KR20040006621A - 접착성 쉬트로 채취한 사람의 표피로부터 규조토를이용하여 ｄｎａ를 획득하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람의 DNA를 이용한 유전자 분석을 위하여 지문으로부터 DNA를 획득하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 접착성 쉬트를 이용하여 채취한 사람의 지문으로부터 DNA를 획득하는데 있어서, 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해완충용액을 첨가하여 용해시키고, DNA 결합물질을 이용하여 DNA를 추출하는 DNA 획득방법에 관한 것이다. 본 발명의 접착성 쉬트를 이용하여 지문을 채취하고 이로부터 DNA를 획득하는 방법은 유전자 분석의 반응을 저해하는 물질의 오염없이 순수하게 DNA를 분리할 수 있고, DNA 회수율이 높으며, DNA 획득과정이 간단하여 대량샘플을 처리하기 위한 기계적 자동화에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

접착성 쉬트로 채취한 사람의 표피로부터 규조토를 이용하여 ＤＮＡ를 획득하는 방법{A method for isolating DNA using diatomaceous earth from human skin collected by an adhesive sheet}

본 발명은 사람의 DNA를 이용한 유전자 분석을 위하여 지문으로부터 DNA를 획득하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 접착성 쉬트를 이용하여 채취한 사람의 지문으로부터 DNA를 획득하는데 있어서, 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해완충용액을 첨가하여 용해시키고, DNA 결합물질을 이용하여 DNA를 추출하는 DNA 획득방법에 관한 것이다.

DNA(deoxyribonucleic acid)는 유전물질로서 인체의 구성 요소와 모든 신진 대사를 암호하는 유전자를 함유하고 있다. 게놈프로젝트(Genome Project)로 대표되는 20세기 후반의 생명과학의 발전은 21세기의 유전자 검사의 보편화를 예고하고 있다. 게놈 프로젝트가 진행됨에 따라, 인간은 인간 DNA의 모든 유전정보를 읽고 있으며 중요한 유전병이나 성인병과 관련된 유전자들이 속속 밝혀지기 시작했고 유전자의 이상도 염기서열의 수준에서 파악할 수 있게 되었다. 이에 따라, 사람들은 자기가 가지고 있는 병과 관련된 주요한 유전자의 타입을 미리 앎으로서 적절한 예방 조치를 취할 수 있고 의사들은 정확한 처방과 치료를 시행할 수 있게 될 것이다.

DNA는 사람마다 고유한 특성이 있고 모든 세포에 존재하기 때문에, 유전자 차원에서 개인을 식별하는 유전자 감식(DNA 프로필) 방법이 개발되어 왔다. 이에 따라, 유전자 감식 기술은 법집행의 차원이나 친생자 확인 문제 등의 해결에 획기적인 도구가 되고 있다. 이를테면, 영국과 미국에서는 수감자들을 대상으로 DNA 프로필 데이터베이스를 구축하였으며 강력사건 현장의 증거물들로부터 DNA 프로필을 얻고 용의자들을 컴퓨터로 검색하고 있다.

병의 진단을 위해서든, 또는 유전자감식의 목적이든, DNA의 원천은 보통 혈액이다. 그러나 DNA 공급을 위해 혈액을 채취하는 것은 다음과 같이 여러 가지 문제점을 가지고 있다.

첫째, 채혈은 병원과 전문인력에 의하여만 가능하다.

둘째, 수검자에게 채혈의 고통이 뒤따른다.

셋째, AIDS나 간염과 같은 전염병에 감염될 위험성이 상존한다.

넷째, 나이, 건강, 종교 등의 이유 등으로 혈액 채취가 불가능한 경우가 있다.

다섯째, 채취된 혈액만으로는 직관적으로 신원확인을 할 수 없기 때문에 혈액에서 도출된 DNA 프로필과 혈액공여자의 동일성을 확보하기 위해서는 수검자의 사진과 지문을 채취하고 채취자, 운반자 및 분석자들이 인계 확인서를 작성해야 했다.

여섯째, 법집행의 차원에서 강제로 채혈하는 것은 미국의 경우 위헌으로 관시된 바 있다(Lehrman,Nature394:818, 1998).

이와 같은 불편을 개선하기 위해 근래에는 구강세포를 이용하여 혈액을 대체하려는 시도가 이루어지고 있다. 구강세포는 혈액보다 여러 가지 편리한 점이 있으나 역시 샘플과 공여자의 동일성을 보장하기 위해서는 혈액의 경우와 유사한 복잡한 절차와 서류 및 증인이 필요하며 체내를 침투한다는 점에서는 역시 수검자에게 거부감을 일으키기 쉽다.

본 발명자들은 혈액이나 구강세포 채취의 문제점을 극복할 수 있는 방안을찾던 중 표피가 이러한 여러 가지 불편과 문제점을 해결하는 DNA 공급원이 될 수 있다는 점에 착안하여 새로운 DNA 공급원으로서 표피를 사용하는 DNA 분석 방법을 개발한 바 있다(특허등록 제326937호). 상기 방법은 접착성 쉬트를 이용하여 표피에서 검사에 충분한 양의 DNA를 얻고 접착성 쉬트에 남겨진 표피 물질로부터 DNA를 획득하는 것이다.

상기 방법을 간단하게 설명하면,

1) 표피 DNA를 포함하는 접착성 쉬트에 획득완충액(켈렉스 혼합이온교환수지 및 단백질분해효소)을 넣어 56℃에서 30분 동안 부란시킨 후 100℃에서 10분간 가열하여 원심분리하고

2) 분리된 상등액을 통상적인 알코올 공침 과정을 거쳐 DNA를 획득한다.

상기에서 제공하는 표피 DNA 획득 방법은 간단하긴 하지만 완벽하게 제거되지 않은 반응저해물질로 인해 정확하게 유전자를 분석하기가 어렵다. 상기 이유로 반응저해물질을 제거하기 위해 세파덱스 원심분리형 크로마토그라피 방법을 적용해 DNA를 획득하는 과정을 추가하여 DNA를 획득하였다. 그러나 상기 방법에 의해 DNA를 획득하는 것은 회수율이 낮고, DNA를 획득하는데 상당히 많은 시간이 소요되어, 그에 따라 인력의 소모가 많은 단점이 있었다.

DNA를 획득하는데 있어서 순도 및 수득률을 높이기 위하여 이용되는 방법으로는 세슘 클로라이드 농도 경사법(cesium chloride gradient)(Birnboim,Methods in Enzymology100:243-255, 1983), 이온 교환법(ion exchange high-performancemethod)(Colpan et al.,J. Chromatog296:339-353, 1984), 젤 여과법(gel-filtration high-performance method)(Moreau et al.,Analyt. Biochem166:188-193, 1987), 규조토를 이용한 방법(미국특허 US5075430)등이 있다.

상기 세슘 클로라이드 농도 경사법은 세포용액에 세슘 클로라이드를 첨가해 4내지 24시간 동안 고속으로 원심분리를 하여 농도 구배에 따라 DNA 분리하는 방법이고, 상기 이온 교환법은 이온을 교환시켜주면서 DNA를 선택적으로 분리하는 것이고, 상기 젤 여과법은 젤을 통해 여과시켜 줌으로써 DNA를 선택적으로 분리하는 것이고, 상기 규조토를 이용한 방법은 케이오트로픽 용매를 이용하여 극성용매(예컨대 물)에서 비극성 물질(예컨대 DNA)의 용해도를 높이고 DNA를 규조토에 결합시켜 규조토로부터 물을 이용해 DNA를 용출시켜 DNA를 획득하는 방법이다.

이에 본 발명자들은 유전자 분석을 용이하고 정확하게 하기 위해, 접착성 쉬트를 이용해 채취한 사람의 표피로부터 DNA 결합물질 이용하여 기존의 방법보다 DNA 회수율이 높고, 높은 순도로 DNA를 획득하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유전자 분석을 위해 접착성 쉬트를 이용해 채취한 표피로부터 DNA를 획득하는 방법에 있어서, DNA 회수율을 높이고 높은 순도의 DNA를 획득하기 위하여 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해시키고 DNA 결합물질을 이용하여DNA를 획득하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 표피 채취용 접착성 쉬트(아이디 프린트^TM카드)의 외관 및 지문을 날인하는 방법을 도시한 것이고,

도 2는 접착성 쉬트로 채취한 사람의 지문에서 획득한 DNA의 4개의 유전자좌를 증폭한 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 방법에 의해 획득한 지문 DNA와 기존의 동물세포로부터 DNA를 획득하는 방법에 의해 획득한 모근 DNA의 프로파일을 비교한 것이고,

도 4는 미토콘드리아 DNA의 과변이 부위(hypervariable region)와 프라이머의 위치를 도시한 것이고,

도 5는 본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA를 이용해 미토콘드리아 DNA의 과변위 부위를 증폭한 PCR 산물을 전기영동한 사진이고,

도 6은서열번호 3으로 기재되는 L16010 프라이머를 사용해 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 분석한 것이고,

도 7은서열번호 4로 기재되는 H16395 프라이머를 사용해 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 분석한 것이고,

도 8은서열번호 5로 기재되는 L048 프라이머를 사용해 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 분석한 것이고,

도 9는 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 분석한 결과가 좋지 않은 예이고,

도 10은 접착성 쉬트에 지문을 날인하여준 공여자의 가계도 및 이들의 샘플로부터 획득한 DNA로 3개의 STR 유전자좌를 분석한 결과이며,

도 11은 공여자들의 지문으로부터 획득한 DNA를 이용해 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 비교한 것이고,

도 12는 4내지 5개월 보관된 지문으로부터 획득한 DNA의 STR을 증폭한 결과이며,

도 13은 좌우 엄지 지문 각각에서 획득한 DNA의 미토콘드리아 DNA를 증폭하여 전기영동한 사진이며,

도 14는 좌우 엄지 지문 및 모근에서 획득한 DNA의 STR을 분석한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 사람의 DNA를 이용한 유전자 분석을 위하여 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해완충용액을 첨가하여 용해시키고, DNA 결합물질을 이용하여 DNA를 획득하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 사람의 DNA를 이용한 유전자 분석을 위하여 접착성 쉬트를 이용하여 수검자의 표피를 채취하고 접착성 쉬트에 남겨진 표피로부터 DNA를 획득하는 방법에 있어서, 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해완충용액을 첨가하여 용해시키고, DNA 결합물질을 이용하여 DNA를 획득하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명의 DNA 획득방법은

1) 접착성 쉬트를 이용하여 수검자의 표피를 채취하는 단계;

2) 채취된 표피를 포함하고 있는 접착성 쉬트에 용해완충용액 및 단백질분해효소 K를 첨가하여 용해시키는 단계;

3) 상기 용해액에 결합완충용액 및 DNA 결합물질을 첨가하여 반응시키는 단계;

4) 상기 반응액을 컬럼에 채우고 DNA를 세척하는 단계; 및

5) 상기 컬럼에서 DNA를 용출하는 단계를 포함한다.

여기에서 "접착성 쉬트"라 함은 최소 하나의 표면에 접착제가 도포되어 있는 지지부에 접착제를 도포한 것을 뜻한다. 즉, 본 발명에서 접착성 쉬트는 지지부 및 이에 도포된 접착제로 구성되며 채취된 표피 샘플을 보호하기 위하여 접착제와 반응하지 않는 코팅된 보호막으로 덮여 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 접착성 쉬트로 아이디프린트^TM카드(아이디진 사)를 사용하였다(도 1참조).

본 발명의 DNA 샘플을 획득하는 방법에서 "표피"는 손바닥, 손가락, 발바닥 또는 발가락의 표피일 수 있고, 인간의 엄지 손가락으로부터 채취되는 지문인 것이 바람직하고, 유전자 검사의 신뢰성을 위해서 인간의 좌우 엄지 손가락에서 동시에 지문을 채취하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 정확한 유전자 분석을 위해 DNA 회수율을 높이고 순도 높은 DNA를 획득하기 위해 하기와 같은 방법으로 DNA를 획득한다.

접착성 쉬트에 좌우 엄지 지문을 날인하고 지문이 남겨진 접착성 쉬트의 일부를 잘라내어 프로티네이즈 K가 포함된 용해완충용액에 담궈 접착성 쉬트로부터 지문 샘플을 녹여내고 단백질을 제거한다. 상기 반응액에 DNA 결합물질과 결합완충용액을 넣어 결합완충용액이 DNA를 DNA 결합물질에 결합하기 쉬운 상태로 만들어주어 DNA를 결합시킨 후 상기의 반응액을 컬럼에 채운다. 상기 컬럼에 채워져 있는 규조토에 결합된 DNA를 에탄올로 세척하고, 상기의 DNA 결합물질에 결합된 DNA를 증류수로 용출한다.

본 발명에서 용해완충용액은 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 접착성 쉬트로부터 분리해내고 프로티네이즈 K와 함께 표피세포를 용해시키고 단백질을 분해시킨다. 상기 용해완충용액은 SDS, TritonX-100, NP-40 및 Tween-20 으로 구성된 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 예로 상기 용해완충용액은 Tris 10 내지 20 mM, EDTA 10 내지 20 mM 및 SDS 0.5 내지 1%를 포함한다.

본 발명에서 프로티네이즈 K는 상기의 용해완충용액에 첨가하여 사용하는 것으로 단백질을 분해하는 성질로 인해 표피세포를 용이하게 용해하기 위해 사용하는 것이다. 상기 단백질분해효소 K는 0.005 내지 0.05 중량%로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 결합완충용액은 물구조의 질서를 파괴하는 케이오트로픽 용매(chaotropic agent)를 포함하며 상기 용매를 구성하는 이온(예컨대 SCN-, ClO4, guanidinium)의 성질에 의해 극성 물질과 비극성 물질을 분리시킴으로써 비극성 물질의 물에 대한 용해도를 높여주어 DNA가 규조토에 결합하기 용이하게 만들어준다.상기 역할을 하는 결합완충용액의 케이오트로픽 용매는 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 아이소티오치아네이트인 것이 바람직하다. 바람직한 예로 결합완충용액은 구아니딘 하이드로클로라이드 5 내지 6 M, Tris-Cl 20 내지 50 mM, 및 EDTA 20 내지 40 mM을 포함한다.

본 발명에서 DNA 결합물질은 자체로는 DNA를 결합하지 못하며 상기의 결합완충용액에 의해 용해도가 증가된 DNA를 선택적으로 결합한다. 상기의 DNA 결합물질은 글래스 비드(glass bead), 실리카 젤(silica gel) 또는 규조토(diatomaceous earth)인 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 규조토(시그마 사, D-5384)를 사용하였다. 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 규조토의 직경은 100 내지 500 ㎛인 것이 바람직하다.

본 발명에서 컬럼은 규조토를 완충용액으로부터 걸러내는 필터 역할을 하는 것으로 필터의 소공 직경이 100 ㎛ 이하이고, 상기 DNA가 결합된 규조토를 채운 후 DNA만을 용출하고자 할 때 규조토를 거르기 위해 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 위자드 미니컬럼(Wizard^®Minicolumn)(프로메가 사, A7211)를 사용하였다.

본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA의 획득성공률과 유전자 분석을 위한 PCR용 DNA로서의 순도를 알아보기 위해 짧은연쇄유전자좌(STR)를 수행한 결과, 전체 샘플 중 66.3%가 결과의 질이 좋은 것으로 나타났고 18.8%가 보통으로 나왔다(표 1, 도 2참조). 상기의 결과를 통해 본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA는 순도가 높고 획득성공률도 높음을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA의 신뢰성을 조사하기 위해 본 발명의 방법에 의해 획득한 지문 DNA와 일반적인 동물세포로부터 DNA를 획득하는 방법에 의해 획득한 모근 DNA의 프로파일을 비교한 결과 10개의 유전자좌가 모두 일치하는 샘플이 64.3%를 차지하고, 최소 7개의 유전자좌 이상 일치하고 불일치가 없는 샘플이 16.7%를 차지하였다(표 2,도 3참조). 상기의 결과를 통해 본 발명을 통해 획득한 DNA는 유전자 분석을 하는데 있어서 신뢰성이 있음을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA를 친생자 검사에도 이용가능한지 확인하기 위해 모계유전되는 미토콘드리아 DNA의 과변이 부위를 증폭해 염기서열을 분석한 결과 유전자좌가 모두 정상적으로 유전됨을 확인하였으며 또한 모계 유전되는 미토콘드리아 DNA의 염기서열이 모두 동일한 것으로 확인되어 정상적인 유전이 이루어졌음을 알 수 있었다(도 10,도 11참조). 상기의 결과를 통해 본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA는 유전자 감식에 유용하게 이용됨을 알 수 있다.

본 발명에서 사용하는 접착성 쉬트에 날인된 지문의 DNA를 보관가능한 시간을 알아보기 위해, 접착성 쉬트에 지문을 날인 한 후 4내지 5개월 동안 상온 보관된 접착성 쉬트로부터 DNA를 획득하여 STR 분석한 결과 지문이 날인된 접착성 쉬트를 4내지 5개월 동안 상온 보관하여도 접착성 쉬트상의 표피 DNA에는 거의 손상이 없는 것으로 나타났다(도 12참조). 상기의 결과를 통해 본 발명에서 사용한 접착성 쉬트는 단기간 DNA를 보관하는 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 방법은 신뢰도를 높이기 위해 좌우 엄지손가락 지문을 동시에 채취하여 먼저 한쪽 지문에서 DNA를 획득하여 실험하고 이 결과가 좋지 않을 경우 다른 한쪽 지문에서 DNA를 획득하여 STR을 수행해 본 결과 한쪽에서 명확치 않은 결과가 다른 한쪽에서는 뚜렷하게 구분할 수 있는 결과를 보였다(도 13, 도 14참조). 상기의 결과를 통해 유전자 분석 결과의 신뢰도를 높이기 위해서는 좌우 엄지 지문을 동시에 검사하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 접착성 쉬트상의 지문으로부터 DNA 획득방법

본 발명자들은 접착성 쉬트를 이용하여 표피를 채취하고, 상기 표피가 남겨진 접착성 쉬트로부터 DNA를 획득하였다. 구체적으로 접착성 쉬트(아이디프린트^TM카드)(아이디진 사)의 접착면에 지문을 강하게 눌러 찍었다(도 1참조). 지문이 찍힌 부위 5 ㎠를 외과용 칼로 잘라서 2 ㎖ 마이크로센트리퓨즈 튜브에 삽입하였다. 상기 튜브에 용해완충용액(10 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS) 640 ㎕ 및 20 ㎎/㎖ 프로티네이즈 K 10 ㎕를 첨가하여 37℃에서 3시간동안 회전기에서 회전시키며 반응하였다. 상기 반응액에 100 ㎎/㎖ 규조토(Diatomaceous earth) (시그마 사, D-5384) 50 ㎕ 및 결합 완충용액(6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0) 700 ㎕를 첨가하고 손으로 흔들어 잘 섞은 후, 상온에서 1시간동안 회전기에서 회전시키며 반응시켰다. 상기 반응액에 아이소프로판올 550 ㎕를 첨가하고 손으로 흔들어 섞어서 SDS 침전물을 녹였다. 상기의 혼합액을 일회용 5 ㎖ 주사기내로 빨아들여 상기 주사기의 끝에 위자드 미니컬럼(Wizard^®Minicolumn)(프로메가 사, A7211)을 장착하고 혼합액을 미니컬럼으로 밀어내어 규조토를 미니컬럼에 채웠다. 주사기에 80% 에탄올 3 ㎖을 넣은 후 상기의 미니컬럼내로 밀어내어 규조토를 한번 씻어주었다. 씻어준 미니컬럼을 새 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 10,000 g로 2분간 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 제거하였다. 상기 미니컬럼을 다시 새 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 80℃로 가열된 핵산이 오염되지 않은 순수 증류수 30 ㎕를 미니컬럼 바닥의 규조토에 첨가하고 상온에서 10분간 방치하여 규조토에 결합된 DNA를 물에 녹인 후, 10,000 g로 2분간 원심분리하여 DNA를 1.5 ㎖ 튜브내로 수거하였다. 상기의 튜브에서 미니컬럼을 제거하고 DNA가 들어 있는 튜브를 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.

<실시예 2> 지문에서 획득한 DNA로부터 짧은연쇄반복좌(STR) 분석

본 발명자들은 상기 방법에 의해 획득한 DNA의 획득 성공률 및 PCR용 DNA로서의 순도를 알아보기 위해 짧은연쇄반복좌(STR)를 수행하였다.

상기 실시예 1에 따라 임의로 101개의 지문 샘플을 채취하여 DNA를 획득한 후, 4개의 유전자좌(TH01, TPOX, CSF1PO, Amelogenin)를 증폭하도록 구성된 AmpFlSTR^TMGreen I PCR 증폭 키트(AmpFlSTR^TMGreen I PCR Amplification Kit) (퍼킨엘머 사, 402902)를 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. AmpFlSTR PCR 반응 혼합액 10.5 ㎕, 상기 4개 각각의 유전자좌를 증폭하는 프라이머 세트 5.5 ㎕, 5 unit/㎕ 앰플리탁 골드(AmpliTaqGold) 0.5 ㎕를 먼저 섞은 후, 이 혼합액에 획득한 DNA 10 ㎕를 섞어서 PCR용 튜브에 넣었다. PCR 반응은 먼저 95℃에서 11분간 반응한후, 94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 세 과정을 31회 반복한 후, 60℃에서 45분간 반응시켰다. 증폭한 DNA는 ABI Prism^TM310 및 ABI Prism^TM3100 자동염기 분석기를 사용하여 분석하였다.

상기의 방법에 의해 총 101개의 샘플을 시험해 본 결과표 1과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 결과의 질은도 2에서 보인 예처럼 식별 가능한 유전자좌의 수에 따라 4가지로 구분하였다. 그 결과 전체 샘플 중 66.3%가 결과의 질이 좋은 것으로 나타났고 18.8%가 보통으로 나왔다.

상기의 결과를 통해 본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA는 순도가 우수하고 획득성공률이 높음을 알 수 있었다.

101개의 지문 샘플에서 획득한 DNA의 4 유전자좌 분석 결과

결과의 질: 식별가능한 유전자좌의 개수	샘플수	%
좋음 : 4	67	66.3
보통 : 2~3	19	18.8
나쁨 : 1~2	9	8.9
증폭 안됨 : 0	6	5.9
전체	101	100

<실시예 3> 지문에서 획득한 DNA의 신뢰성 조사

본 발명자들은 상기 실시예 1에 의해 지문에서 획득한 DNA 프로파일이 실제 그 사람의 DNA 프로파일과 일치하는지 확인하기 위하여 모근에서 획득한 DNA와 지문에서 획득한 DNA의 프로파일을 비교하는 실험을 실시하였다.

모근에서 DNA를 획득하는 것은 일반적인 동물세포로부터 DNA를 획득하는 방법을 사용하였다. 모근 2 내지 3가닥을 튜브에 넣고, 용해완충용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 50 ㎍/㎖ 프로티네이즈 K, 38 mM 디티오트레이톨, 2% SDS) 500㎕를 첨가하고 56℃에서 3시간동안 반응시켰다. 상기 반응액에 페놀: 클로로포름: 아이소아밀알콜(25 : 24 : 1) 용액 500 ㎕를 첨가하여 가볍게 섞어준 후 13,000 g로 5분간 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮긴 후, 이 과정을 한번 더 반복하였다. 옮겨진 상등액에 에탄올 1 ㎖과 3 M 소듐 아세테이트 pH 5.2 50 ㎕를 첨가하고 -20℃에서 20분 이상 정치한 후, 13,000 g로 15분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 상기의 침전된 DNA를 70% 에탄올로 한번 씻어주고 건조시킨 후 증류수 30 ㎕에 녹였다. 본 발명자들이 지문 및 모근에서 획득한 DNA를 가지고 STR을 분석하기 위해사용한 키트는 AmpFlSTR^®Profiler PlusTM PCR Amplification Kit(퍼킨엘머 사, 403038)로, 총 10개의 유전자좌(D4S1358, vWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820)를 증폭할 수 있도록 구성되어 있다. AmpFlSTR PCR 반응 혼합액 10.5 ㎕, 상기 10개 각각의 유전자좌를 증폭하기 위한 프라이머 세트 5.5 ㎕, 5 unit/㎕ 앰플리 탁 골드 0.5 ㎕를 먼저 섞은 후, 이 혼합액에 획득한 DNA 10 ㎕를 섞어서 PCR용 튜브에 넣었다. PCR 반응은 먼저 95℃에서 11분간 반응한 후, 94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 세 과정을 31회 반복한 후, 60℃에서 45분간 반응시켰다. 상기 방법의 방법에 의해 증폭한 DNA는 ABI Prism^TM310 및 ABI Prism^TM3100 자동염기분석기를사용하여 분석하였다.

총 42개의 샘플을 시험해 본 결과표 2와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 상기의 결과는 지문에서 획득한 DNA의 프로파일과 모근에서 획득한 DNA의 프로파일의 일치정도에 따라 4가지로 구분하였다. 모두 일치는 10개 유전자좌 모두 일치하는 경우이고, 부분 일치는 최소 7개 유전자좌 이상 일치하고 불일치가 없을 경우에 해당하고, 불일치는 하나의 유전자좌라도 명확한 불일치를 보일 경우에 해당한다. 미결정은 증폭되지 않았거나, 식별할 수 없을 정도로 여러 개의 피크가 나타나 일치여부를 결정할 수 없을 경우에 해당한다. 불일치로 4개의 샘플이 발생한 것은 샘플 준비과정에서 타인의 접촉으로 발생했을 것으로 사료되는바 샘플 채취 시 주의가 요구된다.도 3은 위에서 구분한 4 종류의 결과를 예를 들어 보인 것이다. 상기의 방법에 의해 총 42개의 샘플을 시험해 본 결과 10개의 유전자좌가 모두 일치하는 샘플이 64.3%를 차지하고, 최소 7개의 유전자좌 이상 일치하고 불일치가 없는 샘플이 16.7%를 차지하였다.

상기의 결과를 통해 본 발명을 통해 획득한 DNA는 신뢰성이 있음을 알 수 있었다.

지문 DNA와 모근 DNA의 프로파일 비교

일치 정도	샘플수	%
모두일치	27	64.3
부분일치	7	16.7
불일치	4	9.5
미결정	4	9.5
전체	42	100

<실시예 4> 지문에서 획득한 DNA로부터 미토콘드리아 DNA 염기서열 분석

본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 획득한 DNA의 염기서열이 정확한지 확인하기 위해 미토콘드리아 DNA 과변이 부위(Hypervariable region)를 PCR 증폭하여 염기서열 분석을 실시하였다.

도 4에서는 미토콘드리아 DNA 과변이 부위와 본 발명에 사용한 각 프라이머의 위치를 모식도로 나타내었다. 1차 PCR 반응은 10배 농축 ExTaq완충용액(다까라 사) 2.5 ㎕, dNTPs(각각 2.5 mM) 2 ㎕, 25 mM 마그네슘 클로라이드 1.5 ㎕,서열번호 1로 기재되는 L15997(10 μM) 0.5 ㎕,서열번호 2로 기재되는 K408(10 μM) 0.5 ㎕, 5 unit/㎕ ExTaq(다까라 사) 0.25 ㎕, 증류수 15 ㎕, 획득한 DNA 3 ㎕를 PCR용 튜브에서 섞은 후 T3 써모사이클러(바이오메트라 사)를 사용하여 증폭반응을 실시하였다. PCR 반응은 먼저 95℃에서 3분간 반응한 후, 94℃에서 45초, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 세 과정을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 상기 방법으로 증폭한 DNA는 1.2% 아가로즈젤에서 증폭여부를 확인하였다(도 5참조). 증폭되지 않은 샘플은 1차 PCR 반응액을 주형으로 첨가하고 프라이머를 L16010과 K408을 사용하여 1차와 동일한 조건으로 2차 PCR 반응을 실시하였다(도 5참조). 이와 같은 반응을 총 101개의 샘플에서 실시한 결과표 3과 같은 결과를얻을 수 있었다.

상기 방법으로 증폭된 DNA는 E.Z.N.A.^®Cycle-Pure Kit(오메가 바이오-텍 사, D6493-02) 를 사용하여 증폭된 DNA만을 정제한 후 ABI PRISM^®BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(퍼킨엘머 사, 4390242)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 반응에 사용된 프라이머로 HV1 부위는서열번호 3으로 기재되는 L16010과서열번호 4로 기재되는 H16395를 사용하여 양방향으로 염기서열을 분석하였고, HV2 부위는서열번호 5로 기재되는 L048을 사용하여 한쪽 방향으로만 분석하였다. 반응은 제품에서 제시하는 방법에 따라 진행하였고, 염기서열 분석은 ABI Prism^TM3100 자동염기분석기를 사용하였다.

표 4는 101 샘플을서열번호 4로 기재되는 H16395를 사용하여 염기서열분석을 실시한 결과이며 결과의 질은 염기서열 식별가능 여부에 따라 좋음과 나쁨으로 구분하였다.도 6및7,8은 염기서열분석 결과 예로서,도 6은서열번호 3으로 기재되는 L16010를,도 7은서열번호 4로 기재되는 H16395를도 8은서열번호 5로 기재되는 L048를 사용하여 염기서열 분석을 실시한 결과이다. 각 그림의 상단은 양질의 결과를 보였고, 하단은 호모폴리머 C 스트레치 서열로 인하여 그 뒤쪽 분석결과가 좋지 않게 되는 결과를 보였다.도 9는 분석결과가 좋지 않은 샘플의 예를 보였다. 상단은 염기서열을 전혀 알 수 없는 결과이고 하단은 피크 수준이 너무 낮아서 염기서열 분석이 어려운 결과를 보였다.

101개의 지문샘플에서 획득한 DNA로부터 미토콘드리아 DNA 증폭

1차 PCR
PCR 증폭여부	샘플수	%
양성	92	91.1
음성	9	8.9
전체	101	100
2차 PCR(1차 PCR 결과 음성인 9개의 샘플)
PCR 증폭여부	샘플수	%
양성	9	100
음성	0	0
전체	9	100

지문에서 획득한 DNA의 염기서열분석 결과의 질

결과의 질	샘플수	%
좋음	89	88
나쁨	12	12
전체	101	100

<실시예 5> 지문 날인 후 4 내지 5개월 동안 상온 보관된 카드상에서 DNA 획득

본 발명자들은 본 발명에서 사용하는 접착성 쉬트의 DNA를 보관할 수 있는 시간을 알아보고자 하였다.

아이디프린트에 지문을 날인하여 4 내지 5개월 동안 상온 방치된 샘플에서 DNA를 상기 실시예 1의 방법으로 획득하였다. 획득한 DNA는 AmpFlSTS^®Profiler Plus^TMPCR Amplification Kit(퍼킨엘머 사, 403038)를 사용하여 STR을 분석하였다(도 12참조).

상기 분석 결과 4 내지 5개월 동안 상온 보관하여도 접착성 쉬트상의 표피DNA에는 거의 손상이 없는 것으로 나타났다. 상기 결과를 통해 본 접착성 쉬트는 단기간 DNA 보관을 위한 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 6> 친생자 검사에 이용 가능성 타진

본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법에 의해 획득한 DNA를 친생자 검사에 이용 가능한지 알아보기 위해 미토콘드리아의 과변이 부위의 염기서열을 분석하였다.

도 10과 같은 가계에서 아이디프린트 카드를 사용하여 지문을 채취한 후 상기 실시예 1의 방법에 의해 DNA를 획득하였다. 획득한 DNA는 AmpFlSTR^TMGreen I PCR Amplification Kit(퍼킨엘머 사, 402902)를 사용하여 3개의 STR 유전자좌의 유전을 확인하였고,서열번호 1로 기재되는 L15997와서열번호 2로 기재되는 K408 프라이머를 사용하여 미토콘드리아 DNA의 과변이 부위를 증폭하고,서열번호 3으로 기재되는 L16010 프라이머와서열번호 4로 기재되는 H16395 프라이머를 사용하여 HV1 부위의 염기서열을 분석하였다.

그 결과도 10의 가계에서 3개의 STR 유전자좌는 모두 정상적으로 유전되었음을 확인하였다(도 10참조). 또한 모계유전되는 미토콘드리아 DNA도 B, D, E, G, H, I, J 모두 염기서열이 동일한 것으로 확인되는바 정상적인 유전이 이루어졌음을 알 수 있었다(도 11참조).

상기의 결과를 통해 본 발명의 방법을 사용하여 아이디프린트 카드상의 지문으로부터 획득한 DNA는 친생자 검사도 가능함을 알 수 있었다.

<실시예 7> DNA 회수 성공률을 높이기 위해 좌우 엄지 지문 채취

본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법에 의해 획득한 DNA의 회수 성공률을 높이고자 하였다.

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제시하는 방법으로 지문을 채취하여 DNA를 획득하였으나 약 30% 정도의 샘플에서는 명확히 알 수 없는 결과를 보였다. 이러한 개인차를 줄이기 위한 방책으로 좌우 엄지손가락 지문을 동시에 채취하여 먼저 한쪽 지문에서 DNA를 획득하여 실험한 후 결과가 좋지 않을 경우 다른 한쪽 지문에서 DNA를 획득하여 실험하는 대안을 도입하여 보았다.

좌우 엄지손가락 지문으로부터 각각 획득한 DNA에서 미토콘드리아 DNA를서열번호 1로 기재되는 L15997 프라이머와서열번호 2로 기재되는 K408 프라이머를 사용하여 증폭해 본 결과 대체로 좌우에서 증폭되는 수준은 비슷하나 경우에 따라서는 한쪽에서 증폭되지 않거나 증폭량이 현저히 적은 결과를 보이는 샘플이 있었다(도 13참조). 또한 상기 샘플을 AmpFlSTR^®Profiler Plus^TMPCR Amplification Kit (퍼킨엘머사, 403038)를 사용하여 STR을 분석해본 결과 한쪽에서는 명확치 않은 결과가 다른 한쪽에서는 뚜렷하게 구분할 수 있는 결과를 보이는 예도 있었다(도 14참조).

상기의 결과로 볼 때 좌우 엄지 지문을 동시에 검사하는 것은, 결과가 좋지않은 한쪽을 다른 한쪽이 대체할 수 있는 효과뿐만 아니라 한쪽 결과를 다른 한쪽에서 재확인할 수 있는 효과도 있어 결과의 신뢰도를 더욱 높일 수 있음을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명이 제공하는 접착성 쉬트를 이용하여 채취한 사람의 지문으로부터 DNA를 획득하는 방법은 접착성 쉬트로부터 용해완충용액을 이용하여 DNA의 획득을 용이하게 하고, 결합완충용액과 DNA 결합물질을 이용하여 DNA만을 선택적으로 DNA 결합물질에 결합시키고 컬럼을 통과시킴으로써 DNA를 획득하는 것으로, 유전자 분석의 반응을 저해하는 물질의 오염없이 순수하게 DNA를 분리할 수 있고, DNA 회수율이 높으며, DNA 획득과정이 간단하여 대량샘플을 처리하기 위한 기계적 자동화에도 유용하게 사용될 수 있어 대량으로 유전자 분석을 수행하는데 유용하게 사용될 수 있는 방법이다.

Claims (14)

1. 사람의 DNA를 이용한 유전자 분석을 위하여 접착성 쉬트를 이용하여 수검자의 표피를 채취하고 접착성 쉬트에 남겨진 표피로부터 DNA를 획득하는 방법에 있어서, 접착성 쉬트에 남겨진 표피를 용해완충용액을 첨가하여 용해시키고, DNA 결합물질을 이용하여 DNA를 추출하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 획득방법은

   1) 접착성 쉬트를 이용하여 수검자의 표피를 채취하는 단계;

   2) 채취된 표피를 포함하고 있는 접착성 쉬트에 용해완충용액 및 프로티네이즈 K를 첨가하여 용해시키는 단계;

   3) 상기 용해액에 결합완충용액 및 DNA 결합물질을 첨가하여 반응시키는 단계;

   4) 상기 반응액을 컬럼에 채우고 DNA를 세척하는 단계; 및

   5) 상기 컬럼에서 DNA를 용출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 접착성 쉬트는 한쪽 표면에 접착제가 도포되어 있는 지지부를 포함하고, 상기 지지부는 합성수지, 섬유, 금속 또는 양면이 비수용성 막으로 코팅된 종이인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 표피는 손바닥, 손가락, 발바닥 또는 발가락의 표피인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 표피는 엄지손가락 지문인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 용해완충용액은 SDS, TritonX-100, NP-40 및 Tween-20 으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 용해완충용액은 Tris 10 내지 20 mM, EDTA 10 내지 20 mM 및 SDS 0.5 내지 1%를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
8. 제 2항의 2)에 있어서, 상기 프로티네이즈 K는 0.005 내지 0.05 중량%로 첨가하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
9. 제 2항에 있어서, 상기 결합완충용액은 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 아이소티오시아네이트인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 결합완충용액은 구아니딘 하이드로클로라이드 5 내지 6 M, Tris-Cl 20 내지 50 mM, 및 EDTA 20 내지 40 mM을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
11. 제 1항 에 있어서, 상기 DNA 결합물질은 글래스 비드, 실리카 젤 또는 규조토인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 DNA 결합물질은 규조토인 것을 특징으로 하는 DNA획득방법.
13. 제 12항에 있어서 상기 규조토는 직경이 100 내지 500 ㎛인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.
14. 제 2항에 있어서, 상기 컬럼은 필터의 소공 직경이 100 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 DNA 획득방법.