genetische DNA (Desoxyribonukleinsäure)-Material stellt die Gene dar, die die Synthese der Zellkomponenten und -stoffwechsel aller Lebewesen kodieren. Die großen Fortschritte der Biomedizin in der letzten Hälfte des 20. Jahrhunderts, die das Genom-Projekt einschließen, lassen vorhersehen, dass die genetische Analyse der Allgemeinheit zugänglich gemacht werden wird.
Als eine Konsequenz des Genom-Projekts sind wir in der Lage, die gesamte genetische Information der menschlichen DNA zu lesen, und die für Erbkrankheiten verantwortlichen oder an diesen beteiligten Gene sind eines nach dem anderen entdeckt worden. Außerdem können genetische Abnormitäten jetzt auf der Ebene der Nucleotidsequenz verstanden werden. Dementsprechend sind auf Grund der Kenntnis der an Krankheiten beteiligten Gentypen Patienten in die Lage versetzt, geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu ergreifen, und Ärzte können adäquate Rezepte und Behandlungen verschreiben.
Da die DNA in jeder Zelle allgegenwärtig und der DNA-Typ bei jedem Individuum zu unterscheiden ist, wurden Verfahren der genetischen Identifikation (oder DNA-Profilierung) entwickelt, mit Hilfe derer Individuen auf Genebene voneinander unterschieden werden können. Auf Grund ihrer Genauigkeit gilt die Genidentifikationstechnik als das beste Werkzeug auf Gebieten wie den forensischen und Vaterschaftsbestimmungstests. In der Praxis wurden im Vereinigten Königreich und in den Vereinigten Staaten DNA-Profildatenbanken für Häftlinge entwickelt und dazu verwendet, Verdächtige mit Hilfe von Computern durch den Vergleich von DNA-Profilen, die aus Beweismaterial der Kriminalszene stammen, zu überprüfen.
Sowohl zur Diagnostik von Krankheiten als auch zur Genidentifikation wird die DNA üblicherweise aus dem Blut gewonnen. Die Entnahme von Blutproben für DNA-Profile ist indessen aus folgenden Gründen problematisch:
Erstens muss die Blutprobenentnahme von Fachpersonal wie Ärzten und Krankenschwestern durchgeführt werden.
Zweitens ist die Blutprobenentnahme für Testpersonen mit Unannehmlichkeiten verbunden.
Drittens besteht immer die Möglichkeit, dass die mit Blut umgehenden Personen mit Krankheiten, wie z. B. Hepatitis oder AIDS infiziert sind.
Viertens kann eine Blutprobenentnahme aus Gründen des Alters, der Gesundheit, Religion usw. unmöglich sein.
Fünftens ist eine Blutprobenentnahme mit Problemen der Handhabung verbunden. Weil eine direkte Identifikation der Testperson allein durch die von ihr entnommene Blutprobe nicht möglich ist, müssen nämlich außerdem Lichtbilder von ihr angefertigt und Fingerabdrücke abgenommen werden, um eine zuverlässige Übereinstimmung von Blutspender und Testperson zu gewährleisten, und relevante Personen, die die Proben entnehmen, überbringen und analysieren, stellen die Kette der Verwahrungsdokumente zusammen. Der FBI der USA hat z. B. eine Richtlinie aufgestellt, die besagt, dass jeder, der an irgendeinem Punkt an dieser Kette der Verwahrung beteiligt ist, diese Beteiligung, einschließlich Überbringung oder Behandlung von Blutproben, durch seine Unterschrift oder auf sonstige Weise bezeugen muss. Die Sicherung wird verdoppelt durch die Markierung der Blutproben (Technische Arbeitsgruppe zu DNA-Analyseverfahren, „Richtlinien für ein Qualitätssicherungsprogramm für die DNA-Analyse", Crime Laboratory Digest, 22:21-43, 1995).
Sechstens gilt eine erzwungene Blutprobenentnahme zum Zweck des Vollzugs von Gesetzen in den USA als Verstoß gegen die Verfassung (Lehrman, Nature 394:818, 1998).
Um solche Nachteile zu überwinden, wurde vor kurzem ein Versuch unternommen, Mundepithelzellen anstatt von Blut zu verwenden. Die Mundepithelzellen bieten Vorteile gegenüber Blutproben aus verschiedenen Gesichtspunkten. Jedoch sind ähnlich komplizierte Verfahren, Dokumente und Zeugnisse wie im Fall von Blutproben notwendig, um die zuverlässige Übereinstimmung eines Probenspenders mit einer bestimmten Testperson zu gewährleisten. Außerdem zeigen die Testpersonen eine Abneigung gegen die Entnahme von Epithelzellen innerhalb des Körpers.
OFFENLEGUNG DER ERFINDUNG
Die intensive und gründliche Forschung zur genetischen Identifikation, die die Autoren vorliegender Erfindung immer wieder angestellt haben mit dem Ziel, die üblichen Probleme, die bei der Entnahme von Blut- oder Mundzellenproben auftreten, zu überwinden, führte zu dem Ergebnis, dass die Epidermis eine ideale DNA-Quelle sein könnte und dass DNA-Material in einer für eine DNA-Analyse ausreichend großen Menge aus der Epidermis entnommen werden könnte unter Benutzung einer adhäsiven Folie mit dem Vorteil, dass keine weiteren gesonderten Identifikationsmaßnahmen notwendig sind. Dies bedeutet, dass, wenn DNA aus der Epidermis von Fingern, Handinnenflächen, Fußsohlen oder Zehen unter Benutzung von adhäsiven Folien erhalten wird, ausreichende Mengen an DNA zusammen mit den Finger-, Handinnenflächen-, Fuß- oder Zehenabdrücken auf den adhäsiven Folien haften bleiben, die es ermöglichen, den Spender der DNA-Proben immer individuell zu erkennen, ohne Lichtbilder anzufertigen oder andere Identifikationsverfahren anzuwenden. Da sich die an der erfindungsgerechten adhäsiven Folie haftenden Epidermisfragmente in trockenem Zustand befinden, kann die DNA in den Fragmenten über einen langen Zeitraum stabil konserviert werden. Zusammen mit den auf die adhäsive Folie aufgedruckten Abdrücken können DNA-Profile, die aus der an der Folie haftenden Epidermis gewonnen werden, zur Identifizierung unbekannter Leichnamen, zu Vaterschaftsbestimmungstests, Untersuchungen zu Erbkrankheiten usw. verwendet werden.
Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, den oben genannten, bei der bisherigen Technik auftretenden Problemen abzuhelfen und ein Verfahren zur Erhaltung von DNA anzubieten, bei welchem die DNA-Probenentnahme und Identifikation einer Testperson gleichzeitig erfolgen kann.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Mittel zur Erhaltung oder Aufbewahrung von DNA-Proben von Individuen oder einer Population zu liefern.
Ein Aspekt dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Erhaltung menschlicher DNA zur genetischen Analyse anzubieten, das den Schritt der Extraktion der DNA aus der auf der adhäsiven Folie klebenden Epidermis umfasst, wobei die Epidermis von einer Testperson mittels einer adhäsiven Folio entnommen wird.
Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur genetischen Analyse unter Benutzung von menschlicher DNA anzubieten, das die folgenden Schritte umfasst: Visualisierung des Epidermisabdrucks als ein Bild, wobei die Epidermisfragmente aus der Haut einer Testperson unter Benutzung einer adhäsiven Folie entnommen wurden, Aufzeichnung des Bildes in einem optischen oder elektronischen Medium, Extraktion der DNA aus den auf der adhäsiven Folie klebenden Epidermisfragmenten und Messung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der DNA.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Entnahme von Epidermis oder Aufbewahrung von DNA anzubieten, das auf kombinierten Folien haftende Haut umfasst, wobei die kombinierten Folien eine adhäsive Folie und eine Schutzfolie zum Schutz einer adhäsiven Oberfläche der adhäsiven Folie umfassen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, eine Ausrüstung zur Entnahme von Epidermisfragmenten oder zur Extraktion von DNA anzubieten, die ihrerseits eine Kristallviolettlösung und mindestens einen Satz kombinierter Folien umfasst, der eine adhäsive Folie und eine Schutzfolie zum Schutz einer adhäsiven Oberfläche der adhäsiven Folie beinhaltet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben genannten und weitere Ziele, Merkmale und weitere Vorteile dieser Erfindung werden klarer verständlich durch folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen, die folgendes darstellen:
1 zeigt eine Struktur einer adhäsiven Folie zur Entnahme von Epidermis gemäß dieser Erfindung.
2 ist das Bild eines Handinnenflächenabdrucks, der in einen Computer eingegeben wurde, nachdem er auf eine adhäsive Folie abgefärbt worden war.
3 zeigt Bilder von Fingerabdrücken, die vom Bild des Handinnenflächenabdrucks vergrößert wurden.
4 zeigt Elektropherogramme, die den Einfluss der verschiedenen Faktoren veranschaulichen, die zur DNA-Isolierung bei der DNA-Analyse eingesetzt werden.
5 zeigt Elektropherogramme, die die Auswirkung der zusätzlichen Reinigung durch Sephadex G-50 Chromatographie auf die Entfernung von Hemmstoffen darstellen.
6 zeigt die indirekte Quantifikation der Epidermis-DNA, die aus einem 1,5 cm × 0,5 cm großen Stück adhäsiver Folie extrahiert wurde.
7 zeigt Elektropherogramme, die veranschaulichen, dass DNA-Analyse unmöglich ist, wenn die Epidermis mittels eines nicht adhäsiven Papiers oder einer adhäsiven Folie mit nur einer filmbeschichteten Seite entnommen wurde.
8 zeigt allele Merkmale in drei kurze Wiederholungssequenz-Loci (short tandem repeats = STRs) und ein Amelogeningen als Resultat eines Vaterschaftstests, wobei neun STRs und das Amelogeningen durch multiplexe PCR [Polymerase-Kettenreaktion] amplifiziert werden und aus der adhäsiven Folie isolierte DNA als Matrize verwendet wird.
9a zeigt eine Nucleotidsequenz eines ACE (angiotensinogen converting enzyme)-Gens, das erhalten wird, indem aus Blut isolierte DNA verwendet wird.
9b zeigt eine Nucleotidsequenz desselben ACE-Gens, das aus der Sequenzierung der DNA resultiert, die unter Benutzung der erfindungsgerechten adhäsiven Folie erhalten wird, und
9c zeigt eine Nucleotidsequenz einer F13A01-Region, die bestimmt wird durch Benutzung der mittels einer adhäsiven Folie erhaltenen DNA.
BESTE DURCHFÜHRUNGSMODI DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGEN
Bei der vorliegenden Erfindung kann DNA aus der Epidermis sichergestellt werden. Zu diesem Zweck wird eine adhäsive Folie benutzt, um Epidermisfragmente zu erhalten, die DNA-Quellen darstellen. Das heißt, DNA wird aus Epidermisfragmenten extrahiert, die auf einer adhäsiven Folie kleben.
Ein Aspekt dieser Erfindung besteht also darin, ein Verfahren zur Erhaltung von DNA aus Epidermis unter Benutzung einer adhäsiven Folie anzubieten.
Die Begriffe „Epidermis oder Epidermisfragment" bedeuten, wie sie hier verwendet werden, Gewebe, die auf der Oberfläche menschlicher oder tierischer Haut existieren oder davon abgesonderte Materialien, die erfindungsgemäß als DNA-Quelle, aus welcher DNA extrahiert werden kann, verwendet werden.
Der Begriff „adhäsive Folie", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine folienähnliche Struktur, bei der ein adhäsiver Wirkstoff auf mindestens eine Oberfläche eines Trägers aufgetragen ist. Eine erfindungsgemäß nützliche adhäsive Folie besteht hauptsächlich aus einem Träger und einem darauf aufgetragenen Klebstoff, wie in 1 dargestellt. Der Träger besteht aus festem Material, das in eine folienähnliche Form gebracht und mit einem Klebstoff beschichtet werden kann. Als Beispiele der erfindungsgerecht verfügbaren Trägermaterialen sind Papier, synthetische Harze wie Zellulose, Polypropylen, Polyethylen und PVC, Fasern wie die in Heftpflastern Verwendeten und Metalle wie Aluminium zu nennen.
Grundsätzlich wird die adhäsive Folie durch Auftragen einer klebenden Substanz auf eine Seite des Trägers hergestellt. Wahlweise können die gegenüberliegenden Seiten eines Trägers mit einem Klebstoff beschichtet sein, während eine der beiden Seiten z. B. mit einer nichtfaltbaren Kunststoffplatte unterlegt sein kann.
Besteht der Träger aus Papier, werden seine beiden Seiten vorzugsweise mit einem unlöslichen Film beschichtet, weil bei der DNA-Extraktion verschiedene Hemmstoffe aus dem Papier freigegeben werden.
Klebstoff und Beschichtungssubstanzen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Entnahme der DNA aus der Epidermis (siehe 7). Wird die Epidermis unter Benutzung eines Papiers ohne Adhäsionsmittel entnommen, ist es praktisch unmöglich, DNA zu erkennen, selbst nach Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit fluoreszenz- oder radiomarkierten Primern. Man nimmt an, dass unbeschichtete oder einseitig beschichtete adhäsive Folien Epidermisfragmente in demselben Maße aufnehmen wie beidseitig beschichtete adhäsive Folien, dass aber Hemmstoffe gegen die DNA-Extraktion von unbeschichteten oder einseitig beschichteten Folien freigesetzt werden, die es unmöglich machen, DNA-Peaks nach primärer PCR zu lesen. In diesem Fall kann eine erneute Amplifikation des Produkts der primären PCR eine DNA-Detektion ermöglichen, aber dies ist nicht zu empfehlen, weil das Verfahren kompliziert, ökonomisch ungünstig und mit einer höheren Fehlerquote behaftet ist.
Es wird vorgezogen, dass eine beschichtete Schutzfolie, die mit dem Klebstoff nicht reagiert, über die adhäsive Oberfläche gelegt wird, um die adhäsive Oberfläche und die daran haftenden Epidermisfragmente, wie in 1 gezeigt, zu schützen.
Die erfindungsgerechte adhäsive Folie wird in ausreichender Größe hergestellt, um die Hand oder den Fuß aufzunehmen, z.B. in Größe A5 oder B5. Wird es zu Aufbewahrungs- oder Überbringungszwecken und aus anderen Gründen erforderlich, kann die adhäsive Folie auf eine Größe reduziert werden, dass sie nur für Finger oder Zehen passt.
Vorzugsweise werden Epidermisfragmente von Handinnenflächen, Fingern, der Fußsohle und/oder den Zehen entnommen. Abdrücke von diesen Körperstellen ermöglichen es, die Spender der Epidermis zu identifizieren (siehe 2 und 3).
Am meisten bevorzugt ist die Sicherstellung von Epidermisfragmenten aus der Handinnenfläche. Im Fall, dass die Handinnenfläche nicht deutlich gedruckt ist, wie im Falle neugeborener Babys, können Epidermisproben durch Anheften der adhäsiven Folie auf andere Hautoberflächen wie der Fußsohle, Brust, usw erhalten werden. Die Hautoberflächen, die auf die erfindungsgerechte adhäsive Folie gedruckt werden sollen, müssen sauber und trocken sein, damit die Epidermisprobenentnahme nicht durch einen Film behindert wird, der sich zwischen den Hautoberflächen und dem Klebstoff in Form von auf den Oberflächen haftendem Puder, Wasser, Öl und Ähnlichem bildet.
Die auf der adhäsiven Folie zurück gelassene Epidermis wird zur DNA-Extraktion herangezogen. Obwohl verschiedene bekannte Methoden zur DNA-Extraktion zur Verfügung stehen, ist die folgende Methode der DNA-Extraktion von Epidermis, welche auf adhäsiver Folie haftet, vorzuziehen: Die Epidermis enthaltende Folie wird ganz oder teilweise in einen Extraktionspuffer eingetaucht, der dann gekocht und danach der Alkoholfällung der DANN-Fällung mittels unterzogen wird. Der DNA-Extraktionspuffer umfasst gemischte Ionenaustauschharze und Proteasen. Wie dies durch Chelex-100 (Bio-Rad, USA) und Amberlite IRN-150 (Supelco, USA) beispielhaft dargestellt ist, umfassen die gemischten Ionenaustauschharze, die für diese Erfindung geeignet sind, kationische und anionische Komponenten. Jede der nicht spezifischen Proteasen, einschließlich der Protease K, die im Allgemeinen zur DNA-Isolierung verwendet werden, kann für diese Erfindung verwendet werden.
Im Detail wird ein Stück (1,5 cm × 0,5 cm) einer adhäsiven Folie, welche Epidermis enthält, in ein Teströhrchen gegeben, das den DNA-Extraktionspuffer enthält. Alternativ kann ein Wattestäbchen, das in 0,2 N NaOH Lösung getaucht worden ist, dazu benutzt werden, um Epidermis von der adhäsiven Folie abzukratzen. In diesem Fall wird die abgenommene Epidermis dann dem Extraktionspuffer beigegeben.
Bei einem erfindungsgerechten Beispiel werden die PCR-Hemmer durch die Wirkungen des Ionenaustauschharzes (z.B. Chelex-100) und der Protease im Extraktionspuffer entfernt. Wird die Epidermis nicht mit dem Ionenaustauschharz oder der Protease behandelt, treten viele nicht spezifische Peaks auf, die das genaue Ablesen exakter Peaks, wie sie im Elektropherogramm gemessen werden, unterbrechen (siehe 4). Der folgende Kochvorgang ist das wirksamste und direkte Mittel bei der DNA-Extraktion durch Freigabe der Epidermis von der adhäsiven Folie in die Lösungsphase, wie in 4 dargestellt. Ohne einen Kochvorgang erhält man keine DNA. Durch Alkoholfällung wird die DNA in Form von Pellets zurück gewonnen. Nach dem Trocknen werden die Pellets in einem geeigneten Volumen eines Puffers gelöst. Die erhaltene DNA kann erforderlichenfalls durch PCR amplifiziert werden.
In den meisten Fällen produziert vorstehendes Verfahren gereinigte DNA in für die nachfolgende genetische Analyse ausreichender Menge. Jedoch können die Hemmsubstanzen unzureichend entfernt sein auf Grund persönlicher Eigenschaften wie des Hauttyps und Zustands der Epidermis bei der Probenentnahme. In diesem Fall ist ein zusätzlicher Reinigungsprozess erforderlich. Bevorzugt wird ein chromatographischer Prozess, der Materialien mit Molekulargewichten, die so niedrig wie mehrere Zehntausende sind, ausschließen können. Z. B. können Unreinheiten, die ein Molekulargewicht aufweisen, das so geringfügig wie Zehntausende ist, durch die Anwendung eines molekularsiebenden chromatographischen Harzes, wie des Sephadex G-50 (Sigma, USA), und eines Filters, wie des Microcon 100 (Amicon, USA), wirksam entfernt werden. Nach einer solchen zusätzlichen Reinigung können mehr gereinigte DNA und deutlichere PCR-Resultate erhalten werden, wie dies in 5 dargestellt ist.
Die Menge an DNA, die von der adhäsiven Folie erhalten wird, ist sehr klein, so dass exaktes Messen nicht leicht ist, aber sie kann indirekt gemessen werden. Z.B. kann, wenn exakt gemessen wird, aus Blut extrahierte DNA zu einer Konzentration verdünnt werden, deren Grad ähnlich demjenigen der von der adhäsiven Folie gewonnenen DNA ist. Wird die DNA durch PCR amplifiziert, ist die Amplifikation proportional zur Kopienzahl der DNA-Matrize, welche benutzt wird, bis ein vollständig saturierter Zustand erreicht ist. Deshalb kann eine indirekte Schätzung der Menge der von einer adhäsiven Folie erhaltenen DNA durch Amplifikation der DNA zusammen mit einer verdünnten Kontroll-DNA-Probe unter derselben Bedingung erreicht werden. Durch dieses indirekte Messen wurde festgestellt, dass etwa 1 ng Epidermis-DNA von einem 1,5 cm × 0,5 cm großen Bereich der adhäsiven Folie gewonnen werden konnte (siehe 6).
Ein weiterer erfindungsgerechter Aspekt besteht in einem Verfahren zur Analyse menschlicher Gene, wobei Epidermisfragmente unter Benutzung einer adhäsiven Folie erhalten werden und die DNA aus den Epidermisfragmenten isoliert und auf die physikochemischen Eigenschaften hin gemessen wird. Das Verfahren zur genetischen Analyse umfasst folgende Schritte:

a) Entnahme von Epidermisfragmenten von einer Testperson mittels adhäsiver Folie;
b) Visualisierung des Epidermisabdrucks in einem Bild;
c) Aufzeichnung des Bildes in einem optischen oder elektronischen Medium;
d) Isolierung der DNA aus den Epidermisfragmenten, welche auf der adhäsiven Folie kleben und
e) Identifizierung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der DNA.

Die Schritte a) und b) können durch das zuvor beschriebene Verfahren zur Erhaltung von DNA durchgeführt werden.
Wenn die Handinnenfläche oder Fußsohle auf eine adhäsive Folie aufgedruckt wird, kann der Handinnenflächenabdruck, der Finger- oder Zehenabdruck, der auf der adhäsiven Folie abgebildet ist, durch einen geeigneten Farbstoff visualisiert werden. Als Farbstoff wird ein Kristallviolett bevorzugt. Wird die Handinnenfläche oder Fußsohle auf die adhäsive Folie aufgedrückt, wird ein Spiegelbild der oberflächlichen Falten der Epidermis auf die adhäsive Folie aufgedruckt. Durch Eintauchen der Folie in 1 % ige Kristallviolettlösung etwa 10 Sekunden lang und Waschen der Folie mit destilliertem Wasser erscheint ein Bild des Handinnenflächen- oder Fußsohlenabdrucks in klarem Blau (siehe 2 und 3).
Als Regel gilt, dass die Menge der von der adhäsiven Folie zu gewinnenden DNA proportional zur Intensität des auf der adhäsiven Folie haftenden kristallvioletten Farbstoffes ist. Handelt es sich um einen Handflächeninnenabdruck, ist der zentrale Abschnitt der Handinnenfläche schwach gedruckt, während ein unterer Abschnitt der Handinnenfläche gut abgefärbt ist. Die Intensität der Färbung hängt auch von dem persönlichen Hauttyp, von der Trockenheit der Hand bei der Probenentnahme, usw, ab. Ein Stück der gedruckten Folie mit einer Größe von 1,5 cm × 0,5 cm, das dem gut gefärbten Abschnitt entspricht, ermöglicht die Produktion von DNA in einer Menge von 1 ng (siehe 6). Diese Größe passt in ein 1,5 ml Mikroröhrchen.
Zum Zweck der Aufzeichnung und Aufbewahrung des durch Farbstoff visualisierten epidermalen Bildes wird ein optisches oder elektronisches Instrument benötigt. Z.B. sind der Handinnenflächen- und Fingerabdruck, weil sie sehr feine Muster aufweisen, schwer mit dem bloßen Auge zu erkennen. Ein Vergrößerungsglas kann für die nähere Beobachtung des Bildes verwendet werden und eine Nahaufnahmelinse ist zur Anfertigung einer Photographie nützlich. Ein durch eine analoge Kamera auf einen Film photographiertes Bild kann durch einen Scanner in eine digitale Computerdatei umgewandelt werden. Alternativ kann der Handinnenflächen- oder Fingerabdruck direkt als Computerdatei eingegeben werden, indem man sich einer digitalen Kamera oder eines Scanners bedient. Die Gleichheit zwischen zwei oder mehreren Handinnenflächenabdrücken, Finger- oder Fußabdrücken kann mit Hilfe eines Vergrößerungsglases oder einer konventionellen Computersoftware bestimmt werden. Diese in den Computer eingegebenen Bilder von Finger-, Handinnenflächen- und Fußabdrücken einer Testperson können in Verbindung mit den im Verfahrungsschritt e) erhaltenen Resultaten der Analyse aufgezeichnet und aufbewahrt werden.
Was die Identifikation der physikalischen und chemischen Eigenschaften der DNA anbetrifft, kann diese entweder durch Untersuchung der physikochemischen Eigenschaften der Nucleotidsequenz, wie der Länge der durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente, des Hybridisierungsverhaltens, der elektrophoretischen Mobilität usw., oder durch direkte Sequenzierung der DNA erreicht werden. Die Untersuchungen, bei denen das Hybridisierungsverhalten geprüft wird, schließen die konventionelle Southern-Blotting-Analyse, die automatisierte, DNA-Chips verwendende Analyse, usw., sowie solche Untersuchungen, bei denen die elektrophoretischen Mobilitäten SSNP-, SSCP-Prüfungen und Ähnliches beinhalten, ein.
Der Zweck der DNA-Analyse bestimmt, welcher Untersuchungstyp durchgeführt werden soll. Zielt die DNA-Analyse auf eine DNA-Typisierung hin, wie bei Vaterschafts- oder forensischen Tests, werden DNA-Proben zur Bestimmung des Typs eines spezifischen Gens benutzt. Diesbezüglich werden Gene oder Gensegmente von Interesse je nach dem letztendlichen Zweck der DNA-Analyse ausgewählt. Wenn z. B. der Zweck die genetische Identifikation von Einzelpersonen in Verbindung mit einem Vaterschafts- oder forensischen Test ist, wird das Target auf mehrere STR-Loci gerichtet sein. Richtet sich der Fokus des Interesses auf eine bestimmte Krankheit oder die Forschung zu einem besonderen Gen selbst, wird das Target ein Gen oder mehrere der auf 80.000 geschätzten menschlichen Gene sein. Einige der Nucleotidsequenzen der Targetgene werden amplifiziert.
Um die physikochemischen Eigenschaften der DNA zu messen, können konventionelle Markierungsverfahren angewandt werden, wobei das Targetgen oder seine komplementäre Nucleotidsequenz für die quantitative oder qualitative Analyse markiert wird. Bevorzugte Markierungsverfahren umfassen die Audioradiographie, Fluoreszenzmarkierung, usw. Alternativ kann das Silberfärben zur Detektion nicht markierter DNA eingesetzt werden.
Die genetische Analyse des Schritts e) wird grob in zwei Kategorien unterteilt.
Die Unterscheidung von Allelen ist Gegenstand einer der beiden. Z.B. nimmt man an, dass verschiedene Typen der STRs durch die Größen der amplifizierten DNA-Fragmente bestimmt werden. In einem erfindungsgerechten Beispiel wurden STRs und das Amelogeningen auf ihren Längenunterschied hin in den Genen unter Anwendung einer DNA-Profilier-Ausrüstung untersucht. Bei einem anderen Beispiel wird die Profilier-Ausrüstung für den Vaterschaftstest praktisch angewandt. Werden DNAs, die aus auf adhäsiven Folien klebenden Epidermisfragmenten isoliert wurden, durch PCR amplifiziert, werden die STR-Allele, welche bei einem wirklichen Kind und seinen Eltern gemeinsam sind, klar erkannt, wie in 8 dargestellt.
Der andere Typ der genetischen Analyse besteht in der Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Gens. Da ein Längenunterschied zwischen DNA-Fragmenten konsequenter Weise auf eine Insertion oder Deletion von Nucleotiden zurückzuführen ist, geht mit der Bestimmung von Nucleotidsequenzen die Unterscheidung der Längenunterschiede einher. Zusätzlich liefert die Bestimmung von Nucleotidsequenzen Informationen über Mutationen, welche einen absoluten Einfluss auf die Physiologie des Organismus haben, aber keinen Unterschied in der Länge eines DNA-Fragments ergeben. Diese Mutationen schließen Transposition oder Inversion ein und sind schwierig aufzudecken durch andere Techniken als die direkte Sequenzierung.
In dieser Erfindung wurden F13A01 (einer der STR-Loci) und das partielle ACE-Gen für die Sequenzierung amplifiziert. Wie andere Gene, die sich auf Krebs oder Erbkrankheiten beziehen, sind das ACE-Gen und das F13A01-STR einmalige Gene im gesamten Genom, so genannte Single-Copy-Gene. Dies beweist, dass selbst ein Single-Copy-Gen aufgedeckt und entsprechend sequenziert werden kann, wenn die DNA von einer adhäsiven Folie stammt und amplifiziert wird.
9 zeigt die Resultate der DNA-Sequenzierung in einem automatischen Sequenzer. 9a stellt eine Nucleotidsequenz des ACE-Gens dar, welche unter Benutzung von 5 ng aus Blut isolierter DNA erhalten wird, während 9b eine Nucleotidsequenz derselben Gegend darstellt mit Resultaten der Sequenzierung von DNA, welche unter Verwendung der erfindungsgerechten adhäsiven Folie erhalten wurde. 9c stellt eine Nucleotidsequenz einer F13A01-Region dar, welche unter Benutzung von DNA, die mittels adhäsiver Folie erhalten wurde, bestimmt wurde. Insbesondere wird, weil das F13A01 Gen die Allele 3,2 und 4 hat, eine aus einem Heterozygoten extrahierte Genom-DNA für die Bestimmung ihrer Nucleotidsequenzen ausgewählt. Dieses Resultat rührt von der Koexistenz verschiedener Nucleotidsequenzen in einem Abschnitt von zwei amplifizierten DNA-Fragmenten her, was beweist, dass DNA, die erfindungsgemäß aus der adhäsiven Folie gewonnen wurde, für die Forschung über SNP (single-nucleotide-polymorphism) oder Analyse der Mutation von Nucleotidsequenzen geeignet sein kann.
In den Beispielen, welche den 4 bis 8 entsprechen, wird bestimmt, ob aus einer adhäsiven Folie extrahierte DNA für die genetische Identifikation geeignet ist. Insbesondere wird eine DNA-Profilier-Ausrüstung (Profiler-Plus, Perkin-Elmer, USA), die für die genetische Identifikation entwickelt wurde, für die PCR benutzt, und danach die Untersuchung unter Benutzung des automatischen Nucleotidsequenzers ABI310 (Perkin-Elmer, USA) durchgeführt, um die Muster von Allelen zu besfimmen.
Die Profiler-Plus Ausrüstung wurde entwickelt, um gleichzeitig 10 Gen-Regionen zu amplifizieren, einschließlich 9 STR-Regionen und ein Amelogeningen, deren Unterschiede in den Nucleotidsequenzen von X und Y-Chromosomen für die Geschlechtsunterscheidung benutzt werden. Diese gleichzeitige Amplifikation von multiplen Genen ist schwieriger zu erzielen als die Amplifikation von einer oder zwei Nucleotidsequenzen in anderen Tests. Wenn die PCR-Produkte der zehn Regionen der Profiler-Plus Ausrüstung und ihre elektrophoretischen Muster also offenbar erhalten werden, bestätigt dies, dass die DNA-Probe bei jeder allgemeinen PCR und Elektrophorese benutzt werden kann. Die Profiler-Plus Ausrüstung enthält die neun Paare von STR Primern und nur der 5'-endprimer eines jeden Paares wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert. Drei STRs, bei denen die Fragmentgrößenbereiche von Allelen sich nicht überlappen, gehören zu einer Gruppe, und die Gruppen werden durch Anwendung von drei verschiedenen Farben fluoreszierender Farbstoffe voneinander unterschieden. Werden sie in einem automatischen Nucleotidsequenzer elektrophoresiert, wird die Mobilität der DNA-Fragmente bestimmt durch die Zeit, die sie benötigen, um einen mit einem Laserstrahl bestrahlten Punkt zu erreichen, während die Bänder in der konventionellen Elektrophorese als Peaks auf der X-Achse in den Abbildungen erscheinen. In diesem Elektropherogramm ist das linke Ende die Position der Laserquelle, entsprechend dem unteren Ende eines konventionellen Gels, und breitere Fragmente sind in weiter rechten Positionen. Die Höhe der Peaks, welche die Intensität der Fluoreszenz widerspiegelt, ist proportional zur DNA-Menge. Die drei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker werden getrennt erkannt und als drei verschiedene Farben dargestellt.
Wenn die von einer adhäsiven Folie erhaltene DNA ausreichend gereinigt und genügend reichlich ist, um durch ein solches fluoreszenzmarkierendes System entdeckt zu werden, können an den Positionen eines jeden Allels des STR und Amelogenins in einem Elektropherogramm deutliche Peaks gelesen werden. Andernfalls werden keine Peaks entdeckt, stattdessen erscheinen Peaks, welche zu niedrig sind, um vor dem Hintergrund wahrgenommen zu werden, oder unspezifische Peaks, welche zu unferschiedlich sind, um eine Zuverlässsigkeit sicher zu stellen.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung besteht in kombinierten Folien, welche benutzt werden, um Epidermis von Einzelpersonen zu entnehmen und die DNA der Epidermisspender zu speichern. Diese kombinierten Folien zur Entnahme von Epidermis oder Speicherung von DNA umfassen eine adhäsive Folie zur Entnahme der Epidermis und eine Schutzfolie.
Die adhäsive Folie zur Entnahme der Epidermis ist in der Struktur identisch mit der adhäsiven Folie, welche beim Schritt a) des Verfahrens zur Erhaltung von Epidermis-DNA benutzt wird. D.h., die adhäsive Folie zur Entnahme von Epidermis umfasst einen Träger, auf dessen eine Seite ein Klebstoff aufgetragen wird. Der Träger wird aus Papier, synthetischem Harz, Faser und Metall hergestellt und mit einem unlöslichen Film auf mindestens einer seiner beiden Seiten beschichtet.
Die Schutzfolie kann aus irgendeinem flexiblen Material hergestellt sein, welches nicht auf die adhäsive Oberfläche geklebt ist. Nicht zu empfehlen ist ein Material, das mit der adhäsiven Oberfläche oder mit dem darauf haftenden Epidermisfragment reagiert. Bevorzugte Materialien für die Schutzfolie ist beispielsweise Papier, dessen eine Seite mit einem unlöslichen Film beschichtet ist.
Die kombinierten Folien zur Entnahme von Epidermis oder zur Aufbewahrung von DNA können als Mittel zur Aufbewahrung von Epidermisproben einer Einzelperson oder einer Population oder als Mittel zur Überbringung von DNA an ein Institut zur genetischen Analyse benutzt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einer Ausrüstung zur Entnahme von Epidermis oder Extraktion von DNA, wobei diese Ausrüstung eine oder mehrere kombinierte Folien zur Entnahme von Epidermis oder zur Aufbewahrung der DNA umfasst.
Die Anwendungen der Ausrüstung umfassen die Probenentnahme von Epidermis von einer oder mehreren Testpersonen, die Aufbewahrung der Epidermis für künftige Verwendung, Erhaltung der Epidermis zum Zweck der DNA Extraktion, usw..
Die grundlegende Komponente der Ausrüstung sind die kombinierten Folien zur Aufnahme von Epidermis oder zur Aufbewahrung der DNA, deren charakteristische Eigenschaften oben näher beschrieben sind.
Zusätzliche Komponenten der Ausrüstung können Kristallviolettlösung, gemischte Ionenaustauschharze, Proteasen und deren Puffer, Natriumazetat, Kaliumazetat oder Natriumchloridlösung, TE-Puffer oder TRIS-Puffer, Säulen für Molekularsiebchromatographie, Filter, Benutzerhandbuch, usw. einschließen.
Von den zusätzlichen Komponenten wird die Kristallviolettlösung für das Färben von Handinnenflächen-, Fingerabdrücken und Ähnlichem verwendet und vorzugsweise in einer Konzentration von 1 % (w/v) geliefert.
Gemischte Ionenaustauschharze, Proteasen und deren Puffer, Natriumazetat, Kaliumazetat oder Natriumchloridlösung, TE-Puffer oder TRIS-Puffer sind Agenzien der DNA-Extraktion aus der Epidermis. Die gemischten Ionenaustauschharze sind beispielhaft durch Chelex-100 (Bio-Rad, USA) und Amberlite IRN-150 (Sulpelco, USA) dargestellt. Die Proteasen sind durch die Protease K vertreten und der Proteasepuffer enthält vorzugsweise 50 mM Tris (pH 7,5) und 5 mM Natriumchlorid. Das Natriumazetat, Kaliumazetat und die Natriumchloridlösung, die Salze, die bei der konventionellen Alkoholfällung verwendet werden, können vorzugsweise in einer Konzentration von 0,3 M verwendet werden. Außerdem kann verdünnter Alkohol (vorzugsweise zu 95 und 70 %) in der erfindungsgerechten Ausrüstung enthalten sein. Der TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) oder Tris-Puffer wird für die Resuspendierung des DNA-Pellets oder zur langfristigen Aufbewahrung von DNA verwendet, wobei der Tris-Puffer vorzugsweise mit einer Konzentration von 10 mM hergestellt und auf einen pH-Wert von 8,0 angepasst wird.
Die Säulen für die Molekularsiebchromatographie und die Filter sind nützlich für eine zusätzliche Reinigung im Fall, dass die Hemmer der nachfolgenden Reaktion nicht genügend entfernt worden sind. Vorgezogen werden Säulen oder Filter, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als Zehntausend kDa ausschließen können. Bestes Beispiel für die Harze für die Säule ist Sephadex G-50 (Sigma, USA), für den Filter Microcon 100 (Amicon, USA).
Zusätzlich kann die Ausrüstung 1,5 ml Mikroröhrchen als Instrument zur DNA-Extraktion enthalten.
Die Ausrüstung kann weiter eine Reihe von Reagenzien für die PCR, z. B. einen PCR-Puffer, Nucleotide, eine hitzeresistente Art der DNA-Polymerase und Primer umfassen. Die Region, die mit Hilfe der Primer amplifiziert werden soll, wird je nach dem Endziel der DNA-Analyse bestimmt. Z.B. kann die Amplifikation der gesamten Region oder einer Teilregion eines oder mehrerer Gene zur Diagnose von Krankheiten oder für die genetische Forschung erwünscht sein. Amplifizierte Gene im Fall der genetischen Identifikation können aus einem oder mehreren STRs und/oder einem Abschnitt eines Targetgens, wie z.B. des Amelogenins, bestehen.
Zum besseren Verständnis dieser Erfindung dienen folgende Beispiele, welche zur Veranschaulichung dargestellt werden, aber nicht als Einschränkung dieser Erfindung ausgelegt werden dürfen.
BEISPIEL 1
Adhäsive Folie zur Entnahme von Epidermis.
Eine bevorzugte Ausführung der adhäsiven Folie, welche im Verfahren zur Isolierung von DNA aus der Epidermis verwendet wird, ist in 1 dargestellt. Die in 1 gezeigte adhäsive Folie umfasst einen Klebstoff, der mit der Haut in Kontakt gebracht wird, und einen Träger, der aus Papier hergestellt und auf den der Klebstoff aufgetragen ist. Damit der Klebstoff und die auf dem Klebstoff haftenden Epidermisfragmente vor Kontamination oder Verlust geschützt sind, wird weiter eine beschichtete Schutzschicht, die mit dem Klebstoff nicht in Wechselwirkung treten kann, benutzt. Besteht der Träger wie in 1 aus Papier, ist es erforderlich, beide Seiten des Trägers zu beschichten, um zu verhindern, dass während der DNA Extraktion aus dem Papier Hemmsubstanzen freigegeben werden. Der Beschichtungseffekt wird später beschrieben werden (Beispiel VII).
BEISPIEL II
Gefärbter Handinnenflächenabdruck
2 zeigt gedruckte Bilder der Handinnenfläche und des Daumens eines Erwachsenen auf der adhäsiven Folie (Größe A5) des Beispiels I. Nachdem die adhäsive Folie den Abdruck von der Handinnenfläche erhalten hat, wurde sie in 1 % iger Kristallviolettlösung (Sigma, USA) 10 Sekunden lang eingetaucht und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um einen blau gefärbten Handinnenflächenabdruck zu visualisieren. Danach wurde die adhäsive Folie in Luft getrocknet und mit einer transparenten Kunststofffolie bedeckt. Das blau gefärbte Bild wurde mit Hilfe eines Scanners (Modell GT-5000, Epson, Japan) mit 300 dpi in den Computer eingegeben. Von dieser Datei wurde das Bild des Handinnenflächenabdrucks mit derselben Auflösung ausgedruckt und in 2 dargestellt.
BEISPIEL III Vergrößerte Fingerabdrücke
Da der . Handinnenflächenabdruck des Beispiels II in einer computerlesbare Datei aufgezeichnet wurde, konnte ein auf einem Monitor abgebildetes Bild des Handinnenflächenabdrucks mit Hilfe von Software, wie z.B. Photoshop Version 5.0 (Adobe, USA), vergrößert werden, um die Fingerabdrücke im Detail darzustellen. Notfalls kann eine digitale Kamera (Ricoh RDC-4300, Japan), die mit einer Vergrößerungs- oder Nahaufnahmelinse ausgerüstet ist, verwendet werden, um nur die Fingerabdruckteile zu vergrößern, und die auf diese Weise erhaltenen digitalen Dateien können direkt in einen Computer eingegeben werden. 3 zeigt vergrößerte Fingerabdrucksbilder.
BEISPIEL IV
Optimierung der DNA-Extraktion
DNA wurde aus einer adhäsiven Folie extrahiert, auf welcher ein Handinnenflächenabdruck aufgedruckt worden war, und durch PCR unter Verwendung eines von Perkin-Elmer hergestellten Profilier-Systems amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde für DNA-Profile analysiert, wobei der automatische Nucleotidsequenzer ABI310 (Perkin-Elmer, USA) verwendet wurde.
Ein Stück in der Größe von 1,5 cm × 0,5 cm wurde aus der adhäsiven Folie des Beispiels II ausgeschnitten und in einen Extraktionspuffer eingetaucht, der durch Mischen von 5 μl Protease K (Boehringer Mannheim) mit der Konzentration von 10 mg/ml in 500 μl einer 5 % igen Chelex-100 (Bio-Rad)-Suspension von gemischten Ionenaustauschharzen zubereitet wurde. Nach Inkubation bei 56 °C 30 Minuten lang wurde die Lösung 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt, und danach bei 13.000 Umdrehungen/Minute 10 Minuten lang zentrifugiert. Das Obenschwimmende wurde in eine neue Röhre transferiert und der Alkoholfällung unterzogen, um eine DNA zu erhalten, die von Hemmsubstanzen fast frei ist. Die DNA, die in Form eines trockenen Pellets erhalten wurde, wurde in 20 μl eines TE-Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) aufgelöst.
4 zeigt Multiplex-PCR-Resultate von 9 STR-Regionen und einen Teil eines Amelogeningens unter Benutzung der Profiler-Plus Ausrüstung (Perkin-Elmer). Eine Mischung bestehend aus 20 μl der DNA-Lösung, 20 μl eines Puffers, 10 μl eines Primerpaares und 1 μl einer Taq Polymerase (Ampli-Taq Gold, Perkin-Elmer), wobei die letzten drei aus der Profiler-Plus Ausrüstung stammen, wurde bei der Multiplex-PCR verwendet. Ein thermaler Zyklusregler (T-Gradient, Biometra, Deutschland) wurde wie folgt eingestellt:
95 °C 11 Minuten lang (Prädenaturierung) und 29 thermale Zyklen: 95 °C 1 Minute lang (Denaturierung), 59 °C 1 Minute lang (Glühen), 72 °C 1 Minute lang (Elongation) und schließlich 60 °C 45 Minuten lang (Postelongation).
Nach der Amplifikation wurden 3 μl der Probe zu 15 μl einer Molekulargewichtstandardlösung hinzugefügt, die durch Mischen von 1 μl eines Molekulargewichtmarkers, der mit Rox, einem aus der Ausrüstung stammenden Fluoreszenzfarbstoff unterschiedlicher Farbe markiert wurde, mit 24 μl Formamid (Sigma, USA) zubereitet wurde. Die Mischung wurde auf 95 °C 3 Minuten lang erhitzt, 3 Minuten lang auf Eis gelegt und in einem automatischen Nucleotidsequenzer (ABI310) elektrophoresiert.
In 4 bedeutet ein Symbol (-), dass eine entsprechende Komponente oder ein Behandlungsprozess beim DNA-Extraktionsverfahren unterlassen wurde. Die unterste Aufzeichnung resultierte aus der Probe, welche alle Behandlungen mit dem Chelex Ionenaustauschharz, der Protease und dem Kochvorgang durchlaufen hat.
Das Elektropherogramm der 4 wurde derart durchgeführt, dass nachdem die Zeiten, während derer fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente einen mit einem Laserstrahl bestrahlten Bezugspunkt passierten, gemessen worden waren, die Entfernungen vom Startpunkt nachträglich errechnet wurden. Der äußerst linke Punkt im Elektropherogramm ist der Bezugspunkt. Da schwerere DNA-Fragmente sich langsamer bewegten, wurden sie an Punkten positioniert, die vom Bezugspunkt etwas weiter entfernt waren. Die Profiler-Plus Ausrüstung hatte drei in der Farbe unterschiedliche Fluoreszenzmarker. Drei STRs, bei denen die Fragmentgrößenbereiche der Allele sich nicht gegenseitig überlappten, waren Gegenstand einer Gruppe, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff einer Farbe markiert wurde. So erschienen 9 Allele von STRs in drei Farben im Elektropherogramm. Die Höhe der Peaks, die der Intensität der Fluoreszenz entspricht, ist proportional zur Menge der verwandten DNA. Das in blassem grau gedruckte Peak an der äußerst linken Position zeigt das Amelogenin, und die entdeckten Peaks entsprachen ausschließlich Allelen des X-Chromosoms, weil die verwandte DNA-Probe von einer Frau stammte.
BEISPIEL V
Zusätzliche Entfernung von Reaktionshemmsubstanzen
Die Resultate des Beispiels IV ergeben, dass gute DNA-Profile durch die Behandlung mit Chelex und Proteasen sowie einem Kochvorgang erhalten werden können. In der Praxis jedoch wird häufig ein Überschuss an Reaktionshemmsubstanzen entdeckt je nach den persönlichen Eigenschaften, wie z.B. dem Hauttyp und Zustand der Epidermis bei der Entnahme, sodass exakte und eindeutige Peaks bei den in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Verfahren nicht abgelesen werden können.
5 zeigt den Unterschied im DNA-Profil, bevor und nachdem Reaktionshemmsubstanzen entfernt wurden. Das nach Alkoholfällung des Beispiels IV erhaltene DNA-Pellet wurde in 100 μl von TE aufgelöst und dann der Spinnsäulenchromatographie unterzogen, wobei Sephadex G-50 mit einem Volumen von 1 ml verwendet wurde. Die DNA-Lösung, welche durch die Sephadexröhre lief, wurde in Vakuum getrocknet, bis ein Pellet entstand, welches danach in 20 μl deionisiertem Wasser aufgelöst wurde. Die PCR wurde unter Verwendung der Profiler-Plus Ausrüstung wie in Beispiel IV durchgeführt.
BEISPIEL VI
Quantifizierung der von einer adhäsiven Folie erhaltenen DNA
Wird DNA aus Blut gewonnen, kann sie durch UV-Absorption oder einen Fluoreszenzfarbstoff, wie z.B. Hoechst 33258, dank ihrer großen Menge quantifiziert werden. Dagegen kann eine Spurenmenge von DNA, wie sie aus der Epidermis gewonnen wird, nicht direkt quantifiziert werden. Eine indirekte Schätzung der Menge der in Beispiel IV extrahierten DNA wurde durch Vergleich ihres amplifizierten Grades mit dem Grad der aus Blut isolierten DNA durchgeführt. Diesbezüglich wurde DNA aus 100 μl Blut gewonnen, der Reaktion mit Hoechst 33258 überlassen und dann durch die Aufnahmefähigkeit bei 260 nm quantifiziert. Die DNA-Lösung wurde in Serien bis zu 0,125 ng/μl verdünnt. Die seriell verdünnte Blut-DNA oder die von einem 1,5 cm × 0,5 cm großen Stück einer adhäsiven Folie extrahierte Epidermis-DNA wurde als Matrize für die PCR verwendet, die unter derselben Bedingung mit Hilfe der Profiler-Plus Ausrüstung (Perkin-Elmer) durchgeführt wurde.
Die Produktion eines PCR-Produkts verhält sich wie das Wachstum von Bakterien in Form einer S-förmigen Kurve. Um einen quantitativen Vergleich durchzuführen, muss die Produktion in exponentieller Phase sein. Zu diesem Zweck wurde die PCR bei diesem Beispiel in 29 Zyklen durchgeführt. Zur Vereinfachung wurde nur die FGA-Region der neun STRs der Profiler-Plus Ausrüstung in 6 gezeigt. Die Peaks, welche unter Benutzung der aus einem 1,5 cm × 0,5 cm großen Stück einer adhäsiven Folie extrahierten DNA amplifiziert wurden, zeigten ähnliche Höhen wie die Peaks, welche unter Verwendung von 0,5 ng Blut-DNA amplifiziert wurden, die sich als höher erwiesen als diejenigen, welche aus 0,1 ng oder 0,25 ng Blut-DNA erhalten wurden. Dieses Resultat zeigt, dass mindestens 1 ng DNA aus Epidermis unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von Reaktionshemmstoffen in den Extrakten der adhäsiven Folie erhalten werden kann.
BEISPIEL VII
Vorbeugung gegen die Freigabe von Reaktionshemmern durch Beschichtung
Papier wird durch unterschiedliche chemische Behandlungen hergestellt und Klebstoffe haben komplizierte Zusammensetzungen. Diese Materialien, welche die erfindungsgerechte adhäsive Folie zusammensetzen, werden im Laufe der DNA-Extraktion zusammen mit der DNA eluiert und wirken sich auf die PCR der DNA schädlich aus. Um grundsätzlich die Eluierung solcher potenter Reaktionshemmer auszuschließen, wird auf beiden Seiten des erfindungsgerechten Papiers ein undurchlässiger Film aufgetragen.
7 zeigt die Wirkung einer solchen Beschichtungsbehandlung. Die Handinnenfläche wurde auf drei verschiedene Papiere aufgedrückt: eine normale Folie aus Kopierpapier ohne Behandlung, eine adhäsive Folie auf Papierbasis, wobei nur eine Seite des Papiers mit einem Film beschichtet war, auf dem ein Klebstoff aufgetragen war, und eine adhäsive Folie auf Papierbasis, deren beide Papierseiten mit einem Film beschichtet waren, auf denen ein Klebstoff aufgetragen war. Derselbe Vergleich wie in Beispiel IV wurde für diese drei Fälle aufgestellt. Abgesehen von kleinen Peaks in regelmäßigen Abständen (Molekulargewichtmarker), wurden in den Elektropherogrammen bei dem Kopierpapier und der einseitig beschichteten Folie fast keine Peaks vorgefunden. Dieses Resultat zeigt an, dass der auf die adhäsive Folie aufgetragene Klebstoff unverzichtbar ist für eine genügend große Menge Epidermisproben, während die PCR die Entfernung verschiedener, vom Papier abgegebener Zusammensetzungen zwingend erfordert.
BEISPIEL VIII
Multiplex-PCR von aus einer adhäsiven Folie extrahierter DNA und ihre Verwendung bei Vaterschaftstests.
Wirkliche Eltern und ihre Kinder drückten ihre Handinnenfläche auf erfindungsgerechte adhäsive Folien, aus welchen ihre DNA-Profile konstruiert wurden unter Benutzung der Profiler-Plus Ausrüstung, die von Perkin-Elmer kommerziell erhältlich ist.
Zusammen mit einem DNA-Profil für einen Standardmarker wurden die DNA-Profile in 8 dargestellt. Wie man sieht, unterscheiden sich die drei DNA-Profile voneinander, aber die Peaks der Allele einer jeden STR-Region, welche in dem DNA-Profil des Sohnes gefunden wurden, finden sich auch bei den entsprechenden Positionen in beiden DNA-Profilen der Eltern und beweisen so die Mendelsche Erblehre. In der obersten Grafik sind die Allele des Amelogenins in einer Standardsprossenleiterform mit drei STR-Regionen dargestellt.
Das Resultat zeigt, dass wie die aus Blut erhaltene DNA die mittels einer adhäsiven Folie aus Epidermis extrahierte DNA zur Identifikation der Verwandtschaft, einschließlich des Vaterschaftstests, verwendet werden kann.
BEISPIEL IX
Nucleotidsequenzen partieller ACE-Gene und F13A01 STR in aus einer adhäsiven Folie extrahierter DNA
In diesem Beispiel wurde ein Fragment des ACE-Gens, welches nur eine Kopie im gesamten Genom besitzt, der Nucleotidsequenzierung unterzogen. Zu diesem Zweck wurden zwei synthetische Oligonucleotide, jeweils repräsentiert durch SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2, als Primer für die Amplifikation des ACE-Gens benutzt. Als Matrize für die PCR wurden 20 μl der aus der adhäsiven Folie extrahierten DNA, wie in Beispiel IV, und 10 ng der aus Blut isolierten DNA zur Kontrolle benutzt. Die PCR bestand aus 30 thermalen Zyklen, bei denen die Erhitzung wie folgt durchgeführt wurde: 94 °C 1 Minute lang, 58 °C 1 Minute lang und 72 °C 1 Minute lang.
Die PCR-Produkte wurden der Nucleotidsequenzierung durch ein Therminatorzyklus-Sequenzierungsverfahren unterzogen, wobei eine Big-Dye Terminatorsequenzierung-Ausrüstung (Perkin-Elmer) zum Einsatz kam. Zu 10 μl der amplifizierten DNA-Matrize wurden 4 μl des Big-Dye Terminator Reaktionsgemischs und 4 μl eines Primers (0,8 pmol) hinzugefügt, welche beide in der Ausrüstung mitgeliefert sind, und die resultierende Reaktionslösung wurde deionisiertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl hinzugefügt. Dies wurde 25 thermalen Zyklen unterworfen, wobei das Erhitzen wie folgt durchgeführt wurde: 96 °C 10 Sekunden lang, 50 °C 5 Sekunden lang und 60 °C 4 Minuten lang. Wie in der Gebrauchsanweisung der Ausrüstung empfohlen wurde die durch die PCR amplifizierte DNA in einer Menge von 30 ng hinzu gegeben. Die Elektrophorese wurde in dem automatischen Nucleotidsequenzer ABI310 wie in Beispiel IV durchgeführt Die 9a und 9b zeigen Nucleotidsequenzen eines partiellen ACE-Gens, das jeweils von den Blut-DNA- und Epidermis-DNA-Matrizen abgeleitet ist. Wie sich aus den Abbildungen ergibt, ist die Nucleotidsequenz des ACE-Gens, welches aus adhäsiver Folie extrahiert wurde, identisch mit derjenigen der aus Blut gewonnenen DNA.
9c zeigt eine Nucleotidsequenz der F13A01 STR-Region, welche unter Benutzung einer aus einer adhäsiven Folie extrahierten Epidermis-DNA erhalten wurde. Als Primer für die Amplifikation der F13A01 STR-Genregion wurden synthetische Oligonucleotide benutzt, welche durch SEQ ID Nr. 3 und Nr. 4 beschrieben wurden. In 9c können Nucleotidsequenzen in der Basisregion 180 deutlich gelesen werden. Jedoch wurden zwei Peaks entdeckt, die sich überlappen etwa von der Basisregion 180 her. Dieses Überlappen ist der Tatsache zuzuschreiben, dass die aus der Probe isolierte genomische DNA beim F13A01 STR einen Heterozygoten bildet.
INDUSTRIELLE VERWENDBARKEIT
Wie oben beschrieben ist das DNA-Isolierverfahren, bei dem eine erfindungsgerechte adhäsive Folie verwendet wird, sehr geeignet für die DNA-Probenentnahme und kann die Probleme überwinden, welche konventionelle Blutentnahmeverfahren mit sich bringen. Insbesondere können, wo Handinnenflächenabdrücke auf die adhäsive Folie aufgedrückt werden, diese Handinnenflächen- oder Fingerabdrücke als eine direkte Identifikationsmaßnahme verwendet werden, wobei die Umstände des Fotografierens und notarieller Beglaubigungsverfahren, die bisher erforderlich waren, wenn DNA-Proben zur genetischen Identifikation aus Blut oder Epithelzellen des Mundes entnommen wurden, wegfallen.
Weil die erfindungsgerechte adhäsive Folie sich nicht in flüssigem Zustand befindet, ist sie sehr einfach aufzubewahren, zu übermitteln oder zu handhaben. Außerdem kann sie per Post verschickt werden. Die erfindungsgerechte adhäsive Folie ermöglicht daher eine vereinfachte medizinische Untersuchung mit Krankheiten verbundener Gene, ohne dass die Testperson ein Krankenhaus aufsuchen muss.
Die Epidermiszellen, welche auf der adhäsiven Folie entnommen werden, sind in trockenem Zustand, sodass die DNA in stabilem Zustand aufrechterhalten werden kann. Die adhäsive Folie ist somit ein effektives und effizientes Mittel zur DNA-Aufbewahrung für möglichen Rückgriff bei Ereignissen wie z.B. Flugkatastrophen, Kidnapping, Gerichtsverfahren zur Verwandtschaftsbestimmung, usw., und ermöglicht außerdem die Errichtung von DNA-Datenbanken.
Sequenzauflistung

Claims

Verfahren zur Erhaltung menschlicher DNA für die genetische Analyse, das den Schritt der DNA-Extraktion aus Epidermis, die auf einer adhäsiven Folie klebt, umfasst, wobei die Epidermis von einer Testperson mittels einer adhäsiven Folie entnommen wurde.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei die Epidermis von der Handinnenfläche, den Fingern, der Fußsohle oder den Zehen stammt.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei die adhäsive Folie einen Träger umfasst, auf dessen eine Seite ein Klebstoff aufgetragen ist, wobei dieser Träger aus einem synthetischen Harz, aus Faser, Metall oder Papier hergestellt ist, dessen beide Seiten mit einem unlöslichen Film beschichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei der Schritt der DNA-Extraktion aus der auf der adhäsiven Folie haftenden Epidermis unter Benutzung von Natriumhydroxidlösung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei der Schritt der DNA-Extraktion aus der auf der adhäsiven Folie haftenden Epidermis durch Eintauchen eines Teils der adhäsiven Folie oder der gesamten adhäsiven Folie in einen Extraktionspuffer, Erwärmung des Puffers auf 80 °C oder darüber, DNA-Fällung mit Alkohol und Molekularsiebchromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5 wobei der Extraktionspuffer ein gemischtes Ionenaustauschharz und eine Protease umfasst.
Verfahren zur genetischen Analyse unter Benutzung von menschlicher DNA, das folgende Schritte umfasst: a) Visualisation des Epidermisabdrucks als ein Bild, wobei die Epidermisfragmente von der Haut der Testperson unter Verwendung einer adhäsiven Folie entnommen wurden, b) Aufzeichnung des Bildes in einem optischen oder elektronischen Medium, c) Extraktion von DNA aus Epidermisfragmenten, die auf einer adhäsiven Folie kleben und d) Messung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften der DNA.
Verfahren nach Anspruch 7 wobei der Schritt a) durch Färbung der adhäsiven Folie mit Kristallviolett durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7 wobei beim Schritt b) eine analoge Kamera, eine digitale Kamera und/oder ein Scanner verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 7 wobei die physikalischen oder chemischen Eigenschaften der DNA die Länge der durch Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten DNA-Sequenz, das Hybridisierungsverhalten, die elektrophoretische Mobilität und Nucleotidsequenzen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10 wobei die durch Polymerase-Kettenreaktion amplifizierte DNA-Sequenz einen (STR) oder mehrere kurze Wiederholungssequenz-Loci (STR) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7 wobei beim Schritt d) Silberfärben, Autoradiographie oder Fluoreszenzmarkierung angewendet werden.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche wobei kombinierte Folien, die eine adhäsive Folie und eine Schutzfolie zum Schutz einer adhäsiven Oberfläche der adhäsiven Folie umfassen, benutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 13 wobei die adhäsive Folie einen Träger umfasst, auf dessen eine Seite ein Klebstoff aufgetragen ist.
Verfahren nach Anspruch 14 wobei der Träger aus Papier, einem synthetischen Harz, aus Faser oder Metall hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 14 wobei mindestens eine Seite des Trägers mit einem unlöslichen Film beschichtet ist.
Ausrüstung zur Entnahme von Epidermisfragmenten oder zur Extraktion von DNA, die Kristallviolettlösung und mindestens einen Satz kombinierter Folien umfasst, der aus einer adhäsiven Folie und einer Schutzfolie zum Schutz einer adhäsiven Oberfläche der adhäsiven Folie besteht.
Ausrüstung nach Anspruch 17 wobei sie weiter mindestens eine Komponente umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus gemischten Ionenaustauschharzen, Proteasen und deren Puffern, Natriumazetat, Kaliumazetat oder Natriumchloridlösung, TE-Puffern oder Tris-Puffern und dem Benutzerhandbuch besteht.
Ausrüstung nach Anspruch 18 wobei sie weiter mindestens eine Säule für die Molekularsiebchromatographie und/oder mindestens einen Filter umfasst.