DK168960B1 - Fremgangsmåde til adskillelse af glucoseisomerase fra vandige opløsninger - Google Patents

Description

DK 168960 B1.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til adskillelse af glucoseisomerase fra vandige opløsninger.

Glucose isomerase er et enzym, der omdanner glucose til fructose. Der kendes forskellige mikroorganismer, 5 der producerer glucoseisomerase. F.eks. producerer mikroorganismer af slægterne Actinoplanes, Aerobacter, Ampullar iella, Arthrobacter, Bacillus, Lactobacillus og Strep-tomyces glucoseisomerase. Generelt produceres glucoseisomerase primært intracellulært, og størstedelen af glucose-10 isomerasen findes således inden i og/eller på cellevæggene hos mikroorganismerne. Det er derfor nødvendigt at ekstrahere enzymet fra de mikrobielle celler for at kunne producere det opløselige enzym. Ekstraktionsprocessen resulterer i en i det mindste delvis sprængning af celleomhyl-15 ningen, hvilket tillader en diffusion af enzymet og andre cellematerialer ind i den mikrobielle enzymekstrakt. Enzymekstrakten indeholder således både opløselige og uopløselige urenheder. De uopløselige urenheder kan let skilles fra ved kendte metoder, såsom ved filtrering eller centrifuge-20 ring. De opløselige urenheder, som antages at være biologiske oligomere eller polymere, f.eks. nucleinsyrer, ikke--enzymatiske proteiner eller cellevægskoraponenter, såsom polyuronsyrer, er imidlertid vanskelige og kostbare at fjerne, fordi de ofte har kemiske eller fysiske egenska-25 ber, der er lig med det ønskede produkts.

Der kendes metoder til fjernelse eller fraskillel-se af uønskede opløselige materialer fra mikrobielle enzymekstrakter. Et aktuelt resume af disse metoder kan findes i bind XXII i "Methods of Enzymology", side 273-287 og 30 side 476-556 (udgivet af W.E. Jakoby, Academic Press, N.Y., N.Y.). Der er beskrevet forskellige metoder til enzymrensning, såsom adskillelse baseret på opløselighed, adskillelse baseret på specifik affinitet og chromatografiske adskillelser.

I talrige patentskrifter er også beskrevet forskel-35 lige metoder til rensning af enzymer. I US patentskrift nr. 3.769.168 er beskrevet rensningen af β-amylase ved adsorp- 0 DK 168960 B1.

2 tion, vaskning og eluering af enzymet med en ionopløsning.

I US patentskrift nr. 3.912.595 er beskrevet rensningen af en hydrolytisk enzymopløsning ved reversibel kompleksbinding af enzymet på et granulært støttemateriale i en søj-5 le, hvorefter enzymet genvindes ved eluering med en puffer.

I US patentskrift nr. 3.972.777 er beskrevet en fremgangsmåde til raffinering af β-galactosidase ved selektiv adsorption på en syre-kationbytterharpiks og efterfølgende eluering af β-galactosidasen fra harpiksen med en puffer. Ved 10 alle disse metoder bringes en uren enzymopløsning i berøring med en matrix, der adsorberer eller binder enzymet, hvorpå det rensede enzym elueres fra denne matrix ved tilsætning af en ionisk opløsning.

I US patentskrift nr. 4.347.322 er beskrevet en 15 chroma tograf isk proces til enzymrensning, ved hvilken de opløselige urenheder fortrinsvis adsorberes af et ionbyt-termateriale. Ifølge US patentskrift nr. 4.106.992 underkastes rå urokinase eksklusionschromatografi ved anvendelse af en DEAE-celluloseharpiks. Den beskrevne proces er hoved-20 sagelig rettet mod fjernelse af pyrogene stoffer fra urokinase.

I adskillige patentskrifter er beskrevet rensning af mikrobielle enzymekstrakter ved fældning. I US patentskrift nr. 3.728.244 er beskrevet fældning af urenheder 25 med kvaternære ammoniumforbindelser. I US patentskrift nr. 3.794.562 er beskrevet fældning af urenheder ved anvendelse af polyethylenimin. I US patentskrift nr. 4.055.469 er beskrevet fældning af urenheder ved anvendelse af syntetiske polyelektrolytter. I GB patentskrift nr.

30 1.411.503 er beskrevet fældning af urenheder med et kat- ionisk overfladeaktivt middel. I alle disse patentskrifter er beskrevet fremgangsmåder til fældning og fjernelse af urenheder, medens det aktive enzym forbliver i opløsning.

Kvaternære ammoniumforbindelser med mindst én lang 35 carbonhydridkæde som N-substituent er overfladeaktive elektrolytter, der kan danne aggregater eller miceller i opløsning.

DK 168960 B1.

3

Disse forbindelser er karakteriseret ved den hydrofile kva-ternære aminogruppe og ved den hydrofobe carbonhydridkæde.

Mange kvaternære ammoniumforbindelser har fundet udbredt anvendelse som antimikrobielle midler på grund af deres ev-5 ne til at inaktivere eller inhibere mikroorganismer. Denne egenskab formodes at være et resultat af dannelsen af et anion-kation -kompleks mellem den positivt ladede kvaternære amin og den negativt ladede mikrobielle overflade.

Kvaternære ammoniumforbindelser danner også uoplø-10 selige anion-kation -komplekser med forskellige netativt ladede makromolekyler, såsom proteiner. Fældning, inaktivering, denaturering, gendispergering og kompleksdannelse er alle fænomener, der er rapporteret som hidrørende fra vekselvirkningen mellem proteiner og kvaternære ammonium-15 forbindelser.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til adskillelse af glucoseisomerase fra vandige opløsninger, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den vandige opløsning bringes i kontakt med et aminkompleks med den 20 almene formel 1*2-N eller N+ X** E3 R4 25 4 hvor Ri betyder en carbonhydridgruppe med mindst 6 carbonato-mer, R2 betyder en carbonhydridgruppe med fra 8 til 20 car-bonatomer, R3 betyder lavere alkyl, R4 betyder H eller lavere alkyl, og X er en anion, idet mængden af aminforbindelsen 30 udgør mindst 500 ppm, beregnet på den vandige opløsning, og opløsningens pH-værdi er fra 5,5 til 8,5, hvorpå det herved dannede enzymholdige bundfald udvindes.

Fremgangsmåden kan anvendes til rensning af glucoseisomerase i vandig opløsning. Glucoseisomerasen bringes i 35 kontakt med aminforbindelsen under betingelser, hvorved aminen vekselvirker med isomerasen til dannelsen af et uoplø- DK 168960 B1 4 seligt enzym-aminkompleks. Isomerase-aminkomplekset kan sættes til en stærkt ionisk opløsning, hvori komplekset dissocierer til dannelse af et opløseligt, renset og koncentreret glucoseisomerasepræparat.

5 Det har således uventet vist sig, at de ovennævnte aminforbindelser kan anvendes ved en fremgangsmåde til rensning af glucoseisomerasepræparater.

De tertiære og kvaternære aminkomplekser, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er defineret 10 ovenfor.

Carbonhydridgrupperne er fortrinsvis alkyl, cyclo-alkyl, alkenyl, aryl eller aralkyl.

X kan være en vilkårlig egnet uorganisk eller organisk anion, såsom et halogenid, nitrat, sulfat, benzen-15 sulfonat, acetat, etc., idet anionen er indifferent over for enzymet.

Eksempler på amingrupper repræsenteret ved den ovenfor anførte formel, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er dimethylbenzyldodecylammonium, 20 dimethyldilaurylammonium, stearyldimethylbenzylammonium, distearyldimethylammonium, diethyldioctadecylammonium, dimethyldidodecylammonium, dimethyldodecylnaphthylmethyl-ammonium, dimethylhexadecyldichlorbenzylammonium og di-methyldiisobutylphenoxyethylbenzylammoniumsalte.

25 Ifølge den foreliggende opfindelse sættes mindst én af de ovenfor anførte aminforbindelser til den vandige glucose isomerac©ekstrakt til rensning under sådanne betingelser, at aminen vekselvirker med glucose isomerasen til dannelse af et uopløseligt isomerase-amin-kompleks, 30 der udfælder. Det uopløselige isomerase-amin-kompleks skilles derefter fra på gængs måde, såsom ved filtrering, centrifugering eller lignende. Til fjernelse af enzymet fra bundfaldet sættes isomerase-amin-komplekset til en ioniseret saltopløsning, hvori komplekset dissocierer, og iso-35 merasen og aminen gøres igen opløselige. Aminforbindelsen kan derefter skilles fra enzymopløsningen ved ultrafil- 0 DK 168960 B1.

5 trering eller ved behandling med kationbytterharpiks, hvorved der fås et renset, koncentreret glucoseisome-rasepræparat med høj specifik aktivitet (f.eks. aktivitet pr. mg protein).

5 Den til genopløsningen af det udfældede enzym-amin- -kompleks nødvendige mængde ioniseret salt kan let bestemmes ved simple forsøg ved at anvende opløsninger med varierende koncentration, dvs. ionstyrke, af egnede elektrolytter, blandt hvilke der foretrækkes natriumchlorid 10 af økonomiske grunde, og fordi det er let tilgængeligt.

Der kan anvendes en hvilken som helst elektrolyt, når blot den ikke har en ugunstig indvirkning på glucoseisomerasen.

Den nødvendige mængde salt bestemmes som den mindste koncentration, der kræves til opløsning af bundfaldet. Da 15 natriumchlorid ikke synes at have nogen nævneværdig indvirkning på enzymet, kan det anvendes i koncentreret opløsning, således at det sikres, at der opnås en fuldstændig opløsning af bundfaldet.

I nogle tilfælde kan den vandige enzymopløsning, 20 hvorfra enzymet skal genvindes, indeholde urenheder, som danner bundfald med den tilsatte aminforbindelse, inden det ønskede enzym udfælder. I sådanne tilfælde bør amin-tilsætningen ske i flere trin, sædvanligvis i to trin, hvor urenhederne fældes ud i det første trin, og enzy-25 met til slut fældes i det andet trin. Den til det første trin nødvendige mængde amin kan let bestemmes ved at anvende alikvoter af den oprindelige enzymopløsning, til hvilken der er sat inddelte mængder aminforbindelse. Det bundfald, der dannes ved hver tilsætning, undersøges for 30 enzymaktivitet som, når den er påvist, indikerer den mængde fældningsmiddel, der er nødvendig til det første trin af fældningen.

Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse foretrækkes det at anvende kvaternære aminer med den oven-35 for anførte almene formel, hvori R2 betyder alkyl med fra 8 til 18 carbonatomer, er et radikal med fra DK 168960 Bl 6 6 til 10 carbonatomer, R^ og R^ betyder lavere alkyl, og X betyder en halogenidanion. Der foretrækkes især forbindelser, hvori R2 betyder alkyl med fra 12 til 18 carbonatomer, R-^ betyder aralkyl med fra 7 til 10 carbon-5 atomer, Rg og R^ betyder lavere alkyl, og X betyder et halogenid.

De mest foretrukne forbindelser kan gengives ved formlen CH3

CnH2n+l-- |+ X

ch3 15 hvor n er 12, 14 eller 16, og X er en halogenidanion. Et produkt indeholdende disse forbindelser sælges under navnet BTC-835 af Onyx Chemical Company, Jersey City, New Jersey. BTC-835 er en blanding sammensat af 50% af en forbindelse, hvor n i den ovenfor anførte formel er 14, 40% af en forbin-20 delse, hvor n i den ovenfor anførte formel er 12, og 10% af en forbindelse, hvor n i den ovenfor anførte formel er 16.

Betingelserne for udøvelsen af fremgangsmåden i-følge opfindelsen kan variere afhængende af isomeraseeks-traktens renhed og koncentration og den specielle amin-25 forbindelse, der anvendes. Den anvendte mængde amin skal være tilstrækkelig til fældning af praktisk talt alt aktivt enzym og være mindst 500 ppm, på vægt/rumfangsbasis.

Den foretrukne mængde er sædvanligvis fra 500 ppm til ca.

5000 ppm. Der foretrækkes især en mængde på fra ca. 1000 30 til ca. 3000 ppm.

pH-værdien bør ligge i et område, der er ca. 1 ! pH-enhed over det isoelektriske punkt (pi) for enzymet og ca. 1 pH-enhed under den anvendte aminforbindelses pKa. pH-værdien er fra 5,5 til 8,5, ideelt fra 6,0 til 8,0, spe-35 cielt fra 7,0 til 7,4.

DK 168960 B1.

7

Temperaturen kan variere inden for et bredt område fra en temperatur så lav som 0°C op til under den temperatur, ved hvilken der sker en varmedenaturering eller -inaktivering af enzymet. For nemheds skyld gennemføres frem-5 gangsmåden almindeligvis ved omgivelsestemperatur.

Mekanismen ved den her omhandlede fremgangsmåde er ikke helt klarlagt, men det antages, at aminen vekselvirker med glucoseisomerasen, hvorved der dannes et uopløseligt isomerase-amin-kompleks. Når det uopløselige iso-10 merase-amin-kompleks sættes til en stærkt ionisk opløsning, dissocierer isomerase-amin-komplekset, og isomerasen og a-minen er igen opløselige.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver uventede resultater. Det er meget overraskende, at de her omhand-15 lede aminforbindelser, som generelt antages at være potente enzyminaktivatorer og -denatureringsmidler, kan anvendes til rensning af glucoseisomeraseekstrakter. Det er overraskende, at ikke alle kvaternære ammoniumsalte eller alle tertiære aminer er i stand til at give de resulta-20 ter, der opnås ved anvendelse af de anførte tertiære aminer og kvaternære ammoniumsalte ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Kendte kvaternære aminsalte, såsom hexadecyltrime-thylammoniumchlorid, danner ikke bundfald under de betingelser, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 25 medens andre aminforbindelser, f.eks. octadecyltrimethylammo-niumchlorid, danner et ubetydeligt bundfald, som ikke udviser nogen påviselig enzymaktivitet. Andre aminer bevirker betydelige tab med hensyn til enzymaktivitet, uanset om der dannes bundfald eller ej. De særligt effekti-30 ve aminforbindelser er sådanne, hvori R^ er en aralkyl-gruppe med fra 7 til 11 carbonatomer, f.eks. benzyl og naphthylmethyl, R2 er alkyl med fra 12 til 16 carbonatomer, og Rg og R^ hver især betyder lavere alkyl, især methyl. Det er også overraskende, at isomerase-aminkomplek-35 0 DK 168960 B1 8 set kan dissocieres så let til dannelse af et renset aktivt enzym.

Fremgangsmåder til fremstilling af glucoseisome-raseekstrakterne anvendt som udgangsmaterialer ved frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen er kendte. F.eks. kan et enzymekstrakt indeholdende glucoseisomerase fås ved fermentering af mikroorganismer af en art, som man véd producerer glucoseisomerase, idet enzymet ekstraheres fra myceliet, og uopløseligt materiale fjernes ved kendte metoder.

10 De foretrukne glucoseisomeraseekstrakter kan fås fra mikroorganismer af slægterne Actinoplanes, Ampullari-ella, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora, Norcardia eller Strepto-myces. Glucoseisomeraseekstrakter kan typisk fås fra mi-15 kroorganismer af arterne Streptomyces rubigenosus, Strep-tomyces olivochromogenes, Bacillus coagulans eller Bacillus stearothermophilus.

20 Analysemetoder Total protein

Total protein bestemmes ved at anvende et Beckman model DK-2A spektrofotometer ved en bølgelængde på 280 mil-limikron.

25

Isomeraseaktivitet-IGIU

IGIU er forkortelsen for "International Glucose Isomerase Unit" og er den mængde enzym, der omdanner et ^.umol glucose til fructose pr. minut i en opløsning, der 30 oprindelig indeholder 2 mol glucose pr. liter, 0,02 mol

MgS04 og 0,001 mol CoCl2 pr. liter ved en pH-værdi på 6,84 til 6,85 (0,2 M natriummaleat) målt ved omgivelsestemperatur og ved en temperatur på 60°C. Glucose-isomerasebe-stemmelserne udføres ifølge fremgangsmåden beskrevet af 35 N.E. Lloyd et al., Cereal Chem., 49, nr. 5 s. 544-553 (1972).

9 0 DK 168960 Bl

linmobiliseret isomeraseaktivitet FAU

Immobiliseret isomeraseaktivtet bestemmes ved den følgende metode.

En immobiliseret.isomeraseprøve indeholdende 1400 5 til 2200 IGIU afvejes. Prøven vaskes i en 250 ml kolbe med 125 ml dextroseanalyseopløsning (forinden opvarmet til 65°C) og 10 ml 0,1 trishydroxymethylaminomethan (THAM) opløsning (pH 7,8) . Dextroseanalyseopløsningen består af 3,33 M dextrose, 20 mM magnesiumsulfat, 10 mM natriumsul-10 fit, 100 mM THAM og 1 mM cobaltchlorid (pH 7,8). Ved 65°C har denne dextroseopløsning en pH-værdi på 7,0. Kolben neddyppes i et vandbad med en temperatur på 65°C og omrystes i 1 time. Blandingen vakuumfiltreres gennem en 45 mm simpel frittet glastragt forsynet med et glasfiber-15 filter og i forvejen belagt med 1 g filterhjælpemid- del. Kolben og enzymkagen skylles med små alikvoter 100 mM THAM pufferopløsning (pH 7,8), i alt 100 ml.

Det vaskede enzym sættes til en 250 ml kolbe indeholdende 125 ml dextroseanalyseopløsning (i forvejen ækvi-20 libreret til 65°C). Det vaskede enzym vaskes kvantitativt i kolben med 10 ml 10 mM THAM puffer (pH 7,8) , og kolben omrystes i nøjagtig 60 minutter. Derpå tilsættes der 12,0 ml iseddike, og den syrnede blanding omrystes i yderligere 15 minutter. Blandingen vakuumfiltreres gennem en 45 mm 25 simpel frittet glastragt forsynet med et glasfiberfilter og i forvejen belagt med ca. 1 g filterhjælpemiddel. Kolbens og tragtens indhold vaskes med demineraliseret vand, indtil der er opsamlet omtrent 400 ml filtrat. Det til 25°C afkølede filtrat fortyndes til 500 ml. Opløsningens 30 drejning bestemmes med en 2 dm celle ved 25°C som R2·

En blindprøve behandles på samme måde som anført ovenfor, idet der dog ikke tilsættes noget enzym. Den optiske drejning af blindprøven bestemmes også ved 25°C som Ri. Isomeriseringsgraden beregnes ud fra følgende for-35 hold: DK 168960 B1.

10 o (R9 - R-, ) I = —--—

aC L P

hvor a er den specifikke drejningsændring, når fructose er 5 helt omdannet til dextrose, er koncentrationen af sukker i opløsning (0,15 g/ml), og L er længden af polarimeter-røret (2 dm).

FAU (fixed activity units) af isomeraseaktivi-teten beregnes på følgende måde: 10 FAU/g = JC/Kftw hvor er en hastighedskonstant (1,21 I hr-^FAU ^ mg glucose) , t er reaktionstiden i timer (1 hr.) , w er vægten i 15 gram af prøven, C er den oprindelige koncentration i mg pr. 125 ml reaktionsblanding (75.000 mg glucose), og J er defineret som følger: J = ^(¾ * ) + 'l) ‘ IeIfe " ) hvor 25 i er isomeriseringsgraden ved ligevægt i molbrøk af fructose (0,513).

I er isomeriseringsgraden i molbrøk af fructose.

Cm er den oprindelige molkoncentration af glucose (3,33 M).

K er Michaelis konstant for glucose (0,7M).

30 Kp er Michaelis konstant for fructose (1,43 M).

Én IGIU er lig med 15,8 FAU.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

35 DK 168960 B1.

11 o

Eksempel 1.

Dette eksempel illustrerer dannelsen af et uopløseligt glucoseisomerase-amin-kompleks og efterfølgende dissociation af komplekset i en ionisk opløsning til dan-5 nelse af et renset aktivt glucoseisomerasepræparat.

Fra mikroorganismer af en udvalgt stamme af Strep-tomyces slægten fås en glucoseisomerasepræparat, som indstilles på en pH-værdi på 7,2. Ekstraktens isomeraseaktivi-tet er 40 IGIU/ml. Ni beholdere tilsættes hver især 25 10 ml enzymekstrakt (1000 IGIU i alt). Hver beholder tilsættes en passende mængde BTC-835, N-alkyl(C12, C14, Clg)-di-methylbenzylammoniumchlorid (fra Onyx Chemical Company,

Jersey City, New Jersey), ved stuetemperatur under uafbrudt omrøring i 15 minutter. Tilsætningen af BTC-resul-15 terer i dannelsen af et hvidt fnugagtigt bundfald, selv ved det laveste niveau på 100 ppm.

Bundfaldene fjernes ved centrifugering, og portioner af de resulterende supernatanter analyseres for isomera-seaktivitet. Resultaterne er opsummeret i tabel I.

20

Tabel I

25 [BTC] Opløselig aktivitet % Resterende

Forsøg ppm _IGIU/ml_ supernatant fraktion 1 0 40 100 2 100 40 100 3 500 20 50 30 4 1000 0 0 5 1500 0 0 6 2000 0 0 7 3000 0 0 8 4000 0 0 35 9 5000 0 0 DK 168960 B1.

0 12

Dataene viser, at der ikke er nogen opløselig iso-meraseaktivitet tilbage ved en BTC koncentration på 1000 ppm eller derover. Ved en BTC koncentration på 500 ppm er den resterende opløselige aktivitet 50%.

5 Bundfaldet fra forsøg 5 resuspenderes i 5 ml 0,5 N

NaCl ved stuetemperatur og omrøres. Bundfaldet genopløses i løbet af nogle få minutter. En portion på 0,5 ml af den resulterende opløsning fortyndes med 19,5 ml 0,5 N NaCl, og analysen viser isomeraseaktivtet.

1o

Eksempel 2.

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af den her omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af en renset og koncentreret glucoseisomerase.

15 En 300 ml prøve af isomeraseekstrakten fra ek sempel 1 med en samlet aktivitet på 12.000 IGIU og en specifik aktivitet på 2,7 IGIU/mg protein indstilles til en pH-værdi på 7,2 med NaOH. Der tilsættes BTC-835, således at der fås en slutkoncentration på 1000 ppm, og der omrøres 20 i 15 minutter. Det dannede bundfald isoleres ved filtrering på en præcoat af filterhjælpemiddel. Filterkagen vaskes på filteret med vand, og prøver af filtratet og vaskevæskerne analyseres for isomeraseaktivitet. Der påvises ingen opløselig aktivitet.

25 Filterkagen elueres med 0,5 N NaCl. Natriumchlo- rideluatet ultrafiltreres med et Amicon 401 element med omrører (Amicon Corp., Danvers, MA) under anvendelse af en XM100 [100.000 molvægtgrænse (mol. wt. cut-off (MWCO))] membran. Ultrafilterretentatet diafiltreres med tre 5 rum-30 fang portioner 0,5 N NaCl til fjernelse af rester af ubundet BTC. Til slut afsaltes retentatet ved gentagen diafiltrering med vand. Slutretentatet indeholder i alt 8.850 IGIU med en specifik aktivitet på 43,32 IGIU/mg protein. I alt 73,8% af udgangsisomeraseaktiviteten er 35 genvundet, og den specifikke aktivitet på 43,32 IGIU/mg protein indikerer, at præparatet er mindst 90% isome- 0 DK 168960 B1.

13 rase på proteinbasis. En rensning på ca. 20 gange er således opnået med god genvinding af aktiviteten.

Eksempel 3.

5 Fremgangsmåden ifølge eksempel 2 gentages, idet der anvendes en isomeraseekstrakt fra en anden fermentering af den samme Streptomyces som beskrevet i eksempel 1.

En 500 ml portion af isomeraseekstrakten (14.000 IGIU i alt) indstilles til en pH-værdi på 7,2, og der til-10 sættes BTC-835 dråbevis til en slutkoncentration på 1000 ppm. Den resulterende suspension filtreres efter tilblan-ding af 2 g filterhjælpemiddel, og filterkagen vaskes med ca. 100 ml vand. Filtratet plus vaskevæskerne har ingen isomeraseaktivitet. Den vaskede filterkage elueres derpå 15 langsomt in s i tu med 300 ml 0,5 N NaCl i løbet af 3 timer.

Salteluatet ultrafiltreres med en Amicon XM-50 (50.000 MWCO) membran. Ultrafilterretentatet diafiltreres i vid udstrækning med 0,5 N NaCl og derpå med vand til fjernelse af rester af BTC og salt. Slutretentatet 20 indeholder i alt 13.550 IGIU med en specifik aktivitet på 43,4 IGIU/mg. Rensningen er således lige så effektiv som i eksempel 2, og genvindingen af aktivitet (94%) er betydeligt forbedret.

25 Eksempel 4.

Dette eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen til rensning af en isomeraseekstrakt fra en Bacillus mikroorganisme.

A. Udgangsenzymkilden er et tørt pulver beståen-30 de af hele celler af Bacillus blandet med et filterhjælpe-middelbærestof og identificeret som Novo SP-103 isomerase (Novo Industri A/S, Bagsværd, Danmark). Enzymopløselig-gørelsen gennemføres ved suspension af pulveret i fortyndet tris-puffer, pH 7,0, og omrøring i 2 timer ved stue-35 temperatur efter tilsætning af lysozym (200 mg/100 g tørt enzym). Uopløseligt materiale fjernes derpå ved filtre- 0 DK 168960 B1.

14 ring gennem en filterhjælpemiddelpræcoat, og filtratet opvarmes til 60°C og holdes ved denne temperatur i 20 minutter til fældning af urenheder og pasteurisering af ekstrakten. Efter fjernelse af uopløselige dele ved præ-5 coatfiltrering indstilles en 10 ml portion af ekstrakten (262 IGIU) til en pH-værdi på 7,2, og der tilsættes BTC--835 til en slutkoncentration på 1500 ppm. Det tunge hvide bundfald, der dannes næsten øjeblikkelig, fjernes ved centrifugering, og en alikvot af supernatanten analyse-10 res for isomeraseaktivitet. Praktisk talt al udgangsaktivitet (250 IGIU) er til stede i den opløselige fraktion.

B. En portion af de oprindelige ekstrakter fra afsnit A behandles med 1500 ppm BTC-835, og det resul-15 terende uopløselige materiale fjernes ved filtrering og kasseres. 25 ml portioner (hver 555 IGIU) af den behandlede ekstrakt anvendes derpå, idet der tilsættes forskellige mængder BTC-835 til bestemmelse af, hvilken koncentration der vil være nødvendig til fældning af is omer a-20 se. Efter tilsætning af BTC, fjernes bundfaldene ved centrifugering, og alikvoter af den opløselige fase analyseres for isomeraseaktivitet. Resultaterne er opsummeret i tabel II.

25

Tabel II

[BTC] Opløselig aktivitet % Opløselig Forsøg ppm IGIU/ml IGIU i alt (555 IGIU i alt) 30 1 1000 10,36 259 46,6 2 2000 1,76 44 7,9 3 3000 1,76 44 7,9 4 5000 2,10 53 9,5 35 DK 168960 Bl 0 15

Tilsætning af BTC, efter forbehandling med 1500 ppm til fjernelse af ikke-enzymurenheder, resulterer i næsten fuldstændig tab af opløselig isomeraseaktivitet ved koncentrationer på 2000 ppm BTC eller derover. En til-5 sætning på 1000 ppm resulterer i fældning af ca. halvdelen af den opløselige aktivitet.

Bundfaldet fra hver af de ovenfor anførte forsøg suspenderes i 10 ml 0,5 N NaCl. Bundfaldene genopløses hurtigt. Opløsningerne, der indeholder de opløste bundfald, 10 samles og ultrafiltreres med en XM-50 membran. Efter diafiltrering med 0,5 N NaCl og med vand analyseres retena-tet for isomeraseaktivitet og proteinkoncentration. Den samlede genvundne aktivitet er 1103 IGIU. Den specifikke aktivitet er 4,16 IGIU/mg baseret på proteinbestemmelse 15 ved UV-absorption.

Eksempel 5.

Dette eksempel illustrerer behandlingen af en glucose isomeraseekstrakt med forskellige kvaternære ammonium-20 forbindelser.

Lige store portioner af isomeraseekstrakten beskrevet i eksempel 3 indstilles til en pH-værdi på 7, og de forskellige kvaternære ammoniumforbindelser tilsættes til en slutkoncentration på 2000 ppm. Dannelsen af et bund-25 fald tages som bevis på en vekselvirkning mellem enzymet og den kvaternære ammoniumforbindelse.

Følgende kvaternære forbindelser afprøves: 1. BTC-835

Alkyl (C^2· ci4' ci6^ dimethyIbenzyl-30 ammoniumchlorid (ifølge opfindelsen) 2. "ARQUAD" 18-50

Octadecyltrimethylammoniumchlorid 3. "CERTRIMID" (CTAB)

Cety1trimethy1ammoniumbromid 35 4. BTC-2125M (DUAL QUAT)

Alkyl (C14, C16, C^2· C^g) dimethylbenzyl-ammoniumchlorid (ifølge opfindelsen) 0 16 DK 168960 B1.

Alkyl (C^2' C14^ dimethylethylbenzyl-ammoniumchlorid (ifølge opfindelsen) 5. "HYAMIN" 1622

Diisobutylphenoxyethoxyethyldimethylbenzyl-5 aminoniumchlorid (ifølge opfindelsen) 6. "HYAMIN" 2389 (Methyldodecylbenzyl) trime thyl ammon ium-chlorid

Methyldodecylxylenbis(tetramethyl)ammonium-10 chlorid 7. "MAQUAT" DLC 1214

Alkyl -(C12, C14, C16, C18) (ifølge op- dimethyl(dichlorbenzyl)ammoniumchlorid findelsen) 8. BTC-812 (i.føl g o 15 Octyldodecyldimethylammoniumchlorid finnisen) 9. Hexadecyltrimethylammoniumchlorid

Forbindelserne 1, 4, 5 og 7 danner fyldige hvide bundfald. Mindre udfældning sker med 8, 3 og 2, medens 9 20 og 6 forbliver klare. Suspensionerne centrifugeres til sedimentering af bundfaldene, og alikvoter af de klare supernatanter analyseres for isomeraseaktivitet.

Bundfaldene suspenderes igen i 0,5 N NaCl til dis-sociering af komplekset af enzym og kvaternær ammoniumfor-25 bindelse, og enzymet opløseliggøres igen. Alikvoter af bundfaldene, der er opløseliggjort igen, analyseres for

isomeraseaktivitet efter fortynding med 0,5 N NaCl -0,2 M

„ ++

Co

Resultaterne er opsummeret i tabel III.

30 35 DK 168960 Bl.

0 17

Tabel III

Genvundet

Forbin- Bund- Opløselig akti- bundfalds- I alt

delse nr. fald vitet IGIU aktivitet IGIU IGIU

5 1 +++ 101 1422 1523 2 + 1772 1772 3 + 664 664 4 +++ 58 278 336 5 +++ 182 722 904 10 6 - 1820 ---- 1820 7 +++ 8 272 280 8 ++ 1064 722 1786 9 - 1974 1974

Kontrol - 1980 1980 15

De fire forbindelser, der giver det rigeste og mest synlige bundfald, forbindelserne 1, 4, 5 og 7, indeholder alle en N-benzylsubstituent.

BTC-812 (8) , der indeholder to lange alkylkæder, 20 resulterer i et bundfald, der er fysisk forskelligt fra BTC-835 og andre bundfald. Genvinding af aktiviteten er i dette tilfælde fremragende. Forbindelserne 6 og 9 bevirker intet synligt bundfald og meget lille enzyminaktivering. Forbindelserne 3, 4 og 7 bevirker betydeligt 25 tab af aktivitet.

Eksempel 6.

Dette eksempel illustrerer, at det uopløselige kompleks af et enzym og en kvaternær ammoniumforbindel- 30 se er enzymatisk aktivt.

En prøve af isomeraseekstrakten fra eksempel 4 indstilles til en pH-værdi på 7,2, behandles således, at der opnås et niveau på 1500 ppm BTC-835, og der tilblandes filterhjælpemiddel, hvorpå det uopløselige materiale iso-35 leres ved filtrering. Filterkagen vaskes med vand og 0 DK 168960 B1.

18 blandes. En prøve analyseres for immobiliseret enzymaktivitet ved FAU metoden.

Resultaterne viser en udtrykkelig aktivitet, der er 29% af den initielle opløselige aktivitet.

5

Eksempel 7.

Dette eksempel beskriver en alternativ metode, ved hvilken der anvendes en kationbytterharpiks med en stærk syre til fjernelse af BTC fra genopløste isome-10 rase BTC-bundfald.

Et delvis renset isomerasekoncentrat fremstilles ved ultrafiltrering på en rå enzymekstrakt med en Amicon CH4 koncentrator under anvendelse af en HIP100 filterindsats (100.000 MWCO). Ultrafilterretentatet diafiltreres 15 med 5 rumfang afioniseret vand til fjernelse af rester af opløselige dele med lav molekylvægt. Det endelige koncentrat har en styrke på 2175 IGIU/ml og en proteinkoncentration på 66,9 mg/ml. (Specifik aktivitet 32,5 IGIU/mg).

En 10 ml portion af dette koncentrat fortyndes 2o til 300 ml med vand, og pH-værdien indstilles til 7,2.

Denne opløsning tilsættes 300 mg BTC-835, og suspensionen omrøres i 30 minutter. Det dannede bundfald isoleres ved centrifugering og genopløses i 25 ml 0,5 M NaCl.

Denne opløsning tilsættes 1 g tør basis fugtig AG50 W X4 25 (fremstillet af Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) kationbytterharpiks (natriumform). pH-værdien indstilles til 7,0, og suspensionen omrøres forsigtigt i 30 minutter. Derefter får harpiksen lov at bundfælde, og en alikvot af supernatanten udtages til UV-analyser for opløseligt pro-30 tein (absorption ved 280 nm) og BTC (absorption ved 262 nm). UV-analyserne viser en fuldstændig fjernelse af opløseligt BTC. En yderligere alikvot af supernatanten udtages og fortyndes 10 gange med vand. Fravær af et bundfald ved denne reducerede saltkoncentration indikerer, at BTC er 35 fjernet af harpiksen. Resten af supernatanten skilles fra harpiksen ved filtrering, og filtratet ultrafiltre- DK 168960 Bl.

0 19 res med et Amicon 201 element med omrører under anvendelse af en YM-30 membran til fraskillelse af rester af NaCl. Det endelige ultrafilterretentat analyseres for isomeraseaktivitet og proteinkoncentration. Genvindin-5 gen af isomeraseaktivitet er 19.400 IGIU eller derover eller 90% af udgangsaktiviteten, efter at denne er korrigeret for prøvetagningstab. Den specifikke aktivitet er 40,12 IGIU/mg protein.

10 Eksempel 8.

Dette eksempel illustrerer anvendelse af forskellige kvaternære og tertiære aminer ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen. Den eksperimentelle fremgangsmåde er i alt væsentligt den samme som beskrevet i eksempel 5.

15 Vellykket enzymfældning og genvinding på mindst 80% af den fældede aktivitet opnås med de følgende forbindelser: "MAQUAT" MC 1412

Alkyl (CC16^ dimethylbenzyl-ammoniumchlorid (iflg. opfindelsen) 20 BTC-1010

Didecyldimethylammoniumchlorid (iflg. opfindelsen) BTC-1100

Alkyl (C-^2' ci4^ dimethyl-l-naphthylmethyl-ammoniumchlorid (iflg. opfindelsen) 25 Stearyldimethylbenzylammoniumchlorid (iflg. opfindelsen) "HYAMIN" 3500

Alkyl (C14, C12, Clg) dimethylbenzyl-ammoniumchlorid (iflg. opfindelsen)

Ved anvendelse af de følgende forbindelser fore-30 kommer der hverken fældning eller inaktivering af enzym: "VARIQUAT" B-200

Benzyltrimethylammoniumchlorid "ARQUAD" 12-50

Dodecyltrimethylammoniumchlorid 35 D ime thyIdodecylamin D ime thyIbenzylamin Triisooctylamin

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til adskillelse af glucoseisomerase fra vandige opløsninger, kendetegnet ved, at den vandige opløsning bringes i kontakt med et aminkompleks med 5 den almene formel R K eller Η* X-

10 P'3 hvor betyder en carbonhydridgruppe med mindst 6 carbonatomer, R2 betyder en carbonhydridgruppe med fra 8 til 20 carbonato- 15 mer, R3 betyder lavere alkyl, R4 betyder H eller lavere alkyl, og X er en anion, idet mængden af aminforbindelsen udgør mindst 500 ppm, beregnet på den vandige opløsning, og opløsningens pH-værdi er fra 5,5 til 8,5, hvorpå det herved dannede enzymholdige bundfald udvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at pH-værdien indstilles på en værdi på 6-8.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der anvendes en aminforbindelse, i hvilken R^ betyder alkyl med fra 8 til 18 carbonatomer, R2 be- 25 tyder en carbonhydridgruppe med fra 8 til 10 carbonatomer, R3 og R4 hver især betyder lavere alkyl, og X betyder en halogenanion.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at der anvendes en aminforbin- 30 delse med formlen cm 35 (O) cm DK 168960 B1. hvor R2 betyder CnH2n+i, hvor n er 12, 14 eller 16, og X er en anion.

5 R2 er en blanding af grupper med formlen CnH2n+i, hvor n er 12, 14 og 16.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der anvendes en aminforbindelse, i hvilken

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at den vandige opløsnings pH-værdi indstilles på fra 7,0 til 7,4.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 4-6, kendetegnet ved, at aminforbindelsen tilsættes i en mængde på mindst 1000 ppm, beregnet på den vandige opløsning.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 4-7, 15 kendetegnet ved, at der som aminforbindelse anvendes et alkyl-(0^2/ c14» c16) diraethylbenzylammoniumchlo-rid.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-8, kendetegnet ved, at der som aminforbindelse an- 20 vendes octyldodecyldimethylammoniumchlorid, stearyldimethyl-benzylammoniumchlorid eller didecyldiraethylammoniumchlorid.