KR100478138B1 - Ｄｎａ 보관체 및 ｄｎａ 보관방법 - Google Patents

Ｄｎａ 보관체 및 ｄｎａ 보관방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 보관체 및 DNA 보관방법에 관한 것으로, 특히 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA를 포함하는 DNA 보관체에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 보관체는 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 형태로 가시화되었으며, 상온에서 반영구적으로 보관할 수 있다.

Description

ＤＮＡ 보관체 및 ＤＮＡ 보관방법{DNA CONTAINED COMPOSITION FOR KEEPING AND METHOD FOR STORING DNA}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 DNA 보관체 및 DNA 보관방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA를 상온에서 반영구적으로 가시화된 형태로 보관하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
인간게놈프로젝트로 DNA 서열이 밝혀지면서, 여러 가지 사회현상이 생겨나고 있다. 그 중 하나가 유전자 은행이다. 유전자 은행은 개인의 게놈을 보관시켜주는 곳으로, 개인의 유전자를 사전에 보관함으로써 추후 발생 가능한 예측불허의 상황과 위해에 대비하고자 하는 차원에서 선진 외국 뿐 아니라 국내에서도 점차 확산되고 있다.
게놈 DNA는 일차적으로 친자확인이나 재난과 재해로 인한 불의의 사고 시 신원확인에 가장 중요한 자료로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 유전질병확인이나 유전질환가계도 분석 시에도 유용한 자료로 활용될 수 있다. 한편, 2001년 1월부터 시행된 장묘법 개정안에 의하면 묘지의 면적제한과 더불어 '시한부 매장제'를 도입, 기본적으로 15년 간 묘지를 설치할 수 있도록 하되 시, 군, 구청장에게 신고하면 15년씩 세 차례까지 자동 연장이 가능토록 하고, 그 이후에는 화장 또는 납골하도록 의무화되었다. 따라서 게놈 DNA는 개인의 유골을 납골당에 모시는 것과 같은 의미로 선조의 DNA를 직접 보관하는 용도로 사용될 수 있으며, 각 가계별로 보관된 게놈 DNA는 향후 미래사회에서 최첨단 과학 기술에 의해 다양한 형태로 사용되어질 수 있다.
현재 국내에 개인의 게놈 DNA를 보관하는 유전자 은행을 가동하는 회사들이 설립 중에 있으며, 국외도 이와 비슷한 실정이다.
게놈 DNA의 보관방법은 냉동보관이 일반적이며, 표피 또는 혈액을 저온(-20℃, 또는 -70℃)에서 보관하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 특별 냉동장치가 요구되며, 이후 장치유지비용 또한 영구적으로 발생하여 막대한 경제적 부담이 발생한다.
또 다른 DNA의 보관 방법은 생물학적 샘플에서 DNA를 분리하고 이를 건조하여 보관하는 방법과 에탄올에 넣어 상온에 보관하는 방법이 있다. 그러나 이러한 방법에 의해 얻어진 DNA는 시각화되지 않아 가시적으로 보이지 않을 뿐 아니라 조건을 갖춘 실험실이 아닌 장소에서 장기간 보관하는 데는 부적합한 형태이다.
상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 간편하고, 안전하게 게놈 DNA를 보관할 수 있는 방법을 제공하는 목적과 동시에 DNA를 시각화하여 그로부터 얻어 질 수 있는 다양한 효과를 제시하는데 있다.
또한 본 발명은 경제적이면서도 반영구적으로 게놈 DNA를 보관할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 종래의 납골문화를 대체할 수 있으며, 반영구적으로 선조의 DNA를 상온에서 보관할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 게놈 DNA 보관용 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 DNA를 규조토 또는 수산화인회석에 결합시켜 분말상태로 시각화할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA를 포함하는 DNA 보관체를 제공한다.
상기 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA는 정제된 DNA에 구아니딘-HCl을 넣고, 여기에 규조토 또는 수산화인회석를 혼합하고, 상기 혼합물을 알코올로 세척 및 건조하여 제조할 수 있으며, 또는 DNA를 포함하는 시료의 단백질을 제거하고, 상기 단백질이 제거된 시료에 구아니딘 이소티오시아네이트를 넣고, 여기에 규조토 또는 수산화인회석을 첨가하여 반응시키고, (c) 상기 반응물을 알코올로 세척 및 건조하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기의 DNA 보관체를 용기에 넣어 보관하는 것인 DNA 보관방법을 제공한다.
또한 본 발명은 가루형태로 변형시킨 DNA 및 그 보관체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 게놈 DNA을 규조토 또는 수산화인회석에 결합시켜 상온에서 반영구적으로 DNA를 보관할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
규조토는 평균 크기 50 내지 100 마이크로미터 크기의 규조류(diatome)라고 불리는 부유성 조류(藻類; algae) 껍데기로 이루어진 퇴적물이다. 규조토는 가공정도에 따라 자연(natural) 규조토, 소결(calcined) 규조토 및 용결(fluxed) 규조토로 나뉜다. 규조토는 주로 SiO2로 이루어져 있으며, 그외 Al2O3, Fe 2O3, Na2O, K2O, CaO, MgO, PO2O5 및 TiO2를 소량 포함하고 있다.
본 발명의 바람직한 규조토는 입경 10~100 ㎛의 크기를 가지며, SiO2를 97 중량% 이상 포함하는 것이다.
수산화인회석(Hydoxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2)은 분말상이나 일정 형태를 가지는 구조물일 수 있다.
본 발명에서 언급하는 게놈 DNA는 동물의 조직 또는 세포로부터 추출 및 정제한 DNA이며, 보다 구체적으로는 타액, 구강상피세포, 머리카락 또는 혈액으로부터 추출된 것이다.
본 발명에서는 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA 보관체를 제공한다. DNA 보관체는 1 ㎍의 DNA에 대하여 1 ㎍ 내지 1000 mg의 규조토 또는 수산화인회석를 포함하며, 바람직하게는 20 내지 100 ㎎의 규조토 또는 수산화인회석를 포함한다. 1 ㎍ 미만의 규조토 또는 수산화인회석에 DNA를 결합시킬 경우 DNA가 결합되지 않고 손실되는 문제점이 발생할 수 있으며, 1000 ㎎을 초과하여 결합시킬 경우에는 DNA가 회수되지 않거나, 또는 DNA에 많은 손실을 가져오는 문제점이 발생될 수 있다.
본 발명의 규조토 및 상기 규조토에 결합된 DNA를 포함하는 DNA 보관체는 정제된 DNA를 규조토에 결합시키거나, DNA 추출과정중에 규조토를 결합시키는 방법으로 제조한 후, 이를 건조하는 방법으로 제조할 수 있다.
먼저, 정제된 DNA를 규조토에 결합시키는 방법은 (a) 정제된 DNA에 구아니딘-HCl 및 규조토를 혼합하는 단계, (b) 상기 혼합물을 알코올 및 건조하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서는 DNA 1 ㎍에 0.3 내지 0.5 mL의 7 M 구아니딘-HCl와 1 ㎍ 내지 1000 ㎎의 규조토를 혼합할 수 있다.
다음으로, DNA 추출 과정 중에 규조토를 첨가하여 규조토에 결합된 DNA를 제조하는 방법은 (a) DNA를 포함하는 시료의 단백질을 제거하는 단계, (b) 단백질이 제거된 시료에 구아니딘 이소티오시아네이트 및 규조토를 첨가하여 반응시키는 단계, (c) 상기 반응물을 알코올로 세척 및 건조하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서는 통상의 DNA 추출방법에서 사용되는 단백질 제거방법으로 실시될 수 있으며, 일 예로 프로테아제를 처리하고, 유기용매를 혼합한 다음 원심분리로 상층액만을 회수할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 100 ㎕의 시료에 0.3 내지 0.5 ㎖의 7M의 구아니딘 이소시아네이트와 20 내지 100 ㎎의 규조토를 혼합할 수 있다.
또한, 본 발명의 수산화인화석 및 상기 수산화인화석에 결합된 DNA를 포함하는 DNA 보관체는 상기에 언급한 규조토를 이용한 DNA 보관체 제조방법과 동일한 방법으로 실시가능하며, 이러한 기술은 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 누구나 용이하게 실시할 수 있다.
본 발명의 DNA 보관체는 규조토 또는 수산화인화석에 결합된 형태로 DNA를 시각화시킬 수 있으며, 시각화된 상품으로 사용할 수 있다. 또한 상기 DNA는 규조토 또는 수산화인회석 결합 전 또는 후에 염료 또는 형광물질로 염색시켜 다양한 색상으로 시각화시킬 수 있다. 상기 염료로는 브로모페놀블루, 페놀 레드 등의 일반염료 등이 있으며, 형광물질로는 EtBr 등이 있으며, 통상의 방법으로 실시 가능하다. 또한 상기 규조토 또는 수산화인회석 역시 염료 또는 형광물질로 염색할 수 있다.
본 발명의 DNA 보관체는 상온에서 용기에 넣어 보관할 수 있으며, 바람직하게는 DNA가 물리적으로 파괴되지 않는 온도(80 ℃)이하에서는 장기적으로 보관할 수 있다. 이후 DNA 보관체로부터 DNA를 회수할 경우 증류수 또는 TE 완충용액을 이용하여 쉽게 회수할 수 있다. 또한 DNA 보관체는 납골용으로 사용하여 선조의 DNA를 반영구적으로 보관할 수 있다.
또한 본 발명은 DNA 보관방법을 제공한다. DNA 보관방법은 상기에서 언급한 DNA 보관체를 용기에 넣어 보관하는 것으로, 납골방법일 수 있으며, 다양한 형태 또는 재질의 용기에 넣어 상온에서 보관하는 것이다.
본 발명의 DNA 보관방법은 기존의 저온보관만이 가능하였던 DNA를 상온에서 보관할 수 있도록 간편화하였을 뿐만 아니라 DNA 보관을 위해 사용된 특수 장비나 이의 유지비용을 생략시켜 경제적인 부담을 해소시킨다. 또한 DNA가 결합된 형태로 시각화된 DNA 보관체는 개인이 자체 보관하여 유사시에 사용할 수 있으며, 다양한 용기에 담아 쉽게 보관할 수 있다.
이에 본 발명의 DNA 보관방법은 종래의 납골방법을 대체할 수 있는 방안으로 최소의 비용으로 반영구적으로 선조의 DNA를 상온에서 보관할 수 있는 새로운 납골방법으로 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 규조토에 정제한 DNA 결합시키는 방법
(1) DNA 추출
조직 또는 세포에 380 ㎕의 TEN 완충액(Tris-Cl, EDTA, NaCl), 20 ㎕의 10 % SDS 완충액 및 프로테나제 K를 처리하여 65 ℃에서 1시간동안 방치하였다. 여기에 400 ㎕의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올을 혼합하고, 13,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액 400 ㎕를 분리하였다. 상층액에 3 M 소듐 아세테이트 40 ㎕ 및 100 % 에탄올 1 ㎖를 가하고, -20 ℃ 또는 -70 ℃에 20분 이상 방치하였다. 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 80 % 에탄올로 2회 이상 세척하여 DNA를 건조시켰다. 이후 DNA는 증류수 또는 TE 완충에 용해시킨 후 전기영동 또는 분광광도계로 DNA 농도를 정량 한 후 보관하였다.
(2) 규조토에 DNA 결합
2 ㎖ 튜브에 2% 규조토, 7M 구아니딘-HCl 300 ㎕를 넣고 1분간 혼합하였다. 이를 13,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 75 % 에탄올로 세척하여 건조시켰다. 이후 건조된 규조토는 밀봉 가능한 용기에 넣어 밀봉하여 보관하였다.
실시예 2: DNA 추출 과정 중 규조토 첨가하여 결합시키는 방법
조직 또는 세포에 380 ㎕의 TEN 완충액(Tris-Cl, EDTA, Nacl), 20 ㎕의 10 % SDS 완충액 및 프로테나제 K를 처리하여 65 ℃에서 1시간동안 방치하였다. 여기에 400 ㎕의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올을 혼합하고, 13,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액 400 ㎕를 분리하였다. 여기에 2 % 규조토, 7M 구아니딘 이소티오시아네이트 1.2 ㎖를 넣고 혼합하여 30분간 반응시켰다. 이후 13,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 75 % 에탄올로 3회 세척하여 건조시켰다. 건조된 규조토는 밀봉 가능한 용기에 넣어 밀봉하여 보관하였다.
실시예 3: DNA 보관성 검증
구강 상피세포로부터 DNA를 정제하고, 규조토에 결합시킨 후 밀봉 가능한 용기에 넣고 밀봉하여 상온에서 보관하였다.
이후, DNA 보관시간에 따라 DNA를 회수하고, 50 ng의 DNA를 전기 영동 하여 DNA 안정성을 확인하였다.
도 1의 DNA를 규조토에 결합시킨 상태로 보관하고, 보관한 시간에 따른 DNA 안정성을 전기영동으로 확인한 것이다. 도 1의 레인1은 보관 전 DNA 이고, 레인 2는 1개월 후 DNA이고, 레인 3은 2개월 후 DNA이고, 레인 4는 5개월 후 DNA이고, 레인 5는 9개월 후 DNA이고, 레인 6은 1년 후 DNA이다.
도 1에서, DNA는 규조토에 결합한 상태로 반영구적으로 보관할 수 있음을 알 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 규조토 또는 수산화인회석을 이용한 DNA 보관방법은 기존의 저온보관만이 가능하였던 DNA를 상온에서 보관할 수 있도록 간편화하였을 뿐만 아니라 DNA 보관을 위해 사용된 특수 장비나 이의 유지비용을 생략시켜 경제적인 부담을 해소시킨다. 또한 보다 일반적인 방법으로 개인이 직접 보관할 수 있는 실용성과 동시에, '눈으로 볼 수 있는 DNA'라는 의미에서 납골이나 화장에 대한 거부감과 상실감을 대체시킬 수 있는 만족감을 제공할 수 있다. 또한 보다 안정한 DNA의 보관은 예측 불허한 자연재해나 사고시에 필요한 DNA 분석실험에 유용하게 사용할 수 있으며, 가계의 유전자를 대대로 물려줄 수 있다는 의미에서 이 DNA 보관 시스템이 노릴 수 있는 효과는 크다고 볼 수 있다.
도 1은 DNA를 규조토에 결합시킨 상태로 보관하고, 보관한 시간에 따른 DNA 안정성을 전기영동으로 확인한 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 정제된 DNA에 구아니딘-HCl을 넣고, 여기에 규조토 또는 수산화인회석를 혼합하고; 및
    (b) 상기 혼합물을 알코올로 세척 및 건조하여 제조하는 것;
    을 포함하는 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA 보관체 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 보관체는 규조토 또는 수산화인회석에 결합되어 가시화된 것인 DNA 보관체 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 DNA는 염료 또는 형광물질로 염색되어 더욱 가시화된 것인 DNA 보관체 제조방법.
  4. 삭제
  5. (a) DNA를 포함하는 시료의 단백질을 제거하고;
    (b) 상기 단백질이 제거된 시료에 구아니딘 이소티오시아네이트를 넣고, 여기에 규조토 또는 수산화인회석을 첨가하여 반응시키고; 및
    (c) 상기 반응물을 알코올로 세척 및 건조하여 제조된 것;
    을 포함하는 규조토 또는 수산화인회석에 결합된 DNA 보관체 제조방법.
  6. 제 1항 내지 3항 및 제 5항중 어느 한항에 있어서, 상기 DNA 보관체는 납골용인 것인 DNA 보관체 제조방법.
  7. 제 1항 내지 3항 및 제 5항중 어느 한항에 따른 방법으로 제조된 DNA 보관체를 용기에 넣어 보관하는 것인 DNA 보관방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 DNA 보관방법은 납골인 것인 DNA 보관방법.
  9. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 DNA 보관체는 가루형태인 DNA 보관체 제조방법.
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