JPH07143879A

JPH07143879A - Ｄｎａの分離精製方法

Info

Publication number: JPH07143879A
Application number: JP31741193A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Ezaki; 孝行江崎; Kazuo Shimizu; 和郎清水
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1993-11-24
Publication date: 1995-06-06

Abstract

(57)【要約】【目的】細胞からＤＮＡを高純度で且つ簡便に分離精製
する方法を提供する。【構成】界面活性剤、細胞壁溶解酵素及び蛋白分解酵素
との処理によりＤＮＡを遊離させた細胞を、尿素及びリ
ン酸ナトリウムを含有する水溶液とし、該水溶液をヒド
ロキシアパタイトに接触せしめてＤＮＡを吸着させた
後、該ヒドロキシアパタイトを、尿素及びリン酸ナトリ
ウムの混合水溶液で洗浄し、更に水洗してから、リン酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム又は炭酸水素アンモニ
ウムの水溶液と接触せしめてＤＮＡを含有する溶出液を
収得し、水で希釈した上でアルコール沈澱法によりＤＮ
Ａを析出させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞からＤＮＡを高純
度で且つ簡便に分離精製する方法に関する。本発明の方
法は、原核生物並びに真核生物の遺伝子解析や所謂ＤＮ
Ａ診断又は遺伝子操作等において必要とされている生物
細胞のＤＮＡの分離精製法として有用である。

【０００２】

【従来の技術】細胞からＤＮＡを抽出調製することに関
しては種々の方法が提案されており、広く採用されてい
る基本的なＤＮＡ抽出調製法として、以下のからの
工程からなる方法がある。細胞を界面活性剤及び必要に応じて細胞壁分解酵素で
処理して溶解すると共に蛋白分解酵素で蛋白質を分解さ
せる。必要に応じて、セチルトリメチルアンモニウムブロミ
ド処理により多糖類を除去する。フェノール・クロロホルム処理により蛋白質を除去す
る。アルコール添加によってＤＮＡ（ＲＮＡが混在する）
を沈澱収得する。リボヌクレアーゼＡ処理によりＲＮＡを分解する。フェノール・クロロホルム処理によりリボヌクレアー
ゼＡを除去する。アルコール添加によってＤＮＡを沈澱収得する。上記の方法は、高価な機器を必要とせず、又ＤＮＡの収
量がμｇからmgのオーダーにわたり巾広く適用できる便
利さがあるが、他方多糖類、蛋白質及びＲＮＡの除去に
それぞれの操作が必要で、多段階の工程を要すること、
中でもフェノール・クロロホルム処理工程において発生
する廃液は煩瑣な廃棄処理が必要であり、難点を少なし
としない。

【０００３】さて、ヒドロキシアパタイトがＤＮＡ吸着
能を有することは既に知られており、この性質を利用し
て上記方法を改善する試みがある。即ち、ブリテン等
は、上記工程で得られる細胞崩壊液をヒドロキシアパ
タイトと接触させるに際して、細胞崩壊液を約８モル濃
度の尿素と約０．２４モル濃度のリン酸ナトリウムを含
有する水溶液としたとき、ヒドロキシアパタイトにＤＮ
Ａは吸着するが、多糖類、蛋白質及びＲＮＡは吸着しな
いことを見出し、これを利用したＤＮＡの分離精製方法
を提示している（R.J.Britten etal.Carnegie Inst. Wa
sh. Yearbook 68, 400 , 1970年及びW.Meinke etal. An
al. Biochem.,58,82,1974年）。しかしながら、この方
法は実際にはあまり利用されていない。それは、ＤＮＡ
を溶離させるのに、０．４８モル濃度という高濃度のリ
ン酸ナトリウム溶離液を使用するため、例えば制限酵素
処理等の諸酵素反応が阻害され、折角収得したＤＮＡに
対する以降の諸操作を実施できない状況となるからであ
る。

【０００４】このような状況を避けるため、溶出液中に
おいてＤＮＡと混在するリン酸ナトリウムを除去する方
法として、溶出液の透析又はゲル濾過が考えられるが、
いずれもＤＮＡの付着損失を招き、殊に高分子ＤＮＡ鎖
では切断も起こり易く、ＤＮＡを損なうことなく収得す
ることが困難となる。又、アルコール添加によりＤＮＡ
を析出させる所謂アルコール沈殿法でも、ＤＮＡとリン
酸ナトリウムが同時に沈澱してしまい、これを回避する
には溶出液を水で約５００倍に希釈する必要があるが、
このように溶出液中のＤＮＡ濃度を小さくするとＤＮＡ
も沈澱として得られない。

【０００５】所で、ブリテン等の方法が実用化されてい
ないのには更に原因がある。即ち、従来吸着剤として調
製され又は提供されてきたヒドロキシアパタイトは、例
えばチゼリウス（A.Tiselius）の提示になるものは板状
又は鱗片状微小粒子で圧密されて、通液性が低く、分析
に用いる程度の流速を得るにも加圧が必要な程で、特に
本発明における分離対象のＤＮＡは高分子である上に、
多数の電離基をもって大きく広がっており、そのうち分
子量の大きなものは、圧密されたヒドロキシアパタイト
間の細隙に捕らえられて回収することができない。又、
ヒドロキシアパタイトの微小粒子を団塊に固結したもの
もあり、あたかも液の流れは遅滞なきに見受けられる
が、大きなＤＮＡ分子は固結粒子間の行き止まりに捕捉
され、回収されないことは同然である。事実、板状又は
鱗片状のヒドロキシアパタイトを試用する実験者のいず
れもが努力を放棄する結果となっている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来より広
く実施されている基本的なＤＮＡ抽出調製法をヒドロキ
シアパタイトを用いて実施する場合の問題点を解決し、
細胞からＤＮＡを高純度で且つ簡便に分離精製する方法
を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため鋭意検討した結果、特定の濃度を有す
るリン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は炭酸水素
アンモニウムの水溶液を溶離液として試みた所、溶出液
を水で特定の倍率で希釈すると、意外にも、アルコール
沈殿法により、溶出液からリン酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム又は炭酸水素アンモニウムを析出させずにＤ
ＮＡのみを析出させることができることを見出し、本発
明を完成するに到った。即ち、第一の本発明は、界面活
性剤及び蛋白分解酵素との処理に附してＤＮＡを遊離さ
せ、尿素及びリン酸ナトリウムを含有する水溶液とし、
該水溶液をヒドロキシアパタイトに接触せしめてＤＮＡ
を吸着させた後、該ヒドロキシアパタイトを、尿素及び
リン酸ナトリウムの混合水溶液で洗浄し、更に水洗して
から、溶離液である１．８〜２．０モル濃度のリン酸ア
ンモニウム水溶液と接触せしめてＤＮＡを含有する溶出
液を収得し、該溶出液を水で１０倍に希釈した後、アル
コールを添加混合して、ＤＮＡを析出させることを特徴
とするＤＮＡの分離精製方法であり、第二の本発明は、
上記の溶離液が、炭酸アンモニウム又は炭酸水素アンモ
ニウムを１．８〜２．０モル濃度含有する水溶液であ
り、溶出液の希釈に用いる水の量が２倍（容積）である
ことを特徴とするＤＮＡの分離精製方法であり、第三の
本発明は、上記のヒドロキシアパタイトとして、六角柱
状又は針状のヒドロキシアパタイトからなり、細孔容積
が１〜５ml/ ｇであるヒドロキシアパタイト凝集体を用
いることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のＤＮ
Ａの分離精製方法である。

【０００８】以下、本発明を詳述する。（細胞崩壊）本発明の方法は、細胞からその遺伝子的成
分であるＤＮＡを分離精製することに係わり、本発明に
おいて、細胞の種類は制限はなく、原核細胞及び真核細
胞のいずれであっても良い。本発明の方法は、先ず細胞
を崩壊してＤＮＡを遊離せしめることから出発する。細
胞崩壊を行うには、細胞を界面活性剤で処理すれば良
い。界面活性剤の好ましい具体例として、例えばドデシ
ル硫酸ナトリウムやＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリ
ウム等がある。なお、原核細胞においては、細胞壁のあ
るものが多いので、細胞崩壊を行うためには、リゾチー
ム或いはクロモペプチターゼ等の細胞壁多糖類分解酵素
を併用することが望ましい。

【０００９】次に、細胞内において蛋白質と結合してい
るＤＮＡを遊離させるために、蛋白分解酵素処理をす
る。蛋白分解酵素の好ましい具体例として、例えばプロ
ナーゼや殊に最近はプロティナーゼＫ（和光薬品株式会
社製）がある。

【００１０】界面活性剤、細胞壁溶解酵素又は蛋白分解
酵素で細胞を処理する工程は、同時に行っても、別々に
行っても良く、好ましい処理条件は、室温から６０℃、
より好ましくは３７℃から６０℃に至る間の温度で、数
分から数時間にわたる。そして、充分ＤＮＡを遊離せし
めることが望ましい。なお、フレンチプレス等の機械的
崩壊作用を利用することも可能であるが、ＤＮＡの解裂
を避けるため、できれば穏和な作用条件が望ましい。

【００１１】上記のようにして細胞崩壊を行った後、Ｄ
ＮＡを遊離させた細胞を尿素及びリン酸ナトリウムを含
有する水溶液とする必要がある。この水溶液をヒドロキ
シアパタイトと接触させることにより、ヒドロキシアパ
タイトに蛋白質、ＲＮＡ及び多糖類等の不純物を吸着さ
せず、ＤＮＡのみを吸着させることができる。上記水溶
液における好ましい尿素の濃度は６〜８モル濃度であ
り、好ましいリン酸ナトリウムの濃度は０．２０〜０．
２４モル濃度である。このように各成分の濃度を調整す
ると、蛋白質等のＤＮＡ以外の不純物がヒドロキシアパ
タイトに吸着するのを抑制することができる。

【００１２】（吸着）上記のようにして得た溶液をヒド
ロキシアパタイトに接触せしめて、ＤＮＡをそれに吸着
せしめる。

【００１３】従来、ヒドロキシアパタイトにＤＮＡを吸
着させる方法に特に制限はなく、例えば上記のようにし
て得たＤＮＡを含有する溶液（以下、単にＤＮＡ含有液
という）とヒドロキシアパタイトとを、容器中で攪拌し
ながら接触させる方法、或いはカラムに充填したヒドロ
キシアパタイトにＤＮＡ含有液を通液する方法等があ
る。操作を連続的に行うには、通常カラムに通液する方
法が好ましい。しかし、一般のヒドロキシアパタイトに
おいてはカラムに充填した場合、ＤＮＡ含有液は通常高
粘性であるため、カラムを円滑に通過させることは容易
ではないので、カラム通液を行う場合には、円滑にカラ
ムを通過せしめることができ、負荷、洗浄を極めて円滑
且つ効果的に遂行できることから、ヒドロキシアパタイ
トとして、ヒドロキシアパタイト凝集体を用いることが
好ましい。

【００１４】上記のヒドロキシアパタイト凝集体は、特
開昭６２−１７６９０号公報又は米国特許第５，０７
３，３５７号に記載されたものと同じであって、六角柱
状又は針状のヒドロキシアパタイト単結晶が凝集した、
平均粒径６０〜１００μｍの凝集体であり、細孔容積が
１〜５ml/gなるもの（以下、単にヒドロキシアパタイト
凝集体と略記する）であり、市販品としてギガパイト
（東亞合成化学工業株式会社製商品名）がある。

【００１５】この材料は、極めて高い通液性を有し、高
分子電解質水溶液に特有の高粘性を呈するＤＮＡ含有溶
液も円滑に通過し、その間効果的な吸脱着による分離精
製が遂行される。殊に、従前のヒドロキシアパタイト材
料に見られる大きなＤＮＡ断片の繋留損失の回避が期せ
られる。

【００１６】（洗浄）上記のようにして、ヒドロキシア
パタイトにＤＮＡを吸着させた後、尿素及びリン酸ナト
リウムの混合水溶液を暫く流して、蛋白質、ＲＮＡ、多
糖類等を流去し、次いで水を通して、尿素、リン酸ナト
リウムを洗去する。尿素及びリン酸ナトリウムの好まし
い混合水溶液として、６〜８モル濃度の尿素、０．２０
〜０．２４モル濃度のリン酸ナトリウムを含有する緩衝
液（ＰＨ値６．８、以下ＰＵ液と略記する）がある。こ
の水溶液を用いることにより、効率的に蛋白質、ＲＮ
Ａ、多糖類等の不純物を流去することができる。

【００１７】（溶離）上記のようにして、洗浄した後、
従来の方法では、０．４８Ｍ−リン酸ナトリウム水溶液
でＤＮＡを溶離させるのであるが、本発明では溶離液と
して、１．８〜２．０モル濃度のリン酸アンモニウム水
溶液、同濃度の炭酸アンモニウム又は、同濃度の炭酸水
素アンモニウムの各水溶液を使用する。溶離液の濃度が
１．８モル濃度未満では、ＤＮＡ以外の不純物が混在し
てしまい、高純度のＤＮＡを得ることができないという
問題があり、一方溶離液の濃度が２．０モル濃度を越え
るとヒドロキシアパタイトに対するＤＮＡの吸着効率が
低下するため、収率良くＤＮＡを得ることが困難とな
る。

【００１８】（アルコール沈殿）上記のようにして溶離
して得た溶出液を、水で希釈した後、アルコールを添加
混合して、ＤＮＡを析出させる。溶離液として、リン酸
アンモニウム水溶液を用いた場合には、水による溶出液
の希釈倍率は１０倍であり、炭酸アンモニウム又は炭酸
水素アンモニウムを用いた場合には、水による溶出液の
希釈倍率は２倍である。もしも、溶離液として、０．４
８Ｍリン酸ナトリウム水溶液を使用した場合には、アル
コールの添加により溶出液からＤＮＡを沈澱させるため
にも、その他の後工程のためにも、リン酸ナトリウムを
除去するために、透析乃至ゲル濾過が必要であるが、こ
れには時間と手間を要し、且つＤＮＡの劣化、損失が招
来されるという問題がある。

【００１９】上記の好ましいアルコールとして、エチル
アルコール及びイソプロピルアルコール等があり、その
好ましいアルコールの添加条件として、水で希釈した
後、その希釈した溶出液の２倍量（容積）のエチルアル
コール又は等倍量（容積）のイソプロピルアルコールを
添加する。このような条件でアルコール沈澱を行うこと
によって、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は
炭酸水素アンモニウムを沈澱させずに、ＤＮＡのみを沈
澱させることができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００２１】実施例１（グラム陰性細菌フラボバクテリ
アからのＤＮＡの分離精製）フラボバクテリア（Flavobacteria ）の普通寒天平板１
夜培養を集菌し、その１００mgを１０mMＥＤＴＡ加生理
食塩水１mlに懸濁し１０mg/ml リゾチーム液１００μl
を混合し、３７℃に１時間保持した。次いで、２０％Ｓ
ＤＳ液５０μlと１０mg/ml プロティナーゼＫ（和光薬
品株式会社製）を５０μl 添加して、６０℃に１時間保
持する。

【００２２】これに８Ｍ−尿素，０．２４Ｍ−リン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ値６．８（以下、ＰＵ液と略記す
る）９mlを混合し、予めＰＵ液で平衡化したヒドロキシ
アパタイト凝集体１ml（0.8φ×2.0cm）を充填したカラ
ムに負荷する（流速：約０．５ml/ 分）。更に、ＰＵ液
５mlを通し、次いで水１０mlで洗浄した後、２Ｍ−リン
酸アンモニウム水溶液（ｐＨ値６．８）２mlを通してＤ
ＮＡを溶出する。溶出液に水を加えて２０mlとした上
で、冷イソプロピルアルコール２０mlを重層して放置５
分後、遠心して析出するＤＮＡを沈澱として上澄みと分
離し、沈澱には７０％エチルアルコールを加えて再度遠
心し、沈澱を収得し、乾燥する。

【００２３】乾燥ＤＮＡを１mM−ＥＤＴＡ、１０mM−ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ値８．０）１０mlに溶解し、波長
２６０nm及び２８０nmの紫外線吸光度を測定し、下記の
値を得た。ＯＤ₂₆₀＝０．３７２，ＯＤ₂₈₀＝０．２１０これより、ＤＮＡ収量は０．１９mgであり、又ＯＤ₂₆₀
/ ＯＤ₂₆₀＝１．７７と算出される。

【００２４】実施例２（グラム陽性細菌ストレプトコッ
カス・ミティスからのＤＮＡの分離精製）ストレプトコッカス・ミティス（Streptococus mitis）
をトッド・ヘィウッド（Todd・ Heywood ）液体培地に１
夜培養し、６０００rpm で遠心集菌し、その０．５ｇを
５mM−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５mlに懸濁し、これに細
胞壁溶解酵素アクロモペプチダーゼ（和光薬品株式会社
製）１０mg/ml 液を２５０μｌ添加して、３７℃２時間
保持し、次いで２０％ＳＤＳ・アルカリ液２５０μｌを
加えて５５℃で１時間処理し、更に１０mg/ml プロティ
ナーゼＫを２５０μl 加えて、引き続き５５℃で１時間
処理する。

【００２５】これにＰＵ液４５mlを混合し、予めＰＵ液
で平衡化したヒドロキシアパタイト凝集体５ml（1.0φ
×6.5cm）を充填したカラムに負荷する（流速：約１ml/
min）。更にＰＵ液２５mlを通し、次いで水５０mlで洗
浄した後、２Ｍ−炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ
８．２）１０mlを通してＤＮＡを溶出する。溶出液に水
を加えて２０mlとした上で、冷エチルアルコール４０ml
を重層して放置５分後、遠心して白色沈澱を上澄みと分
離し、沈澱を７０％エチルアルコールに懸濁し、再度遠
心し、沈澱を分離し、乾燥する。

【００２６】乾燥ＤＮＡを１mM−ＥＤＴＡ、１０mM−ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ値８．０）２５mlに溶解し、実施
例１に倣って紫外線吸光度を測定し、下記の値を得た。ＯＤ₂₆₀＝０．７５７，ＯＤ₂₈₀＝０．４２１これより、ＤＮＡ収量は０．９５mgであり、又ＯＤ₂₆₀
/ ＯＤ₂₈₀＝１．８０と算出される。

【００２７】実施例３（牛型結核菌マイコバクテリウム
・ボビスからのＤＮＡの分離精製）マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis ）
を小川培地に約１ヵ月培養し、集菌した。その１００mg
を１mM−ＥＤＴＡ、１０mMトリス塩酸緩衝液（（ｐＨ
８．０）１mlに懸濁し、１０mg/ml リゾチーム液１００
μl を添加し、３７℃で１８時間保持した。次いで、２
０％ＳＤＳ液５０μl と１０mg/ml プロティナーゼＫ液
を５０μl 添加して、６０℃に１時間保持する。

【００２８】これにＰＵ液９mlを混合し、予めＰＵ液で
平衡化したヒドロキシアパタイト凝集体２ml（0.8φ×
3.5cm）を充填したカラムに負荷する（流速：約0.5ml/
分）。更に、ＰＵ液１０mlを通し、次いで水２０mlで洗
浄した後、２Ｍ−炭酸アンモニウム水溶液（（ｐＨ値
９．２）５mlを通してＤＮＡを溶出する。溶出液に水を
加えて１０mlとした上で、冷エチルアルコール２０mlを
重層して放置５分後、遠心して白色沈澱を上澄みと分離
し、沈澱に７０％エチルアルコールを加えて懸濁し再度
遠心し、沈澱を収得し、乾燥する。

【００２９】乾燥ＤＮＡを１mM−ＥＤＴＡ、１０mM−ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ値８．０）１０mlに溶解し、実施
例１に倣って紫外線吸光度を測定し、下記の値を得た。ＯＤ₂₆₀＝０．４５２，ＯＤ₂₈₀＝０．２５４これより、ＤＮＡ収量は０．２３mgであり、又ＯＤ₂₆₀
/ ＯＤ₂₈₀＝１．７８と算出される。

【００３０】実施例４（酵母染色体ＤＮＡの分離精製）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）を５mlのＹＰＤ培養液（酵母エキス１％、ポリペプ
トン１％、グルコース２％）で１昼夜培養し遠心集菌す
る。その１００mgを０．１Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ値７．
５）１mlに懸濁し１０mg/ml のZymolyase （キリンビー
ル）を１０μl 添加し、３７℃に１時間保持した後、１
０％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム液１００μ
l と１０mg/ml プロティナーゼＫを５０μl 添加して、
６０℃に１時間保持する。

【００３１】これにＰＵ液９mlを混合し、予めＰＵ液で
平衡化したヒドロキシアパタイト凝集体２ml（0.8φ×
3.5cm）を充填したカラムに負荷する（流速：約0.5ml/
分）。更に、ＰＵ液５mlを通し、次いで水１０mlで洗浄
した後、２Ｍ−炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ値９．
２）５mlを通してＤＮＡを溶出する。溶出液に水を加え
て１０mlとした上で、冷エチルアルコール２０mlを重層
して放置５分後、遠心して白色沈澱を上澄みと分離し、
沈澱に７０％エチルアルコールを加えて懸濁し再度遠心
し、沈澱を分離し、乾燥する。

【００３２】乾燥ＤＮＡを１mM−ＥＤＴＡ、１０mM−ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ値８．０）１０mlに溶解し、実施
例１に倣って紫外線吸光度を測定し、下記の値を得た。ＯＤ₂₆₀＝０．４１６，ＯＤ₂₈₀＝０．２３３これより、ＤＮＡ収量は０．２１mgであり、又ＯＤ₂₆₀
／ＯＤ₂₈₀＝１．７９と算出される。

【００３３】

【発明の効果】本発明は、高価な機器を必要とせず、又
ＤＮＡの収量がμｇからmgのオーダーにわたり巾広く適
用できるという簡便さを有している。即ち、細胞崩壊液
から一段の操作で混在する蛋白質、ＲＮＡ及び多糖類等
を除去することができ、従来より用いられている所謂フ
ェノール・クロロホルム水混合廃液を生ずることから免
れる。又、ＤＮＡを含有する溶出液を水で希釈するのみ
でアルコール沈澱法が可能となり、透析或いはゲル濾過
等の、ＤＮＡ分子の損失をもたらす工程を不要とし、高
分子のＤＮＡを収率良く得ることができる。本発明は、
上記のように簡便さを有すると共に、細胞からＤＮＡを
高純度で分離精製することができ、原核生物並びに真核
生物の遺伝子解析や所謂ＤＮＡ診断又は遺伝子操作等に
おいて必要とされる、生物細胞からのＤＮＡの分離精製
法として有用である。溶離液として、リン酸アンモニウ
ム水溶液を用いる場合は、溶出液を水で約１０倍に希釈
するのみで、アルコール添加によってＤＮＡを純度良く
沈澱せしめることができ、炭酸アンモニウム又は炭酸水
素アンモニウムの水溶液を用いる場合は、溶出液を僅か
に水で２倍に希釈するのみでＤＮＡのアルコール沈澱分
離を遂行することができる。ヒドロキシアパタイトとし
て、ヒドロキシアパタイト凝集体を用いる場合には、カ
ラム通液方式で、短時間にＤＮＡを分離精製することが
できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を、界面活性剤及び蛋白分解酵素との
処理に附してＤＮＡを遊離させ、尿素及びリン酸ナトリ
ウムを含有する水溶液とし、該水溶液をヒドロキシアパ
タイトに接触せしめてＤＮＡを吸着させた後、該ヒドロ
キシアパタイトを、尿素及びリン酸ナトリウムの混合水
溶液で洗浄し、更に水洗してから、溶離液である１．８
〜２．０モル濃度のリン酸アンモニウム水溶液と接触せ
しめてＤＮＡを含有する溶出液を収得し、該溶出液に水
を加え１０倍（容積）に希釈した後、アルコールを添加
混合して、ＤＮＡを析出させることを特徴とするＤＮＡ
の分離精製方法。
【請求項２】請求項１において、溶離液が、炭酸アンモ
ニウム又は炭酸水素アンモニウムを１．８〜２．０モル
濃度含有する水溶液であり、溶出液の希釈に用いる水の
量が２倍（容積）であることを特徴とするＤＮＡの分離
精製方法。
【請求項３】ヒドロキシアパタイトとして、六角柱状又
は針状のヒドロキシアパタイトからなり、細孔容積が１
〜５ml/ ｇであるヒドロキシアパタイト凝集体を用いる
ことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のＤＮＡの
分離精製方法。