JP2000023668A - Ｄｎａの精製方法 - Google Patents
Ｄｎａの精製方法Info
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- JP2000023668A JP2000023668A JP10193244A JP19324498A JP2000023668A JP 2000023668 A JP2000023668 A JP 2000023668A JP 10193244 A JP10193244 A JP 10193244A JP 19324498 A JP19324498 A JP 19324498A JP 2000023668 A JP2000023668 A JP 2000023668A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、
ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを
精製する方法において、吸着性物質としてヒドロキシア
パタイトを用いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方
法。 【効果】 本発明によれば、ムコ多糖類が混在するＤＮ
Ａ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを大量
に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法が提
供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有する
生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング等の
遺伝子分析に供するに十分な量である10μｇ以上の精製
ＤＮＡを得ることができる。
ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを
精製する方法において、吸着性物質としてヒドロキシア
パタイトを用いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方
法。 【効果】 本発明によれば、ムコ多糖類が混在するＤＮ
Ａ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを大量
に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法が提
供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有する
生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング等の
遺伝子分析に供するに十分な量である10μｇ以上の精製
ＤＮＡを得ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ムコ多糖類が混在
するＤＮＡ溶液からＤＮＡを精製する方法に関する。特
に、本発明は、アコヤガイ等の貝類や多くの藻類などム
コ多糖類を大量に含有する生物試料から抽出したＤＮＡ
溶液に混在するムコ多糖類を除去し、高純度のＤＮＡを
大量に精製する方法に関する。
するＤＮＡ溶液からＤＮＡを精製する方法に関する。特
に、本発明は、アコヤガイ等の貝類や多くの藻類などム
コ多糖類を大量に含有する生物試料から抽出したＤＮＡ
溶液に混在するムコ多糖類を除去し、高純度のＤＮＡを
大量に精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、水産生物の遺伝的系統や品種を調
べたり、種苗の遺伝的多様性を検査して近交弱性の危険
を予防するなど対象生物の遺伝的特性を評価する必要性
が高まっている。ＤＮＡをかかる遺伝子解析に供するた
めには、対象生物の個体、器官、組織、または培養細胞
からのＤＮＡが、高分子量を維持したままで、しかも酵
素反応の基質となりうる純度にまで精製されていなけれ
ばならない。殊に、PCRやサザンブロッティングなどの
高感度遺伝子検出法を用いる最近の研究では、その対象
のＤＮＡが高純度に精製されていることが前提となる。
べたり、種苗の遺伝的多様性を検査して近交弱性の危険
を予防するなど対象生物の遺伝的特性を評価する必要性
が高まっている。ＤＮＡをかかる遺伝子解析に供するた
めには、対象生物の個体、器官、組織、または培養細胞
からのＤＮＡが、高分子量を維持したままで、しかも酵
素反応の基質となりうる純度にまで精製されていなけれ
ばならない。殊に、PCRやサザンブロッティングなどの
高感度遺伝子検出法を用いる最近の研究では、その対象
のＤＮＡが高純度に精製されていることが前提となる。
【０００３】これまで生物試料からＤＮＡを精製するに
は、一般的には、細断した生物個体、器官、組織、ある
いは培養細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等で
溶解し、蛋白質分解酵素を加えてインキュベートして蛋
白質を分解し、その後フェノール抽出またはヨウ化ナト
リウム処理、または塩析法による蛋白質の沈殿除去を行
なった後、エタノールまたはイソプロパノールを加えて
ＤＮＡ画分を沈殿させることにより行われている。
は、一般的には、細断した生物個体、器官、組織、ある
いは培養細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等で
溶解し、蛋白質分解酵素を加えてインキュベートして蛋
白質を分解し、その後フェノール抽出またはヨウ化ナト
リウム処理、または塩析法による蛋白質の沈殿除去を行
なった後、エタノールまたはイソプロパノールを加えて
ＤＮＡ画分を沈殿させることにより行われている。
【０００４】ところが、貝類や藻類などのムコ多糖類を
多量に含有する生物試料では、上記の手法にてＤＮＡを
精製してもムコ多糖類が除去されずに残ってしまう。ム
コ多糖類がＤＮＡ試料中に混在すると、制限酵素による
ＤＮＡの切断反応や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素
反応が阻害され、その結果、PCRを利用した技術やサザ
ンブロッティング、マイクロサテライトＤＮＡフィンガ
ープリント法等への応用が出来ないなど問題が生じる。
多量に含有する生物試料では、上記の手法にてＤＮＡを
精製してもムコ多糖類が除去されずに残ってしまう。ム
コ多糖類がＤＮＡ試料中に混在すると、制限酵素による
ＤＮＡの切断反応や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素
反応が阻害され、その結果、PCRを利用した技術やサザ
ンブロッティング、マイクロサテライトＤＮＡフィンガ
ープリント法等への応用が出来ないなど問題が生じる。
【０００５】これまでムコ多糖類のＤＮＡ溶液からの除
去には、一般的にはセチルトリメチルアンモニウムブロ
ミド（ＣＴＡＢ）処理、ボロン修飾ビーズによる処理等
がなされており、生物種によっては良好な結果を得てい
るが、貝類の一部や藻類など多量にムコ多糖類を含む生
物試料からのＤＮＡの精製には有効ではない場合が多
い。また、ＤＮＡ試料を精製する他の方法として、市販
のスピンカラム等が用いられている。これは、ＤＮＡの
リン酸基の負電荷を利用してシリカやDEAE等の担体にＤ
ＮＡを一時吸着させ、不純物を緩衝液で洗い流し、その
後ｐＨや塩強度を変えてＤＮＡを担体から溶出させて得
るのであるが、ムコ多糖類の多くは負電荷を持っている
ためＤＮＡと同じ挙動を示し除去することはできない。
去には、一般的にはセチルトリメチルアンモニウムブロ
ミド（ＣＴＡＢ）処理、ボロン修飾ビーズによる処理等
がなされており、生物種によっては良好な結果を得てい
るが、貝類の一部や藻類など多量にムコ多糖類を含む生
物試料からのＤＮＡの精製には有効ではない場合が多
い。また、ＤＮＡ試料を精製する他の方法として、市販
のスピンカラム等が用いられている。これは、ＤＮＡの
リン酸基の負電荷を利用してシリカやDEAE等の担体にＤ
ＮＡを一時吸着させ、不純物を緩衝液で洗い流し、その
後ｐＨや塩強度を変えてＤＮＡを担体から溶出させて得
るのであるが、ムコ多糖類の多くは負電荷を持っている
ためＤＮＡと同じ挙動を示し除去することはできない。
【０００６】一方、ヒドロキシアパタイトを用いてＤＮ
Ａを精製することに関し、既にいくつかの報告があるが
[Wu, R. Jay, E. and Roychoudhury, R. (1976), Meth
odsCancer Res. 12:87-176、Wilkie N.M.and Cortini
R. (1976), Journal of Virology 20:211-221]、それら
はアガロースゲル電気泳動で分離したＤＮＡの精製を目
的としたものであり、ゲル電気泳動やエレクトロエリュ
ーションとの組合せで用いられていて、多検体の同時精
製処理には適さない。したがって、かかる方法では、生
物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数検
体から同時に得ることは至難である。
Ａを精製することに関し、既にいくつかの報告があるが
[Wu, R. Jay, E. and Roychoudhury, R. (1976), Meth
odsCancer Res. 12:87-176、Wilkie N.M.and Cortini
R. (1976), Journal of Virology 20:211-221]、それら
はアガロースゲル電気泳動で分離したＤＮＡの精製を目
的としたものであり、ゲル電気泳動やエレクトロエリュ
ーションとの組合せで用いられていて、多検体の同時精
製処理には適さない。したがって、かかる方法では、生
物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数検
体から同時に得ることは至難である。
【０００７】また別の方法として、ＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動して、アガロースゲル電気泳動途中でDEAE
メンブレンなどの陽電荷膜に吸着させることによりムコ
多糖類を除く方法もあるが [Sambrook,J., Fristsch,
E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, a
laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 6:24-27] 、かかる方法もまた、1
5キロベース以上の長いＤＮＡでは極めて収率が悪く、
生物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数
検体から同時に得ることは至難である。
ゲル電気泳動して、アガロースゲル電気泳動途中でDEAE
メンブレンなどの陽電荷膜に吸着させることによりムコ
多糖類を除く方法もあるが [Sambrook,J., Fristsch,
E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, a
laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 6:24-27] 、かかる方法もまた、1
5キロベース以上の長いＤＮＡでは極めて収率が悪く、
生物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数
検体から同時に得ることは至難である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液からムコ多糖類を
除去して高純度のＤＮＡを大量に、しかも複数検体から
同時に精製する簡便な方法を提供することにある。
は、ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液からムコ多糖類を
除去して高純度のＤＮＡを大量に、しかも複数検体から
同時に精製する簡便な方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ムコ多糖類を含有
する生物試料から抽出したＤＮＡ溶液をヒドロキシアパ
タイトを用いて精製することにより、高純度のＤＮＡを
大量に得ることができることを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明は、ムコ多糖類が混在
するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差
異を利用してＤＮＡを精製する方法において、吸着性物
質としてヒドロキシアパタイトを用いることを特徴とす
る、ＤＮＡの精製方法である。本発明はまた、生物試料
を尿素を含有する緩衝液にて抽出することにより得られ
たムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ
多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを精製する方法
において、吸着性物質としてヒドロキシアパタイトを用
いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方法である。以
下、本発明を詳細に説明する。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ムコ多糖類を含有
する生物試料から抽出したＤＮＡ溶液をヒドロキシアパ
タイトを用いて精製することにより、高純度のＤＮＡを
大量に得ることができることを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明は、ムコ多糖類が混在
するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差
異を利用してＤＮＡを精製する方法において、吸着性物
質としてヒドロキシアパタイトを用いることを特徴とす
る、ＤＮＡの精製方法である。本発明はまた、生物試料
を尿素を含有する緩衝液にて抽出することにより得られ
たムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ
多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを精製する方法
において、吸着性物質としてヒドロキシアパタイトを用
いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方法である。以
下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡの精製方法の対象
となる生物試料としては、ムコ多糖類を含有する生物試
料であれば特に限定はされないが、具体的にはムコ多糖
類が多量に含まれるアコヤガイ・シロチョウガイ・クロ
チョウガイ・マルドブガイ・カラスガイ・イケチョウガ
イ・カワシンジュガイ等の海産および淡水産の貝類、ま
たはカイガラアマノリ・アサクサノリ・スサビノリ・マ
クサ等の紅藻類、ヒトエグサ・アオサ・ウスバアオノリ
等の緑藻類、コンブ・ワカメ・モズク等の褐藻類、珪藻
類等から選ばれる藻類、あるいはシラカバ・マツタケ・
イチゴ、サトイモ等の陸上植物が挙げられる。
となる生物試料としては、ムコ多糖類を含有する生物試
料であれば特に限定はされないが、具体的にはムコ多糖
類が多量に含まれるアコヤガイ・シロチョウガイ・クロ
チョウガイ・マルドブガイ・カラスガイ・イケチョウガ
イ・カワシンジュガイ等の海産および淡水産の貝類、ま
たはカイガラアマノリ・アサクサノリ・スサビノリ・マ
クサ等の紅藻類、ヒトエグサ・アオサ・ウスバアオノリ
等の緑藻類、コンブ・ワカメ・モズク等の褐藻類、珪藻
類等から選ばれる藻類、あるいはシラカバ・マツタケ・
イチゴ、サトイモ等の陸上植物が挙げられる。
【００１１】生物試料からのＤＮＡの抽出は、上記に挙
げた生物の個体、器官、組織または培養細胞に対して行
えばよい。本発明において生物試料からのＤＮＡの抽出
は、ＤＮＡの抽出に常套的に用いられるトリス塩酸緩衝
液に、ＳＤＳなど細胞を溶解するための界面活性剤、Ｄ
ＮＡ分解を防ぐEDTAを添加した緩衝液にて行い、好適に
は尿素を含有させたものがよい。尿素を含有する抽出液
としては、具体的には、後記実施例に記載する組成を有
するTNES−UREA緩衝液が好適に使用される。
げた生物の個体、器官、組織または培養細胞に対して行
えばよい。本発明において生物試料からのＤＮＡの抽出
は、ＤＮＡの抽出に常套的に用いられるトリス塩酸緩衝
液に、ＳＤＳなど細胞を溶解するための界面活性剤、Ｄ
ＮＡ分解を防ぐEDTAを添加した緩衝液にて行い、好適に
は尿素を含有させたものがよい。尿素を含有する抽出液
としては、具体的には、後記実施例に記載する組成を有
するTNES−UREA緩衝液が好適に使用される。
【００１２】ＤＮＡの抽出は、例えば上記生物試料の組
織を細断または破砕したものを、その重量(g)の10〜20
倍量(ml)程度のTNES−UREA緩衝液中で70〜80℃でまず５
分間インキュベートし、その後56℃で8〜24時間インキ
ュベートすることにより行う。また、上記のＤＮＡの抽
出において56℃に移行した後に、プロテナーゼＫにて処
理してタンパク質を消化し、続いて、試料由来のタンパ
ク質の分解物および酵素類（プロテナーゼＫなど）を変
性除去する目的でフェノール処理を常套的な手段にて行
う。
織を細断または破砕したものを、その重量(g)の10〜20
倍量(ml)程度のTNES−UREA緩衝液中で70〜80℃でまず５
分間インキュベートし、その後56℃で8〜24時間インキ
ュベートすることにより行う。また、上記のＤＮＡの抽
出において56℃に移行した後に、プロテナーゼＫにて処
理してタンパク質を消化し、続いて、試料由来のタンパ
ク質の分解物および酵素類（プロテナーゼＫなど）を変
性除去する目的でフェノール処理を常套的な手段にて行
う。
【００１３】次に、上記の抽出により得られたＤＮＡ溶
液をヒドロキシアパタイト(Ca5(PO4)3(OH)) を用いて精
製する。本発明で用いるヒドロキシアパタイト(Ca5(P
O4)3(OH)) は、通常のクロマトグラフィー用充填剤とし
て市販されているものであれば特に限定はされず、例え
ばバイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード・
バイオゲルHPT(130-0520)(Biorad 製) 、ヒドロキシル
アパタイト（Code 187-37)（Nakalai tesque製) 等が例
示される。
液をヒドロキシアパタイト(Ca5(PO4)3(OH)) を用いて精
製する。本発明で用いるヒドロキシアパタイト(Ca5(P
O4)3(OH)) は、通常のクロマトグラフィー用充填剤とし
て市販されているものであれば特に限定はされず、例え
ばバイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード・
バイオゲルHPT(130-0520)(Biorad 製) 、ヒドロキシル
アパタイト（Code 187-37)（Nakalai tesque製) 等が例
示される。
【００１４】ヒドロキシアパタイトを用いてＤＮＡ溶液
を精製するには、具体的には、ＤＮＡ溶液にヒドロシア
パタイトを添加し、インキュベートすることによりＤＮ
Ａ溶液中のＤＮＡを夾雑成分（ムコ多糖類、ＲＮＡ等）
とともにヒドロキシアパタイトに吸着させ、その後、ヒ
ドロキシアパタイトに吸着した夾雑成分を各種の緩衝液
にて逐次的に溶出させ、最後にヒドロキシアパタイトに
吸着したＤＮＡを高リン酸塩濃度の緩衝液にて溶出させ
る。
を精製するには、具体的には、ＤＮＡ溶液にヒドロシア
パタイトを添加し、インキュベートすることによりＤＮ
Ａ溶液中のＤＮＡを夾雑成分（ムコ多糖類、ＲＮＡ等）
とともにヒドロキシアパタイトに吸着させ、その後、ヒ
ドロキシアパタイトに吸着した夾雑成分を各種の緩衝液
にて逐次的に溶出させ、最後にヒドロキシアパタイトに
吸着したＤＮＡを高リン酸塩濃度の緩衝液にて溶出させ
る。
【００１５】具体的には、上記のフェノール抽出により
得られた上層（水層）を別の容器に移し、ヒドロキシア
パタイトを添加し、穏やかに攪拌させて５分間放置し、
ヒドロキシアパタイトを沈降させた後、吸引除去により
上清を除去し、その後2.5 MNaCl-TE 緩衝液(pH 8.0)を
加えて穏かに攪拌し、5分間放置してヒドロキシアパタ
イト沈降させた後に上清を除去する。かかる操作によ
り、ＤＮＡはヒドロキシアパタイトに非常に強く結合し
て吸着される一方、負電荷を持った殆どのムコ多糖類
は、2.5 M NaClの塩濃度によりヒドロキシアパタイトへ
の吸着が弱まって洗い流される。
得られた上層（水層）を別の容器に移し、ヒドロキシア
パタイトを添加し、穏やかに攪拌させて５分間放置し、
ヒドロキシアパタイトを沈降させた後、吸引除去により
上清を除去し、その後2.5 MNaCl-TE 緩衝液(pH 8.0)を
加えて穏かに攪拌し、5分間放置してヒドロキシアパタ
イト沈降させた後に上清を除去する。かかる操作によ
り、ＤＮＡはヒドロキシアパタイトに非常に強く結合し
て吸着される一方、負電荷を持った殆どのムコ多糖類
は、2.5 M NaClの塩濃度によりヒドロキシアパタイトへ
の吸着が弱まって洗い流される。
【００１６】その後、0.2mM EDTAを含む10 mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH 7.0)を用いて数回上記と同様にして
ヒドロキシアパタイトを洗浄した後、0.2mM EDTAを含む
200mM のリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)による洗浄を
数回繰り返すことによって、ヒドロキシアパタイトに結
合して残っている可能性のあるリン酸基を有するムコ多
糖類、さらにはＲＮＡや一本鎖ＤＮＡもまた除去するこ
とができる。このようにＲＮＡアーゼを用いずにＲＮＡ
をＤＮＡから除去できるということも、当該発明の副次
的な長所の一つである。
トリウム緩衝液(pH 7.0)を用いて数回上記と同様にして
ヒドロキシアパタイトを洗浄した後、0.2mM EDTAを含む
200mM のリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)による洗浄を
数回繰り返すことによって、ヒドロキシアパタイトに結
合して残っている可能性のあるリン酸基を有するムコ多
糖類、さらにはＲＮＡや一本鎖ＤＮＡもまた除去するこ
とができる。このようにＲＮＡアーゼを用いずにＲＮＡ
をＤＮＡから除去できるということも、当該発明の副次
的な長所の一つである。
【００１７】次に200 mMリン酸ナトリウム緩衝液を出来
る限り吸引除去した後、0.2 M EDTAを含む0.9 Mのリン
酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を加え、チューブごと穏や
かに攪拌することによってヒドロキシアパタイトに吸着
したＤＮＡを解離させ、1,000gで5〜15分間遠心を行な
ってヒドロキシアパタイトを強固に沈殿させ、上清を別
の容器に移す。最後に得られた上清中のＤＮＡを常套的
な手段にて脱塩・濃縮し、目的とするＤＮＡを得る。上
記操作は10検体以上の生物試料に対して同時に行うこと
ができ、生物試料１ｇ（湿重量）から10μｇ以上の大量
の精製ＤＮＡを得ることができる。
る限り吸引除去した後、0.2 M EDTAを含む0.9 Mのリン
酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を加え、チューブごと穏や
かに攪拌することによってヒドロキシアパタイトに吸着
したＤＮＡを解離させ、1,000gで5〜15分間遠心を行な
ってヒドロキシアパタイトを強固に沈殿させ、上清を別
の容器に移す。最後に得られた上清中のＤＮＡを常套的
な手段にて脱塩・濃縮し、目的とするＤＮＡを得る。上
記操作は10検体以上の生物試料に対して同時に行うこと
ができ、生物試料１ｇ（湿重量）から10μｇ以上の大量
の精製ＤＮＡを得ることができる。
【００１８】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、これらは本発明を限定するものではない。 〔実施例１〕（アコヤガイ貝柱からのＤＮＡの精製) (1) ＤＮＡの抽出 アコヤガイの貝柱を採取し、−20℃で凍結した。別途調
製した表１に示す組成から成るTNES−4M−UREA緩衝液
を、50ml容量の使い捨て型遠心チューブ（以下、チュー
ブという）に20ml加え、75℃に加温した。
が、これらは本発明を限定するものではない。 〔実施例１〕（アコヤガイ貝柱からのＤＮＡの精製) (1) ＤＮＡの抽出 アコヤガイの貝柱を採取し、−20℃で凍結した。別途調
製した表１に示す組成から成るTNES−4M−UREA緩衝液
を、50ml容量の使い捨て型遠心チューブ（以下、チュー
ブという）に20ml加え、75℃に加温した。
【００１９】
【表１】 TNES −4M−UREA 緩衝液 １M TrisHCl(pH8.0) 10ml ２M NaCl 60ml 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 20% SDS 25ml尿素 240.24g 蒸留水を加えて１リットルにする。
【００２０】前記の凍結したアコヤガイ貝柱を、約2〜3
mm角になるように氷上でハサミで切り、この貝柱の細
片を直ちに75℃に加温したTNES−4Ｍ−UREA緩衝液入り
チューブに加え、75℃のままで5分間放置した。次いで
該チューブを56℃の振盪インキュベーターに移し、20分
後に10 mg／mlのプロテナーゼＫ溶液を200μl加え、貝
柱の組織の形が溶けて溶液が均一になるまで約80 rpmで
振盪インキュベートし続けた。その後、室温(25 ℃) で
20 mlのフェノールを加え、同温度で10分間ゆっくり攪
拌し、1,000 g、15分間遠心した。上清を別の50 ml 容
量のチューブに採取した。
mm角になるように氷上でハサミで切り、この貝柱の細
片を直ちに75℃に加温したTNES−4Ｍ−UREA緩衝液入り
チューブに加え、75℃のままで5分間放置した。次いで
該チューブを56℃の振盪インキュベーターに移し、20分
後に10 mg／mlのプロテナーゼＫ溶液を200μl加え、貝
柱の組織の形が溶けて溶液が均一になるまで約80 rpmで
振盪インキュベートし続けた。その後、室温(25 ℃) で
20 mlのフェノールを加え、同温度で10分間ゆっくり攪
拌し、1,000 g、15分間遠心した。上清を別の50 ml 容
量のチューブに採取した。
【００２１】(2) ＤＮＡの精製 前記上清を入れた50 ml容量のチューブにヒドロキシア
パタイト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグ
レード バイオゲルHPT(130-0520) （Bio-Rad製) 〕２g
を加え、約１分間穏かに攪拌した。TE(pH 8.0)をチュー
ブ一杯(50ml)まで加えてさらに約１分間穏かに攪拌し、
５分間チューブを立てて放置したところ、ヒドロキシア
パタイトが沈降した。アスピレーターで上清約35 mlを
取り除き、再びTEをチューブ一杯まで加えて約１分間攪
拌し、５分間放置した。上清を取り除き、同じチューブ
に2.5M NaCl-TE緩衝液をチューブ一杯まで加えて約１分
間攪拌した後、５分間放置した。アスピレーターで上清
を取り除き、同じチューブに2.5M NaCl−TE緩衝液をチ
ューブ一杯まで加えて約１分間攪拌した後、５分間放置
した。次いでアスピレーターで上清約35 ml を取り除
き、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−0.2mM EDTA
をチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、５分間放置
し、上清35 mlを取り除く操作を３回繰り返し行なっ
た。さらに、200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−
0.2mM EDTAをチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、
５分間放置し、上清35 mlを取り除く操作を２回繰り返
して行なった。最後に、0.9 Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH 7.0)−0.2mM EDTAをチューブに15ml加えて攪拌し、
1000g で15分間遠心した。以上の操作は全て室温(25
℃)にて行った。
パタイト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグ
レード バイオゲルHPT(130-0520) （Bio-Rad製) 〕２g
を加え、約１分間穏かに攪拌した。TE(pH 8.0)をチュー
ブ一杯(50ml)まで加えてさらに約１分間穏かに攪拌し、
５分間チューブを立てて放置したところ、ヒドロキシア
パタイトが沈降した。アスピレーターで上清約35 mlを
取り除き、再びTEをチューブ一杯まで加えて約１分間攪
拌し、５分間放置した。上清を取り除き、同じチューブ
に2.5M NaCl-TE緩衝液をチューブ一杯まで加えて約１分
間攪拌した後、５分間放置した。アスピレーターで上清
を取り除き、同じチューブに2.5M NaCl−TE緩衝液をチ
ューブ一杯まで加えて約１分間攪拌した後、５分間放置
した。次いでアスピレーターで上清約35 ml を取り除
き、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−0.2mM EDTA
をチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、５分間放置
し、上清35 mlを取り除く操作を３回繰り返し行なっ
た。さらに、200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−
0.2mM EDTAをチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、
５分間放置し、上清35 mlを取り除く操作を２回繰り返
して行なった。最後に、0.9 Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH 7.0)−0.2mM EDTAをチューブに15ml加えて攪拌し、
1000g で15分間遠心した。以上の操作は全て室温(25
℃)にて行った。
【００２２】(3) 精製されたＤＮＡの濃縮および脱塩 上記で遠心したチューブの上清約24 mlを新しいチュー
ブにとり、蒸留水を加えて30 mlとし、3M酢酸カリウム
(pH5.5)を15 ml 加え、Qiagen−tip500を用いてＤＮＡ
を濃縮した。以上の操作はQIAGEN Plasmid Purificatio
n Handbook(January, 1997）のProtocol 9以降に従っ
た。上記の操作により、19個体のアコヤガイの貝柱約1g
からそれぞれ以下の表２に示す量のＤＮＡが得られた。
ブにとり、蒸留水を加えて30 mlとし、3M酢酸カリウム
(pH5.5)を15 ml 加え、Qiagen−tip500を用いてＤＮＡ
を濃縮した。以上の操作はQIAGEN Plasmid Purificatio
n Handbook(January, 1997）のProtocol 9以降に従っ
た。上記の操作により、19個体のアコヤガイの貝柱約1g
からそれぞれ以下の表２に示す量のＤＮＡが得られた。
【００２３】
【表２】
【００２４】図１に上記のアコヤガイの貝柱から精製さ
れたＤＮＡの吸収スペクトルの一例を示す。また、19個
体のうちの8個体のアコヤガイ(＃1〜＃8)から精製され
たＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを図２に示
す。図２に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約
２万bp）に、アコヤガイＤＮＡのバンドが観察された。
れたＤＮＡの吸収スペクトルの一例を示す。また、19個
体のうちの8個体のアコヤガイ(＃1〜＃8)から精製され
たＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを図２に示
す。図２に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約
２万bp）に、アコヤガイＤＮＡのバンドが観察された。
【００２５】さらに、別の２個体(＃1および＃３)から
精製されたＤＮＡ(10μg／個体)を制限酵素AluIおよびH
infI で消化した。これに等量のプラスミドpUC118を加
えて切断状況をモニターする指標とした。アガロースゲ
ル電気泳動パターンを図３に示す。消化されたアコヤガ
イＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC118の断片
のパターンが、右端のレーンのプラスミド単独での完全
消化パターンと一致していることから、アコヤガイのＤ
ＮＡも完全に消化されたものと判断した。
精製されたＤＮＡ(10μg／個体)を制限酵素AluIおよびH
infI で消化した。これに等量のプラスミドpUC118を加
えて切断状況をモニターする指標とした。アガロースゲ
ル電気泳動パターンを図３に示す。消化されたアコヤガ
イＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC118の断片
のパターンが、右端のレーンのプラスミド単独での完全
消化パターンと一致していることから、アコヤガイのＤ
ＮＡも完全に消化されたものと判断した。
【００２６】表２に記載のアコヤガイ19個体から精製さ
れたＤＮＡを各40ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。既にCampbell, D.C., Hoekstra, K.J. and C
arter, J.G. (1997) (in) Johnston, P.A. and Haggar
t, J.(Eds.), The Bivalvia :Half a Billion Years of
Evolution-Essays in Honor of Norman D.Newell ;Uni
versity of Calgary Press (1997)に記載されているメ
キシコアコヤガイの18ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列
などに基づいて設計したプライマー、18Ｓ−rＲＮＡｆ
(5'−AAGGCAGCAGGCRCGCAAAT−3')および18Ｓ−rＲＮＡ
ｒ(5'−TACKCTAYTGRAGCTGGART−3')を合成し、反応液に
ミネラルオイルを添加した後、以下の条件下でPCR反応
を行なった。PCR反応条件 容量:50μl Taqポリメラーゼ：TAKARA Taq (1ユニット) プライマー量：各20 pmol ｄNTP：各10 nmol マグネシウム濃度： 2 mM 反応チューブ: 0.6 ml容量 96℃で30秒、50℃で1分、70℃で2分を１サイクルとして
40サイクル
れたＤＮＡを各40ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。既にCampbell, D.C., Hoekstra, K.J. and C
arter, J.G. (1997) (in) Johnston, P.A. and Haggar
t, J.(Eds.), The Bivalvia :Half a Billion Years of
Evolution-Essays in Honor of Norman D.Newell ;Uni
versity of Calgary Press (1997)に記載されているメ
キシコアコヤガイの18ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列
などに基づいて設計したプライマー、18Ｓ−rＲＮＡｆ
(5'−AAGGCAGCAGGCRCGCAAAT−3')および18Ｓ−rＲＮＡ
ｒ(5'−TACKCTAYTGRAGCTGGART−3')を合成し、反応液に
ミネラルオイルを添加した後、以下の条件下でPCR反応
を行なった。PCR反応条件 容量:50μl Taqポリメラーゼ：TAKARA Taq (1ユニット) プライマー量：各20 pmol ｄNTP：各10 nmol マグネシウム濃度： 2 mM 反応チューブ: 0.6 ml容量 96℃で30秒、50℃で1分、70℃で2分を１サイクルとして
40サイクル
【００２７】得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳
動パターンを図４に示す。使用したＤＮＡのいずれから
も、予想された長さ(185 bp)のPCR産物が得られた。こ
の結果より、ムコ多糖類によるPCR反応の阻害は全く起
きていないことが確認された。図４中のレーン1〜19
は、それぞれ表２の個体番号＃１〜19に対応している。
またレーン20は大腸菌のＤＮＡを用いた場合のPCR産物
のアガロースゲル電気泳動パターンを示し、アコヤガイ
のアガロースゲル電気泳動パターンとは異なる位置に複
数の非特異的と思われるバンドが観察された。
動パターンを図４に示す。使用したＤＮＡのいずれから
も、予想された長さ(185 bp)のPCR産物が得られた。こ
の結果より、ムコ多糖類によるPCR反応の阻害は全く起
きていないことが確認された。図４中のレーン1〜19
は、それぞれ表２の個体番号＃１〜19に対応している。
またレーン20は大腸菌のＤＮＡを用いた場合のPCR産物
のアガロースゲル電気泳動パターンを示し、アコヤガイ
のアガロースゲル電気泳動パターンとは異なる位置に複
数の非特異的と思われるバンドが観察された。
【００２８】〔実施例２〕（スサビノリ糸状体からのＤ
ＮＡの精製) 試料として0120系および0130系のスサビノリ糸状体を使
用した。使用した試料の重量は湿重量で0120系は1g、01
30系は0.5gであり、これを液体窒素で凍結した後、零下
に冷やした乳鉢内で粉砕した。これ以降は実施例１と同
様にしてＤＮＡを抽出・精製した。以上の操作により、
0120系および0130系のスサビノリ糸状体それぞれから表
３に示す量のＤＮＡが得られた。
ＮＡの精製) 試料として0120系および0130系のスサビノリ糸状体を使
用した。使用した試料の重量は湿重量で0120系は1g、01
30系は0.5gであり、これを液体窒素で凍結した後、零下
に冷やした乳鉢内で粉砕した。これ以降は実施例１と同
様にしてＤＮＡを抽出・精製した。以上の操作により、
0120系および0130系のスサビノリ糸状体それぞれから表
３に示す量のＤＮＡが得られた。
【００２９】
【表３】
【００３０】上記のうち0120系から精製されたスサビノ
リＤＮＡの吸収スペクトルを図５に示す。また、同ＤＮ
Ａのアガロースゲル電気泳動パターンを図６に示す。図
６に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万 b
p)にスサビノリＤＮＡのバンドが観察された。また、両
系統から精製されたスサビノリＤＮＡ(5μg/個体)を制
限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプラスミドpUC1
18 を加えて切断状況をモニターする指標とした。アガ
ロースゲル電気泳動パターンを図７に示す。消化された
スサビノリＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC1
18の断片のパターンが、右のレーンのプラスミド単独で
の完全消化パターンと一致していることから、スサビノ
リのＤＮＡも完全に消化されたものと判断した。
リＤＮＡの吸収スペクトルを図５に示す。また、同ＤＮ
Ａのアガロースゲル電気泳動パターンを図６に示す。図
６に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万 b
p)にスサビノリＤＮＡのバンドが観察された。また、両
系統から精製されたスサビノリＤＮＡ(5μg/個体)を制
限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプラスミドpUC1
18 を加えて切断状況をモニターする指標とした。アガ
ロースゲル電気泳動パターンを図７に示す。消化された
スサビノリＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC1
18の断片のパターンが、右のレーンのプラスミド単独で
の完全消化パターンと一致していることから、スサビノ
リのＤＮＡも完全に消化されたものと判断した。
【００３１】さらに表３に記載のスサビノリから精製さ
れたＤＮＡを各40 ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。実施例１と同様の条件下でPCR を試みたとこ
ろ、目的のPCR増幅産物が得られた。図８にそのアガロ
ースゲル電気泳動パターンを示す。ここで使用した２つ
のプライマー、ITS-F（5'-GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCT
GC-3'）およびITS-R（5'-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGG
T-3'）は、アマノリのリボソームＲＮＡ遺伝子の介在配
列(ＩＴＳ)を増やすように設計されたものである。アガ
ロースゲル電気泳動の結果、約１kbのPCR産物が得ら
れ、これはチシマクロノリで得られた長さとほぼ一致し
ていた。
れたＤＮＡを各40 ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。実施例１と同様の条件下でPCR を試みたとこ
ろ、目的のPCR増幅産物が得られた。図８にそのアガロ
ースゲル電気泳動パターンを示す。ここで使用した２つ
のプライマー、ITS-F（5'-GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCT
GC-3'）およびITS-R（5'-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGG
T-3'）は、アマノリのリボソームＲＮＡ遺伝子の介在配
列(ＩＴＳ)を増やすように設計されたものである。アガ
ロースゲル電気泳動の結果、約１kbのPCR産物が得ら
れ、これはチシマクロノリで得られた長さとほぼ一致し
ていた。
【００３２】〔実施例３〕（カイガラアマノリ葉状体か
らのＤＮＡの精製） ＣＴＡＢ法のみを用いてカイガラアマノリ葉状体（0.3
g）からＤＮＡの抽出・精製を試みたところ、得られた
ＤＮＡは制限酵素により切断されず、PCRが働かなかっ
た。このＤＮＡはTE（pH 8.0）に溶解していたので、引
き続きTEを加えて10 mlとし、1gのヒドロキシアパタイ
ト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード
・バイオゲルHPT(130-0520)(Bio-Rad 製) 〕を添加して
ＤＮＡを吸着させた。これ以降は実施例１のヒドロキシ
アパタイトを用いた精製法に従って行なった。以上の操
作により、0.3gのカイガラアマノリ葉状体から5μgのＤ
ＮＡが得られた。得られたカイガラアマノリＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動パターンを図９に示す。図９に示
す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万bp) にカ
イガラアマノリＤＮＡのバンドが観察された。
らのＤＮＡの精製） ＣＴＡＢ法のみを用いてカイガラアマノリ葉状体（0.3
g）からＤＮＡの抽出・精製を試みたところ、得られた
ＤＮＡは制限酵素により切断されず、PCRが働かなかっ
た。このＤＮＡはTE（pH 8.0）に溶解していたので、引
き続きTEを加えて10 mlとし、1gのヒドロキシアパタイ
ト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード
・バイオゲルHPT(130-0520)(Bio-Rad 製) 〕を添加して
ＤＮＡを吸着させた。これ以降は実施例１のヒドロキシ
アパタイトを用いた精製法に従って行なった。以上の操
作により、0.3gのカイガラアマノリ葉状体から5μgのＤ
ＮＡが得られた。得られたカイガラアマノリＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動パターンを図９に示す。図９に示
す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万bp) にカ
イガラアマノリＤＮＡのバンドが観察された。
【００３３】また、精製されたカイガラアマノリＤＮＡ
5μg を、制限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプ
ラスミドpUC118を加えて切断状況をモニターする指標と
した。アガロースゲル電気泳動パターンを図１０に示
す。消化されたカイガラアマノリＤＮＡ(レーン2)のス
メアバンドの上に乗っているpUC118の断片のパターン
が、プラスミド単独での完全消化パターン(レーン3)と
一致していることから、カイガラアマノリのＤＮＡも完
全に消化されたものと判断した。
5μg を、制限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプ
ラスミドpUC118を加えて切断状況をモニターする指標と
した。アガロースゲル電気泳動パターンを図１０に示
す。消化されたカイガラアマノリＤＮＡ(レーン2)のス
メアバンドの上に乗っているpUC118の断片のパターン
が、プラスミド単独での完全消化パターン(レーン3)と
一致していることから、カイガラアマノリのＤＮＡも完
全に消化されたものと判断した。
【００３４】さらに、カイガラアマノリから精製された
ＤＮＡ 10 ngを用いて、PCRが正常に働くかどうかを調
べた。実施例２と同様の条件下で実施例２で用いた２つ
のプライマーと同じプライマーセットを使用してPCRを
試みたところ、目的とするPCR増幅産物が得られた。図1
1にそのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。約1kb
のPCR産物が得られ、このバンドはチシマクロノリおよ
び実施例２のスサビノリで得られた長さとほぼ一致して
いた。
ＤＮＡ 10 ngを用いて、PCRが正常に働くかどうかを調
べた。実施例２と同様の条件下で実施例２で用いた２つ
のプライマーと同じプライマーセットを使用してPCRを
試みたところ、目的とするPCR増幅産物が得られた。図1
1にそのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。約1kb
のPCR産物が得られ、このバンドはチシマクロノリおよ
び実施例２のスサビノリで得られた長さとほぼ一致して
いた。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、ムコ多糖類が混在する
ＤＮＡ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを
大量に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法
が提供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有
する生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング
等の遺伝子分析に供するに十分な量である10マイクログ
ラム以上の精製ＤＮＡを得ることができる。
ＤＮＡ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを
大量に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法
が提供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有
する生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング
等の遺伝子分析に供するに十分な量である10マイクログ
ラム以上の精製ＤＮＡを得ることができる。
【図１】本発明の方法によりアコヤガイの貝柱から精製
されたＤＮＡの吸収スペクトルを示す。
されたＤＮＡの吸収スペクトルを示す。
【図２】本発明の方法によりアコヤガイ8個体（＃1〜＃
8）から精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写
真である。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカー
を示す。
8）から精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写
真である。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカー
を示す。
【図３】本発明の方法によりアコヤガイから精製された
ＤＮＡ10μg を２種の制限酵素（AluI,HinfI) でそれぞ
れ消化し、プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況の
マーカーとした場合に生成したＤＮＡ断片のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレーン）は
分子量マーカーを示す。
ＤＮＡ10μg を２種の制限酵素（AluI,HinfI) でそれぞ
れ消化し、プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況の
マーカーとした場合に生成したＤＮＡ断片のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレーン）は
分子量マーカーを示す。
【図４】本発明の方法によりアコヤガイ19個体（＃1〜
＃19）から精製されたＤＮＡ、および大腸菌のＤＮＡに
ついてPCRを行なった場合に得られたPCR産物のアガロー
スゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）
は分子量マーカーを示す。
＃19）から精製されたＤＮＡ、および大腸菌のＤＮＡに
ついてPCRを行なった場合に得られたPCR産物のアガロー
スゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）
は分子量マーカーを示す。
【図５】本発明の方法によりスサビノリ（0120系）糸状
体から精製したＤＮＡの吸収スペクトルを示す。
体から精製したＤＮＡの吸収スペクトルを示す。
【図６】本発明の方法によりスサビノリ（0120系）糸状
体から精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
体から精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
【図７】本発明の方法によりスサビノリ糸状体から精製
したＤＮＡ5 μg を制限酵素HaeIIIで消化し、プラスミ
ドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーとした場合
に生成したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
したＤＮＡ5 μg を制限酵素HaeIIIで消化し、プラスミ
ドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーとした場合
に生成したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
【図８】本発明の方法によりスサビノリ糸状体から精製
したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）は
分子量マーカーを示す。
したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）は
分子量マーカーを示す。
【図９】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体か
ら精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真であ
る。図中のＭ（左端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
ら精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真であ
る。図中のＭ（左端のレーン）は分子量マーカーを示
す。
【図１０】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体
から精製したＤＮＡ５μgを制限酵素HaeIIIで消化し、
プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーと
した場合のアガロースゲル電気泳動写真である。図中の
Ｍ（両端のレーン）は分子量マーカーを示す。
から精製したＤＮＡ５μgを制限酵素HaeIIIで消化し、
プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーと
した場合のアガロースゲル電気泳動写真である。図中の
Ｍ（両端のレーン）は分子量マーカーを示す。
【図１１】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体
から精製したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のア
ガロースゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレ
ーン）は分子量マーカーを示す。
から精製したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のア
ガロースゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレ
ーン）は分子量マーカーを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年７月２８日（１９９８．７．２
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
フロントページの続き (72)発明者 岡内 正典 三重県度会郡玉城町佐田411番地２号
Claims (2)
- 【請求項１】 ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、
ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを
精製する方法において、吸着性物質としてヒドロキシア
パタイトを用いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方
法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ溶液が、生物試料を尿素を含有す
る緩衝液にて抽出したものであることを特徴とする、請
求項１記載のＤＮＡの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19324498A JP2981548B1 (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Ｄｎａの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19324498A JP2981548B1 (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Ｄｎａの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2981548B1 JP2981548B1 (ja) | 1999-11-22 |
| JP2000023668A true JP2000023668A (ja) | 2000-01-25 |
Family
ID=16304739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19324498A Expired - Lifetime JP2981548B1 (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Ｄｎａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2981548B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100478138B1 (ko) * | 2002-10-28 | 2005-03-21 | 주식회사 코젠바이오텍 | Ｄｎａ 보관체 및 ｄｎａ 보관방법 |
| JP2017035651A (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | 学校法人 神野学園 | Ｄｎａ吸着担体及びその利用方法 |
-
1998
- 1998-07-08 JP JP19324498A patent/JP2981548B1/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100478138B1 (ko) * | 2002-10-28 | 2005-03-21 | 주식회사 코젠바이오텍 | Ｄｎａ 보관체 및 ｄｎａ 보관방법 |
| JP2017035651A (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | 学校法人 神野学園 | Ｄｎａ吸着担体及びその利用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2981548B1 (ja) | 1999-11-22 |
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