JPH07114699B2

JPH07114699B2 - 酵素精製法

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Publication number: JPH07114699B2
Application number: JP60066412A
Authority: JP
Inventors: リチヤード・エイ・ジヨンソン; ノーマン・イー・ロイド
Original assignee: スタブラ・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1984-03-28
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1995-12-13
Anticipated expiration: 2010-12-13
Also published as: GB8508085D0; CA1237084A; HUT37457A; IT8520090A0; US4634673A; DK138485A; GB2156355A; JPS60224491A; DK168960B1; GB2156355B; FR2562087B1; DE3511331C2; DE3511331A1; DK138485D0; HU199558B; FR2562087A1; IT1208519B; BE902048A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は水性グルコース・イソメラーゼ溶液の精製、さ
らに詳しくは、該溶液をアミンで処理して酵素活性を有
する不溶性複合体を形成させる方法に関する。

発明の背景グルコース・イソメラーゼはグルコースをフラクトース
に変える酵素である。グルコース・イソメラーゼを産生
する種々の微生物が知られている。例えばアクチノプラ
ネス（Actinoplnes）、アエロバクター（Aerobacte
r）、アンプラリエラ（Ampullariella）、アースロバク
ター（Arthrobacer）、バチルス（Bacillus）、ラクト
バチルス（Lactobacillus）およびストレプトミセス（S
troptomyces）属の微生物がグルコース・イソメラーゼ
を産生する。一般に、グルコース・イソメラーゼは主に
細胞内で産生され、したがつて、グルコース・イソメラ
ーゼの大部分は微生物の細胞壁内および／または壁上に
見出される。したがつて、可溶性酵素を得るには、酵素
を微生物細胞から抽出する必要がある。この抽出操作
は、細胞外膜の少なくとも一部を崩壊し、酵素および他
の細胞物質を微生物酵素抽出物中に拡散させる。すなわ
ち、酵素抽出物は可溶性および不溶性両方の不純物を含
有している。不溶性不純物は、過または遠心分離のよ
うな公知の方法で容易に分離できる。しかしながら、生
物学的オリゴマーまたはポリマー、例えば、核酸、非酵
素的蛋白またはポリウロン酸のような細胞壁成分などと
考えられる可溶性不純物は、しばしば、所望の産物と同
様な化学的または物理的性質を有するので除去が困難
で、経費がかかる。

微生物酵素抽出物から望ましくない可溶性物質を除去ま
たは分離する方法はよく知られている。これらの方法の
最近の概要はダブリユウ・イー・ジヤコビー編、「メソ
ツド・オブ・エンザイモロジイ）（“Methods of Enzym
ology",ed.W.E.Jakoby,Academic Press,・N.Y.,N.Y.）
第22巻、273〜287頁および476〜556頁に記載されてい
る。溶解度に基く分離、特異親和性に基く分離およびク
ロマトグラフイーによる分離のような種々の酵素精製法
が記載されている。

また、多数の特許が種々の酵素精製法を記載している。
マスダ（Masuda）の米国特許第3769168号は吸着、洗浄
およびイオン溶液による酵素の溶出によるβ−アミラー
ゼの精製を記載している。フイリツプら（Philipp et a
l）の米国特許第3912595号はカラム中の粒状担体上で可
逆的に酵素の複合体を形成させ、ついで、緩衝液で酵素
を溶出させることによる加水分解酵素液の精製を記載し
ている。ヤマダら（Yamada et al）の米国特許第397277
7号は酸カチオン交換樹脂上に選択的に吸着させ、つい
で、緩衝液で樹脂からβ−ガラクトシダーゼを溶出させ
るβ−ガラクトシダーゼの精製法を記載している。これ
らの方法はいずれも、未精製酵素液を、酵素を吸着また
は結合するマトリツクスと接触させ、イオン溶液を添加
して精製酵素をマトリツクスから溶出する操作を含んで
いる。

ジヨンソンら（Johnson et al）の米国特許第4347322号
は酵素精製用のクロマトグラフイーを教示している。バ
イレルら（Vairel et al）の米国特許第4106992号ら
は、粗ウロキナーゼを、DEAE−セルロース樹脂を用いる
クロマトグラフイーに付している。記載された方法は主
としてウロキナーゼからの発熱物質の除去にあてられて
いる。

いくつかの特許が沈澱による微生物酵素抽出物の精製を
教示している。ボルグラム（Borglum）の米国特許第372
8244号は第４級アンモニウム化合物による不純物の沈澱
を教示している。ベルグマイヤーら（Bergmeyer et a
l）の米国特許第3794562号はポリエチレンイミンを用い
る不純物の沈澱を教示している。スノークら（Snoke et
al）の米国特許第4055469号は合成ポリ電解質を用いる
不純物の沈澱を教示する。モリシら（Morisi et al）の
英国特許第1411503号はカチオン界面活性剤による不純
物の沈澱を教示している。これらの特許はいずれも、不
純物を沈澱させて除去し、活性酵素を溶液中に残す方法
を教示している。

少なくとも１つの長鎖炭化水素Ｎ−置換基を有する第４
級アンモニウム化合物は界面活性電解質で、溶液中で集
合体またはミセルを形成することができる。これらの化
合物は親水性の第４級アミノ基と、疎水性の炭化水素鎖
によつて特徴づけられる。多くの第４級アンモニウム化
合物は、それらの微生物の不活化または阻止する能力か
ら抗微生物剤としての広範な用途が判明している。この
能力は陽性に帯電した第４級アミンと、陰性に帯電した
微生物表面の間でアニオン−カチオン複合体が形成され
ることによるものと考えられる。

第４級アンモニウム化合物はまた、蛋白のような陰性に
帯電した種々の高分子物質と不溶性のアニオン−カチオ
ン複合体を形成する。沈澱、不活化、変性、再分散およ
び複合体形成はいずれも、蛋白と第４級アンモニウム化
合物との相互作用によつて生じたと報告されている現象
である。

発明の概要本発明は、水性溶液を式：〔式中、R₁は少なくとも炭素数６のヒドロカルビル基、
R₂は炭素数約８〜20のヒドロカルビル基、R₃は低級アル
キル、Ｘはアニオンを意味する〕で示されるアミン化合物と接触させ、生じた酵素含有沈
澱（析出物）を回収することを特徴とする水性溶液から
のグルコース・イソメラーゼの分離方法に関する。

本発明は水性溶液中のグルコース・イソメラーゼの精製
法を提供するものである。該グルコース・イソメラーゼ
を第３級または第４級アミンと、アミンがイソメラーゼ
と相互作用して不溶性の酵素−アミン複合体を形成する
ような条件下で接触させる。このイソメラーゼ−アミン
複合体は強いイオン性溶液に添加することができ、これ
により、複合体が解離して可溶性の精製、濃縮グルコー
ス・イソメラーゼ調製物が得られる。

意外にも、ある種のアミン化合物がグルコース・イソメ
ラーゼ調製物の精製法において使用できることが判明し
た。

本発明の方法で用いることのできる第３級および第４級
アミン化合物は式：〔式中、R₁は少なくとも炭素数６のヒドロカルビル基、
R₂は炭素数約８〜20のヒドロカルビル基、R₃は低級アル
キル、R₄は水素または低級アルキルを意味する〕で示される。

ヒドロカルビル基は、好ましくは、アルキル、シクロア
ルキル、アルケン、アリールおよびアラルキルで、例え
ば、クロロおよびブロモのようなハロゲン、ヒドロキ
シ、アルコキシなどのような基で置換されていてもよ
い。また、ヒドロカルビル基には、エーテルまたはチオ
エーテル結合におけるごとく、酵素または硫黄原子で中
断された炭化水素鎖、例えば、ジイソブチルフエノキシ
エトキシエチルおよびジイソブチルクレゾキシエトキシ
エチル基も包含する。

Ｘはいずれの適当な無機または有機アニオンでもよく、
ハロゲンイオン、硝酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオ
ン、酢酸イオンなどが挙げられる。該アニオンは酵素に
対して不活性である。

前記の式で示される本発明の方法に用いることのできる
アミンの例としては、ジメチルベンジルドデシルアンモ
ニウム、ジメチルジラウリルアンモニウム、ステアリル
ジメチルベンジルアンモニウム、ジステアリルジメチル
アンモニウム、ジエチルジオクタデシルアンモニウム、
ジメチルジドデシルアンモニウム、ジメチルドデシルナ
フチルメチルアンモニウム、ジメチルヘキサデシルジク
ロロベンジルアンモニウムおよびジメチルジイソブチル
フエノキシエチルベンジルアンモニウム塩が挙げられ
る。

発明の詳説本発明によれば、アミンがグルコース・イソメラーゼと
相互作用して不溶性のイソメラーゼ−アミン複合体を形
成して沈澱する条件下、少なくとも１つの前記アミンを
精製するグルコース・イソメラーゼ水性抽出物に加え
る。ついで、不溶性イソメラーゼ−アミン複合体を
過、遠心分離などの常法により分離する。沈澱物から酵
素を分離するには、イソメラーゼ−アミン複合体をイオ
ン化塩溶液に加える。ここで複合体は解離し、イソメラ
ーゼおよびアミンが再溶解する。ついで、限外過また
はカチオン交換樹脂による処理で酵素溶液からアミン化
合物を分離し、高い特異活性（例えば、mg蛋白当りの活
性）を有する精製、濃縮グルコース・イソメラーゼ調製
物を得てもよい。

沈澱（析出）した酵素−アミン複合体の再溶解に必要な
イオン化塩の量は、適当な電解質、好ましくは、経済
性、入手しやすさから、塩化ナトリウムの種々の濃度、
すなわち、イオン強度の溶液を用いる簡単なテスト法で
容易に決定できる。グルコース・イソメラーゼに不利な
影響を与えない限り、いずれの電解質も使用できる。必
要な塩の量は該沈澱を溶解するのに必要な最少濃度とし
て決定される。塩化ナトリウムは酵素に、目につくよう
な影響は与えないので、沈澱の完全な溶解を保証する濃
度で用いることができる。

場合により、酵素を回収すべき水性酵素溶液は、所望の
酵素の沈澱に先立ち、添加したアミンと沈澱を形成する
不純物を含有しうる。このような場合、アミンの添加を
数回、通常、２回に分けて行なうべきで、最初の添加で
該不純物を析出させ、最後に酵素を析出させる。最初の
添加に必要なアミンの量は、元の酵素溶液のいくつかの
試料を用い、漸変する量のアミン化合物を添加すること
により、容易に決定できる。各添加によつて生じた沈澱
の酵素活性をテストし、いつたん酵素活性が検出された
ら、そのアミンの量が最初の沈澱に必要な量である。

本発明を実施するにおいては、R₂が炭素数約８〜18のア
ルキル、R₁が炭素数約６〜10の基、R₃およびR₄が低級ア
ルキルおよびＸがハロゲンアニオンの前記一般式で示さ
れる第４級アミンを用いることが好ましい。

もつとも好ましい化合物は式：〔式中、ｎは12、14または16の整数、Ｘはハロゲンアニ
オンを意味する〕で示される。これらの化合物を含有する製品が米国ニユ
ージヤージー州、ジヤージー・シテイーのオニクス・ケ
ミカル・カンパニー（Onyx Chemical Co.,Jersey City,
New Jersey,U.S.A.）により、BTC−835の商品名で販売
されている。BTC−835は、前記式において、ｎが14の化
合物50％、ｎが12の化合物40％およびｎが16の化合物10
％からなる混合物である。

本発明を実施するための条件は、イソメラーゼ抽出物の
純度および濃度、実際に用いるアミン化合物によつて変
化しうる。用いるアミンの量は実質的に全ての活性酵素
を沈澱させるに十分な量とすべきで、一般に、W/V基準
で少なくとも100ppmである。好ましい量は少なくとも約
500ppmで、通常、約500〜5000ppmである。もつとも好ま
しくは、約1000〜3000ppmである。

pHは、酵素の等電点（pI）より約1pH単位上で、用いる
アミン化合物のpKaより約1pH単位下の範囲とすべきであ
る。好ましくは、pHは約5.5〜8.5、理想的には、約6.0
〜8.0、もつとも好ましくは、約7.0〜7.4である。

温度は、０℃のような低温から、酵素の熱変性または不
活性が起る温度より下までの広い範囲で変えることがで
きる。一般に、室温で行なうことが都合よい。

本発明の方法の作用機序は完全には判明していない。し
かしながら、アミンがグルコース・イソメラーゼと相互
作用して不溶性のイソメラーゼ−アミン複合体を形成す
るものと考えられる。不溶性のイソメラーゼ−アミン複
合体を高イオン溶液に加えると、イソメラーゼ−アミン
複合体が解離し、イソメラーゼおよびアミンが再溶解す
る。

本発明で得られる結果は実に意外なことである。すなわ
ち、本発明で用いるアミン化合物は、一般に、強力な酵
素不活化剤および変性剤と考えられており、これがグル
コース・イソメラーゼを精製するために使用できるとい
うことは非常に意外なことである。驚くべきことに、第
４級アンモニウム塩の全て、あるいは第３級アミンの全
てが、本発明の特定の第３級アミンおよび第４級アンモ
ニウム塩を用いて得られる結果を与えることができるわ
けではないのである。ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムクロライドのような公知の第４級アミン塩は本発明
の条件下で全く沈澱を形成せず、一方、他のアミン化合
物、例えば、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロ
ライドは、検出できるほどの酵素活性を示さないなずか
な沈澱を形成する。他のアミンは沈澱の形成有無にかか
わりなく、酵素活性を著しく低下させる。特に有効なア
ミン化合物はR₁が炭素数７〜10のアラルキル、例えば、
ベンジルおよびナフチルメチル、R₂が炭素数12〜16のア
ルキルおよびR₃およびR₄が、各々、低級アルキル、特に
メチルのものである。また、イソメラーゼ−アミン複合
体が非常に容易に解離して精製活性酵素を生じることも
意外なことである。

本発明の方法の出発物質として用いるグルコース・イソ
メラーゼ抽出物の製造方法は公知である。例えば、グル
コース・イソメラーゼを含有する酵素抽出物は、グルコ
ース・イソメラーゼを産生することが知られている種の
微生物を培養し、菌糸から酵素を抽出し、公知の方法で
不溶物を除去することにより得られる。

好ましいグルコース・イソメラーゼ抽出物はアクチノプ
ラニス、アンプラリエラ、アエロバクター、アースロバ
クター、バチルス、ミクロモノスポラ（Micromonospor
a）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロエロボ
スポラ（Microellobospora）、ノルカルジア（Norcardi
a）またはストレプトミセス属の微生物から得ることが
できる。典型的には、グルコース・イソメラーゼ抽出物
はストレプトミセス・ルビゲノサス（Streptomyces ru
bigenosus）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス
（Streptomyces olivochromogenes）、バチルス・コア
ギユランス（Bacillus coagulans）またはバチルス・
ステアロサーモフイルス（Bacillus stearothermophil
us）種の微生物から得られる。

分析法総蛋白総蛋白はベツクマン・モデルDK−2A分光光度計を用いて
280mμの波長で測定した。

イソメラーゼ活性（IGLU） IGIUはインターナシヨナル・グルコース・イソメラーゼ
・ユニツトの略で、当初、グルコース２モル／、MgSO
₄ 0.02モル／およびCoCl₂ 0.001モル／を含有する
溶液中、pH6.84〜6.85（0.2Mマレイン酸ナトリウム）で
室温および60℃で測定した、１分当り、１マイクロモル
のグルコースをフラクトースに変える酵素の量である。
グルコース・イソメラーゼの測定はエヌ・イー・ルロイ
ドら、シリアル・ケミストリー（N.E.Lloyed et al,cer
eal Chem.）、49巻、５号、544〜553頁（1972年）に記
載される方法で行なつた。

固定化イソメラーゼ活性（FAU）固定化イソメラーゼ活性はつぎの方法で測定した。

1400〜2200IGIUを含有する固定化イソメラーゼ試料を秤
取した。試料をデキストロース検定溶液（予め65℃に加
温）125mlおよび0.1Mトリス−ヒドロキシメチルアミノ
メタン（THAM）溶液（pH7.8）10mlで250mlフラスコに洗
い込んだ。デキストロース検定溶液はデキストロース3.
33M、硫酸マグネシウム20mM、亜硫酸ナトリウム10mM、T
HAM100mMおよび塩化コバルト1mMを含有する（pH7.8）。
65℃において、このデキストロース溶液はpH7.0を示
す。フラスコを65℃の水浴につけ、１時間振とうした。
混合液を、過助剤1gをプレコートしたガラス繊維フイ
ルターを付した45mm粗ガラス過器を通して真空過し
た。フラスコおよび酵素ケーキを少量の100mMTHAM緩衝
液（pH7.8）で洗浄し、全量を100mlとした。

この洗浄した酵素を、デキストロース検定溶液（予め65
℃で平衡）125mlを含有する250mlフラスコに入れた。洗
浄した酵素を10mMTHAM緩衝液（pH7.8）10mlに定量的に
フラスコに洗い込み、フラスコを正確に60分間振とうし
た。ついで、氷酢酸12.0mlを加え、この酸性化混合液を
さらに15分間振とうした。混合液を、過助剤約1gをプ
レコートしたガラス繊維フイルターを付した45mm粗ガラ
ス過器を通して真空過した。フラスコおよび過器
内容物を、約400mlの液が集まるまで脱ミネラル水で
洗浄した。液を25℃に冷却し、500mlに希釈した。溶
液の旋光度を、25℃にて2dmセルを用いて測定し、R₂と
した。

酵素を加えない以外は前記と同様に操作してブランク調
製した。ブランクの旋光度も25℃で測定し、R₁とした。
異性化度をつぎの式から算出した。

〔式中、ａはフラクトースが完全にデキストロースに変
換されたときの比旋光度、C_pは溶液中の糖濃度（0.15g/
ml）、Ｌは旋光計の管長（2dm）を意味する〕イソメラーゼ活性の固定活性単位（FAU）は次式より算
出される。

FAU/g＝JC/K_ftw 〔式中、K_fは速度定数（1.21 Ihr^-1FAU^-1mgグルコー
ス）、ｔは反応時間（１時間）、ｗは試料重量（ｇ）、
Ｃは反応混合液125ml当りの初期濃度（mg）（75000mgグ
ルコース）、Ｊはつぎのとおり：（式中、I_eはフラクトースのモル分率で示した平衡時の
異性化度（0.513）、Ｉはフラクトースのモル分率で示
した異性化度、C_mはグルコースの初期濃度（3.33M）、K
_sはグルコースのミハエリス定数（0.7M）、K_pはフラク
トースのミハエリス定数（1.43M）を意味する）〕 1IGIUは15.8FAUに等しい。

実施例つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１この実施例では不溶性グルコース・イソメラーゼ−アミ
ン複合体の形成、ついで、イオン溶液中での該複合体の
解離による精製グルコース・イソメラーゼ調製物の製造
を説明する。

ストレプトミセス属の選定した株の微生物（ストレプト
ミセス・ルビゲノサス）からグルコース・イソメラーゼ
抽出物を得、pH7.2に調整した。抽出物のイソメラーゼ
活性は40IGIU/mlであつた。９個の容器の各々に酵素抽
出物25ml（合計1000IGIU）を加えた。適当量のBTC−83
5、Ｎ−アルキル（C₁₂,C₁₄,C₁₆）−ジメチルベンジルア
ンモニウムクロライド（オニツクス・ケミカル・カンパ
ニー）を室温で各容器に加え、15分官撹拌を続けた。BT
Cの添加により、最低100ppmのレベルで白色凝集沈澱が
形成された。

沈澱を遠心分離により除き、得られた上澄液の一部のイ
ソメラーゼ活性を検定した。結果を第１表に示す。

このデータはBTC濃度が1000ppm以上で可溶性イソメラー
ゼ活性が全く残存していないことを示す。500ppmのBTC
濃度で、可溶性活性の残存率は50％であつた。

容器５からの沈澱を室温で0.5N NaCl5mlに再懸濁し、
撹拌した。沈澱は数分で再溶解した。得られた溶液の0.
5ml部分を0.5N NaCl19.5mlで希釈し、検定したとこ
ろ、イソメラーゼ活性を示した。

実施例２この実施例では本発明の方法の精製、濃縮グルコース・
イソメラーゼの製造への使用を説明する。

総活性12000 IGIU、比活性2.7IGIU/mg蛋白の、実施例
１のイソメラーゼ抽出物の試料300mlをNaOHでpH7.2に調
整した。BTC−835を加えて最終濃度を1000ppmとし、15
分間撹拌した。形成した沈澱を、過助剤のプレコート
上で過して集めた。フイルターケーキをフイルター
上、水で洗浄し、液試料および洗液のイソメラーゼ活
性を検定した。可溶性活性は検出されなかつた。

フイルターケーキを0.5N NaClで溶出した。この塩化ナ
トリウム溶出液を、XM100メンブラン（分子量カツトオ
フ（MWCO）100000）を用いる米国マサチユーセツツ州ダ
ンバーズ、アミコン・コーポレイシヨン（Amican Cor
p.,Danvers,MA,U.S.A.）のアミコン（Amicon）401撹拌
セルで限外過した。限外過残留物を５倍容の0.5N
NaClで３回透析過（ダイアフイルトレーシヨン）して
残つた未結合BTCを除去した。最後に、残留物を水でく
り返し透析過して脱塩した。最終の残留物は比活性4
3.32IGIU/mg蛋白の、全体で8860IGIUの活性を有してい
た。全体で、出発イソメラーゼ活性の73.8％が回収さ
れ、43.32IGIU/mg蛋白の比活性はこの調製物が蛋白を基
準として少なくともその90％がイソメラーゼであること
を示した。このように、良好な活性の回収で、約20倍も
の精製を行なうことができた。

実施例３実施例１と同じストレプトミセスの第２回目の発酵で得
られたイソメラーゼ抽出物を用いて実施例２の操作をく
り返す。

イソメラーゼ抽出物500ml（総合14000IGIU）をpH7.2に
調整し、BTC−835を滴下して最終濃度を1000ppmとし
た。得られた懸濁液を、過助剤2gを混合後、過し、
フイルターケーキを水約100mlで洗浄した。液および
洗液はイソメラーゼ活性を有していなかつた。ついで、
洗浄したフイルターケーキをそのまま、３時間を要して
0.5N NaCl300mlでゆつくりと溶出させた。

この塩溶出液をアミコンXM−50（50000MWCO）メンブラ
ンで限外過した。限外過残留物を0.5N NaCl、つい
で、水でよく透析過して残つたBTCおよび塩を除去し
た。最終の残留物は全体で13550IGIU、比活性43.4IGIU/
mg蛋白を有していた。このように、実施例２と同様に比
率よく精製が行なえ、活性の回収（94％）が著しく向上
した。

実施例４この実施例ではバチルス属の微生物（バチルス・コアギ
ュランス）から得られたイソメラーゼ抽出物を精製する
本発明の方法を説明する。

A.出発酵素限はバチルス全菌体を過助剤担体と混合し
てなる乾燥粉末で、デンマーク国バグスベルド、ノボ・
インダストリ社（Novo Industri A/S,Bagsvaerd,Denmar
k）のノボ（Novo）SP−103イソメラーゼと称されるもの
である。

該粉末を希トリス緩衝液（pH7.0）に懸濁し、リゾチー
ム（200mg/100g乾燥酵素）を添加後、室温で２時間撹拌
して酵素を可溶化した。ついで、過助剤プレコートを
通して過して不溶物を除去し、液を60℃に加熱し、
20分間保持して不純物を沈澱させ、抽出物を殺菌した。
プレコート過して不溶物を除去後、抽出物10ml（262I
GIU）をpH7.2に調整し、BTC−835を加え、最終濃度を15
00ppmとした。ほとんど同時に大量の白色沈澱が生じ、
これを遠心分離して除き、上澄液の一部のイソメラーゼ
活性を検定した。実質的に出発活性（250IGIU）の全て
が可溶性フラクシヨン中にあつた。

B.前記Ａのはじめの抽出物の一部をBTC−835（1500pp
m）で処理し、得られた不溶物を去し、すてた。この
処理した抽出の25mlづつ（各555IGIU）に、イソメラー
ゼを沈澱させるに必要なBTC−835の濃度を決定するた
め、種々の量のBTC−835を添加した。BTC添加後、沈澱
を遠心分離で除去し、可溶性相の試料のイソメラーゼ活
性を検定した。結果を第２表に示す。

1500ppmの前処理で非酵素不純物を除去後、BTCを添加す
ると、BTCの濃度2000ppm以上で可溶性イソメラーゼ活性
がほとんど完全になくなつた。1000ppmの添加は可溶性
活性の約半分を沈澱させる。

前記の各試料の沈澱を0.5N NaCl10mlに懸濁した。沈澱
は速やかに再溶解した。溶解した沈澱を含有する溶液を
ため、XM−50メンブランで限外過した。0.5N NaClお
よび水で透析過後、残留物のイソメラーゼ活性および
蛋白濃度を分析した。総活性回収は1103IGIUであつた。
比活性は、紫外部吸収で評価した蛋白基準で4.16IGIU/m
gであつた。

実施例５この実施例では種々の第４級アンモニウム化合物でのグ
ルコース・イソメラーゼ抽出物の処理を説明する。

同量の実施例３のイソメラーゼ抽出試料をpH7に調整
し、種々の第４級アンモニウム化合物を加え、最終濃度
を2000ppmとした。沈澱の生成を酵素と第４級アンモニ
ウム化合物の間の相互作用の証拠とした。

つぎの第４級化合物をテストした。

（１）BTC−835 アルキル（C₁₂,C₁₄,C₁₆）ジメチルベンジルアミノクロ
ライド（２）アークオード（ARQUAD）18−50 オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３）サートリマイド（CERTRIMIDE,CTAB）セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（４）BTC−2125M（DUAL QUAT）アルキル（C₁₄,C₁₆,C₁₂,C₁₈）ジメチルベンジルアンモ
ニウムクロライドアルキル（C₁₂,C₁₄）ジメチルエチルベンジルアンモニ
ウムクロライド（５）ハイアミン（HYAMINE）1622 ジイソブチルフエノキシエトキシエチルジメチルベンジ
ルアンモニウムクロライド（６）ハイアミン2389 （メチルドデシルベンジル）トリメチルアンモニウムク
ロライドメチルドデシルキシレンビス（テトラメチル）アンモニ
ウムクロライド（７）マクオート（MAQUAT）DLC1214 アルキル（C₁₂,C₁₄,C₁₆,C₁₈）ジメチル（ジクロロベン
ジル）アンモニウムクロライド（８）BTC−812 オクチルドデシルメチルアンモニウムクロライド（９）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド化合物（１）、（４）、（５）および（７）は大量の白
色沈澱を形成し、化合物（８）、（３）および（２）で
は沈澱が少なかつた。一方、化合物（９）および（６）
は透明のままであつた。懸濁液を遠心分離し、沈澱を除
き、透明な上澄液のイソメラーゼ活性を検定した。

沈澱を0.5N NaClに再懸濁させた酵素−第４級アンモニ
ウム化合物複合体を解離させ、酵素を再度可溶化した、
再度可溶化させた沈澱を0.5N NaCl−0.2M Co⁺⁺で希釈
後、イソメラーゼ活性を検定した。結果を第３表に示
す。

もつとも大量の沈澱を生じた４つの化合物、（１）、
（４）、（５）および（７）はいずれもＮ−ベンジル置
換基を有している。

２つの長鎖アルキル基を含有するBTC−812、（８）は、
BTC−835および他の沈澱とは物理的に異なつた沈澱を示
した。この場合の活性の回収は非常にすぐれていた。化
合物（６）および（９）は何ら明らかな沈澱を生じず、
酵素の不活化はほとんどなかつた。化合物（３）、
（４）および（７）は著しい活性損失を生じた。

実施例６この実施例では酵素および第４級アンモニウム化合物の
不溶性複合体が酵素的に活性であることを説明する。

実施例４のイソメラーゼ抽出物の試料をpH7.2に調整
し、BTC−835（1500ppm）で処理し、過助剤と混合
し、不溶性物質を取した。フイルターケーキを水洗
し、混合した。試料の固定化酵素活性をFAU法で検定し
た。結果は、出発可溶性活性29％の表示活性を示した。

実施例７この実施例では、再溶解したイソメラーゼBTC沈澱からB
TCを除去するための、強酸カチオン交換樹脂を用いる別
法を記載する。

粗酵素抽出物を、HIP100カートリツジ（100000MWCO）を
用いるアミコンCH4濃縮器で限外過して部分精製イソ
メラーゼ濃縮物を調製した。限外過残留物を５倍容の
脱イオン水で透析過して残つた低分子量物質を除去し
た。最終濃縮物は2175IGIU/mlの活性を有し、蛋白濃度
は66.9mg/mlであつた（比活性32.5IGIU/mg）。

この濃縮物10mlを水で300mlで希釈し、pHを7.2に調整し
た。この溶液にBTC−835 300mgを添加し、懸濁液を30
分間撹拌した。形成した沈澱を遠心分離して集め、0.5M
NaCl25mlに再溶解した。この溶液に、湿潤AG50WX4（米
国カリフオルニア州、リツチモンド、バイト・ラド・ラ
ボラトリース（Bio Rad Laboratories,Richmond,CA,U.
S.A.）製カチオン交換樹脂（ナトリウム型）1gdbを加え
た。pHを7.0に調整し、懸濁液をおだやかに30分間撹拌
した。ついで、樹脂を沈降させ、上澄液の一部をとり、
紫外部吸収により可溶性蛋白（280nmでの吸収）およびB
TC（262nmでの吸収）を分析した。この紫外部吸収分析
は可溶性BTCが全て除去されたことを示した。さらに上
澄液の一部をとり、水で10倍に希釈した。この塩濃度の
減少した段階で沈澱のないことは、BTCが樹脂により除
去されたことを示した。残りの上澄液を過して樹脂を
分離し、液を、YM−30メンブランを用いるアミコン20
1撹拌セルで限外過して残つたNaClを分離した。最終
の限外過残留物のイソメラーゼ活性および蛋白濃度を
検定した。イソメラーゼ活性の回収は194000IGIUで、サ
ンプリングロスを修正すると、出発活性の90％以上であ
つた。比活性は40.12IGIU/mg蛋白であつた。

実施例８この実施例では、本発明の方法における種々の第４級お
よび第３級アミンの使用を説明する。

実験方法は実施例５と実質的に同じである。

良好な酵素の沈澱および少なくとも80％の沈澱活性の回
収がつぎの化合物によつて達成された。

マクオートMC1412 アルキル（C₁₄,C₁₂,C₁₆）ジメチルベンジルアンモニウ
ムクロライド BTC−1010 ジデシルジメチルアンモニウムクロライド BTC−1000 アルキル（C₁₂,C₁₄）ジメチル１−ナフチルメチルアン
モニウムクロライドステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロライドハイアミン3500 アルキル（C₁₄,C₁₂,C₁₆）ジメチルベンジルアンモニウ
ムクロライドつぎの化合物を用いた場合は、酵素が全く沈澱しなかつ
たか、不活化が起らなかつた。

バリクオート（VARIQUAT）Ｂ−200 ベンジルトリメチルアンモニウムクロライドアークオー
ド12−50 トデシルトリメチルアンモニウムクロライドジメチルド
デシルアミンジメチルベンジルアミントリイソオクチルアミン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水性溶液を式：［式中、R₁は少なくとも６個の炭素原子を有するヒドロ
カルビル基、R₂は約８〜20の炭素原子を有するヒドロカ
ルビル基、R₃は低級アルキル、R₄は水素または低級アル
キル、Ｘはアニオンを意味する］で示されるアミン化合物と接触させ、生じた酵素含有沈
殿を回収することを特徴とする水性溶液からのグルコー
ス・イソメラーゼの分離方法。
【請求項２】該溶液のpHが約5.5〜約8.5である請求項
（１）記載の方法。
【請求項３】pHが約６〜約８である請求項（２）記載の
方法。
【請求項４】アミン化合物の量が該水性溶液の少なくと
も500ppmである請求項（１）〜（３）いずれか１つに記
載の方法。
【請求項５】アミン化合物において、R₁が炭素数約８〜
約18のアルキル、R₂が炭素数約６〜10のヒドロカルビル
基、R₃およびR₄が、各々、低級アルキル、Ｘがハライド
アニオンである請求項（１）〜（４）いずれか１つに記
載の方法。
【請求項６】該水性溶液が式：［式中、R₂はC_nH_2n+1（ｎは12、14または16の整数）、
Ｘはアニオンを意味する］で示されるアミン化合物を含有する請求項（１）〜
（５）いずれか１つに記載の方法。
【請求項７】R₂がC_nH_2n+1（ｎは12、14および16）基の
混合物である請求項（６）記載の方法。
【請求項８】該水性溶液のpHが約7.0〜7.4である請求項
（６）または（７）記載の方法。
【請求項９】該アミン化合物の量が、該水性溶液の少な
くとも1000ppmである請求項（６）〜（８）いずれか１
つに記載の方法。
【請求項１０】さらに、分離した酵素含有沈殿を水性溶
媒に再溶解する工程を含む請求項（１）〜（９）いずれ
か１つに記載の方法。
【請求項１１】該水性溶媒がイオン化塩を含有する請求
項（10）記載の方法。
【請求項１２】アミン化合物がアルキル（C₁₂、C₁₄、C
₁₆）ジメチルベンジルアンモニウムクロライドである請
求項（６）〜（11）いずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】アミン化合物がオクチルドデシルジメチ
ルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアン
モニウムクロライドまたはジデシルジメチルアンモニウ
ムクロライトである請求項（１）〜（12）いずれか１つ
に記載の方法。