HU199558B

HU199558B - Process for cleaning of glycose isomerase enzim

Info

Publication number: HU199558B
Application number: HU851161A
Authority: HU
Inventors: Richard A Johnson; Norman E Lloyd
Original assignee: Nabisco Brands Inc
Priority date: 1984-03-28
Filing date: 1985-03-27
Publication date: 1990-02-28
Also published as: GB8508085D0; GB2156355B; DK138485A; GB2156355A; DE3511331A1; JPS60224491A; CA1237084A; IT8520090A0; BE902048A; JPH07114699B2; FR2562087A1; DE3511331C2; DK138485D0; DK168960B1; HUT37457A; IT1208519B; FR2562087B1; US4634673A

Description

A találmány tárgya eljárás glükóz izomeráz tisztítására oly módon, hogy az enzimet tartalmazó oldatot (I) általános képletű kvaterner ammónium vegyülettel kezeljük, aminek eredményeképpen enzimaktivitással rendelkező oldhatatlan komplexet kapunk, a komplexet ismert módon elkülönítjük, majd kívánt esetben valamely vizes közegben újból feloldjuk.

A glükóz izomeráz egy enzim, amely a glükózt fruktózzá alakítja át. Az irodalomban különféle glükóz izomeráz termelő mikroorganizmusokat ismerünk. Például, az Actinoplanes, Aerobacter, Ampullariella, Arthrobacter, Bacillus, Lactobacillus és Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok termelnek glükóz izomerázt. Általában a glükóz izomeráz elsődlegesen intracellulárisan képződik, így nagy részét a mikroorganizmusok sejtfalán és/vagy a sejtfalán belül találjuk meg. Ezért ahhoz, hogy oldható enzimet kapjunk, az enzimet ki kell extrahálni a mikróbás sejtekből. Az extrakció eredményeképpen a sejtfal legalább részben szétzúzódik, így lehetővé válik, hogy az enzim és egyéb sejtes anyagok bediífundáljanak a mikrobiális enzim extraktumba. Az enzim extraktum tehát oldható és oldhatatlan szenynyeződéseket egyaránt tartalmaz. Az oldhatatlan szennyeződéseket ismert eljárásokkal, így például szűréssel vagy centrifugálással könnyen eltávolíthatjuk. Az oldható szennyeződések — így a biológiai oligomerek vagy polimerek, például nukleinsavak, nem-enzimatikus proteinek vagy sejtfal-alkotórészek, mint amilyenek a poliuronsavak — eltávolítása nehéz és költséges, mivel ezek gyakran hasonló kémiai vagy fizikai tulajdonságúak, mint a kívánt termék.

A nemkívánatos oldható anyagoknak a mikrobiális enzim extraktumból való eltávolítására vagy elkülönítésére számos módszer ismeretes. Ezeknek a módszereknek jó összefoglalását tartalmazza az alábbi irodalom: Methods of Enzymology, XXII. kötet, 273—287 és 476—556 oldal (W.E.Jakoby, Academic Press, N.Y., N.Y.). Itt különféle enzimtisztítási módszereket, így oldhatóságon alapuló elválasztást, fajlagos aktivitáson alapuló elválasztást és kromatográfiás elválasztásokat ismertetnek.

Számtalan enzimtisztítással foglalkozó szabadalmi leírás is ismeretes. A 3 769 168 számú USA-beli szabadalmi leírásban béta amiláz adszorpcióval, mosással, majd az enzimnek egy ionos oldattal való eluálásával történő tisztítását írják le. A 3 912 959 számú USA-beli szabadalmi leírás egy hidrolitikus enzim oldat tisztítását ismerteti. A tisztítást úgy végzik, hogy az enzimet reverzibilisen megkötik egy granulált hordozóanyagot tartalmazó oszlopon, majd ezután egy pufferrel eluálják.

A 3 972 777 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint β-galaktozidáz tisztítását úgy végzik, hogy egy savas kationcserélő gyan2 tán szelektív adszorpcióval megkötik az enzimet, majd egy pufferrel eluálják a β-galaktozidázt a gyantáról. Mindegyik módszer szerint úgy járnak el, hogy a szennyeződéseket tartalmazó enzim oldatot egy olyan anyaggal kezelik, amelyik adszorbeálja vagy megköti az enzimet, majd valamilyen ionos oldat hozzáadásával eluálják a tisztított enzimet a hordozó anyagról.

A 4 347 322 számú USA-beli szabadalmi leírás egy olyan kromatográfiás enzim tisztítási eljárást ír le, ahol az oldható szennyeződéseket egy ioncserélő anyagon adszorbeáltatják. A 4 106 992 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint nyers urokinázt kiszorításos kromatográfiával, DEAE-cellulóz gyanta felhasználásával tisztítanak. A leírt módszer főként arra való, hogy a pirogén anyagokat eltávolítsa az urokinázból.

Számos szabadalmi leírás olyan módszert ismertet, ahol a mikrobiális enzim extraktumokat kicsapatással tisztítják. A 3 728 244 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint á szennyeződések kicsapatását kvaterner ammónium vegyületekkel végzik. A 3 794 562 számú USA-beli szabadalmi leírásban foglaltak szerint a szennyeződések kicsapatását polietilén-imin alkalmazásával érik el. A 4 055 469 számú USA-beli szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, ahol a szennyeződések kicsapatását szintetikus polielektrolitek segítségével végzik. Az 1 411 503 számú angol szabadalmi leírás szerint a szennyeződések kicsapatását kationos felületaktív szer felhasználásával végzik. Mindezek a módszerek úgy érik el a tisztítást, hogy a szenynyeződéseket kicsapják és eltávolítják, az aktív enzim pedig az oldatban marad.

A nitrogén atomon legalább egy hosszú szénláncot tartalmazó kvaterner ammónium vegyületek olyan felületaktív elektrolitek, amelyek oldatban aggregátumokat vagy micellákat képesek képezni. Az ilyen vegyületeket a hidrofil kvaterner amino-csoport, és a hidrofób szénhidrogén lánc jellemzi. Sok kvaterner ammónium vegyület mikrobaellenes szerként használható azon képességük miatt, hogy a mikroorganizmusokat inaktiválni vagy gátolni képesek. Ez a tulajdonság feltehetőleg azon alapul, hogy egy anion-kation komplex képződik a pozitív töltésű kvaterner amin és a negatív töltésű mikrobiális felület között.

A kvaterner ammónium vegyületek különféle negatív töltésű makromolekulákkal, így proteinekkel is oldhatatlan anion-kation komplexeket képeznek. A kicsapás, inaktiválás, denaturálás, rediszperzió és komplexképzés mind olyan jelenségek, amelyek a proteineknek kvaterner ammónium vegyületekkel való kapcsolatából következnek.

A találmány tárgya eljárás vizes oldatban lévő glükóz izomeráz tisztítására oly módon, hogy a vizes oldatot egy (I) általános képletű amin-származékkal — ahol R, jelentése 8—14 szénatomos alkil-, benzil-, (1—4 szénatomos alkil)-ben-2HU 199558 Β zil-, dihalogén-benzil- vagy naftil-metil-csoport;

R₂ jelentése 10—18 szénatomos alkilvagy (diizobutil-fenoxi)-etoxi-etil-csoport;

R₃ jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport;

R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1—4 szénatomos alkilcsoport; és χ-jelentése anion, előnyösen halogenid anion;

— kezeljük, az oldatra számítva 500— 5000 ppm koncentrációban, az így keletkezett enzimtartalmú csapadékot ismert módon elkülönítjük, majd kívánt esetben újból oldatba visszük egy szervetlen ionos sót tartalmazó vizes közegben.

X^- jelentése bármilyen, az enzimre nézve inért szervetlen vagy szerves anion lehet, így például halogenid, nitrát, szulfát, benzolszulfát, acetát.

A találmány szerinti eljárás vizes oldatban lévő glükóz izomeráz tisztítására alkalmas. A glükóz izomerázt valamilyen kvaterner-aminnal kezeljük olyan körülmények között, ahol az amin kapcsolatba lép az izomerázz al, oldhatatlan enzim-amin komplex képződése közben. A kapott izomeráz-amin komplexet valamilyen erős ionos oldathoz adhatjuk, ahol a komplex disszociál és így oldható, tiszta, koncentrált glükóz izomeráz készítmény keletkezik.

Bizonyos amin vegyületek esetében meglepő és váratlan volt, hogy ezek a vegyületek glükóz izomeráz készítmények tisztítási eljárásában az enzim kicsapására használhatók.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott (I). általános képletű vegyületek lehetnek például;

dimetil-benzil-dodecil ammónium-, dimetil-dilauril ammónium-, sztearil-dimetil-benzil ammónium-, dietil-dioktadecil ammónium-, dimetil-di dodecil ammónium-, dimetil-dodecil-naftil-metil ammónium- és dimetil-hexadecil-diklór-benzil ammónium sók.

A találmány szerinti eljárásban a fent felsorolt amin vegyületek valamelyikét a megfelelő módon tisztított glükóz izomeráz vizes extraktumhoz adjuk. Az amin reakcióba lép a glükóz izomerázzal és egy oldhatatlan izomeráz-amin komplex keletkezik, amely kicsapódik. Az oldhatatlan izomeráz-amin komplexet ezután ismert módon, például szűréssel, centrifugálással, elkülönítjük. Az enzimet a csapadékból eltávolítandó az izomeráz-amin komplexet egy ionizált sóoldathoz adjuk, amikor is a komplex disszociál, az izomeráz és az amin újra oldatba megy. Ezután az amin vegyületet az enzimes oldattól ultraszűréssel vagy kationcserélő gyantával való kezeléssel választjuk el, így egy tisztított, nagy fajlagos aktivitású (aktivitás/ /protein mg) koncentrált glükóz izomeráz készítményt kapunk.

A kicsapódott enzim-amin komplex visszaoldásához szükséges ionizált só mennyiségét egyszerű eljárásokkal, megfelelő elektrolitek, előnyösen nátrium-klorid különböző koncentrációjú, azaz ionerősségü oldatainak felhasználásával határozhatjuk meg. Bármilyen elektrolit alkalmazható, feltéve ha nem hat gátlóan a glükóz izomerázra. A só szükséges mennyiségét az a minimális koncentráció határozza meg, amely ahhoz szükséges, hogy a csapadék feloldódjék. Mivel a nátrium-klorid nem mutat semmi észrevehető hatást az enzim aktivitására, alkalmazhatunk olyan koncentrált oldatot, ami biztosítja a csapadék teljes feloldódását.

Bizonyos esetekben a vizes enzim oldat tartalmazhat olyan szennyeződéseket, amelyek az elegyhez adott amin vegyülettel csapadékot képeznek, mielőtt a kívánt enzim kicsapódna. Ilyen esetekben előnyös, ha az amin vegyületet több részletben, előnyösen két részletben adjuk az oldathoz, amikor is az első részlet hozzáadása után kicsapódnak a szennyeződések, és a második részlet hozzáadása után pedig az enzim. Az első lépésben alkalmazandó amin mennyiségét könnyen meghatározhatjuk úgy, hogy az eredeti enzim oldatból egy alikvot mennyiséget veszünk, és ehhez adjuk hozzá fokozatos mennyiségekben az amint. Minden amin-beadagolásnál megnézzük a keletkezett csapadék enzimaktivitását: amikor az enzimaktivitás megjelenik, ez jelzi, hogy milyen mennyiségű amin hozzáadására van szükség az első fázisbeli csapadék kiválásához.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatók azok az (I) általános képletű vegyületek, ahol R₂ jelentése 12—18 szénatomos alkilcsoport, R, jelentése 8—10 szénatomos alkilcsoport, R₃ és R₄ jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport, X jelentése pedig halogenid anion.

Legelőnyösebb vegyületek a (II) általános képletű vegyületek, ahol n jelentése egész szám, melynek értéke 12, 14 vagy 16, X jelentése pedig halogenid anion. Ezeket a vegyületeket tartalmazza egy kereskedelmi termék, amely BTC-835 néven kapható (Onyx Chemical Co., Jersey City). A BTC-835 egy keverék, amely 50%-ban olyan (II) képletű vegyületet tartalmaz, ahol π értéke 14, 40%ban olyan vegyületet tartalmaz, ahol n=12, és 10%-ban olyan vegyület van benne, ahol n=16.

A találmány szerinti eljárás reakciókörülményei az izomeráz extraktum tisztaságától és koncentrációjától, valamint az alkalmazott amin vegyülettől függenek. Az amin mennyisége annyi kell legyen, amennyi elegendő gyakorlatilag az összes aktív enzim kicsapásához. Előnyös mennyiség minimálisan körülbelül 500 ppm-től körülbelül 5000 ppm-ig. Legelőnyösebb mennyiség körülbelül 1000 ppm-től körülbelül 3000 ppm-ig.

-3HU 199558 Β

A pH-nak olyan tartományon belül kell ‘lennie, ami az enzim izoelektromos pontjánál (pl) körülbelül egy pH egységgel magasabban, a használt amin vegyület pKa értékénél pedig körülbelül egy pH egységgel alacsonyabban van. Előnyösen a pH körülbelül 7,0-7,4 érték.

A hőmérséklet széles tartományon belül változhat, vagyis O°C-tól addig a hőmérsékletig terjedhet, ahol az enzim hödenaturálódása vagy Ínaktiválódása bekövetkezik. A gyakorlatban legelőnyösebb az eljárást szobahőmérsékleten végrehajtani.

A találmány szerinti eljárás mechanizmusa nem teljesen bizonyított. Feltételezésünk szerint az amin kapcsolatba lép a glükóz izomerázzal egy oldhatatlan izomeráz-amin komplex keletkezése közben. Ha áz oldhatatlan izomeráz-amin komplexet egy erősen tonos oldathoz adjuk, az izomeráz-amin komplex disszociál, az izomeráz és az amin újra feloldódik.

A találmány szerinti eljárással kapott eredmények előre nem várhatóak. Meglepő az a tény, hogy a találmány szerinti eljárásban használt, általában hatásos enzim inaktivátoroknak és denaturáló ágenseknek tartott amin vegyűletek glükóz izomeráz extraktumok tisztítására használhatók. Meglepő módon nem minden kvaterner ammónium só, vagy tercier amin biztosítja ugyanazt az eredményt, mint amit a találmány szerinti eljárásban alkalmazott specifikus tercier aminok és kvaterner ammónium sók mutatnak. Ismert kvaterner ammónium sók, mint például a hexadecil-trimetil-ammónium-klorid, nem adnak semmiféle csapadékot a találmány szerinti eljárásban leírt körülmények között, míg egyéb amin vegyűletek, így például az oktadecil-trimetil-ammónium-klorid, enyhe csapadékképződést mutatnak, s ez a csapadék nem mutat értékelhető enzimaktivitást. Más aminok jelentős enzimaktivitás csökkenést eredményeznek, akár képeznek csapadékot, akár nem. A különlegesen hatékony amin vegyűletek azok, ahol R, például benzil-metil-csoportot jelent, R₂ jelentése 12—16 szénatomos alkilcsoport, R₃ és R₄ pedig 1—4 szénatomos alkilcsoportot, előnyösen metilcsoportot jelent. Meglepő volt az is, hogy az izomeráz-amin komplex olyan könnyen disszociál, tiszta aktív enzimet eredményezve.

A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt glükóz-izomeráz extraktumokat az irodalomban ismert módokon állítjuk elő. Például egy glükóz izomeráz tartalmú enzim extraktumot megkaphatunk úgy, hogy glükóz izomeráz termelő mikroorganizmusokkal fermentálunk, az enzimet extrakcióval kinyerjük a sejtekből és ismert módon eltávolítjuk az oldhatatlan anyagot.

Előnyös glükóz izomeráz extraktumokat nyerhetünk az Actinoplanes, Ampullariella, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Mtcrobispora, Microellobospora, Norcardia, vagy Streptomyces nemzetségbe tar-. 4 tozó mikroorganizmusok által. A glükóz izomeráz extraktumok legegyszerűbben a Streptomyces rubigenosus, Streptomyces olivochromogenes, Bacillus coagulans vagy Bacillus stearothermophilus törzsekkel nyerhetők.

Analitikai módszerek Össz-protein

Az össz-protein mennyiséget egy Beckman DK-2A spektrofotométerrel; 280 mp hullámhossznál határoztuk meg.

Izomeráz aktivitás — IGIU

Az IGIU az International Glucose Isomerase Unit — Nemzetközi Glükóz Izomeráz Egység — rövidítése és azt az enzimmennyiséget jelenti, amely 1 mikromól glükózt 1 perc alatt fruktózzá alakít át egy olyan oldatban, amely kezdetben literenként 2 mól glükózt, 0,02 mól magnézium-szulfátot és 0,001 mól kobalt(II) kloridot tartalmaz 6,84—6,85 közti pH értéken (0,2 M nátrium-mal.eát) környezeti hőmérsékleten és 60°C hőmérsékleten mérve. A glükóz izomeráz meghatározásokat az alábbi irodalomban leírt módszer szerint végezzük: Ν. E. Lloyd és társai, Cereal Chem. 49, 5. 544-553 (1972).

Fix izomeráz aktivitás — FALI

A fix izomeráz aktivitást az alábbi módszerrel határozzuk meg.

Lemérünk egy 1400—2200 IGIU tartalmú fix izomeráz mintát. Ezt a mintát 125 ml, előzőleg 65°C hőmérsékletre melegített dextróz próbaoldattal és 10 ml 0,1-es trisz-hidroxi-metilamino-metán (THAM) oldattal (pH= =7,8) belemossuk egy 250 ml-es lombikba.

A dextróz próbaoldat 3,33 M dextrózt, 20 mM magnézium-szulfátot, 10 mM nátrium-szulfitot, 100 mM THAM-ot és 1 mM kobalt-kloridot tartalmaz (pH=7,8). 65°C hőmérsékleten ez a dextróz oldat pH=7,0 pH értékű. A lombikot egy 65°C-os vízfürdőbe merítjük és 1 órán keresztül rázzuk. A keveréket vákuum-szurjük egy 45 mm-es, üvegszál szűrővel és 1 g szűrési segédanyag előszűrő réteggel töltött durván trittelt üvegtölcséren. A lombikot és az enzimpogácsát 100 mM-os THAM pufferoldat (pH=7,8) kis mennyiségeivel addig öblítjük, amíg 100 ml össztérfogatot el nem érünk.

Ezt a mosott enzimet egy 250 ml-es lombikba töltjük, amely lombik 125 ml, előzőleg 65°C hőmérsékletre melegített dextróz próbaoldatot tartalmaz. A mosott enzimet 10 ml 10 m’M-os Tham pufferoldattal (pH=7,8) kvantitatlve belemossuk a lombikba, és a lombikot pontosan 60 percig rázzuk.. Ezután 12,0 ml jégecetes ecetsavat adunk hozzá, és a megsavanyított elegyet még további 15 percig rázzuk. Az elegyet egy, a fent leírt módon megtöltött 45 mm-es űvegtölcséren át vákuum-szflrjük. A lombikot és a tölcsért addig mossuk desztillált vízzel, amíg körülbelül 400 ml szűrletet gyűjtünk össze. Ezt a szűr-4HU 199558 Β letet 25°C hőmérsékletre hűtjük és 500 ml térfogatra hígítjuk. Az oldat forgatóképességét (R₂) egy 2 dm-es cellában, 25°C hőmérsékleten határozzuk meg.

Egy összehasonlító mintát készítünk ugyanilyen módon, azzal a különbséggel, hogy enzimet nem adunk hozzá. Az összehasonlító minta optikai forgatóképességét (R,) szintén 25°C hőmérsékleten határozzuk meg. Az izomerizáció fokát az alábbi egyenlet alapján számítjuk ki:

(Ra— R.) i =aCpL ahol a fajlagos forgatóképesség változás, ha a fruktóz teljesen átalakul dextrózzá, c_pa cukoroldat koncentrációja (0,15 g/ • /ml) és

L a polariméter cső hosszúsága (2 dm). Az izomeráz aktivitás fix aktivitás-egységeit (FAU) az alábbi képlet alapján számítjuk ki:

FAU/g=JC/Kftw ahol K/ egy sebességkonstans (1,21 I óra^-1FAU^-1 mg glükóz), t a reakcióidő órákban kifejezve (1 óra) w a minta tömege g-ban,

C a kezdeti koncentráció mg/125 ml reakcióelegy (75,000 mg glükóz), és

J az alábbi egyenlettel fejezhető ki:

ahol I,=az izomerizáció foka egyensúlyi állapotban, a fruktóz móltörtjében kifejezve (0,513)

I =az izomerizáció foka a fruktóz móltörtjében kifejezve

I.

C_m=a glükóz kezdeti mólkoncentrációja (3,33 M)

K«=a glükózra vonatkozó Michaelis konstans (0,7 M)

Kp=a fruktózra vonatkozó Michaelis konstans (1,43 M)

IGIU egyenlő 15,8 FAU-val.

Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást szemléltetik anélkül, hogy találmányunkat ezekre a példákra korlátoznánk.

1. példa

A példában egy oldhatatlan glükóz izo₁₅ meráz-amin komplex előállítását írjuk le, amely komplex azután egy ionos oldatban disszociál és tiszta aktív glükóz izomeráz keletkezik.

A glükóz izomeráz extraktumot a Streptomyces nemzetség valamilyen kiválasztott törzsével állítjuk elő és pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be. Az extraktum izomeráz aktivitása 40 IGIU/ml. Kilenc mérőedény mindegyiké25 be 25 ml enzim extraktumot mérünk (összesen 1000 IGIU). Mindegyik edénybe megfelelő mennyiségű BTC-835-öt C,₂-ie alkil-dimetil-benzil-ammónium-klorid, Onyx Chemical Co., Jersey City, New Yersey) adago30 lünk szobahőmérsékleten, 15 percig tartó folyamatos keverés mellett. A BTC hozzáadása fehér pelyhes csapadék képződését eredményezi még a legkisebb hozzáadott menynyiség (100 ppm) hatására is.

A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és az elfolyó folyadékot megvizsgáljuk az izomeráz aktivitás szempontjából. Az eredmények az I. táblázatban láthatók.

táblázat

Kísérlet /BTC/ ppm

Oldható izomeráz aktivitás

IGIU/ml % Visszamaradó elfolyó folyadék frakció

1	0	40	100
2	100	40	100
3	500	20	50
4	1000	0	0
5	1500	0	0
6	2000	0	0
7	3000	0	0
8	4000	0	0
9	5000	0	0

-5HU 199558 Β g

Az adatokból látható, hogy 1000 ppm vagy ennél nagyobb BTC koncentrációnál semekkora oldható izomeráz aktivitás nem marad. 500 ppm BTC koncentrációnál a visszamaradó aktivitás 50%.

Az 5. kísérletből származó csapadékot 5 ml 0,5 N nátrium-kloridban, szobahőmérsékleten újra szuszpendáljuk és keverjük. A csapadék pár perc alatt újra feloldódik. A kapott oldat 0,5 ml-es részét 19,5 ml 0,5 N nátrium-kloriddal hígítjuk és megvizsgáljuk az izomeráz aktivitás szempontjából.

2. példa

A példa egy tisztított és koncentrált glükóz izomeráz oldat előállítására vonatkozik.

Az 1. példa szerint előállított izomeráz extraktumból, amelynek összes aktivitása 12000 IGIU, fajlagos aktivitása pedig 2,7 mg IGIU/mg protein, kiveszünk egy 300 ml-es mintát és pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be nátrium-hidroxiddal. Annyi BTC-835-öt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1000 ppm legyen, és az elegyet 15 percig keverjük. A keletkezett csapadékot szűréssel elkülönítjük, előszűrő réteg alkalmazásával. A szűrőpogácsát a szűrőben vízzel mossuk, a szűrlet és a mosófolyadék mintákat megvizsgáljuk izomeráz aktivitás szempontjából. Oldható aktivitás nem érzékelhető.

A filterpogácsát 0,5 N nátrium-kloriddal eluáljuk. A nátrium-kloridos eluátumot egy Amicon 401 (Amicon Corp., Danvers, MA) berendezéssel ultraszűrjük, egy XM100 membrán (100 000 MWCO) alkalmazásával. Az ultraszűrési maradékot háromszor 5-térfogatrész 0,5 N nátrium-kloriddal diafiltráljuk a meg nem kötött BTC eltávolítása céljából. Végül a maradékot vízzel való diafiltrálással sómentesítjük. A végső maradék összes aktivitása 8860 IGIU, fajlagos aktivitása pedig 43,32 IGIU/mg protein. A kiindulási izomeráz aktivitás 73,8%-át visszanyertük és a 43,32 IGIU/mg protein fajlagos aktivitás érték azt jelzi, hogy a készítmény legalább 90%ban izomeráz, proteinre számítva. Mindezek alapján látható, hogy körülbelül 20-szoros tisztítást értünk el jó aktivitás hasznosítással.

3. példa

A 2. példában leírt módon járunk el, az izomeráz extraktumot az 1. példában említett Streptomyces törzzsel történő utófermentálással állítjuk elő.

Az izomeráz extraktumból (összes aktivitás 14 000 IGIU) kiveszünk 500 ml-t, és pHját pH=7,2 értékre állítjuk be. Ezután cseppenként annyi BTC-835-öt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1000 ppm legyen. A kapott szuszpenziót 2 g szűrési segédanyaggal való összekeverés után szűrjük, és a szűrő.10 pogácsát körülbelül 100 ml vízzel mossuk.

A szűrletet és a mosóvizeket egyesítjük: ezeknek nincs izomeráz aktivitása. Ezután az átmosott szürópogácsát in situ lassan * eluáljuk 300 ml 0,5 N nátrium-kloriddal, három óra hosszat.

A sós eluátumot egy Amicon XM-50 (50 000 MWCO) membrán alkalmazásával ultraszfirjuk. Az ultraszürési maradékot 0,5 N nátrium-kloriddal, majd vízzel. deafiliráljuk a maradék BTC és só eltávolítása végett. A· végső maradék összes aktivitása 13 550 IGIU, fajlagos aktivitása pedig43,4 IGIU/mg. Ezekből látható, hogy a tisztítás olyan hatékony volt, mint a 2. példában és az aktivitás (94%) megőrzése jelentősen javult.

4. példa

A példa olyan izomeráz extraktum tisztítására vonatkozik, amelyet Bacillus mikroorganizmusokkal nyertünk.

A. A kiindulási enzimforrás száraz por volt, amely szűrési segédanyag hordozóval kevert Bacillus sejtekből állt. Azonosítási jele: Novo SP-103 izomeráz (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Dánia). Az enzim szolubilizálását úgy hajtjuk végre, hogy a port pH=7,0 értékű hígított Tris pufferben szuszpendáljuk, és lysozim (200 mg/100 g száraz enzim) hozzáadása után szobahőmérsékleten két óra hosszat keverjük. Ezután az előző példákban leírt szűrési eljárással eltávolítjuk az oldhatatlan anyagokat és a szürletet 60°C hőmérsékletre melegítjük. 20 percig ezen a .

hőmérsékleten tartjuk, ezalatt a szennyeződések kicsapódnak és az extraktum pasztőrizálódik. Előszűréses szűréssel eltávolítjuk az oldhatatlan anyagokat, majd az extrák- >

tűm 10 ml-ét (262 IGIU) pH=7,2 értékre állítjuk be, és annyi BTC-835-őt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1500 ppm legyen. A csaknem rögtön kiváló súlyos fehér csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és az elfolyó folyadék egy alikvot mennyiségét megvizsgáljuk az enzim aktivitás szempontjából. Gyakorlatilag a kiindulási aktivitás (250 IGIU) teljesen jelen van az oldható frakcióban.

B. Az A. részben leírtak szerint elkészített eredeti extraktum egy részét 1500 ppm BTC-835-tel kezeljük, és a kapott oldhatatlan anyagot szűréssel elkülönítjük és félre tesszük. A kezelt extraktumból 25 ml-es mintákat (mindegyik aktivitása 555 IGIU) veszünk és különböző mennyiségű BTC-835 hozzáadásával határozzuk meg, hogy milyen koncentráció szükséges az izomeráz kacsapásához. A BTC hozzáadása után a csapadékokat centrifugálással eltávolítjuk és az oldható fázis alikvot mennyiségeit megvizsgáljuk izomeráz aktivitás szempontjából. Az eredmények a II. táblázatban láthatók.

-6HU 199558 Β

II. táblázat

Kísérlet /BTC/ ppm

Oldható izomeráz aktivitás

IGIU/ml Összes IGIU

Oldható fázis, % /555 IGIU összesen/

1	1000	10,36	259	46,6
2	2000	1,76	44	7,9
3	3000	1,76	44	7,9
4	5000	2,10	53	9,5

A BTC hozzáadása, 1500'ppm-nyi mennyiséggel való előkezelés után, amit a nem-enzim szennyeződések eltávolítása céljából végzünk, 2000 ppm vagy ennél nagyobb BTC koncentrációnál csaknem teljes oldható izomeráz aktivitás veszteséget eredményez. 1000 ppm hozzáadása az oldható aktivitás körülbelül felének kicsapódását eredményezi.

A fenti kísérletekből nyert csapadékokat 10 ml 0,5 N nátrium-kloridban szuszpendáljuk. A csapadékok gyorsan újra feloldódnak. A feloldott csapadékokat tartalmazó oldatokat dekantáljuk és XM-50 membránnal ultraszűrjük. 0,5 N nátrium-kloriddal és vízzel való diafiltrálás után az elfolyó folyadékot megvizsgáljuk izomeráz aktivitás és proteinkoncentráció szempontjából. A visszanyert összes aktivitás érték 1103 IGIU. A fajlagos aktivitás 4,16 IGIU/mg az U.V. abszorpció alapján számolt protein-becslésre számolva.

5. példa

A példában glükóz izomeráz extraktumot különféle kvaterner ammónium vegyületekkel kezelünk.

A 3. példában leírt izomeráz extraktumból egyenlő részeket veszünk, és a minták pH-ját pH=7 értékre állítjuk be, majd hozzájuk adjuk a különböző kvaterner ammónium vegyületeket 2000 ppm végső koncentráció eléréséig. Az enzim és a kvaterner vegyület közötti kölcsönhatás következtében csapadék képződik.

A következő kvaterner ammónium vegyületeket vizsgáltuk:

1. BTC—835C,₂_,_e alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid

2. ARQUAD 18—50 Oktadecil-trimetil ammónium-klorid

3. CERTRIMIDE (CTAB)

Cetil-trimeti 1 ammónium-bromid

4. BTC-2125 M (DUAL QUAT)

C_I2_|₈ alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid

C,₂__H alkil-dimeti 1-(étiI-benzil) ammónium-klorid

5. HYAMINE 1622 [ (p-Diizobutil-fenoxi) -etoxi-etil] -dimetil-benzil ammónium-klorid

6. HYAMINE 2389 (Metil-dodecil-benzil) trimetil ammónium-klorid

Metil-dodecil-xilol-bisz (tetrametil) ammónium-klorid

7. MAQUAT DLC 1214

C₁₂_,₈ alkil-dimetil (diklór-benzil) ammónium-klorid

8. BTC-812

Oktil-dodecil-dimetil ammónium-klorid

9. Hexadecil-trimetii ammónium-klorid

Az 1., 4., 5. és 7. pont alatt felsorolt vegyületek esetén bőséges fehér csapadék képződik: kevesebb csapadék keletkezik a 8., 3.

_4g és 2. pont vegyü létéi nél: míg a 9. és 6. pont ⁵ vegyü létéi esetén nem képződik csapadék. A szuszpenziókból centrifugálással elkülönítjük a csapadékokat és az elfolyó folyadékok alikvot mennyiségeit megvizsgáljuk izomeráz aktivitás szempontjából.

A csapadékokat 0,5 N sósavban újra szuszpendáljuk, ennek hatására az enzim-kvaterner ammónium vegyület komplex disszociál és az enzim újra oldatba megy. 0,5 N sósav —0,2 MCo²⁺ oldattal való hígítás után megmérjük az oldatok izomeráz aktivitását.

Az eredményeket a III. táblázatban foglaljuk össze.

-7HU 199558 Β

III. táblázat

Vegyület szám	Csapa- dék	Oldható aktivitás IGIU	A csapadék visszaoldása utáni aktivitás IGIU	összes IGIU
1	+++	101	1422	1523
2	+	1772	----	1772
3	+	664	—	664
4	+++	58	278	336
5	+++	182	722	904
6	-	1820	—	1820
7	+++	8	272	280
8	++	1064	722	1786
9	-	1974	—	1974
Kontrol	—	. 1980		1980

A négy vegyület mindegyike (az 1., 4.,

5. és 7. számmai jelöltek), amely a legbőségesebb csapadékot adta, tartalmaz N-ben- ³⁵zil szubsztituenst.

A 8-as számmal jelölt BTC-812, amely két hosszú alkil-láncot tartalmaz, olyan csapadékot képez, amely fizikailag különbözik a BTC-835 adta csapadéktól és a többi csa- ⁴⁰padéktól is. Ez esetben az aktivitás visszanyerése kiváló volt. A 6 és 9 számokkal jelölt vegyületek nem adtak csapadékot és igen kicsi enzim inaktivációt okoztak. A 3., 4. és

7. számokkal jelölt vegyületek jelentős ak- 45 tivitásveszteséget okoztak.

6. példa

A példában azt illusztráljuk, hogy egy enzim és egy kvaterner ammónium vegyület 50 oldhatatlan komplexe enzimatikusan aktív.

A 4. példa szerint előállított' izomeráz extraktumből egy minta pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be, 1500 ppm BTC-835-tel kezeljük, szűrési segédanyaggal keverjük és 55 az oldhatatlan anyagot szűréssel összegyűjtjük. A szűrőpogácsát vízzel mossuk és a szűrletet összekeverjük. Kiveszünk egy mintát és a FAU módszerrel megmérjük a fix izomeráz aktivitást. Az eredmények kifejezett θθ aktivitást mutatnak, amely a kiindulási oldható aktivitás 29%-a.

7. példa

A példában egy olyan alternatív eljárást írunk le, amelyben erősen savas kationcse- θθ 8 rélő gyantát használunk a BTC-nek az újra feloldott izomeráz BTC csapadékokból való eltávolítására.

Elkészítünk egy részlegesen tisztított izomeráz koneentrátumot oly módon, hogy egy nyers enzim extraktumot Amion CH4 koncentrátorral, HIP100 töltet (100 000 MWCO) felhasználásával ultraszűrjük. Az ultraszűrés elfolyó folyadékát 5 térfogatnyi ionmentesített vízzel diafiltráljuk, ezzel eltávolítjuk az alacsony molekulasúlyú feloldott anyagok maradékát is. A végső koncentrátum aktivitása 2175 IGIU/ml, a proteinkoncentráció pedig 66,9 mg/ml. (A fajlagos aktivitás 32,5 IGIU/mg.)

Ebből a koncentrátumból 10 ml-es részt kiveszünk, ezt 300 ml vízzel meghígítjuk és pH-ját 7,2 értékre állítjuk be. Ehhez az oldathoz 300 .mg BTC-835-öt adunk és a kapott szuszpenziót 30 percig keverjük. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük, majd 25 ml 0,5 M nátrium-klorid oldatban újra feloldjuk. Ehhez az oldathoz 1 g nedves AG50 W X4 kationcserélő gyantát adunk (Bio Rád Laboratories, Richmond, CA gyártmány, nátriumos alakban). A pH-t 7,0 értékre állítjuk be és a szuszpenziót 30 percig erőteljesen keverjük. Ezt kővetően a gyantát hagyjuk leülepedni, és a fel ül úszó folyadék egy alikvot mennyiségét U.V. analízissel megvizsgáljuk az oldható proteink (abszorbció 280 nm-nél) és BTC (abszorbeió 262 nmnél) szempontjából. Az U.V. analízis az oldha-8HU 199558 Β tó BTC teljes eltávolítását mutatja. A felülúszó folyadékból kiveszünk egy további alikvot mennyiséget és vízzel tízszeresére hígítjuk. A csapadékképződés elmaradása ennél a csökkentett sókoncentrációnál azt jelzi, hogy aBTC-t eltávolítottuk a gyantával. A folyadék maradékát szűréssel elkülönítjük a gyantától és a szűrletet egy AMICON 201 kevert cellával, egy YM-30 membrán felhasználásával ultraszűrjük a nátrium-klorid maradék eltávolítása végett. A végső ultraszűrési folyadék izomeráz aktivitását és proteink koncentrációját megmérjük. Az izomeráz aktivitás visszanyerése 194000 IGIU volt, vagyis több mint ,90%-a a kiindulási aktivitásnak. A fajlagos aktivitás 40,12 IGIU/mg protein.

8. példa

A példa különféle kvaterner és tercier aminok alkalmazását illusztrálja a találmány szerinti eljárásban.

A példában mindenben az 5. példában leírtak szerint járunk el. Az alább felsorolt vegyületek alkalmazásával eredményes enzim kicsapódás és a kicsapott aktivitás legalább 80%-ának visszanyerése volt elérhető:

MAQUAT MC 1412

C,₂_₁₆ alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid

BTC-1010

Dodecil-dimetil ammónium-klorid

BTC-1100

C|₂-_I4 alkil-dimetil 1-naftil-metil ammónium-klorid

Sztearil-dimetil-benzil ammónium-klorid

HYAMINE 3500

C|₂— is alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid

Az alább felsorolt vegyületekkel vagy nem történt enzim kicsapódás: vagy inaktiváció jött létre:

VARIQUAT B-200

Benzil-trimetil ammónium-klorid

ARQUAD 12-50

Dodecil-trimetil ammónium-klorid Dimetil-dodecil-amin

Dimetil-benzil-amin

Triizooktil-amin

Claims

1. Eljárás glükóz izomeráz tisztítására vizes oldatból való elkülönítésével, 0°C és az enzim inaktiválódási hőmérséklete közötti hőmérsékleten, 6,5—7,5 pH tartományban, azzal jellemezve, hogy a vizes oldatot (I) általános képletű amin-származékkal — ahol

5 R, jelentése 8—14 szénatomos alkil-, benzil-, (1—4 szénatomos alkil)-benzil-, dihalogén-benzil- vagy naftil-metil-csoport,

R₂ jelentése 10—18 szénatomos alkil- vagy (diizobuti 1-fenoxi) -etoxi-eti 1-csoport,

10 R3 jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport, R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1—4 szénatomos alkilcsoport, és X^- jelentése egy anion, előnyösen halogenid anion — kezeljük az oldatra számítva 500—5000 ppm koncentrációban a keletkezett enzimtartalmú csapadékot ismert módon elkülönítjük, és kívánt esetben a kapott csapadékot szervetlen ionos sót tartalmazó vizes közegben újra fel20 oldjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldatot az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (II)

25 általános képletű amin származékkal kezeljük, ahol n jelentése egész szám, melynek értéke 12, 14 vagy 16 lehet, X jelentése pedig egy anion, előnyösen halogenid anion, majd a keletkezett enzimtartalmú csapadékot el30 távolítjuk az oldatból.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldatot olyan (II) általános képletű amin-származék keverékkel kezeljük, ahol C_nH2_n+i jelentésében n értéke

35 12, 14 és 16.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldat pH-ját 7,0—7,4 értékek közé állítjuk be.

40

5. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldatban az amin-származék végső koncentrációja legalább 1000 ppm mennyiségű.

6. A 2—6. igénypontok bármelyike szerin45 ti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldatot C,₂—16 alkil-dimetil-benzil ammónium-kloriddal kezeljük.

7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes olda⁵⁰ tót oktil-dodecil-dimetil-ammónium-kloriddal, sztearil-dimetil-ammónium-kloriddal vagy dodecil-dimetil-ammónium-kloriddal kezeljük.