JP2837467B2 - 精製方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はストレプトキナーゼを精製する方法に関す
る。
る。
ストレプトキナーゼは、連鎖球菌の種々の菌株により
生成される細胞外蛋白である。その活性は、W.S.Tillet
及びR.L.Garner（1933）「J.Exp.Med.」58,485〜502に
より初めて報告され、彼等はこの蛋白が血液の凝固の溶
解を生じさせることを見い出した。ストレプトキナーゼ
のフイブリン溶解活性が血漿プラスミノーゲンを活性さ
せるその能力から生じていることが現在十分に確証され
ている。（F.J.Castellino（1979）「Trends Biochem.S
ci.」（Pers.Ed.）４,1−５）。
生成される細胞外蛋白である。その活性は、W.S.Tillet
及びR.L.Garner（1933）「J.Exp.Med.」58,485〜502に
より初めて報告され、彼等はこの蛋白が血液の凝固の溶
解を生じさせることを見い出した。ストレプトキナーゼ
のフイブリン溶解活性が血漿プラスミノーゲンを活性さ
せるその能力から生じていることが現在十分に確証され
ている。（F.J.Castellino（1979）「Trends Biochem.S
ci.」（Pers.Ed.）４,1−５）。
ストレプトキナーゼは、急性心筋梗塞の治療のための
静脈内血栓溶解剤として臨床上用いられている〔Gruppo
Italiano per lo studio della streptochinase nel i
nfarto Miacardico（GISSI）（1986）Lancet,387参
照〕。それは、ヨーロツパ特許公開第0028489号明細書
に記載されたAPSAC（アニソイル化プラスミノーゲンス
トレプトキナーゼ活性体複合体）として知られている血
栓溶解剤の２個の蛋白成分の一つでもある。
静脈内血栓溶解剤として臨床上用いられている〔Gruppo
Italiano per lo studio della streptochinase nel i
nfarto Miacardico（GISSI）（1986）Lancet,387参
照〕。それは、ヨーロツパ特許公開第0028489号明細書
に記載されたAPSAC（アニソイル化プラスミノーゲンス
トレプトキナーゼ活性体複合体）として知られている血
栓溶解剤の２個の蛋白成分の一つでもある。
ストレプトキナーゼは、或るStreptococci及び或る細
菌（Lancefield群A,C又はＧのStreptococciから誘導さ
れた適当な遺伝子物質を含む）により生成する。臨床上
の目的に用いられるべきストレプトキナーゼは、通常S.
equisimilis株H46Aの培養物から製造される。
菌（Lancefield群A,C又はＧのStreptococciから誘導さ
れた適当な遺伝子物質を含む）により生成する。臨床上
の目的に用いられるべきストレプトキナーゼは、通常S.
equisimilis株H46Aの培養物から製造される。
ストレプトキナーゼを精製する種々の方法が記載され
てきており、それらは溶解度、電荷、分子の大きさ又は
形状又は表面との非特異的物理的相互反応の定量的差異
に基づく。発表された方法は、しばしばストレプトキナ
ーゼの許容し難い損失又は不純物の不適切な除去をもた
らし、そして高価な反応性の高い又は可燃性の試薬を用
いる。
てきており、それらは溶解度、電荷、分子の大きさ又は
形状又は表面との非特異的物理的相互反応の定量的差異
に基づく。発表された方法は、しばしばストレプトキナ
ーゼの許容し難い損失又は不純物の不適切な除去をもた
らし、そして高価な反応性の高い又は可燃性の試薬を用
いる。
不純物を構成している混在蛋白例えばストレプトリシ
ン又はストレプトドルナーゼとは異なりストレプトキナ
ーゼは、アミノ酸であるシステイン又はシスチンを含ま
ない〔Einarsson et al（1979）Biochim,Biophys.Acta
568,19−29;De Renzo et al（1967）J.Biol.Chem.24
2,533−542〕。この構造上の差は、発酵ブロスからスト
レプトキナーゼを精製するさらに有効な方法を提供する
ために用いることができる。
ン又はストレプトドルナーゼとは異なりストレプトキナ
ーゼは、アミノ酸であるシステイン又はシスチンを含ま
ない〔Einarsson et al（1979）Biochim,Biophys.Acta
568,19−29;De Renzo et al（1967）J.Biol.Chem.24
2,533−542〕。この構造上の差は、発酵ブロスからスト
レプトキナーゼを精製するさらに有効な方法を提供する
ために用いることができる。
本発明によれば、ストレプトキナーゼ含有混合物中の
混在蛋白からストレプトキナーゼを分離する方法におい
て、混合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスル
フイド架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物と
Ｒ−Ｘ（ここでＲは遊離チオール基と反応しうる基であ
り、Ｘは遊離チオール基と反応しうる基R1であるか又は
チオール含有マトリツクスである）の試薬とを接触さ
せ、次に混合物から得られた化学的に変性した混在蛋白
を分離して混在蛋白を実質的に含まない形のストレプト
キナーゼをもたらすことよりなる方法が提供される。
混在蛋白からストレプトキナーゼを分離する方法におい
て、混合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスル
フイド架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物と
Ｒ−Ｘ（ここでＲは遊離チオール基と反応しうる基であ
り、Ｘは遊離チオール基と反応しうる基R1であるか又は
チオール含有マトリツクスである）の試薬とを接触さ
せ、次に混合物から得られた化学的に変性した混在蛋白
を分離して混在蛋白を実質的に含まない形のストレプト
キナーゼをもたらすことよりなる方法が提供される。
精製したストレプトキナーゼは、好ましくはヨーロツ
パ薬局方の純度の明細に適合しており、そして好ましく
は10,000IUストレプトキナーゼ当り1IUより少いストレ
プトドルナーゼ及び1,000,000IUストレプトキナーゼ当
り1IUより少いストレプトリシンを含む。
パ薬局方の純度の明細に適合しており、そして好ましく
は10,000IUストレプトキナーゼ当り1IUより少いストレ
プトドルナーゼ及び1,000,000IUストレプトキナーゼ当
り1IUより少いストレプトリシンを含む。
ジスルフイド架橋の還元は、任意の好適な還元剤によ
り行うことができる。その例は、低いレドツクス電位を
有するチオール例えばジチオトレイトール（DTT）及び
ジチオエリスリトール〔その単独又は第二級還元剤例え
ばNADPH（Lou.M.F.「Methods in Enzymology」143,124
ページ、Academic Press,1987）〕にカツプリングし
て〕を含む。或るほう素水素化物例えば水素化ほう素ナ
トリウム又はシアノポロヒドリドも電気化学的還元（Ka
din H.「Methods in Enzymology」143,256ページ、Aca
d.Press,1987）で用いられるように用いることができ
る。蛋白の還元の他の方法は、Jocelyn,P.C.（「Meth.E
nz.」143,246ページ,Academic Press,1987）の総説から
明らかであろう。これらの方法の中で、ジチオトレイト
ールにより処理が好ましく、好ましくは５〜100mM,さら
に好ましくは25〜100mMのDTT濃度で、pH6.0〜8.5及び５
゜〜35℃の温度で行われる。
り行うことができる。その例は、低いレドツクス電位を
有するチオール例えばジチオトレイトール（DTT）及び
ジチオエリスリトール〔その単独又は第二級還元剤例え
ばNADPH（Lou.M.F.「Methods in Enzymology」143,124
ページ、Academic Press,1987）〕にカツプリングし
て〕を含む。或るほう素水素化物例えば水素化ほう素ナ
トリウム又はシアノポロヒドリドも電気化学的還元（Ka
din H.「Methods in Enzymology」143,256ページ、Aca
d.Press,1987）で用いられるように用いることができ
る。蛋白の還元の他の方法は、Jocelyn,P.C.（「Meth.E
nz.」143,246ページ,Academic Press,1987）の総説から
明らかであろう。これらの方法の中で、ジチオトレイト
ールにより処理が好ましく、好ましくは５〜100mM,さら
に好ましくは25〜100mMのDTT濃度で、pH6.0〜8.5及び５
゜〜35℃の温度で行われる。
基Ｒ及びR1の好適な例は、 ５−ニトロ−２−ピリジルチオ ５−カルボキシ−２−ピリジルチオ ２−ピリジルチオ ４−ピリジルチオ ２−ベンゾチアゾールチオ ４−ニトロ−３−カルボキシフエニルチオ 及び上記のピリジル基のＮ−オキシドを含む。
本発明の方法に用いて好適なマトリツクスは、例えば
変性アガロース、デキストラン及びシリカのような種々
の形の蛋白クロマトグラフイーでマトリツクスとして用
いられ、例えば英国特許第1506403又は1597757号明細書
に記載されたようにチオール基をそう入するために変性
され、又はチオール化合物を含む単量体の重合により形
成された粒状の不溶性の親水性物質を混入する。これら
の物質の例は、Brockle hurst,K et al（1973）「Bioch
em.J.」133,593〜584により記述され、そしてBiorad In
cによりAffigel 401スルヒドリル・ゲル並にPharmacia
Ltd.によりThiopropyl−Sepharose 6B又はAgthiol Agar
ose−Ether−Thiolの名で売られている。
変性アガロース、デキストラン及びシリカのような種々
の形の蛋白クロマトグラフイーでマトリツクスとして用
いられ、例えば英国特許第1506403又は1597757号明細書
に記載されたようにチオール基をそう入するために変性
され、又はチオール化合物を含む単量体の重合により形
成された粒状の不溶性の親水性物質を混入する。これら
の物質の例は、Brockle hurst,K et al（1973）「Bioch
em.J.」133,593〜584により記述され、そしてBiorad In
cによりAffigel 401スルヒドリル・ゲル並にPharmacia
Ltd.によりThiopropyl−Sepharose 6B又はAgthiol Agar
ose−Ether−Thiolの名で売られている。
マトリツクス上のチオール基は、還元した蛋白内でチ
オ基との接触を促進するスペーサー基によりマトリツク
に最も有効に結合できる。チオールに隣接するカルボキ
シレート又はアミノ基とのマトリツクスリンカーチオー
ル基が特に適している。このような好ましい物質の例
は、セフアロースに不動化されたシステイン又はグルタ
チオンである。
オ基との接触を促進するスペーサー基によりマトリツク
に最も有効に結合できる。チオールに隣接するカルボキ
シレート又はアミノ基とのマトリツクスリンカーチオー
ル基が特に適している。このような好ましい物質の例
は、セフアロースに不動化されたシステイン又はグルタ
チオンである。
好ましい試薬Ｒ−R1は、Aldrithiol−２の商標名でAl
drich Chemical Co.により売られている2,2′−ジピリ
ジルスルフイドである。
drich Chemical Co.により売られている2,2′−ジピリ
ジルスルフイドである。
ストレプトキナーゼの混合物は、好ましくは細菌の細
胞からストレプトキナーゼの分離を行う技術例えば遠心
分離、過又は吸着により本発明に従つて精製前に発酵
ブロスから分離される。このような分離は、好ましくは
ストレトキナーゼがチオール含有不純物による多大の混
在から免かれる他の精製工程と組合わされる。ブロスの
前処理の好適な技術は、例えば東独特許第126342及び12
1522号明細書、De Renzo E.C.（1967）「J.Biol.Che
m.」242,533又は米国特許第2784145号明細書に記載され
たような分別沈澱、Florisil及びイオン交換クロマトグ
ラフイを含む。好ましい処理は、本質的にクロマトグラ
フイでありそしてストレプトキナーゼを変性する試薬に
さらされることを避ける。
胞からストレプトキナーゼの分離を行う技術例えば遠心
分離、過又は吸着により本発明に従つて精製前に発酵
ブロスから分離される。このような分離は、好ましくは
ストレトキナーゼがチオール含有不純物による多大の混
在から免かれる他の精製工程と組合わされる。ブロスの
前処理の好適な技術は、例えば東独特許第126342及び12
1522号明細書、De Renzo E.C.（1967）「J.Biol.Che
m.」242,533又は米国特許第2784145号明細書に記載され
たような分別沈澱、Florisil及びイオン交換クロマトグ
ラフイを含む。好ましい処理は、本質的にクロマトグラ
フイでありそしてストレプトキナーゼを変性する試薬に
さらされることを避ける。
化学的に変性された混在蛋白の分離は、物理的及び／
又は化学的に行うことができる。
又は化学的に行うことができる。
試薬がＲ−R1の形のもののとき、それとストレプトキ
ナーゼ混合物との反応は、基Ｒ及びR1の混合したジルス
ルフイド及び混合物の還元した不純物をもたらす。多く
の条件下反応は得られる化学的に変性した混在蛋白の沈
澱を生ずる。
ナーゼ混合物との反応は、基Ｒ及びR1の混合したジルス
ルフイド及び混合物の還元した不純物をもたらす。多く
の条件下反応は得られる化学的に変性した混在蛋白の沈
澱を生ずる。
この沈澱工程の条件は、沈澱の形成を最大にするよう
にコントロールできる。
にコントロールできる。
特に、試薬Ｒ−R1の好ましい濃度は10〜200mMであ
り、活性化は好ましくはpH6.0〜8.5及び温度５〜35℃で
行われる。
り、活性化は好ましくはpH6.0〜8.5及び温度５〜35℃で
行われる。
沈澱は、任意の好適な従来の物理的なやり方例えば
過、沈降、遠心分離又はクロマトグラフイーのカラム或
いは他の好適な装置内の沈澱の保持により混合物から除
去できる。
過、沈降、遠心分離又はクロマトグラフイーのカラム或
いは他の好適な装置内の沈澱の保持により混合物から除
去できる。
過は、好ましくは１μｍ以下の大きさの粒子を保持
できる任意の好適なフイルターの使用により行うことが
できる。好適な材料は、ガラスフイバー、ポリスルホ
ン、ポリ二弗化ビニリデン及びナイロンを含む。
できる任意の好適なフイルターの使用により行うことが
できる。好適な材料は、ガラスフイバー、ポリスルホ
ン、ポリ二弗化ビニリデン及びナイロンを含む。
沈澱が最適になされたとき、過による混合物からの
分離は、所望の純度のストレプトキナーゼを生ずる。必
要な純度が達成されないときには、液自体はチオール
含有マトリツクスに適用されてチオール交換クロマトグ
ラフイにより残存する混在蛋白を除く。
分離は、所望の純度のストレプトキナーゼを生ずる。必
要な純度が達成されないときには、液自体はチオール
含有マトリツクスに適用されてチオール交換クロマトグ
ラフイにより残存する混在蛋白を除く。
一方、特に不完全な沈澱が生じたとき、混合物はその
前の過なしにチオール含有マトリツクスに直接適用さ
れる。
前の過なしにチオール含有マトリツクスに直接適用さ
れる。
低い混在濃度（例えば1ml当り25IUより低い）では、
沈澱は有効でなくそしてマトリツクス法が有利に用いら
れる。
沈澱は有効でなくそしてマトリツクス法が有利に用いら
れる。
試薬が形Ｒ−Ｘ（ここでＲは前記同様でありそしてＸ
はチオール含有マトリツクスである）のもののとき、本
発明の方法は本質的に還元した混合物と活性化したチオ
ール含有マトリツクスとの接触を含む。
はチオール含有マトリツクスである）のもののとき、本
発明の方法は本質的に還元した混合物と活性化したチオ
ール含有マトリツクスとの接触を含む。
チオール含有マトリツクスの活性化は、マトリツクス
を試薬Ｒ−R1（ここでＲ及びR1は前記同様である）によ
り処理して基Ｒ及びR1の混合したジスルフイド及びチオ
マトリツクスを提供することにより達成できる。好まし
い試薬はAldrithiol−２であり、それは還元したストレ
プトキナーゼ混合物との反応に好適なチオマトリツク２
−ピリジルジスルフイドに製造するのに用いられる。こ
のようなチオマトリツクス２−ピリジルジスルフイド
は、又英国特許第1506409号明細書に記載されたものの
ような別の手段により製造でき、そしてチオマトリツク
スから製造されたものの代りに用いることができる。
を試薬Ｒ−R1（ここでＲ及びR1は前記同様である）によ
り処理して基Ｒ及びR1の混合したジスルフイド及びチオ
マトリツクスを提供することにより達成できる。好まし
い試薬はAldrithiol−２であり、それは還元したストレ
プトキナーゼ混合物との反応に好適なチオマトリツク２
−ピリジルジスルフイドに製造するのに用いられる。こ
のようなチオマトリツクス２−ピリジルジスルフイド
は、又英国特許第1506409号明細書に記載されたものの
ような別の手段により製造でき、そしてチオマトリツク
スから製造されたものの代りに用いることができる。
一つの態様において本発明は従つてストレプトキナー
ゼ含有混合物中の混在蛋白からストレプトキナーゼを分
離する方法を提供し、その方法は混合物を還元剤により
処理して混在蛋白中のジスルフイド架橋を還元して遊離
のチオール基とし、混合物と不動化したチオール含有化
合物を含むマトリツクスとを接触させ、このとき還元し
た混合物及びマトリツクスの一つは接触前に活性化さ
れ、そして混在蛋白が実質的にない形でマトリツクスか
らストレプトキナーゼを溶離することよりなる。
ゼ含有混合物中の混在蛋白からストレプトキナーゼを分
離する方法を提供し、その方法は混合物を還元剤により
処理して混在蛋白中のジスルフイド架橋を還元して遊離
のチオール基とし、混合物と不動化したチオール含有化
合物を含むマトリツクスとを接触させ、このとき還元し
た混合物及びマトリツクスの一つは接触前に活性化さ
れ、そして混在蛋白が実質的にない形でマトリツクスか
らストレプトキナーゼを溶離することよりなる。
ストレプトキナーゼは、好都合にはストレプトキナー
ゼとマトリツクスとの間の非共有相互反応を最低にする
ようにデザインされた水性バツフアーにより洗うことに
より好都合にはマトリツクスから分離できる。少くとも
200mMのナトリウムイオン及び任意にはキレート剤例え
ばEDTAを含むバツフアーが好適なことが分つた。
ゼとマトリツクスとの間の非共有相互反応を最低にする
ようにデザインされた水性バツフアーにより洗うことに
より好都合にはマトリツクスから分離できる。少くとも
200mMのナトリウムイオン及び任意にはキレート剤例え
ばEDTAを含むバツフアーが好適なことが分つた。
ストレプトキナーゼの分離後、マトリツクスは、水性
バツフアーにより洗つてカラムを再使用のため再生する
前に、前述したような還元剤により処理する。
バツフアーにより洗つてカラムを再使用のため再生する
前に、前述したような還元剤により処理する。
マトリツクスは好都合にはカラムの形で提供され、そ
して精製はバツチ式又は連続式で行うことができる。
して精製はバツチ式又は連続式で行うことができる。
本発明によるストレプトキナーゼの精製は、下記の材
料及び方法を用いて記述される。
料及び方法を用いて記述される。
ストレプトキナーゼの精製の例 材料及び方法 材料 セフアロース4BをPharmacia LKB,ウプサラ、スウエー
デンから得た。チオヒドロキシプロピル及びグルタチオ
ンアガロースは、又Pharmaciaから得られたか又はDean
et al（1985）の方法に従つて合成した。2,2′−ジピリ
ジル ジスルフイド（Aldrithiol−２）は、Aldrich Ch
emical Company,ギリンガム、ドーセツトから得られ
た。他の化学品は、Sigma（ロンドン）Chemical co,プ
ール，ドーセツト，英国又はFisons,ローボロー，ライ
クス，英国から得られた。
デンから得た。チオヒドロキシプロピル及びグルタチオ
ンアガロースは、又Pharmaciaから得られたか又はDean
et al（1985）の方法に従つて合成した。2,2′−ジピリ
ジル ジスルフイド（Aldrithiol−２）は、Aldrich Ch
emical Company,ギリンガム、ドーセツトから得られ
た。他の化学品は、Sigma（ロンドン）Chemical co,プ
ール，ドーセツト，英国又はFisons,ローボロー，ライ
クス，英国から得られた。
方法 1. 共有結合クロマトグラフイー （ａ） ストレプトキナーゼ含有蛋白溶液の前処理 （ｉ） 蛋白溶液を25mMのDTTにより還元し、そして30
分間30℃でインキユベートした。過剰のDTTを、Pharmac
ia PD−10カラムのＧ−25クロマトグラフイーを用いる
バツフアー交換によるか又はAmicon撹拌セル限外過シ
ステムの透析過によるバツフアー交換によるかの何れ
かにより除いた。両者の場合、蛋白溶液を脱気した150m
M NaCl,100mM NaH2PO4,1mM EDTA,pH7.0バツフアーに交
換した。
分間30℃でインキユベートした。過剰のDTTを、Pharmac
ia PD−10カラムのＧ−25クロマトグラフイーを用いる
バツフアー交換によるか又はAmicon撹拌セル限外過シ
ステムの透析過によるバツフアー交換によるかの何れ
かにより除いた。両者の場合、蛋白溶液を脱気した150m
M NaCl,100mM NaH2PO4,1mM EDTA,pH7.0バツフアーに交
換した。
（ii） 蛋白溶液を25mMのDTTにより還元しそして緩や
かに撹拌しつつ30分間30℃インキユベートした。（蛋白
溶液はこの点で10mM NaH2PO4,200mM NaCl pH7.0バツフ
アー中にあつた。）Aldrithiol−２（2,2′ジピリジル
ジスルフイド）を加えて最終濃度を50mMとした。過剰の
Aldrithiol−２を次に前述の二つの方法の一つにより除
いた。
かに撹拌しつつ30分間30℃インキユベートした。（蛋白
溶液はこの点で10mM NaH2PO4,200mM NaCl pH7.0バツフ
アー中にあつた。）Aldrithiol−２（2,2′ジピリジル
ジスルフイド）を加えて最終濃度を50mMとした。過剰の
Aldrithiol−２を次に前述の二つの方法の一つにより除
いた。
（ｂ） クロマトグラフイー 共有結合クロマトグラフイーを二つの以下の方法の一
つにより行つた。方法（Ａ）（ストレプトキナーゼ前処
理法（ｉ）の場合）又は方法（Ｂ）（前処理（ii）の場
合）。
つにより行つた。方法（Ａ）（ストレプトキナーゼ前処
理法（ｉ）の場合）又は方法（Ｂ）（前処理（ii）の場
合）。
（Ａ） 20mlのグルタチオンアガロース又はヒドロキシ
チオプロピルアガロースを50％スラリーとしてPharmaci
a C−16クロマトグラフイーカラムに加えた。安定な充
填したベツドが得られるまで、カラムを次に20cm/時の
流速で150mM NaCl,1mM EDTA,100mM NaH2PO4pH7.0（バツ
フアーＡ）により洗つた。100mlの50mM DTTを次に10cm/
時の見かけの流速でカラムを通してチオールアガロース
の全還元を確実にした。カラムを次にDTTが完全になく
なるまで脱気したバツフアーＡにより洗つた。（カラム
の10容量）。カラムを次に10cm/時の見かけの流速でAld
rithiol−２の飽和溶液により洗い（100ml）、そして再
びAldrithiol−２がなくなるまで脱気したバツフアーＡ
により洗つた。
チオプロピルアガロースを50％スラリーとしてPharmaci
a C−16クロマトグラフイーカラムに加えた。安定な充
填したベツドが得られるまで、カラムを次に20cm/時の
流速で150mM NaCl,1mM EDTA,100mM NaH2PO4pH7.0（バツ
フアーＡ）により洗つた。100mlの50mM DTTを次に10cm/
時の見かけの流速でカラムを通してチオールアガロース
の全還元を確実にした。カラムを次にDTTが完全になく
なるまで脱気したバツフアーＡにより洗つた。（カラム
の10容量）。カラムを次に10cm/時の見かけの流速でAld
rithiol−２の飽和溶液により洗い（100ml）、そして再
びAldrithiol−２がなくなるまで脱気したバツフアーＡ
により洗つた。
方法（ｉ）により製造した蛋白溶液（容量10〜20ml）
を10cm/時の流速でカラムに加えそしてバツフアーＡに
より洗つた。カラムを280nMでモニターしそして洗つた
蛋白のピークを保持しそしてアツセイした。カラムは次
に前述した方法により再生できた。
を10cm/時の流速でカラムに加えそしてバツフアーＡに
より洗つた。カラムを280nMでモニターしそして洗つた
蛋白のピークを保持しそしてアツセイした。カラムは次
に前述した方法により再生できた。
（Ｂ） 20mlのグルタチオンアガロース又はヒドロキシ
チオプロピルアガロースを50％スラリーとしてPharmaci
a C−16クロマトグラフイーカラムに加えた。カラムを
次に安定な充填したベツドが得られるまで、20cm/時の
流速で150mM NaCl,1mM EDTA,100mM NaH2PO4pH7.0（バツ
フアーＡ）により洗つた。100mlの50mM DTTを次に10cm/
時の流速でカラムを通してチオールアガロースの全還元
を確実にした。カラムを次にDTTが完全になくなるまで
脱気したバツフアーＡにより洗つた。（カラムの10容
量）。
チオプロピルアガロースを50％スラリーとしてPharmaci
a C−16クロマトグラフイーカラムに加えた。カラムを
次に安定な充填したベツドが得られるまで、20cm/時の
流速で150mM NaCl,1mM EDTA,100mM NaH2PO4pH7.0（バツ
フアーＡ）により洗つた。100mlの50mM DTTを次に10cm/
時の流速でカラムを通してチオールアガロースの全還元
を確実にした。カラムを次にDTTが完全になくなるまで
脱気したバツフアーＡにより洗つた。（カラムの10容
量）。
方法（ii）により製造した蛋白溶液（容量20〜100m
l）を10cm/時の流速でカラムに加えそしてバツフアーＡ
により洗つた。カラムを280nmでモニターしそして洗つ
た蛋白のピークを保持しそしてアツセイした。カラムは
次に前述した方法により再生できた。
l）を10cm/時の流速でカラムに加えそしてバツフアーＡ
により洗つた。カラムを280nmでモニターしそして洗つ
た蛋白のピークを保持しそしてアツセイした。カラムは
次に前述した方法により再生できた。
2. 共有結合沈澱（方法Ｃ） （ａ） ストレプトキナーゼ蛋白溶液の前処理 蛋白溶液を100mMのDTTにより還元しそして30分間30℃
でインキユベートした。150mMの最終濃度になるようにA
ldrithiol−２を次に加えそして溶液（pH7.5）を撹拌し
つつ30℃で20分間次に35℃で15分間インキユベートし
た。溶液を次に５℃に冷却しそして20分間保つた。
でインキユベートした。150mMの最終濃度になるようにA
ldrithiol−２を次に加えそして溶液（pH7.5）を撹拌し
つつ30℃で20分間次に35℃で15分間インキユベートし
た。溶液を次に５℃に冷却しそして20分間保つた。
（ｂ） 沈澱の除去 残存するAldrithiol−２及び沈澱した蛋白混在物を次
の何れかの方法により除いた。
の何れかの方法により除いた。
（ｉ） WhatmanガラスマイクロフアイバーGF/Aプレフ
イルター（孔径1.6μｍ）を通して過し次にブツクナ
ーフルター系で真空下Whatmanガラスマイクロフアイバ
ーGF/Fフアイナルフイルター（孔径0.7μｍ）を通して
過し、液を保持しアツセイした。
イルター（孔径1.6μｍ）を通して過し次にブツクナ
ーフルター系で真空下Whatmanガラスマイクロフアイバ
ーGF/Fフアイナルフイルター（孔径0.7μｍ）を通して
過し、液を保持しアツセイした。
（ii） ５℃で20分間6000Xgで遠心分離。上澄み液を次
に沈澱からデカンテーシヨンし、保持しアツセイした。
に沈澱からデカンテーシヨンし、保持しアツセイした。
アツセイ テストするサンプルを燐酸緩衝生理食塩水により10倍
に段階的に希釈して下記の希釈物を得た。1,0.1,0.01及
び0.001。
に段階的に希釈して下記の希釈物を得た。1,0.1,0.01及
び0.001。
これらの希釈したサンプルを次にヨーロツパ薬局方の
方法の変法によりストレプトリシン−０についてアツセ
イし、それは1/5容量のサンプル及び試薬（ヨーロツパ
薬局方、第２版、356〜３、1984に引用された）の使用
を含む。方法をサンプルと中間の希釈物について繰返し
た。
方法の変法によりストレプトリシン−０についてアツセ
イし、それは1/5容量のサンプル及び試薬（ヨーロツパ
薬局方、第２版、356〜３、1984に引用された）の使用
を含む。方法をサンプルと中間の希釈物について繰返し
た。
結果を次の表に要約する。
結論 すべての方法（方法A,B及びＣ）は高収率（80〜100
％）でストレプトキナーゼを生成し、そしてすべてはス
トレプトリシンの量をかなり減少させる。
％）でストレプトキナーゼを生成し、そしてすべてはス
トレプトリシンの量をかなり減少させる。
方法Ａは、溶液中に検出可能な量のストレプトリシン
を残す。方法Ｂの場合、ストレプトキナーゼの低濃度の
ために、ストレプトリシンの量はアツセイの感度より低
く、従つて結果は「より少く」と表示される。方法Ｂ例
１の場合、ストレプトキナーゼの量は、サンプルがヨー
ロツパ薬局方の標準を通るか又は通らないかを決めるに
は不十分であつた。低い量のストレプトリシンは、方法
Ｃにより生成した材料中で検出可能であるが、これらは
ヨーロツパ薬局方の明細の中にある。方法Ｃは、チオー
ルマトリツクスを利用するコストなしにヨーロツパ薬局
方の標準の純度に材料を生成することが要求されると
き、好ましい。
を残す。方法Ｂの場合、ストレプトキナーゼの低濃度の
ために、ストレプトリシンの量はアツセイの感度より低
く、従つて結果は「より少く」と表示される。方法Ｂ例
１の場合、ストレプトキナーゼの量は、サンプルがヨー
ロツパ薬局方の標準を通るか又は通らないかを決めるに
は不十分であつた。低い量のストレプトリシンは、方法
Ｃにより生成した材料中で検出可能であるが、これらは
ヨーロツパ薬局方の明細の中にある。方法Ｃは、チオー
ルマトリツクスを利用するコストなしにヨーロツパ薬局
方の標準の純度に材料を生成することが要求されると
き、好ましい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチヤード・アンソニー・ゴツドウイ ン・スミス イギリス国，サリ州ケイテイ18・５エツ クスキユー，エプソン，ユートリーボト ムロード，グレートバー，ビーチヤムフ アーマシユーチカルズ（番地なし) (72)発明者 セリ・ジヨン・ルイス イギリス国，サリ州ケイテイ18・５エツ クスキユー，エプソン，ユートリーボト ムロード，グレートバー，ビーチヤムフ アーマシユーチカルズ（番地なし) (72)発明者 ジユリアン・スタンレー・ハーバー イギリス国，ウエストサセツクス州ビー エヌ14・８キユーエイチ，ワーシング, クラレンドンロード，ビーチヤムフアー マシユーチカルズ（番地なし) (56)参考文献 米国特許4381346（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (10)
- 【請求項１】ストレプトキナーゼ含有混合物中の混在蛋
白からストレプトキナーゼを分離する方法において、混
合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフイド
架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物とＲ−Ｘ
（ここでＲは遊離チオール基と反応しうる基であり、Ｘ
は遊離チオール基と反応しうる基R1であるか又はチオー
ル含有マトリツクスである）の試薬とを接触させ、次に
混合物から得られた化学的に変性した混在蛋白を分離し
て混在蛋白を実質的に含まない形のストレプトキナーゼ
をもたらすことよりなる前記方法。 - 【請求項２】還元剤がジチオトレイトールである請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】基Ｒ及びR1が ５−ニトロ−２−ピリジルチオ ５−カルボキシ−２−ピリジルチオ ２−ピリジルチオ ４−ピリジルチオ ２−ベンゾチアゾリルチオ ４−ニトロ−３−カルボキシフエニルチオ 及び上記のピリジル基のＮ−オキシド から選ばれる請求項１又は２記載の方法。
- 【請求項４】試薬Ｒ−ＸがＲ−R1の形のものである請求
項１〜３の何れか一つの項記載の方法。 - 【請求項５】試薬Ｒ−R1が2,2′−ジピリジルジルスル
フイドである請求項４記載の方法。 - 【請求項６】試薬Ｒ−R1の濃度が10〜200mMである請求
項４又は５記載の方法。 - 【請求項７】還元された混合物と試薬Ｒ−R1との反応が
pH6.0〜8.5で行われる請求項４〜６の何れか一つの項記
載の方法。 - 【請求項８】還元された混合物と試薬Ｒ−R1との反応が
５〜35℃の温度で行われる請求項４〜７の何れか一つの
項記載の方法。 - 【請求項９】生じた化学的に変性された混在蛋白が、
過、沈降、遠心分離により又はクラマトグラフイーのカ
ラム内の保持により分離される沈澱を形成する請求項４
〜８の何れか一つの項記載の方法。 - 【請求項１０】残存する化学的に変性された混在蛋白が
チオール交換クロマトグラフイーにより除去される請求
項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8824496.7 | 1988-10-19 | ||
| GB888824496A GB8824496D0 (en) | 1988-10-19 | 1988-10-19 | Process |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02128688A JPH02128688A (ja) | 1990-05-17 |
| JP2837467B2 true JP2837467B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=10645453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1269272A Expired - Lifetime JP2837467B2 (ja) | 1988-10-19 | 1989-10-18 | 精製方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334384A (ja) |
| EP (1) | EP0365278B1 (ja) |
| JP (1) | JP2837467B2 (ja) |
| KR (1) | KR0136613B1 (ja) |
| AT (1) | ATE103633T1 (ja) |
| AU (1) | AU622492B2 (ja) |
| CA (1) | CA2000850A1 (ja) |
| DE (1) | DE68914242T2 (ja) |
| DK (1) | DK515889A (ja) |
| ES (1) | ES2062029T3 (ja) |
| GB (1) | GB8824496D0 (ja) |
| IE (1) | IE63478B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ231039A (ja) |
| PT (1) | PT92024B (ja) |
| ZA (1) | ZA897849B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| TR200002284T2 (tr) | 1998-02-05 | 2000-11-21 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Mage ailesinden tümör ile ilgili tümör türevleri |
| US6388073B1 (en) | 2000-07-26 | 2002-05-14 | Shire Us Inc. | Method for the manufacture of anagrelide |
| US7094351B2 (en) | 2000-10-12 | 2006-08-22 | Corcoran Robert C | Purification of substances by reaction affinity chromatography |
| KR20020007231A (ko) * | 2001-08-01 | 2002-01-26 | 이병철 | 스트렙토키나제의 정제방법 |
| US20060030574A1 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Shire Holdings Ag | Quinazoline derivatives useful for the treatment of peripheral arterial disease and as phosphodiesterase inhibitors |
| US7700608B2 (en) * | 2004-08-04 | 2010-04-20 | Shire Holdings Ag | Quinazoline derivatives and their use in the treatment of thrombocythemia |
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| US7910597B2 (en) * | 2006-11-28 | 2011-03-22 | Shire Llc | Substituted quinazolines |
| NZ589557A (en) * | 2008-06-04 | 2012-08-31 | Talecris Biotherapeutics Inc | Immobilised streptokinase, method and kit for preparing plasmin |
| ES2552337T3 (es) | 2009-03-03 | 2015-11-27 | Grifols Therapeutics Inc. | Procedimientos para la preparación de plasminógeno |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4381346A (en) | 1979-11-13 | 1983-04-26 | Huasin Syed S | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3419472A (en) * | 1960-10-24 | 1968-12-31 | American Cyanamid Co | Process for preparing streptokinaserich material |
| US3226304A (en) * | 1960-10-24 | 1965-12-28 | American Cyanamid Co | High purity streptokinase and process for preparing same |
| US3255094A (en) * | 1963-01-10 | 1966-06-07 | Baxter Laboratories Inc | Method for purification of streptokinase |
| US3444045A (en) * | 1966-09-20 | 1969-05-13 | American Cyanamid Co | Process for purifying streptokinase |
-
1988
- 1988-10-19 GB GB888824496A patent/GB8824496D0/en active Pending
-
1989
- 1989-10-17 CA CA002000850A patent/CA2000850A1/en not_active Abandoned
- 1989-10-17 NZ NZ231039A patent/NZ231039A/en unknown
- 1989-10-17 ZA ZA897849A patent/ZA897849B/xx unknown
- 1989-10-17 US US07/422,430 patent/US5334384A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-17 DK DK515889A patent/DK515889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-10-17 EP EP89310648A patent/EP0365278B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-17 DE DE68914242T patent/DE68914242T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-17 ES ES89310648T patent/ES2062029T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-17 AT AT89310648T patent/ATE103633T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-10-17 IE IE333889A patent/IE63478B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-17 AU AU42964/89A patent/AU622492B2/en not_active Ceased
- 1989-10-18 KR KR1019890015025A patent/KR0136613B1/ko not_active Expired - Fee Related
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- 1989-10-18 JP JP1269272A patent/JP2837467B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4381346A (en) | 1979-11-13 | 1983-04-26 | Huasin Syed S | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
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| ATE103633T1 (de) | 1994-04-15 |
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| PT92024B (pt) | 1995-08-09 |
| EP0365278A3 (en) | 1991-08-28 |
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| NZ231039A (en) | 1991-07-26 |
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| US5334384A (en) | 1994-08-02 |
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| DK515889A (da) | 1990-04-20 |
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