JPH11512612A

JPH11512612A - 土壌ｄｎａからのキシラナーゼ遺伝子配列の単離方法、この方法で有用な組成物、およびこうして得られる組成物

Info

Publication number: JPH11512612A
Application number: JP9513831A
Authority: JP
Inventors: ラドムスキイ，クリストファー，シー．エイ．; セオウ，カー，トン; ウォレン，アール．，アンソニー，ジェイ．; ヤップ，ワイ，ホー
Original assignee: ターラジェンディバーシティインコーポレイテッド
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 1999-11-02
Also published as: CA2232709C; US5849491A; CA2232709A1; AU6922196A; AU725144B2; WO1997012991A1; US6441148B1; EP0851938A1

Abstract

(57)【要約】キシラナーゼＤＮＡは、縮重プライマーを使用してＰＣＲ増幅により土壌から回収される。土壌試料の複雑さのために、回収された生成物は２つ以上の分子種のポリヌクレオチドを含む可能性が高い。これらの回収されたコピーは宿主生物内にクローン化して各個別の分子種の追加のコピーを産生してから、配列決定により性状解析してもよい。既知のキシラナーゼとは異なることが知られている回収されたＤＮＡは、いくつかの方法で使用して、工業的応用のための新規キシラナーゼの産生を促進することができる。まず、回収されたＤＮＡまたはその部分に対応するプローブをプローブとして用いて、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、回収されたＤＮＡのユニークな領域を含む完全なキシラナーゼ遺伝子を回収することができる。第２に、回収されたＤＮＡまたはその部分に対応するポリヌクレオチドは、既知のキシラナーゼ遺伝子に挿入して、回収されたＤＮＡの配列の変化したものを有する組換えキシラナーゼ遺伝子を産生することができる。

Description

【発明の詳細な説明】土壌ＤＮＡからのキシラナーゼ遺伝子配列の単離方法、この方法で有用な組成物、およびこうして得られる組成物発明の分野本出願は、土壌ＤＮＡから新規キシラナーゼ（xylanase）遺伝子を単離するためのＰＣＲ増幅法の使用、およびその方法において有用なプライマー、およびこうして得られる生成物に関する。発明の背景セルロースおよびヘミセルロース（キシラン（xylane）がヘミセルロースの主成分である）の加水分解には、共同して作用する、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、およびキシラナーゼとしての活性を有する種々の酵素が必要である。自然界で植物物質を分解しているのは、これらの酵素の系（異なるセルラーゼファミリーの酵素からなる）である。セルロースは１２のファミリー（Ａ〜Ｌと呼ばれる）に分類されており、１つの生物が、いくつかのファミリーから得られるメンバーを有する酵素のセットを有することもある。これらのファミリーの中で、ファミリーＦとＧがキシラナーゼ活性を示す。セルラーゼやキシラナーゼの工業的応用の可能性は、ますます注目されている。例えば、バイオマス変換（ジェイ・エヌ・サドラー（Saddler，J.N．）、森林および農業植物残渣の生物変換（Biocnversion of forest and agricultural pl ant residues）、キャンインターナショナル（CAN Internationl）、オックスフォード、イングランド（1993））、およびパルプ加工や紙の生産におけるセルラーゼやキシラナーゼの役割（シー・ビー・ウイック（Wick，C.B.）、Genetic En gineering news 14: 10-11（1994））がある。例えば、キシラナーゼは、有機塩素系廃液の量を減少させることによりパルプの漂白を、より環境に優しいものにするのに使用できる。エヌ・マキュビン（McCubbin，N.）、Pulp & Paper Canad a，95: 4(1994)。工業的使用に適したセルラーゼやキシラナーゼの同定および性状解析は、セルラーゼやキシラナーゼを産生する生物をセルロースやセルロース様の基質上で増殖させて、これらの生物を単離および選択する伝統的な方法が行われている。しかし、この伝統的な方法は、培養可能な生物にのみ可能である。土壌中に存在する生物のわずかに１％しか培養できないと推定される（ジェイ・エム・チエジェ（Tiedje，J.M.）、ASM New 60 :524-525(1994)）ことを考慮すると、この伝統的方法は、土壌が理論的に提供できる酵素資源の表面をすくい取っているのみである。 1994年６月のカナダのモントリオールでの工業微生物学会（the Society of I ndustrial Microbiology Meeting）で発表された報告でベルグクイスト（Bergqu ist）らは、９５℃という高温の熱水の水たまりの中の極めて好熱性の細菌から、ヘミセルロース分解酵素を単離する方法について検討している。彼らは、培養できない生物については、既知のキシラナーゼ遺伝子の保存領域にハイブリダイズするプライマーを用いて、濃縮した温泉のお湯から単離した総ＤＮＡについてポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用して、キシラナーゼＤＮＡを単離することを提案している。ベルグクイスト（Bergquist）は、より複雑で難しい土壌試料からのキシラナーゼＤＮＡの回収法については、開示も示唆もしていない。本発明の目的は、ファミリーＦキシラナーゼに特異的なＤＮＡを土壌から抽出するための機序を提供することにより、培養できない生物が産生するセルラーゼおよびキシラナーゼ酵素を利用する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、この単離法を実施するのに有用な具体的な組成物（特に、プライマー）を提供することである。本発明のさらなる目的は、本発明の方法を使用して土壌から単離される、活性部位を有する新規キシラナーゼ酵素を提供することである。発明の要約本発明は、土壌からキシラナーゼをコードするＤＮＡを回収する方法であって、（ａ）土壌試料を処理して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いハイブリダイゼーションのために土壌中のＤＮＡを利用できるようにし、（ｂ）処理した土壌試料を、増幅反応混合物中の第１および第２の増幅プライマーと一緒にして、ここで第１および第２のプライマーは、キシラナーゼをコードする遺伝子のそれぞれセンスおよびアンチセンス鎖の保存領域とハイブリダイズし、かつ遺伝子中の目的の領域の両側に位置し、（ｃ）それぞれが少なくとも１つの変性期とプライマー伸長期を含む複数のサイクルにより増幅反応混合物の熱サイクリングを行って、両側にプライマーが存在する目的の領域の複数のコピーを産生し、そして（ｄ）増幅反応混合物から目的の領域のコピーを回収する、工程からなる方法を提供する。土壌試料の複雑さのために、回収された生成物が２つ以上の分子種のポリヌクレオチドを含有する可能性がある。従って、本発明によれば、回収された分子種のコピーを宿主生物にクローン化して、それぞれの追加のコピーを産生した後、配列決定により解析する。既知のキシラナーゼとは異なることが知られている回収されたＤＮＡは、いくつかの方法で使用して、工業的応用のための新規キシラナーゼの生産を促進することができる。まず、回収されたＤＮＡまたはその部分に対応するプローブをプローブとして用いて、土壌ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、回収されたＤＮＡのユニークな領域を含む完全なキシラナーゼ遺伝子を回収することができる。第２に、回収されたＤＮＡまたはその部分に対応するポリヌクレオチドは、既知のキシラナーゼ遺伝子に挿入して、回収されたＤＮＡの配列の変化したものの組換えキシラナーゼ遺伝子を産生することができる。図面の簡単な説明図１は、プライマーとしての使用に適した保存領域の位置を示すファミリーＦのキシラナーゼ遺伝子の地図を示す。図２は、本発明の方法を使用して単離される２０個のＤＮＡ断片の配列の差、およびセルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）のファミリーＦキシラナーゼの対応する領域の配列を示す。発明の詳細な説明土壌試料からキシラナーゼＤＮＡを回収するための本発明の方法は、振り返ってみると他の供給源（ベルグクイスト（Bergquist）らの温泉の湯を含む）からのＤＮＡのＰＣＲ増幅に似ているようであるが、土壌の複雑さのために、この環境およびこの目的のためのＰＣＲ増幅の有用性は自信を持って予測できない。土壌は、ミネラル、分解している有機物および多くの生物や微生物の複雑な混合物である。従って土壌は、ＤＮＡ、および多くの複雑な有機物（例えば、腐植物質）の多くの可能な供給源を含有し、これらは、プライマー結合またはポリメラーゼ酵素活性を妨害してＰＣＲ増幅を困難にする可能性がある。従って、本発明の開発における最初の問題は、土壌試料に直接ＰＣＲ増幅が実施できるか否かであった。抽出された土壌試料中に移行した腐植物質の存在下でファミリーＦセルラーゼ遺伝子断片を増幅するのに、ＰＣＲが有効に利用できるかどうかを調べるために、バーンズ（Barns）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．91: 1609-1613（1994）が記載した直接溶解法により調製した土壌ＤＮＡにセルロモナス・フィミ（Cellulom onas fimi）のゲノムＤＮＡを添加し、ファミリーＦキシラナーゼ遺伝子（図１）の保存領域にハイブリダイズする縮重プライマーを使用してＰＣＲを行い、２回のＰＣＲで合計７０サイクルを行なった。アガロースゲル電気泳動を使用して、ＰＣＲ産物を分離した。これらのゲルを評価すると、添加した試料と非希釈ゲノム対照の約３００塩基対と４００塩基対に対応する２つのバンドが明瞭に証明された。下のバンドはセルロモナス・フィミ（C．fimi）ゲノムＤＮＡから予測されたサイズ（２８５塩基対）である。４００塩基対のバンドをさらに調べると、セルロモナス・フィミ（C．fimi）の推定される第２のファミリーＦセルラーゼのメンバーが得られた。ゲノムＤＮＡの希釈率を上げると、４００塩基対と３００塩基対の領域の外の領域に、より明瞭なＰＣＲ産物が現れる。全体にこれらの結果は、腐植物質はＰＣＲを強く阻害することはなく、最適化することなくＰＣＲ産物が得られることを示している。さらにゲノムＤＮＡの高い希釈率では、土壌ＤＮＡ中の標的配列は、プライマー結合についてゲノムＤＮＡから競合を受けることが少ない。こうして、土壌ＤＮＡ標的が増幅される。予備実験では、ＰＣＲを用いて土壌ＤＮＡが増幅できることが証明されたため、添加していない土壌ＤＮＡについてＰＣＲを行なった。この場合、ＰＣＲ増幅により、３００塩基対より大きい５つのバンドが増幅された。既知のファミリーＦのメンバーの中で、作製されたプライマーが標的とするファミリーＦセルラーゼの断片のサイズは非常に不均一（１９５塩基対〜３４５塩基対）なため、そして回収された断片を評価すると、生成物は、既知の遺伝子との相同性に基づきキシラナーゼ遺伝子断片である可能性が確認されたため、この結果は予測外である。すなわち、本発明において、土壌からキシラナーゼＤＮＡを回収する方法を提供され、この方法は、（ａ）土壌試料を処理して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いハイブリダイゼーションのために土壌中のＤＮＡを利用できるようにし、（ｂ）処理した土壌試料を、増幅反応混合物中の第１および第２の増幅プライマーと一緒にして、ここで第１および第２のプライマーは、キシラナーゼをコードする遺伝子のそれぞれセンスおよびアンチセンス鎖の保存領域とハイブリダイズし、かつ遺伝子中の目的の領域の両側に位置し、（ｃ）それぞれが少なくとも１つの変性期とプライマー伸長期を含む複数のサイクルにより増幅反応混合物の熱サイクリングを行って、両側にプライマーが存在する目的の領域の複数のコピーを産生し、そして（ｄ）増幅反応混合物から目的の領域のコピーを回収する、工程からなる。本発明で使用される土壌試料は、ミネラルと有機物質の混合物を含む任意のタイプの土壌であってよい。本発明の方法の最初の工程で、土壌試料を処理して、増幅反応に使用されたプライマーや酵素がＤＮＡに利用できるようにする。例えば、土壌をリゾチーム、続いてプロテイナーゼＫで処理し、次に有機溶媒で抽出する直接溶解により、ＤＮＡを利用できるようにすることができる。ＤＮＡを水相から沈殿させ、次にクロマトグラフィーでさらに精製する。ファージライブラリーへの土壌ＤＮＡの取り込みも実施可能であり、そのようなライブラリーは、本発明の範囲内で処理した土壌試料の１つの型である。処理した土壌試料を、増幅反応混合物中のＰＣＲ増幅のための２つのプライマーと一緒にする。ＰＣＲ増幅の基本的な必要条件は公知であり、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に記載されており、これは参考のため本明細書に組み込まれる。しかし一般に、増殖反応は、プライマー伸長反応に適した緩衝液中に熱安定性ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑまたはウルトラサーム（Ultratherm ）（登録商標）ポリメラーゼ）、およびすべての４つの型のヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）を含むであろう。本発明の方法で使用されるプライマーは、セルラーゼ／キシラナーゼ遺伝子の相補鎖上の保存領域に結合し、構造の多様性が疑われるため目的の領域の両側に位置する、任意のプライマー対である。図１は、温泉の湯からキシラナーゼ遺伝子断片を増幅するのにベルグクイスト（Bergquist）らが使用したプライマーの位置を示し、より大きい断片を産生するプライマーの好適なセットの位置を示す。これらの好適なプライマーは、配列前進プライマー CGS GGS CAC ACS XTS XTS TGG ［配列番号１］および、逆プライマー GTT GTA GTC GTT GWX GXA SA ［配列番号２］（ここで、ＳはＣまたはＧであり、、ＷはＡまたはＴであり、Ｘはイノシンを示す）を有する、縮重プライマーである。プライマーと処理した土壌試料を含有する増幅反応混合物を、複数回の熱サイクリングにかけて、プライマーがその両側に位置する領域に対応する増幅したＤＮＡ断片を産生させる。熱サイクリング後、増幅産物を電気泳動ゲルで分離する。アガロースゲルがこの目的には充分であることがわかっているが、ポリアクリルアミドゲルも使用できる。毛細管電気泳動やストレプト（アビジン）コーティング支持体上での増幅した物質の捕捉を促進するためのビオチン化プライマーの使用を含む他の分離法も、反応混合物から増幅したＤＮＡを回収するのに使用することができる。土壌試料中のＤＮＡの多様性のために、増殖反応で産生される生成物は、２つ以上の分子種のキシラナーゼ遺伝子断片を含む可能性がある。すなわち、回収されたＤＮＡは、宿主生物に適切にクローン化されて、各分子種毎に複数のコピーを産生する。我々は、ｐＣＲIIへの増幅断片をクローニングするための結合に、ＰＣＲ産物上の３’オーバーハングを利用する、インビトロゲン（InVitrogen）の「オリジナルＴＡクローニングキット（Original TA cloning kit）」を使用した。次にこのプラスミドを、従来法により大腸菌（E．coli）ＩＮＶαＦ’中に導入した。しかし、この特異的プラスミドと宿主生物は決定的に重要ではなく、他のプラスミドや宿主も使用できる。クローン化した土壌ＤＮＡを含有するプラスミドは、好ましくはサンガー（Sa nger）らの方法を修飾して、宿主生物から回収し、配列決定により評価する。元々の増幅プライマーと同じかまたは類似の配列決定プライマーを使用して、プラスミドの部分にハイブリダイズするプライマーのように、増幅プライマーが両側に位置する領域の配列を得ることができる。配列決定は、標識したプライマーまたは色素標識した鎖停止ヌクレオチド三リン酸を使用して行うことができる。例えばブラスト（Blast）プログラムを使用して、決定した配列をキシラナーゼ遺伝子の既知の配列と比較して、クローン化した断片が確かにキシラナーゼ遺伝子由来であることを確認し、これがまだ性状解析されていない配列を有するかどうかを決定する。次にユニークなキシラナーゼ配列をさらに処理して、評価のためのユニークな配列の完全な遺伝子を得る。完全なキシラナーゼ遺伝子を得るための方法は、２つの方法で行われる。第１に、回収されたＤＮＡ、またはユニークな塩基配列を含有するその選択された部分を使用して、土壌ＤＮＡを含有するファージライブラリーからキシラナーゼ遺伝子を選択する。このタイプのライブラリーの作製に使用される具体的な技術や試薬は、個人の好みの応じて多くの設定が可能であるが、我々は、ホルベン（Ho lben）ら、Appl．Environ Microbiol．53: 703-711（1988）が記載した方法の修飾法により調製した土壌ＤＮＡから、そのようなライブラリーを作製した。この方法では、土壌試料をホモジナイズし、徐々に大きなｇをかけて遠心分離して、細菌ペレットを単離する。ペレットを緩衝液に懸濁し、サルコシル（Sarkosyl）で処理し、次にリゾチームで溶解する。溶解した細胞をプロナーゼ次にサルコシルで処理する。得られる細菌溶解物の上清から標準的フェノール／クロロホルム抽出を用いて、ＤＮＡを抽出した。次に、イソプロパノールでＤＮＡを沈殿させた。下記のようにセファデックスＧ−２００カラムを通して遠心分離してＤＮＡをさらに精製した。得られる土壌ＤＮＡを、ＤＮＡ１μg 当たり０．５単位の制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＹＩで部分消化（酵素への暴露が２０分未満）し、０．３％アガロースゲルにかけ、ここから６〜１２キロ塩基の断片を電気溶出した。結合、パッケージング、および増幅プロトコールは、ストラタジーン（Stratagene）のプレダイジェスティッドＺＡＰエキスプレスＢａｍＨＩ／ＣＩＡＰベクタークローニングキット（Predigested ZAP Express BamHI/CIAP Vector Cloning Kit）とギガパックIII ゴールドパッケージングエキストラクト（Gigapack III Gold Packag ing Extract）に従った。結合は、ベクター：挿入ＤＮＡを１：５のモル比で行なった。次に得られたライブラリーをスクリーニング化て、土壌ＤＮＡの最初の増幅からわかった新規配列に基づくプローブを使用して、キシラナーゼ遺伝子を含有するライブラリーのメンバーを同定する。プローブ配列は、土壌ＤＮＡの増幅とクローニングにより産生される完全長ポリヌクレオチドでもよい。あるいは、プローブ配列は、本来は既知のキシラナーゼ遺伝子断片中の、増幅産物中で検出されるユニークな遺伝子の１つまたはそれ以上の変化を含むポリヌクレオチドであってもよい。この工程で使用されるプローブは、２０〜１５００塩基、好ましくは１００〜１０００塩基の範囲の長さを有してもよい。いったん同定されると、選択されたキシラナーゼ挿入体を含有するファジミドを回収し評価することができる。キシラナーゼ挿入体は、例えば挿入部に対してプライマー歩行を使用して配列決定して、目的の変化の存在を確認するか、または発現させて発現した酵素を評価して、挿入体によりコードされる酵素の性質を調べることができる。標準的なキシラナーゼ配列からずれる天然に存在する酵素を単離するためのプローブ使用の代替法として、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ指令ドメインシャフリング（クラメリ（Crameri）ら、Nature Biotechnology 14: 315-319(19 96)）のような方法を使用して、作製したキシラナーゼ遺伝子を生成し、増幅した土壌試料ＤＮＡ中に存在する変化に対応する１つまたはそれ以上の配列の変化を導入することができる。既知の配列に規定された変化を導入するための一般的な方法は、当該分野で公知であり、ここででは繰り返さない。本発明の方法を使用して、本発明者らは、これまで既知のキシラナーゼには対応しない全部で２０個の異なるキシラナーゼＤＮＡ断片と１つの完全な新規キシラナーゼ遺伝子を単離し配列決定した。これらの断片および遺伝子の配列は、配列番号３〜２２に示す。図２は、断片配列と、セルロモナス・フィミ（C.fimi）のキシラナーゼの対応する領域（配列番号２３）との比較を示し、重要な変化のある領域を含有する領域の周りは四角で囲ってある。１つまたはそれ以上のこれらの変化を含むポリヌクレオチド、特に四角で囲った領域を含むポリヌクレオチドは、前述のようにプローブまたは組換え遺伝子の設計に使用することができる。本発明をさらに以下の非限定例について説明する。例１バーンズ（Barns）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．91: 1609-1613（1994）が記載した「直接溶解法」を使用して、土壌試料からＤＮＡを抽出した。得られた抽出土壌試料を、ファミリーＦセルラーゼの高度に保存された領域を標的にする２つの縮重プライマー、すなわち 5'-CG(CG) GG(CG) CAC AC(CG) XT(CG) XT(CG) TGG-3' ［配列番号１］および、 5'-GTT GTA GTC GTT G(AT)X GXA (CG)A-3' ［配列番号２］（ここで、Ｘはイノシンを示す）と一緒にした。イノシンは、各プライマーの縮重を低下させるために使用した。パチル（Patil）ら、Nucleic Acid Res．18: 3 080（1990）。これらの配列は、回収された配列中の変化が酵素の機能にとって重要であるように、ファミリーＦセルラーゼの活性部位の両側に位置する。増幅は、エムジェイリサーチ（MJResearch）ＰＴＣ−１００サーモサイクラーで以下のように行なった：２５〜８０ngの鋳型ＤＮＡ、０．５０μgの各プライマー、５０μM の各ｄＮＴＰ、１．５mMのＭｇＣｌ₂、１×の１０×Ｔａｑ緩衝液、および５ＵのＴａｑポリメラーゼ（緩衝液とポリメラーゼはギブコビーアールエル（GibcoBRL）から）を、無菌蒸留水と混合して５０μｌとした。９４℃で３分間「ホットスタート」した後、混合物を氷中で５分間冷却し、遠心分離し、８０℃で維持しながらポリメラーゼを入れて、プライマーのＴｍの差を克服し異常なプライミングを防止するために「タッチダウン」プロトコールを使用した。ドン（Don）ら、Nucleic Acids Res．19: 4008(1991)；ケー・エィチ・ルー（Ro ux，K.H.）、BioTechniques 16: 812-814(1994)。熱サイクリング：変性、９４ ℃、５０秒；アニーリング、６５℃１分；伸長、７２℃１分；および最初の１０サイクルについては、アニーリング温度を、５５℃になるまで１サイクルにつき１℃低下させた。次に、アニーリング温度５５℃で２５サイクルを行なった。７２℃で１０分間最後の伸長を行なった。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルで臭化エチジウム染色を用いて電気泳動により解析した。ゲルからのＤＮＡの切り出し、−８０℃で２０分間凍結、３７℃で１０分間融解、１０μl のＨ２Ｏの添加、ミニフュージ（minifuge）中で１５０００rpm で２分間遠心分離、次に液体を取り出し保存する、工程からなる、キアゲンキアエックス（QIAGEN Qiaex）プロトコール、すなわち「凍結−融解」法により、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、同じプライマーを使用して再増幅し、アガロースゲルで分離し、次にインビトロゲン（InVitrogen）の「オリジナルＴＡクローニングキット（Original TA cloning kit）」を使用して、ｐＣＲIIプラスミドにクローン化した。このプラスミドを、インビトロゲン（InVitrogen）のコンピタントな大腸菌（E．coli）細胞に形質転換した。形質転換したプラスミドを含有する細胞の選択は、アンピシリンとＸ−ｇａｌを含有するＬＢ培地での増殖により行なった。白いコロニーを選択し、一晩増殖後、クローン化プラスミドを、キアウェル（QIAwell）８またはチップ−２０修飾アルカリ分解、および樹脂プラスミド抽出精製キット（キアゲン社（Quiagen Inc.）から）を使用して精製し、アプライドバイオシステムズ社（Applied Bios ystems，Inc.）のプリズム即時反応ダイデオキシターミネーターサイクル配列決定キット（PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit ）をＡＢＩ３７３ストレッチシーケンサー（Stretch sequencer）で使用して、配列決定した。配列のあいまいさ、翻訳、および整列の作製のために、ジーンワークス（Geneworks）（インテリジェネティックス社（IntelliGenetics Inc.））のアップルマック版を使用した。決定したＤＮＡ配列を、タンパク質データベースに対するＤＮＡ配列の比較のために、電子メール：blast@ncbi.nlm.nih.gov に存在するＮＣＢＩＢＬＡＳＴデータベースに送った。この方法を使用して、８個のＤＮＡ断片（以後、配列番号３〜１０と呼ぶ）を同定した。Ｂｌａｓｔ解析により、これらの断片がキシラナーゼ遺伝子に由来するとして割り当てられることが確認されたが、いずれの断片についても完全な一致はなかった。例２異なるＰＣＲ試薬と条件を使用した以外は、例１の実験を繰り返した。Ｔａｑポリメラーゼの代わりに、バイオ／キャン（BIO/CAN）のＩＵのウルトラサーム（Ultratherm）（登録商標））を使用し、低いアニーリング温度で処理して、これがより多様なセットの断片を生成するかどうかを調べた。使用した熱サイクリングプログラムは以下の通りである：９４℃３０秒；４５℃１分；７２℃まで５秒に１℃ずつ温度を上げる；７２℃で４５秒；前の工程を４回繰り返し、各回にアニーリング温度を２℃ずつ上げる；９４℃で３０秒、５３℃で１分、７２℃で４５秒を１０サイクル行う；次に９４℃３０秒、５５℃で１分、７２℃まで５秒に１℃ずつ温度を上げ、そして７２℃で４５秒；次に９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒を３０サイクル；および最後の伸長工程を７２℃で１０分行う。こうして、本明細書で配列番号１１〜２０と呼ぶ追加の１０個の断片が回収された。例３ファージライブラリーを調製するために、５０ｇの土壌試料を、１．４３mMＫ₂ ＨＰＯ₄、１．０１mM ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２．１４mM ＮａＣｌ、４．７５ μM Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃・７Ｈ₂、Ｏ、１４．８μM ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏを含有しアスコルビン酸ナトリウムを加えたホモジナイズ用緩衝液で、使用直前に最終濃度を０．２Ｍになるように加えた緩衝液でホモジナイズして、土壌ＤＮＡを調製した。ホモジネートをチーズ布でろ過し、回収した固体を１００mlのＴＥ緩衝液に懸濁して、細菌懸濁液を作成した。２５mlの５ＭＮａＣｌを加えて懸濁液を１ＭＮａＣｌとし、室温で１０分間インキュベートし、次に遠心分離して集めた。ペレットをＴＳ緩衝液（５０mM トリス、ｐＨ８．０；５０mM ＮａＣｌ）に再懸濁し、５０mlのポリカーボネート遠心分離管に移し、２０％サルコシル５０ μｌを加えて、０．１％サルコシル濃度とした。混合物を室温で１０分間インキュベートし、次に細菌を遠心分離して集めた。細菌ペレットの水を切り、０．７５Ｍショ糖、５０mM トリス（ｐＨ８．０）、および１０mM ＥＤＴＡを含有する３５mlのトリス−ショ糖−ＥＤＴＡに懸濁した。リゾチームを最終濃度５mg/ml になるように加えて、試料を３７℃で６０分間インキュベートした。３７℃で３０分間インキュベートしてあらかじめ消化したＴＳ緩衝液中のプロナーゼ溶液を、この細菌−リゾチーム混合物に加えて、ボルテックス混合し、次に３７℃で６０分間インキュベートした。次に温度を６５℃に上げ、２０％サルコシル０．２５mlを加えて、１０分間インキュベートした。得られた細菌溶解物の上清から、標準的フェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを抽出した。次にこのＤＮＡをイソプロパノールにより沈殿させた。以下のようにセファデックスＧ−２００カラムを通して遠心分離することにより、ＤＮＡをさらに精製した。２ｇのセファデックスＧ−２００（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biot ech））を、７５mlのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０mM トリス−塩酸、１mM ＥＤＴＡ）で５回洗浄した。毎回、混合物を沈殿させ、過剰のＴＥを除去してから、さらにＴＥを加えた。次にセファデックス懸濁液をオートクレーブにかけた。過剰のＴＥを除去し、高塩濃度ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０mM トリス −塩酸、１mM ＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣｌ）で懸濁物を元の容量にして、振盪し、沈殿させた。過剰のＴＥを除去し、高塩濃度ＴＥ緩衝液で懸濁物を再度元の容量にして、振盪し、沈殿させた。５mlのシリンジに無菌のフィルターガラスを１ccの印のところまで充填し、セファデックスを加えた。次に、このカラムをスイングバケット型遠心分離機で１０００×ｇで１０分間、無菌試験管中で遠心分離し、５００μｌの高塩濃度ＴＥを加えて、カラムを再度１０００×ｇで１０分間遠心分離した。次にカラムを新しい試験管に移し、ＤＮＡをカラムに加え、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。さらに３回、５００μｌの高塩濃度ＴＥを加えて、カラムを１０００×ｇで１０分間遠心分離した。最後の遠心分離を１０００×ｇで１０分間行なった。次にＤＮＡを、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の９５％エタノールで沈殿させた。懸濁物を４℃で一晩靜置した。次にこれをミニフュージ中で４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、７０％エタノールで置換し、再度遠心分離した。上清を除去し、ペレットを乾燥させ、ＴＥ（高塩ではない）に溶解した。得られた土壌ＤＮＡ調製物を、ＤＮＡ１μg 当たり０．５単位のＢｓｔＹＩで部分消化（酵素への暴露が２０分未満）し、６〜１２キロ塩基の断片を０．３％アガロースゲルから電気溶出した。結合、パッケージング、および増幅プロトコールは、ストラタジーン（Stratagene）のプレダイジェスティッドＺＡＰエキスプレスＢａｍＨＩ／ＣＩＡＰベクタークローニングキット（Predigested ZAP Express BamHI/CIAP Vector Cloning Kit）とギガパックIII ゴールドパッケージングエキストラクト（Gigapack III Gold Packaging Extract）に従った。結合は、ベクター：挿入ＤＮＡを１：５のモル比で行なった。配列番号３〜２０のいずれかに由来する配列を有するプローブをライブラリーのスクリーニングに使用できるが、我々は、ライブラリーストックのＰＣＲ増幅により追加のプローブを調製することを選択した。５μｌの１．１×１０⁵ pfu/ μl ライブラリーストック、最終濃度５０μM の各ｄＮＴＰ、最終濃度０．５μ M の各縮重プライマー（配列番号１と２）、最終濃度１．５mMのＭｇＣｌ₂、１０％ＤＭＳＯ、１×の１０×ウルトラサーム緩衝液、１Ｕのウルトラサームポリメラーゼ（緩衝液とポリメラーゼは、バイオ／キャンサイエンティフィック（BI O/CAN Scientific）、オンタリオ、カナダ、から）、および無菌蒸留水を、混合した。熱サイクリング：９４℃５０秒；６５℃１分；７２℃１分；および最初の１０サイクルについては、アニーリング温度を、５５℃になるまで１サイクルにつき１℃低下させた。次の３５サイクルは、アニーリング温度を５５℃で行い、次に７２℃で１０分間最後の伸長を行なった。例１と同様に、クローニングのためにインビトロゲン（InVitrogen）の「オリジナルＴＡクローニングキット（Or iginal TA cloning kit）」を使用した。追加のＡＴＰを最終濃度１mMになるように加えた。プラスミドＤＮＡを抽出し、キアゲン（Quiagen）のチップ−２０キットで精製した。挿入体を有するＴＡベクターをＥｃｏＲＩで消化してプローブを調製した。消化した試料を、１．２％アガロースゲルで臭化エチジウム染色を用いて電気泳動を行なった。目的のバンドをゲルから切り出し、キアゲンのキアエックス（QIAGEN's Qiaex）キットを使用してＤＮＡ断片を精製した。この操作により、さらに２つのキシラナーゼ断片（本明細書において、配列番号２１と２２と呼ぶ）が同定された。ギブコビーアールエル（GibcoBRL）のランダムプライマーＤＮＡ標識システム（Random Primers DNA Labeling System）を用いて、提供されているプロトコールに従って［α−３２Ｐ］ｄＣＰＴにより、これらの断片を標識した。例４プローブとして配列番号２１により与えられる配列を有する断片を使用して、ライブラリーのスクリーニングを行なった。ストラタジーン（Stratagene）のプレダイジェスティッドＺＡＰエキスプレスＢａｍＨＩ／ＣＩＡＰベクタークローニングキット（Predigested ZAP Express BamHI/CIAP Vector Cloning Kit）とともに提供されたスクリーニングプロトコールを使用した。ハイブリダイゼーション後の洗浄は以下の通りである：０．５×ＳＳＣ、０．１％（w/v）ＳＤＳで５５℃で２回洗浄；次に０．５×ＳＳＣ、０．１％（w/v）ＳＤＳで６０℃で１回洗浄。次に、ストラタジーン（Stratagene）の推奨するインビボ切り出しプロトコールに従って、挿入体ＤＮＡを有するｐＢＫ−ＣＭＶファジミドを含有する大腸菌（E．coli）コロニーを単離した。挿入体を有するファジミドＤＮＡを抽出し、キアゲン（Quiagen）のチップ−２０キットで精製した。例５ライブラリーからのファジミド中に含有されるキシラナーゼ遺伝子を、初期伸長プライマーとして縮重増幅プライマー（配列番号１と２）を使用して、挿入体に対してプライマー歩行を行って配列決定した。次に、あらかじめ作成した配列データを見て、以後の伸長プライマーを作製した。キシラナーゼ遺伝子の配列とコードされるキシラナーゼの推定のアミノ酸配列を、本明細書に配列番号２４として示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月１３日【補正内容】土壌中に存在する生物のわずかに１％しか培養できないと推定される（ジェイ・エム・チエジェ（Tiedje，J.M.）、ASM New 60 :524-525(1994)）ことを考慮すると、この伝統的方法は、土壌が理論的に提供できる酵素資源の表面をすくい取っているのみである。 1994年６月のカナダのモントリオールでの工業微生物学会（the Society of I ndustrial Microbiology Meeting）で発表された報告でベルグクイスト（Bergqu ist）らは、９５℃という高温の熱水の水たまりの中の極めて好熱性の細菌から、ヘミセルロース分解酵素を単離する方法について検討している。彼らは、培養できない生物については、既知のキシラナーゼ遺伝子の保存領域にハイブリダイズするプライマーを用いて、濃縮した温泉のお湯から単離した総ＤＮＡについてポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用して、キシラナーゼＤＮＡを単離することを提案している。ベルグクイスト（Bergquist）は、より複雑で難しい土壌試料からのキシラナーゼＤＮＡの回収法については、開示も示唆もしていない。ＪＰ６２７７０６１号は、阻害する可能性のある成分を有する便や他の環境試料中に存在する、ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を増強するためにポリアミンを使用する可能性を開示している。しかし、この方法の有効性は、１００コピーの標的ＤＮＡで補強した添加試料で証明されている。土壌試料の極端な不均一性のため、これは、そのような試料から直接キシラナーゼ遺伝子を増幅するための試みにより提示される状況の有効なモデルではない。本発明の目的は、ファミリーＦキシラナーゼに特異的なＤＮＡを土壌から抽出するための機序を提供することにより、培養できない生物が産生するセルラーゼおよびキシラナーゼ酵素を利用する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、この単離法を実施するのに有用な具体的な組成物（特に、プライマー）を提供することである。本発明のさらなる目的は、本発明の方法を使用して土壌から単離される、活性部位を有する新規キシラナーゼ酵素を提供することである。発明の要約本発明は、土壌からキシラナーゼをコードするＤＮＡを回収する方法であって、（ａ）土壌試料を処理して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いハイブリダイゼーションのために土壌中のＤＮＡを利用できるようにし、（ｂ）処理した土壌試料を、増幅反応混合物中の第１および第２の増幅プライマーと一緒にして、ここで第１および第２のプライマーは、キシラナーゼをコードする遺伝子のそれぞれセンスおよびアンチセンス鎖の保存領域とハイブリダイズし、かつ遺伝子中の目的の領域の両側に位置し、（ｃ）それぞれが少なくとも１つの変性期とプライマー伸長期を含む複数のサイクルにより増幅反応混合物の熱サイクリングを行って、両側にプライマーが存在する目的の領域の複数のコピーを産生し、そして（ｄ）増幅反応混合物から目的の領域のコピーを回収する、工程からなる方法を提供する。土壌試料の複雑さのために、回収された生成物が２つ以上の分子種のポリヌクレオチドを含有する可能性がある。従って、本発明７．プローブは、配列番号３〜２２のいずれか１つと同じであるかまたは相補的である配列を有する、請求の範囲第５項に記載の方法。８．培養できない微生物に由来し、請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の方法により土壌から回収される、キシラナーゼＤＮＡ断片。９．土壌からキシラナーゼ遺伝子を回収するための方法であって、（ａ）土壌ＤＮＡをハイブリダイゼーションで利用できるように処理された土壌試料を、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有するポリヌクレオチドプローブと一緒にして、そして（ｂ）処理された土壌試料からプローブとハイブリダイズするＤＮＡを単離する、工程を含む、上記方法。 10．処理された土壌試料は、土壌試料から調製されるファージライブラリーである、請求の範囲第８項に記載の方法。 11．請求の範囲第９項または第１０項のいずれかの方法により、土壌試料中に存在する培養できない微生物から単離される、実質的に精製されたキシラナーゼ遺伝子。 12．配列番号２４により与えられる配列を有する、実質的に精製されたキシラナーゼ遺伝子。 13．標準的領域と修飾された領域を含む組換えキシラナーゼ遺伝子であって、標準的領域は、配列番号２３により与えられる既知のキシラナーゼ配列に対応する配列を有し、修飾された領域は、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有する、上記組換えキシラナーゼ遺伝子。 14．配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有するキシラナーゼ遺伝子の、単離または同定のためのポリヌクレオチドプローブ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラドムスキイ，クリストファー，シー．エイ. カナダ国ブイ４エックス１エックス２ブリティッシュコロンビア，アボッツフォード，プレイリーストリート 4115 (72)発明者セオウ，カー，トンシンガポール国 0511，ケントリッジクレセント 10，ナショナルユニバーシティオブシンガポール，インスチチュートオブモルキュラアンドセルバイオロジイ (72)発明者ウォレン，アール．，アンソニー，ジェイ. カナダ国ブイ６アール１エイチ９ブリティッシュコロンビア，バンクーバー, ウエストセカンドアベニュー 3387 (72)発明者ヤップ，ワイ，ホーシンガポール国 458748，エリートテラス５

Claims

【特許請求の範囲】１．土壌からキシラナーゼＤＮＡを回収する方法であって、（ａ）土壌試料を処理して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いハイブリダイゼーションのために土壌中のＤＮＡを利用できるようにし、（ｂ）処理した土壌試料を、増幅反応混合物中の第１および第２の増幅プライマーと一緒にして、ここで第１および第２の増幅プライマーは、キシラナーゼをコードする遺伝子のそれぞれセンスおよびアンチセンス鎖の保存領域とハイブリダイズし、かつ遺伝子中の目的の領域の両側に位置し、（ｄ）それぞれが少なくとも１つの変性期とプライマー伸長期を含む複数のサイクルにより増幅反応混合物の熱サイクリングを行って、両側に第１および第２の増幅プライマーが存在する目的の領域の複数のコピーを産生し、そして（ｅ）増幅反応混合物から目的の領域のコピーを回収する、工程からなる、上記方法２．第１と第２の増幅プライマーは、配列番号１または２により与えられる配列を有する少なくとも１つのプライマーを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。３．回収されたコピーのヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。４．回収されたコピーの配列は、複製開始点を有するプラスミドに回収されたコピーを挿入し、修飾されたプラスミドで細菌宿主を形質転換し、そして形質転換した細菌宿主により産生されるプラスミド内の挿入体の配列を評価することにより決定される、請求の範囲第３項に記載の方法。５．目的の領域の回収されたコピーの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有するプローブを使用して、処理した土壌試料をスクリーニングして完全長ＤＮＡを単離する工程をさらに含み、ここで該一部は、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、請求の範囲第１項〜第４項までのいずれか１項に記載の方法。６．プローブは、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有する、請求の範囲第５項に記載の方法。７．プローブは、配列番号３〜２２のいずれか１つと同じであるかまたは相補的である配列を有する、請求の範囲第５項に記載の方法。８．請求の範囲第１項〜第７項までのいずれか１項に記載の方法により、土壌から回収されるキシラナーゼＤＮＡ断片。９．土壌からキシラナーゼ遺伝子を回収するための方法であって、（ａ）土壌ＤＮＡをハイブリダイゼーションで利用できるように処理された土壌試料を、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有するポリヌクレオチドプローブと一緒にして、そして（ｂ）処理された土壌試料からプローブとハイブリダイズするＤＮＡを単離する、工程を含む、上記方法。 10．処理された土壌試料は、土壌試料から調製されるファージライブラリーである、請求の範囲第９項に記載の方法。 11．請求の範囲第９項または第１０項のいずれかの方法により単離される、実質的に精製されたキシラナーゼ遺伝子。 12．配列番号２４により与えられる配列を有する、実質的に精製されたキシラナーゼ遺伝子。 13．標準的領域と修飾された領域を含む組換えキシラナーゼ遺伝子であって、標準的領域は、配列番号２３により与えられる既知のキシラナーゼ配列に対応する配列を有し、修飾された領域は、配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有する、上記組換えキシラナーゼ遺伝子。 14．配列番号２３により与えられる対照キシラナーゼ配列とは異なる、配列番号３〜２２のいずれか１つの少なくとも一部と同じであるかまたは相補的である配列を有するキシラナーゼ遺伝子の、単離または同定のためのポリヌクレオチドプローブ。 15．配列番号３〜２２のいずれか１つと同じであるかまたは相補的である配列を有するキシラナーゼ遺伝子の、単離または同定のためのポリヌクレオチドプローブ。