JPH0217153B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、長鎖アシル・コエンザイムＡ・シン
セターゼ（本明細書においては、アシルCoAシ
ンセターゼと略す。EC.6.2.1.3）の精製方法に関
するものである。 アシルCoAシンターゼは、生体内における脂
肪酸酸化の第一段階に位置する重要な酵素であ
り、下記の反応に関与する。 RCOOH＋CoA＋ATP→RCOCoA＋AMP＋ピロ燐酸 （ただし、式中Ｒはアルキル基またはアルケニル
基、CoAはコエンザイムＡ、ATPはアデノン−
5′−トリホスフエート、AMPはアデノシン−
5′−ホスフエートを表わすものとする。） この酵素はラツトの肝蔵、大腸菌等の細菌や多
くの酵母、カビに存在することが知られている。
例えば、デイー・サミユエル（D.Samuel）等は
ユーロピアンジヤーナル オブ バイオケミスト
リー（European Journal of Biochemistry）12
巻576〜582ページ（1970年）において、エシエリ
ヒアコリ（Escherichia coli）のアシルCoAシン
セターゼを硫安塩析、ジエチルアミノエチル（以
下DEAEと記す）−セルロースカラムクロマト及
びヒドロキシアパタイトカラムクロマトによつて
精製している。清水等はアナリテイカル バイオ
ケミストリー（Analytical Biochemistry）98
巻、341〜345ページ（1979年）において、シユー
ドモナスエルギノーサ
（Pseudomonasaerugunosa）のアシルCoAシン
セターゼをサミユエル等とほとんど同じ方法によ
つて精製している。また、ジエイ バー タナ
（J.Bar−Tana）等はバイオケミカル ジヤーナ
ル（Biochemical Journal）122巻、353〜362ペ
ージ（1971年）においてラツト肝臓のミクロソー
ムから、長鎖アシルCoAシンセターゼを得てい
るが、ミクロソームから抽出された該酵素はやは
り硫安塩析、DEAE−セフアデツクス（商品名、
フアルマシア フアインケミカルズ社）カラムク
ロマトおよびヒドロキシアパタイトカラムクロマ
トによつて精製している。これに対し、保坂らは
ユーロピアン ジヤーナル オブ バイオケミス
トリー（European Journal Biochemistry）93
巻、197〜203ページ（1979年）において酵母キヤ
ンデイダ・リポリテイカ（Candida Lipolytica）
の細胞内顆粒膜に結合しているアシルCoAシン
ターゼを、以下のような方法で精製している。す
なわち、該酵母を破砕後、8000ｇで15分間遠心し
て細胞壁残渣、核等の沈澱と、ミクロノーム、ミ
トコンドリア等の細胞内顆粒の懸濁液（以下顆粒
画分と記す）とに分離したのち、顆粒画分をトリ
トンＸ−100（商品名、ローム・アンドハース社
製、主成分イソオクチルフエニルポリエトキシア
ルコール、以下活性剤Ｔと呼ぶ。）の水溶液と混
合することによつて顆粒膜から、アシルCoAシ
ンセターゼを遊離する。顆粒と酵素液とは、
230000ｇで超遠心することによつて分離され、清
澄な酵素液はリン酸セルロースカラムクロマト、
ブルーセフアロース（商品名：フアルマシアフア
インケミカルズ社）カラムクロマト等のクロマト
処理によつて電気泳動的に単一な蛋白にまで精製
される。この方法により長鎖アシルCoAシンセ
ターゼは、はじめて純粋な標品として得られたの
であるが、工業的な規模で上記の精製を行なう場
合に、230000ｇで超遠心する工程は、一回処理量
が限られ、有利な方法ではない。この工程を省略
し、活性剤Ｔで処理した顆粒画分をいきなりカラ
ムクロマト処理に供すると、リン酸セルロース、
DEAE−セルロース、DEAE−セフアデツクス
（商品名、前出）等のカラムの粒子間間隙に顆粒
や、細胞壁、細胞膜等の細かい残渣がつまり、ク
ロマト処理において適切な流速が得られないとい
う結果を生じ、とくに、大規模なカラムクロマト
では、きわめて不利である。 前述のジエイ バー タナ等もミクロソームか
ら、デオキシコール酸ナトリウムで遊離されたア
シルCoAシンセターゼとミクロソームとを分離
するために100000ｇで60分間の遠心分離を行つて
おり、また、デイー サミユエル等や清水等も硫
安塩析の前にそれぞれ50000ｇおよび100000ｇで
の遠心分離操作を行つて、細かい粒子を除去して
いるが、かかる細粒除去処理は細胞内蛋白特に膜
結合蛋白のカラムクロマトによる精製の前処理と
して避けられない問題点である。 本発明者らは、アシルCoAシンセターゼの工
業規模での精製に際して、この問題点を解決すべ
く鋭意研究した結果、多孔性アニオン交換樹脂を
クロマト充填剤として用いることにより、上述の
問題点を一挙に解決できることを見い出し、本発
明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、キヤンデイダ属に
属する酵母により生産された長鎖アシルCoAシ
ンセターゼを含有し、かつ不溶性の細胞構成成分
を含む懸濁液を、水溶液中で膨潤した時に100〜
1000Åの孔径を有するマクロポアーを形成し、該
マクロポアーの容積が粒子全容積の５％以上に達
する物理的性質を有し、架橋ポリスチレンを基体
とする強塩基性の多孔性アニオン交換樹脂を充填
したカラムに供して該酵素を吸着させ、必要に応
じて不溶性の細胞構成成分は、緩衝液で洗い流し
たのち、該酵素を多孔性アニオン交換樹脂から脱
離させることを特徴とするアシルCoAシンセタ
ーゼの精製方法に存する。 本発明の一つの特徴は、高速の遠心分離操作を
全く行う必要なく精製を可能にしたことである。
本発明の更に一つの特徴は、微粒懸濁液を処理す
るにもかかわらず、カラム内の圧損がほとんどな
く、自由に所望の流速に設定しうることから、き
わめて能率よく精製しうることである。 これらの特徴は、一にかかつて、イオン交換樹
脂をクロマト剤として用いることに起因する。す
なわち、合成イオン交換樹脂はセルロースやデキ
ストランに比して、水溶液中でも圧縮性がきわめ
て小さいために、圧損が小さいのみならず、充填
塔内での変形がなく、粒子間の間隙が充分に存在
し、さらに、不溶性の細胞構成成分の付着もほと
んどないため、それら微粒は、容易に充填塔内を
通過してしまうという利点を有するのである。 本発明のもう一つの特徴は、かかるクロマト処
理による活性の損失が少ないことである。前述の
保坂らの報告によれば、顆粒画分のアシルCoA
シンセターゼ活性の79％がリン酸セルロースカラ
ムクロマト処理までに失なわれているが、本発明
によれば、顆粒画分中の活性の50〜90％を回収す
ることができる。この好収率の原因は明らかでな
いが、膜に結合した疎水性の蛋白の精製には、セ
ルロースやデキストランを基体とするものよりも
合成イオン交換樹脂のような比較的疎水性の骨格
をもつものの方が適していると考えることも可能
である。 本発明の方法にしたがつて精製されたアシル
CoAシンセターゼは、微粒をほとんど含まない
ため、何らの障害がなく公知の方法によつてさら
に精製することが可能となり、工業的にも大量か
つ容易に該酵素標品を得ることができる。 次に本発明の詳細について説明する。 本発明が適用されるアシルCoAシンセターゼ
含有液としては、工業的観点から、大量取得が容
易で該酵素の安定性が高い、キヤンデイダ
（Candida）属の酵母が挙げられ、該酵母の菌体
を破砕したのち、該酵素を可溶化せしめた粗酵素
液が望ましい。 酵母菌体の破砕は、ホモゲナイザー、超音波、
ガラス・ビーズによる磨砕、フレンチ・プレス等
の機械的手段、又は、細胞壁溶解酸素等による化
学的手段によつて行うことができる。 細胞の破砕のみでは該酵素が可溶化されない場
合は、破砕細胞の懸濁液に界面活性剤を添加する
ことによつて可溶化するのが望ましい。 使用される界面活性剤としては、胆汁酸類、た
とえばコール酸ソーダ、デオキシコール酸ソーダ
等、非イオン性界面活性剤、たとえばポリオキシ
エチレンアルキル・エーテル類、ポリオキシエチ
レンアルキルフエノール・エーテル類、ポリオキ
シエチレンアルキルエステル類、ソルビタン・ア
ルキルエステル類、ポリオキシエチレン・ソルビ
タン・アルキルエステル類等に属する界面活性剤
である。 これ等のうち好ましい界面活性剤は、非イオン
性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンアルキ
ルフエノール・エステル類である。特に好ましい
界面活性剤は活性剤Ｔである。 その添加量は、用いられる微生物の種類、活性
剤の種類等により異なるが、通常0.1〜1.0w／Ｖ
％である。 この様な活性剤による該酵素の可溶化処理は、
通常30分〜２時間行なう。温度は低温たとえば０
〜10℃、好ましくは０〜４℃である。 この時、可溶化に伴なう失活を防ぐ為、処理液
中に燐酸緩衝液、メルカプトエタノール等の酵素
の保護剤。及びEDTA等を添加しても良い。 次に、多孔性アニオン交換樹脂について説明す
る。 多孔性アニオン交換樹脂とは、通常、乾燥状態
で、その比表面積が0.1m²／ｇ以上あるか、また
はその細孔面積が0.05ml／ｇ以上あるアニオン交
換樹脂であり、その内部に物理的細孔を有する点
で通常のゲル型樹脂と明確に区別される。 本発明に用いられる多孔性アニオン交換樹脂と
しては、水溶液中で膨潤した時に100〜1000Åの
孔径を有するマクロポアーが多数形成され、マク
ロポアーの容積が粒子全容積の５％以上に達する
物理的性質を有し、強塩基性ないし弱塩基性アミ
ノ基を交換基とするものが望ましい。 これをさらに説明するに、従来、一般に使用さ
れているイオン交換樹脂は若干の超微細孔（ミク
ロポアー、孔径数Å〜数十Å）を有しているのみ
である。しかし、本発明で使用される多孔性イオ
ン交換樹脂とは、上記ミクロポアー以外に数百Å
程度の孔径の多数の細孔（マクロポアー）を有す
る樹脂であり、分子量が数万ないし数十万の蛋白
質分子をそのマクロポアー内に捕捉しうるような
物理的構造を有するものである。一般にイオン交
換樹脂の母体は、モノビニル単量体とポリビニル
単量体を共重合することにより製造され、モノビ
ニル単量体としては、スチレンの如き芳香族モノ
ビニル化合物が、またポリビニル単量体としては
ジビニルベンゼンの如き芳香族ジビニル化合物が
好適に使用されている。樹脂母体を多孔性にする
には、例えば、前記モノマーの重合系に、溶媒に
よる抽出除去可能で且つ、重合反応に関与しない
材料、例えばポリスチレンなどを共存させながら
重合反応を行ない、反応終了後、得られた樹脂を
溶媒で処理してポリスチレンを抽出除去すること
により行なうことができる。 陰イオン交換基の導入法としては、樹脂母体の
クロルメチル基を導入した後、トリメチルアミン
ジメチルエタノールアミン、エチレンジアミン、
ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン
等の脂肪族アミンあるいは、ピロリジン、モルホ
リン、ピペリジン等の環状アミン等の各種アミン
で処理する方法が適当である。 こうして製造される多孔性アニオン交換樹脂の
粒径は不溶性の細胞構成成分の懸濁液をカラムに
供する場合には、あまりに小さい粒径の場合は粒
子間の間隙につまりが生ずるので大規模生産の場
合には40〜200メツシユの粒径の樹脂を用いるの
が望ましい。 かかる多孔性アニオン交換樹脂に、アシル
CoAシンセターゼ含有液から、アシルCoAシン
セターゼを吸着させるには、撹拌槽内でゆつくり
撹拌しつつ行ない、その後懸洗を行つてもよい
が、樹脂が破砕する危険性もあり、手間もかか
る。それよりも有利な方法としては多孔性アニオ
ン交換樹脂を充填したカラム内を上昇流又は下向
流で、該酵素含有液を連続的に供給し、該酵素の
吸着が不充分な場合には、該酵素含有液を循環し
つつ供給して、充分に吸着させたのち、適切な緩
衝液を通液してカラム内を洗浄するのが、本発明
の望ましい実施形態である。 吸着したアシルCoAシンセターゼを溶離させ
るには、一般にイオン交換クロマトグラフイーで
行なわれるように緩衝液中のイオン強度を上げる
ことにより行うことができる。イオン強度を上げ
るには、緩衝剤として用いるリン酸塩等の塩の濃
度を上げてもよく、又、アルカリ金属の塩化物等
の塩を緩衝液に添加してもよい。通常、緩衝液中
の電解質塩濃度が0.1〜0.3モル濃度で、好適に溶
離される。なお、吸着から脱離までの工程におい
て、PHは常に、該酵素の至適安定PH近傍に保つの
が好ましく、また、温度は15℃以下、好ましくは
２〜８℃に保つのがよい。 かくして得られた該酵素含有液は、ほとんど微
粒が認められず、比活性は供給液のそれの数倍で
あるが、更に精製が必要な場合には、公知の方法
たとえば、ゲル・パーミエーシヨン・クロマトグ
ラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー吸
着クロマトグラフイー等のクロマトグラフイーや
硫安塩析等の溶解度差による分別を行つて精製度
を高めることができる。 次に本発明を実施例により説明するが、本発明
は、この実施例のみに制限されるものではないこ
とは当然である。 〔活性の測定方法〕 上領らがブローデイング オブ ナシヨナルア
カデミー オブ サイエンス オブ ユーエスエ
ー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）74巻、4947〜
4950ページ（1977年）アメリカ国に記載した方法
で測定した。ただし、反応温度は37℃とした。 すなわち、ヒドロキシルアミン塩酸塩（0.5モ
ル）、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン
（0.1モル）、フツ化カリウム（0.025モル）、アデ
ノシントリリン酸ニナトリウム塩（0.015モル）、
コエンザイムＡ（0.0006モル）、ジチオスライトー
ル（0.005モル）、塩化マグネシウム（0.01モル）
を含むPH7.4の水溶液0.8mlに、測定すべき酵素液
0.1mlを添加し、37℃恒温水槽で予熱したのち、
オレイン酸カリウム（0.004モル）、活性剤Ｔ
（0.0016モル）を含む水溶液0.1mlを添加して、37
℃で反応を行つた。各試薬のモル濃度は括弧内に
示した値である。30分経過したら、15mg／mlのア
ルブミン水溶液0.1mlと、５％の過温素酸水溶液
２mlを添加混合して反応を停止し、生じた沈澱を
3000回転／分の速度で10分間遠心して分離し、こ
れに塩化第二鉄（六水塩）の0.2％酸性エタノー
ル溶液３mlを添加して、発色させ、さらに3000回
転／分で10分間遠心して、着色した上清液を
520nｍで比色することにより、オレオイルコエ
ンザイムＡを定量した。上記条件下で１分間に１
マイクロモルのオレオイルコエンザイムＡを生成
する酵素量を１ユニツト（1U）とした。（オレオ
イルヒドロキサメート鉄錯体の分子吸光係数は
1000cm^-1、M^-1とした。） 〔蛋白質量の測定方法〕 ローリー（Lowry）法で行なつた。 実施例 １ 工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第9711号（FERM Ｐ−9711）として寄託されて
いるキヤンデイダ・リポリテイカ（Candida
Lipolytica）NRRL Ｙ−6795株を、２％グルコ
ース、0.5％NH₄H₂PO₄、0.25％KH₂PO₄、0.1％
MgSO₄・7H₂O、0.002％FeCl₃・6H₂O、0.1％バ
クト・イースト・エクストラクト（デイフコ社
製、アメリカ）PH5.2なる組成の培地15に接種
し、ジヤーフアーメンターで温度26℃、通気量
1.0vvm、撹拌速度250rpmの条件で18時間培養
し、500ｇの湿潤菌体を得た。この菌体を５ｍＭ
のメルカプトエタノール及び１ｍＭ EDTAを
含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）１に懸濁し、
連続菌体破砕機ダイノーミルKDL（商標名、W.
A.Bachofen Maschinenfabrik社製、スイス）を
用いてホモゲナイズし、8000ｇで20分遠心分離し
て、顆粒画分1.1を得た。 この中200mlに26.7ｇの硫安を溶解せしめ、PH
6.0、温度４℃で45分撹拌したのち、20000ｇで10
分遠心分離して得た沈澱物を５ｍＭをメルカプト
エタノール、10ｍＭ活性剤Ｔ、0.5ｍＭ EDTA
を含む50ｍＭのリン酸緩衝液200mlに再懸濁して
４℃で２時間放置し、ついで５ｍＭ、メルカプト
エタノール水溶液800mlを加えて1000mlとした。
これを原酵素液とよぶ。 一方、表１の１に示す強塩基性型の多孔性ア
ニオン交換樹脂の100〜200メツシユ品250mlを径
40mmのガラスカラムに充填し、酸及びアルカリで
洗つた後、５ｍＭのメルカプトエタノール及び２
ｍＭの活性剤Ｔを含む20ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.4）で平衡化した。 原酵素液1000mlをこのカラムに下向流で通液し
たあと、平衡化に用いたのと同じ緩衝液１を通
液してカラム内を洗浄し、ついで５ｍＭのメルカ
プトエタノール、２ｍＭの活性剤Ｔを含む150ｍ
Ｍ リン酸緩衝液（PH7.4）の通液を開始すると
ともに、カラム出口液の分画をフラクシヨンコレ
クター）東洋科学産業製、SF160型）を用いて開
始した。１画分当り20mlずつ分画した。これらの
操作は４℃で行ない、流速は120ml／hrとした。
クロマトグラムは第１図に示すようであり、第11
画分から第18画分の間に存在するアシルCoAシ
ンセターゼ活性は380U、比活性は2.1U／mgであ
つた。この画分に着色物の残存はみられたが、濁
りはほとんどみられなかつた。 原酵素液の総活性は65U、比活性は0.23U／mg
であつたから、比活性は９倍に上昇し、活性回収
率は58％である。 実施例 ２ 実施例１と同様にして得た顆粒画分４に100
ｍＭの活性剤Ｔの水溶液400mlを添加して４℃で
１時間放置したあと、５ｍＭメルカプトエタノー
ル水溶液を加えて全量を20とした。これを原酵
素液とよぶ。 一方、表１の２に示す、強塩基性型の多孔性
アニオン交換樹脂の40〜60メツシユ品７を径
100mmのアクリル樹脂製カラムに充填し、酸及び
アルカリで洗つた後、５ｍＭメルカプトエタノー
ル及び２ｍＭの活性剤Ｔを含む20ｍＭリン酸緩衝
液（PH7.4）で平衡化した。原酵素液20をこの
カラムに流速５／hrで終夜循環させたのち、15
の上記平衡化液で洗浄した。ついで、５ｍＭの
メルカプトエタノール、２ｍＭの活性剤Ｔを含む
150ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4）を流速４／hrで
通液し出口液を1.5ずつに分画した。 原酵素液の活性は17500U、比活性は0.144U／
mgであつたのに対し、高活性画分の総活性は
11700U、比活性は0.474U／mgであつた。

【表】 細孔容積：水銀圧入法による。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１のフラクシヨンコレクター
のクロマトグラムである。●印がアシルCoAシ
ンセターゼシンセターゼ活性を、〇印が蛋白質量
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キヤンデイダ属に属する酵母により生産され
   た長鎖アシルCoAシンセターゼ（E.C.6.2.1.3）を
   含有し、かつ不溶性の細胞構成成分を含む懸濁液
   を水溶液中で膨潤した時に100〜1000Åの孔径を
   有するマクロポアーを形成し、該マクロポアーの
   容積が粒子全容積の５％以上に達する物理的性質
   を有し、架橋ポリスチレンを基体とする強塩基性
   の多孔性アニオン交換樹脂と接触させて該酵素を
   吸着させ、次いで溶離剤で溶離させることを特徴
   とする、該酵素の精製方法。