JP2000253885A - 任意プライマーｐｃｒを用いるｄｎａ断片クローニング方法 - Google Patents
任意プライマーｐｃｒを用いるｄｎａ断片クローニング方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 未知遺伝子のクローニングを任意のプライマ
ーを用いて可能にする方法を提供すること。 【解決手段】（ａ）プラスミド由来のベクターＤＮＡを
制限酵素で切断するステップと、（ｂ）得られた切断Ｄ
ＮＡの末端を脱リン酸化するステップと、（ｃ）別に、
対象生物の染色体由来のＤＮＡを前記制限酵素と同じ制
限酵素で切断してＤＮＡ断片混合物を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）で得られた脱リン酸化ＤＮＡとス
テップ（ｃ）で得られたＤＮＡ断片混合物とを用いてラ
イゲーションを行い連結ＤＮＡの混合物を得るステップ
と、（ｅ）得られた連結ＤＮＡの混合物を鋳型とし、任
意のプライマーを用いてＰＣＲを行って連結ＤＮＡを増
幅するステップと、（ｆ）得られたＰＣＲ産物をクロー
ニングベクターに組み込んでコンピテントな細胞に導入
するステップとを含む、遺伝子断片のクローニング方
法。
ーを用いて可能にする方法を提供すること。 【解決手段】（ａ）プラスミド由来のベクターＤＮＡを
制限酵素で切断するステップと、（ｂ）得られた切断Ｄ
ＮＡの末端を脱リン酸化するステップと、（ｃ）別に、
対象生物の染色体由来のＤＮＡを前記制限酵素と同じ制
限酵素で切断してＤＮＡ断片混合物を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）で得られた脱リン酸化ＤＮＡとス
テップ（ｃ）で得られたＤＮＡ断片混合物とを用いてラ
イゲーションを行い連結ＤＮＡの混合物を得るステップ
と、（ｅ）得られた連結ＤＮＡの混合物を鋳型とし、任
意のプライマーを用いてＰＣＲを行って連結ＤＮＡを増
幅するステップと、（ｆ）得られたＰＣＲ産物をクロー
ニングベクターに組み込んでコンピテントな細胞に導入
するステップとを含む、遺伝子断片のクローニング方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、任意のプライマー
を用いて未知遺伝子断片をクローニングする方法及び該
方法を用いてクローニングした未知遺伝子の塩基配列及
び推定アミノ酸配列に関する。
を用いて未知遺伝子断片をクローニングする方法及び該
方法を用いてクローニングした未知遺伝子の塩基配列及
び推定アミノ酸配列に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】遺伝子
をクローニングする方法は、従来から知られているが、
一般的には、その遺伝子がコードするタンパク質の本来
の機能に基づき又はタンパク質フラグメントから推定し
た塩基配列に基づきクローニングが行われていた。近
年、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が開発さ
れるに及んで、タンパク質の機能に依存することなく、
既知遺伝子の５’末端及び３’末端の数十残基のオリゴ
ヌクレオチドを用いて増幅させ、その増幅産物を精製し
た後、クローニングベクターを用いてクローニングを行
うことができるようになった。しかしながら、この方法
でもなお、５’末端及び３’末端の数十残基の塩基配列
が既知であることが必須である。その改良法として、SS
P-PCR (Single Specific Primer-PCR)法が開発された。
この方法は、既知の５’末端又は３’末端の数十残基の
塩基配列及び任意のプライマーを利用して、目的の既知
又は未知の遺伝子をクローニングする方法である。しか
しながら、任意のプライマーのみを用いて未知遺伝子断
片を直接クローニングする方法は知られていない。
をクローニングする方法は、従来から知られているが、
一般的には、その遺伝子がコードするタンパク質の本来
の機能に基づき又はタンパク質フラグメントから推定し
た塩基配列に基づきクローニングが行われていた。近
年、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が開発さ
れるに及んで、タンパク質の機能に依存することなく、
既知遺伝子の５’末端及び３’末端の数十残基のオリゴ
ヌクレオチドを用いて増幅させ、その増幅産物を精製し
た後、クローニングベクターを用いてクローニングを行
うことができるようになった。しかしながら、この方法
でもなお、５’末端及び３’末端の数十残基の塩基配列
が既知であることが必須である。その改良法として、SS
P-PCR (Single Specific Primer-PCR)法が開発された。
この方法は、既知の５’末端又は３’末端の数十残基の
塩基配列及び任意のプライマーを利用して、目的の既知
又は未知の遺伝子をクローニングする方法である。しか
しながら、任意のプライマーのみを用いて未知遺伝子断
片を直接クローニングする方法は知られていない。
【０００３】 このように、従来のＰＣＲ法では、５’
末端及び３’末端の数十残基のオリゴヌクレオチドの情
報が必須であり、その改良法であるSSP-PCR法では、
５’末端又は３’末端の数十残基の塩基配列の情報が必
須である。従って、もしも任意のプライマーを用いて塩
基配列未知の遺伝子断片を直接クローニングする方法が
確立されれば、未知遺伝子を優先的に選択できるように
なり、新しい治療薬等としての可能性を秘めた新しい遺
伝子を効率的に見出すことができるはずである。すなわ
ち本発明は、未知遺伝子のクローニングを任意のプライ
マーを用いて可能にする方法を提供することを目的とす
る。
末端及び３’末端の数十残基のオリゴヌクレオチドの情
報が必須であり、その改良法であるSSP-PCR法では、
５’末端又は３’末端の数十残基の塩基配列の情報が必
須である。従って、もしも任意のプライマーを用いて塩
基配列未知の遺伝子断片を直接クローニングする方法が
確立されれば、未知遺伝子を優先的に選択できるように
なり、新しい治療薬等としての可能性を秘めた新しい遺
伝子を効率的に見出すことができるはずである。すなわ
ち本発明は、未知遺伝子のクローニングを任意のプライ
マーを用いて可能にする方法を提供することを目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の観点
から種々検討を行っていたところ、プラスミド由来のベ
クター、例えばｐＵＣ由来のベクターを制限酵素切断し
て得られる直鎖状ＤＮＡの末端を脱リン酸化しておき、
これと、目的の未知遺伝子を含んだ染色体由来ＤＮＡの
同一の制限酵素による切断混合物とをライゲーションし
て、これを任意のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅
したものをクローニングベクターにのせて細胞に導入す
ることによって、用いたプライマーに相当する配列を
５’末端側に有し且つベクターのＤＮＡ配列が３’末端
側に連結した形で、未知の多種の遺伝子を同時に簡便に
クローニングできることを見出し、反復検討により優れ
た再現性を確認して本発明を完成させた。
から種々検討を行っていたところ、プラスミド由来のベ
クター、例えばｐＵＣ由来のベクターを制限酵素切断し
て得られる直鎖状ＤＮＡの末端を脱リン酸化しておき、
これと、目的の未知遺伝子を含んだ染色体由来ＤＮＡの
同一の制限酵素による切断混合物とをライゲーションし
て、これを任意のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅
したものをクローニングベクターにのせて細胞に導入す
ることによって、用いたプライマーに相当する配列を
５’末端側に有し且つベクターのＤＮＡ配列が３’末端
側に連結した形で、未知の多種の遺伝子を同時に簡便に
クローニングできることを見出し、反復検討により優れ
た再現性を確認して本発明を完成させた。
【０００５】すなわち、本発明は、（ａ） プラスミド
由来のベクターＤＮＡを制限酵素で切断するステップ
と、（ｂ） 得られた切断ＤＮＡの末端を脱リン酸化す
るステップと、（ｃ） 別に、対象生物の染色体由来の
ＤＮＡを前記制限酵素と同じ制限酵素で切断してＤＮＡ
断片混合物を得るステップと、（ｄ） ステップ（ｂ）
で得られた脱リン酸化ＤＮＡとステップ（ｃ）で得られ
たＤＮＡ断片混合物とを用いてライゲーションを行い連
結ＤＮＡの混合物を得るステップと、（ｅ） 得られた
連結ＤＮＡの混合物を鋳型とし、任意のプライマーを用
いてＰＣＲを行って連結ＤＮＡを増幅するステップと、
（ｆ） 得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターに
組み込んでコンピテントな細胞に導入するステップとを
含む、遺伝子断片のクローニング方法を提供する。
由来のベクターＤＮＡを制限酵素で切断するステップ
と、（ｂ） 得られた切断ＤＮＡの末端を脱リン酸化す
るステップと、（ｃ） 別に、対象生物の染色体由来の
ＤＮＡを前記制限酵素と同じ制限酵素で切断してＤＮＡ
断片混合物を得るステップと、（ｄ） ステップ（ｂ）
で得られた脱リン酸化ＤＮＡとステップ（ｃ）で得られ
たＤＮＡ断片混合物とを用いてライゲーションを行い連
結ＤＮＡの混合物を得るステップと、（ｅ） 得られた
連結ＤＮＡの混合物を鋳型とし、任意のプライマーを用
いてＰＣＲを行って連結ＤＮＡを増幅するステップと、
（ｆ） 得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターに
組み込んでコンピテントな細胞に導入するステップとを
含む、遺伝子断片のクローニング方法を提供する。
【０００６】 本方法によれば、ＰＣＲに用いた任意の
プライマーに相当する塩基配列を５’末端に含み、３’
末端側には、用いた制限酵素切断部位でプラスミド由来
のベクターＤＮＡ、例えばｐＵＣ由来のベクターＤＮＡ
配列が連結した形で、対象生物の染色体由来の複数のＤ
ＮＡ配列を、同時に且つ極めて簡単にクローニングする
ことができる。この方法でクローニングされた未知遺伝
子は、従って、同じプライマーを用いて容易に塩基配列
決定を行うことができるため、未知遺伝子の塩基配列決
定を容易にし、種々の疾患の研究や治療薬の開発等のた
めの遺伝子検索の手段として極めて有用である。
プライマーに相当する塩基配列を５’末端に含み、３’
末端側には、用いた制限酵素切断部位でプラスミド由来
のベクターＤＮＡ、例えばｐＵＣ由来のベクターＤＮＡ
配列が連結した形で、対象生物の染色体由来の複数のＤ
ＮＡ配列を、同時に且つ極めて簡単にクローニングする
ことができる。この方法でクローニングされた未知遺伝
子は、従って、同じプライマーを用いて容易に塩基配列
決定を行うことができるため、未知遺伝子の塩基配列決
定を容易にし、種々の疾患の研究や治療薬の開発等のた
めの遺伝子検索の手段として極めて有用である。
【０００７】 また、上記検討において、Streptococcu
s zooepidemicusのゲノムＤＮＡを抽出し、任意プライ
マーを用いて本発明の方法によりクローニングを行うこ
とによって、配列表の配列番号１で示される、デオキシ
グアノシンキナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼ類似
の塩基配列を有するＤＮＡ断片が得られた。
s zooepidemicusのゲノムＤＮＡを抽出し、任意プライ
マーを用いて本発明の方法によりクローニングを行うこ
とによって、配列表の配列番号１で示される、デオキシ
グアノシンキナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼ類似
の塩基配列を有するＤＮＡ断片が得られた。
【０００８】 すなわち本発明は、配列表の配列番号１
で示された塩基配列を有するＤＮＡ、及びこれより推定
された配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタン
パク質を提供する。
で示された塩基配列を有するＤＮＡ、及びこれより推定
された配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタン
パク質を提供する。
【０００９】 更にまた、Streptococcus zooepidemicu
sのゲノムＤＮＡを抽出し、別の任意プライマーを用い
て本発明の方法によりクローニングを行うことによっ
て、配列表の配列番号３で示される、ヒドロキシミリス
トイル−（アシルキャリアータンパク質）デヒドラター
ゼ及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット
（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）類似の塩基
配列を有するＤＮＡ断片が得られた。
sのゲノムＤＮＡを抽出し、別の任意プライマーを用い
て本発明の方法によりクローニングを行うことによっ
て、配列表の配列番号３で示される、ヒドロキシミリス
トイル−（アシルキャリアータンパク質）デヒドラター
ゼ及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット
（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）類似の塩基
配列を有するＤＮＡ断片が得られた。
【００１０】 すなわち本発明は、配列表の配列番号３
で示された塩基配列を有するＤＮＡ、及びこれより推定
された配列番号４又は５に示されたアミノ酸配列を有す
るタンパク質をも提供する。
で示された塩基配列を有するＤＮＡ、及びこれより推定
された配列番号４又は５に示されたアミノ酸配列を有す
るタンパク質をも提供する。
【００１１】 更に、本発明は、上記塩基配列（配列表
において配列番号１又は３で示される）を有するＤＮＡ
の何れかを含んだ発現ベクターをも提供する。
において配列番号１又は３で示される）を有するＤＮＡ
の何れかを含んだ発現ベクターをも提供する。
【００１２】 また更に、本発明は、上記発現ベクター
によって形質転換された宿主細胞をも提供する。
によって形質転換された宿主細胞をも提供する。
【００１３】 加えて、本発明は、配列番号２、４及び
５で示される上記アミノ酸配列の何れかを有するタンパ
ク質に対する、抗体をも提供する。
５で示される上記アミノ酸配列の何れかを有するタンパ
ク質に対する、抗体をも提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の方法において検索の対象
とする染色体由来のＤＮＡは、真核細胞、原核細胞を問
わず、如何なる染色体由来ＤＮＡであってもよい。染色
体由来ＤＮＡの抽出は、当業者に周知の方法で行えばよ
い。プラスミド由来のベクターとしては、例えばｐＵＣ
由来のベクター、そのうち例えば、pUC18その他、種々
のものを用いてよい。また用いるベクター及び染色体由
来ＤＮＡを切断するための制限酵素としては、EcoRIそ
の他、種々のものを用いることができる。プライマーと
して用いるＤＮＡ断片は、任意のものであってよく、長
さも適宜設定すればよいが、通常便宜的には、例えば１
７塩基〜３０塩基程度とすればよい。クローニングベク
ターに組み込んでコンピテントな細胞中にクローニング
した後は、ＤＮＡを抽出し同一のプライマーを用いてＰ
ＣＲを行うことにより挿入断片の存在が確認できる。確
認後は、周知の方法により、挿入断片の塩基配列を決定
すればよい。
とする染色体由来のＤＮＡは、真核細胞、原核細胞を問
わず、如何なる染色体由来ＤＮＡであってもよい。染色
体由来ＤＮＡの抽出は、当業者に周知の方法で行えばよ
い。プラスミド由来のベクターとしては、例えばｐＵＣ
由来のベクター、そのうち例えば、pUC18その他、種々
のものを用いてよい。また用いるベクター及び染色体由
来ＤＮＡを切断するための制限酵素としては、EcoRIそ
の他、種々のものを用いることができる。プライマーと
して用いるＤＮＡ断片は、任意のものであってよく、長
さも適宜設定すればよいが、通常便宜的には、例えば１
７塩基〜３０塩基程度とすればよい。クローニングベク
ターに組み込んでコンピテントな細胞中にクローニング
した後は、ＤＮＡを抽出し同一のプライマーを用いてＰ
ＣＲを行うことにより挿入断片の存在が確認できる。確
認後は、周知の方法により、挿入断片の塩基配列を決定
すればよい。
【００１５】 これらの方法で得られた種々の変異型を
含む所望の遺伝子を発現可能なプラスミドやベクターの
作製方法は、当業者に周知である。すなわち、制限酵素
とリガーゼとの組合わせを用いて、所望の遺伝子含んだ
ＤＮＡを発現ベクターＤＮＡに挿入することにより、所
望の遺伝子を含んだ組換えプラスミドを容易に構築する
ことができる。得られた組換えプラスミドを種々の細胞
に導入することにより細胞をトランスフェクションし形
質転換細胞を作製することができる。細胞としては、大
腸菌などの原核生物から、酵母や昆虫、植物や動物細胞
も利用することができる。本発明において、「宿主細
胞」には、これら原核細胞及び真核細胞の何れも包含さ
れる。 ［参考文献： Vectors essential data. Gacesa P. an
d Ramji D.P. 166 pages. BIOS Scientific Publishers
Limited 1994., John Wiley & Sons in association w
ith BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vec
tors, pages 9-12.］
含む所望の遺伝子を発現可能なプラスミドやベクターの
作製方法は、当業者に周知である。すなわち、制限酵素
とリガーゼとの組合わせを用いて、所望の遺伝子含んだ
ＤＮＡを発現ベクターＤＮＡに挿入することにより、所
望の遺伝子を含んだ組換えプラスミドを容易に構築する
ことができる。得られた組換えプラスミドを種々の細胞
に導入することにより細胞をトランスフェクションし形
質転換細胞を作製することができる。細胞としては、大
腸菌などの原核生物から、酵母や昆虫、植物や動物細胞
も利用することができる。本発明において、「宿主細
胞」には、これら原核細胞及び真核細胞の何れも包含さ
れる。 ［参考文献： Vectors essential data. Gacesa P. an
d Ramji D.P. 166 pages. BIOS Scientific Publishers
Limited 1994., John Wiley & Sons in association w
ith BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vec
tors, pages 9-12.］
【００１６】 宿主細胞への組換えプラスミドの導入
は、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法によ
り行うことができる。塩化カルシウム法は効率的なトラ
ンスホーメイションを与え、特別な装置を必要としな
い。より高い効率を求めるならば、エレクトロポレーシ
ョン法が用いられるべきである。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolo
gy. 3 vols. Edited byAusubel F.M. et al., John Wil
ey & Sons, Inc., Current Protocols.Vol.1, unit 1.
8: Introduction of plasmid DNA into cells, pages
1.8.1-1.8.10.］
は、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法によ
り行うことができる。塩化カルシウム法は効率的なトラ
ンスホーメイションを与え、特別な装置を必要としな
い。より高い効率を求めるならば、エレクトロポレーシ
ョン法が用いられるべきである。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolo
gy. 3 vols. Edited byAusubel F.M. et al., John Wil
ey & Sons, Inc., Current Protocols.Vol.1, unit 1.
8: Introduction of plasmid DNA into cells, pages
1.8.1-1.8.10.］
【００１７】動物細胞系で通常行われるトランスフェク
ションには、一過性のものと安定で永久的なものとの２
通りが知られている。一過性のトランスフェクションで
は、形質転換細胞を１〜４日間培養してトランスフェク
トした遺伝子の転写、複製を起こさせた後、細胞を回収
してＤＮＡ分析を行なう。代わりに、多くの研究では、
トランスフェクト遺伝子を染色体遺伝子に組み込む安定
型の形質転換細胞系を作製している。トランスフェクシ
ョン法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポソーム触媒法などが用いられる。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wil
ey & Son,Inc., Current Protocols. Vol.1, chapter
9: Introduction of DNA into mammalian cells, pages
9.0.1-9.17.3.］
ションには、一過性のものと安定で永久的なものとの２
通りが知られている。一過性のトランスフェクションで
は、形質転換細胞を１〜４日間培養してトランスフェク
トした遺伝子の転写、複製を起こさせた後、細胞を回収
してＤＮＡ分析を行なう。代わりに、多くの研究では、
トランスフェクト遺伝子を染色体遺伝子に組み込む安定
型の形質転換細胞系を作製している。トランスフェクシ
ョン法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポソーム触媒法などが用いられる。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wil
ey & Son,Inc., Current Protocols. Vol.1, chapter
9: Introduction of DNA into mammalian cells, pages
9.0.1-9.17.3.］
【００１８】本発明の遺伝子について、それがコードす
るタンパク質（ポリペプチド）及びその断片や類似体に
対するポリクローナルやモノクローナル抗体の作成も当
該分野において周知の技術を用いて容易に行なうことが
できる。作製された抗体は研究試薬や本遺伝子の関連す
る疾患の診断薬として利用可能である。また、得られた
抗体は抗体カラムの作製、免疫沈殿法、更にはウェスタ
ンブロッティングによる抗原の同定その他に広く利用で
きる。本発明において、「抗体」には、モノクローナル
抗体及びポリクローナル抗体が包含される。
るタンパク質（ポリペプチド）及びその断片や類似体に
対するポリクローナルやモノクローナル抗体の作成も当
該分野において周知の技術を用いて容易に行なうことが
できる。作製された抗体は研究試薬や本遺伝子の関連す
る疾患の診断薬として利用可能である。また、得られた
抗体は抗体カラムの作製、免疫沈殿法、更にはウェスタ
ンブロッティングによる抗原の同定その他に広く利用で
きる。本発明において、「抗体」には、モノクローナル
抗体及びポリクローナル抗体が包含される。
【００１９】本発明の遺伝子がコードするタンパク質に
対するミリグラムレベルのモノクローナル抗体の一般的
作製法は、次の通りである。すなわち、抗原タンパク質
をマウスに接種して免疫し、十分な抗体タイターを示す
マウスから脾臓を除去する。脾臓細胞を分離して脾臓Ｂ
細胞を選択し、Ｂ細胞起源の骨髄腫細胞に融合し、抗体
を分泌するハイブリドーマ細胞を構築し、ハイブリドー
マ細胞から分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養
液からアフィニティーカラム、イオン交換法、ゲル濾過
等を用いて精製する。また、一般的な方法で本発明物質
のポリクローナル抗体をも製造できる。すなわち、免疫
動物としてはウサギ、ウマ、マウス、モルモットなどを
用い、当業者に既知の種々のスケジュールで抗原タンパ
ク質を接種して免疫し、採血した血清から免疫グロブリ
ンＧなどを単離する。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al. John Wile
y & Sons, Inc., Current Protocols. Vol.2, chapter
11: Immunology, pages 11.0.1-11.16.13.］
対するミリグラムレベルのモノクローナル抗体の一般的
作製法は、次の通りである。すなわち、抗原タンパク質
をマウスに接種して免疫し、十分な抗体タイターを示す
マウスから脾臓を除去する。脾臓細胞を分離して脾臓Ｂ
細胞を選択し、Ｂ細胞起源の骨髄腫細胞に融合し、抗体
を分泌するハイブリドーマ細胞を構築し、ハイブリドー
マ細胞から分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養
液からアフィニティーカラム、イオン交換法、ゲル濾過
等を用いて精製する。また、一般的な方法で本発明物質
のポリクローナル抗体をも製造できる。すなわち、免疫
動物としてはウサギ、ウマ、マウス、モルモットなどを
用い、当業者に既知の種々のスケジュールで抗原タンパ
ク質を接種して免疫し、採血した血清から免疫グロブリ
ンＧなどを単離する。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al. John Wile
y & Sons, Inc., Current Protocols. Vol.2, chapter
11: Immunology, pages 11.0.1-11.16.13.］
【００２０】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることは
意図しない。
明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることは
意図しない。
【００２１】＜実施例＞Streptococcus zooepidemicus
(S. zooepidemicus; a Lancefield group C streptococ
cus)（一般的にウマ等の動物に感染性を示す菌である）
由来のゲノム遺伝子を既知の方法で次のようにして抽出
した。すなわち、培養した菌（100ｍｌ）を遠心して集
め、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.
0）５ｍｌ、10％ＳＤＳ 0.25ｍｌ及び20ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼＫ 0.025ｍｌを加えて37℃にて45分間反応
させた。その後、５Ｍ NaCl 0.948ｍｌを加えて混合
し、更に0.7Ｍ NaClで溶かした10％臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム 0.8ｍｌを加えて65℃にて20分間
反応させた。このようにして得られた溶出液を等量の、
25：24：１の割合で調製したフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールで処理し、更にイソプロパノー
ル（0.6液量）を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを乾燥後、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ ED
TA、ｐＨ8.0）で適当な液量に調整した。残存ＲＮＡは
ＲＮaseを用いて分解した後、等量の、25：24：１の割
合で調製したフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコールで処理し、更にイソプロパノール（0.6液量）
を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを乾燥
後、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.0
（ＴＥ））で適当な量に調整した。
(S. zooepidemicus; a Lancefield group C streptococ
cus)（一般的にウマ等の動物に感染性を示す菌である）
由来のゲノム遺伝子を既知の方法で次のようにして抽出
した。すなわち、培養した菌（100ｍｌ）を遠心して集
め、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.
0）５ｍｌ、10％ＳＤＳ 0.25ｍｌ及び20ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼＫ 0.025ｍｌを加えて37℃にて45分間反応
させた。その後、５Ｍ NaCl 0.948ｍｌを加えて混合
し、更に0.7Ｍ NaClで溶かした10％臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム 0.8ｍｌを加えて65℃にて20分間
反応させた。このようにして得られた溶出液を等量の、
25：24：１の割合で調製したフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールで処理し、更にイソプロパノー
ル（0.6液量）を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを乾燥後、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ ED
TA、ｐＨ8.0）で適当な液量に調整した。残存ＲＮＡは
ＲＮaseを用いて分解した後、等量の、25：24：１の割
合で調製したフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコールで処理し、更にイソプロパノール（0.6液量）
を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを乾燥
後、緩衝液（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.0
（ＴＥ））で適当な量に調整した。
【００２２】 得られたＤＮＡを、次のようにして制限
酵素切断に付した。すなわち、約１μｇのＤＮＡに対
し、制限酵素 EcoRI（20〜30単位）及び10倍濃度の反応
緩衝液（500ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.5）、100ｍＭ MgC
l2、10ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、100ｍＭ N
aCl）５μｌを用い、最終液量50μｌになるように水
（滅菌蒸留水）を加え、37℃にて２時間反応させること
によりＤＮＡを切断した。
酵素切断に付した。すなわち、約１μｇのＤＮＡに対
し、制限酵素 EcoRI（20〜30単位）及び10倍濃度の反応
緩衝液（500ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.5）、100ｍＭ MgC
l2、10ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、100ｍＭ N
aCl）５μｌを用い、最終液量50μｌになるように水
（滅菌蒸留水）を加え、37℃にて２時間反応させること
によりＤＮＡを切断した。
【００２３】 反応終了後、反応液に１／10液量の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ5.4）及び2.5液量の冷エタノール
（99.5％）を添加混合し、混合液を−20℃の冷凍庫に一
晩放置し、解凍後、遠心して沈殿物を得、これを再度70
％エタノールで洗浄後、乾燥させ、50μｌの水で溶解
し、１μｇ／50μｌの濃度に調製した（エタノール沈
殿）。
酢酸ナトリウム（ｐＨ5.4）及び2.5液量の冷エタノール
（99.5％）を添加混合し、混合液を−20℃の冷凍庫に一
晩放置し、解凍後、遠心して沈殿物を得、これを再度70
％エタノールで洗浄後、乾燥させ、50μｌの水で溶解
し、１μｇ／50μｌの濃度に調製した（エタノール沈
殿）。
【００２４】 他方、１μｇのpUC18ベクターＤＮＡに
対して、制限酵素EcoRI(20〜30単位)及び10倍濃度の反
応緩衝液（500ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.5）、100ｍＭMgCl
2、10ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、100ｍＭ NaC
l）２μｌを用い、最終液量20μｌになるように滅菌蒸
留水を加え、37℃にて２時間反応させることによりＤＮ
Ａを切断した。
対して、制限酵素EcoRI(20〜30単位)及び10倍濃度の反
応緩衝液（500ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.5）、100ｍＭMgCl
2、10ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、100ｍＭ NaC
l）２μｌを用い、最終液量20μｌになるように滅菌蒸
留水を加え、37℃にて２時間反応させることによりＤＮ
Ａを切断した。
【００２５】 得られた反応液にウシ腸アルカリフォス
ファターゼ（20単位）を添加し、37℃にて２時間反応さ
せることにより、ＤＮＡ断片を脱リン酸化した。反応
後、等量の緩衝液で飽和したフェノールを添加して混合
し、遠心（２〜３回）した。水性部分に１／10液量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ5.4）及び2.5液量の冷エタノー
ル（99.5％）を混合し、混合液を−20℃の冷凍庫に一晩
放置し、解凍後、遠心して沈殿物を得、再度70％エタノ
ールで洗浄後、乾燥させ、50μｌの滅菌蒸留水で溶解し
た。
ファターゼ（20単位）を添加し、37℃にて２時間反応さ
せることにより、ＤＮＡ断片を脱リン酸化した。反応
後、等量の緩衝液で飽和したフェノールを添加して混合
し、遠心（２〜３回）した。水性部分に１／10液量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ5.4）及び2.5液量の冷エタノー
ル（99.5％）を混合し、混合液を−20℃の冷凍庫に一晩
放置し、解凍後、遠心して沈殿物を得、再度70％エタノ
ールで洗浄後、乾燥させ、50μｌの滅菌蒸留水で溶解し
た。
【００２６】 共に制限酵素で切断した上記ゲノム遺伝
子約0.4μｇと上記pUC18ＤＮＡ0.125μｇとを、T4 ＤＮ
Ａリガーゼ（300〜400単位）１μｌ及び10倍濃度の反応
緩衝液（660ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.6）、66ｍＭ MgC
l2、100ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ MATP）５μｌを用いて、
最終液量50μｌになるように滅菌蒸留水を加え、16℃に
て一晩反応させることにより連結させた。
子約0.4μｇと上記pUC18ＤＮＡ0.125μｇとを、T4 ＤＮ
Ａリガーゼ（300〜400単位）１μｌ及び10倍濃度の反応
緩衝液（660ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ7.6）、66ｍＭ MgC
l2、100ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ MATP）５μｌを用いて、
最終液量50μｌになるように滅菌蒸留水を加え、16℃に
て一晩反応させることにより連結させた。
【００２７】 このライゲーション溶液を利用し、任意
のプライマーとして、配列表の配列番号６に示した塩基
配列を有するプライマーRV（国際試薬（株）より入
手）、及び、配列表の配列番号７に示した塩基配列を有
するプライマーmgaF417（国際試薬（株）より入手）を
選び、これら用いてＰＣＲを行った。すなわち、上記ラ
イゲーション溶液を５μｌ、20 pmolのプライマーRV及
びmgaF417（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.0
（ＴＥ）の緩衝液中、それぞれ20ｐmol／μｌの濃度と
なるよう調製）を各１μｌ、0.2 ｍＭのデオキシリボヌ
クレオチドトリフォスフェート酸混合物（４種類のｄＮ
ＴＰの水溶液各２ｍｌより構成）を８μｌ、Taqポリメ
ラーゼ（0.5単位）を0.5μｌ、10倍濃度の反応緩衝液
（100ｍＭTris-HCl（ｐＨ8.3）、500ｍＭ KCl、15ｍＭ
MgCl2、0.01％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）を10 μｌ、25 ｍ
ＭのMgCl2を６μｌ加えた後、最終液量100μｌになるよ
うに滅菌蒸留水を加え、２滴のミネラルオイルを滴下し
た。ＰＣＲサイクル条件は、変性（94℃、30秒）、アニ
ーリング（55℃、２分）、伸長（78℃、２分）の反復３
０回とした。
のプライマーとして、配列表の配列番号６に示した塩基
配列を有するプライマーRV（国際試薬（株）より入
手）、及び、配列表の配列番号７に示した塩基配列を有
するプライマーmgaF417（国際試薬（株）より入手）を
選び、これら用いてＰＣＲを行った。すなわち、上記ラ
イゲーション溶液を５μｌ、20 pmolのプライマーRV及
びmgaF417（10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ8.0
（ＴＥ）の緩衝液中、それぞれ20ｐmol／μｌの濃度と
なるよう調製）を各１μｌ、0.2 ｍＭのデオキシリボヌ
クレオチドトリフォスフェート酸混合物（４種類のｄＮ
ＴＰの水溶液各２ｍｌより構成）を８μｌ、Taqポリメ
ラーゼ（0.5単位）を0.5μｌ、10倍濃度の反応緩衝液
（100ｍＭTris-HCl（ｐＨ8.3）、500ｍＭ KCl、15ｍＭ
MgCl2、0.01％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）を10 μｌ、25 ｍ
ＭのMgCl2を６μｌ加えた後、最終液量100μｌになるよ
うに滅菌蒸留水を加え、２滴のミネラルオイルを滴下し
た。ＰＣＲサイクル条件は、変性（94℃、30秒）、アニ
ーリング（55℃、２分）、伸長（78℃、２分）の反復３
０回とした。
【００２８】 得られたＰＣＲ産物を次のようにして直
接、市販のＴＡクローニングベクターにライゲーション
した。すなわち、滅菌蒸留水を５μｌ、10倍濃度ライゲ
ーション緩衝液（100ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ8.3）、500ｍ
Ｍ KCl、25ｍＭ MgCl2、0.01％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）を
１μｌ、ＴＡクローニングベクター（pCR2.1；Invitrog
en社：10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８中の緩衝
液中、25ｎｇ／ｍｌの濃度に含有）を１μｌ、前記ＰＣ
Ｒ産物を１μｌ、T4 ＤＮＡリガーゼを１μｌ混合し、
混合物を14℃にて４時間以上反応させた。
接、市販のＴＡクローニングベクターにライゲーション
した。すなわち、滅菌蒸留水を５μｌ、10倍濃度ライゲ
ーション緩衝液（100ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ8.3）、500ｍ
Ｍ KCl、25ｍＭ MgCl2、0.01％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）を
１μｌ、ＴＡクローニングベクター（pCR2.1；Invitrog
en社：10ｍＭ Tris-HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８中の緩衝
液中、25ｎｇ／ｍｌの濃度に含有）を１μｌ、前記ＰＣ
Ｒ産物を１μｌ、T4 ＤＮＡリガーゼを１μｌ混合し、
混合物を14℃にて４時間以上反応させた。
【００２９】 得られたライゲーション反応液を用い、
コンピテント細胞に導入してクローニング及び形質転換
細胞の選択を行った。すなわち、TOP10F7（Invitrogen
社）のコンピテント細胞（濃度：１×108個／ｍｌ）50
μｌに、0.5Ｍ 2-ME（２−メルカプトエタノール）２μ
ｌを加えて混合し、更にライゲーション反応液２μｌを
加え、氷上に30分間放置した。その後、42℃で30秒間反
応させ、その反応液を氷上に２分間放置した。この反応
液にＳＯＣ培地（２％Tryptone、0.5％イーストエキ
ス、10ｍＭ NaCl、2.5ｍＭ KCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ
MgSO4、20ｍＭグルコース）を250μｌ加え、37℃にて
１時間反応させた後、反応液50〜100μｌを、X-gal（濃
度：40ｍｇ／ｍｌ）40μｌ、IPTG（濃度：23.8ｍｇ／ｍ
ｌ）40μｌを事前に含有させてあるカナマイシン（50μ
ｇ／ｍｌ）を含有したＬＢプレート（1.0 Tryptone、0.
5％イーストエキス、1.0％NaCl）に播いた。37℃にて一
晩反応させた後、白いコロニーを選んだ。
コンピテント細胞に導入してクローニング及び形質転換
細胞の選択を行った。すなわち、TOP10F7（Invitrogen
社）のコンピテント細胞（濃度：１×108個／ｍｌ）50
μｌに、0.5Ｍ 2-ME（２−メルカプトエタノール）２μ
ｌを加えて混合し、更にライゲーション反応液２μｌを
加え、氷上に30分間放置した。その後、42℃で30秒間反
応させ、その反応液を氷上に２分間放置した。この反応
液にＳＯＣ培地（２％Tryptone、0.5％イーストエキ
ス、10ｍＭ NaCl、2.5ｍＭ KCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ
MgSO4、20ｍＭグルコース）を250μｌ加え、37℃にて
１時間反応させた後、反応液50〜100μｌを、X-gal（濃
度：40ｍｇ／ｍｌ）40μｌ、IPTG（濃度：23.8ｍｇ／ｍ
ｌ）40μｌを事前に含有させてあるカナマイシン（50μ
ｇ／ｍｌ）を含有したＬＢプレート（1.0 Tryptone、0.
5％イーストエキス、1.0％NaCl）に播いた。37℃にて一
晩反応させた後、白いコロニーを選んだ。
【００３０】 形質転換細胞につき、挿入物が導入され
ているか否かにつき、同じプライマー（RV及びmgaF41
7）を用いてＰＣＲを行った結果、３１種類のクローン
が見出された。それらのうちサイズの異なる１０種類に
ついて塩基配列決定を行った。その結果、挿入断片は、
その５’末端及び３’末端の塩基配列により、２種類の
グループに分けられた。最初のグループは、５’末端が
RVと同じ配列を示し、３’末端はｐＣＵ１８由来の断片
（EcoRIの切断部位を含む）の塩基配列を示すグループ
（８クローン）、他のグループは、５’末端がmgaF417
と同じ配列を示し、３’末端がｐＵＣ由来の断片（EcoR
Iの切断部位を含む）の塩基配列を示すグループ（２ク
ローン）に分類できた。
ているか否かにつき、同じプライマー（RV及びmgaF41
7）を用いてＰＣＲを行った結果、３１種類のクローン
が見出された。それらのうちサイズの異なる１０種類に
ついて塩基配列決定を行った。その結果、挿入断片は、
その５’末端及び３’末端の塩基配列により、２種類の
グループに分けられた。最初のグループは、５’末端が
RVと同じ配列を示し、３’末端はｐＣＵ１８由来の断片
（EcoRIの切断部位を含む）の塩基配列を示すグループ
（８クローン）、他のグループは、５’末端がmgaF417
と同じ配列を示し、３’末端がｐＵＣ由来の断片（EcoR
Iの切断部位を含む）の塩基配列を示すグループ（２ク
ローン）に分類できた。
【００３１】 上記で得られたクローンのうち、５’末
端がRVと同じ配列を示し３’末端側にはpUC18由来の断
片（EcoRIの切断部位を含む）の塩基配列を示すものの
代表的なクローンについて、該クローンに含まれている
Streptococcus zooepidemicusの染色体由来のＤＮＡの
塩基配列部分を、配列表の配列番号１に示す。該塩基配
列部分の５’末端側にはプライマーRVと同一の塩基配列
が連結している。また３’末端側に示されているグアニ
ン（g）は、制限酵素EcoRIの認識配列である「gaattc」
の５’側のグアニン（g）であり、これに残りの配列「a
attc」を介してpUC18由来の塩基配列が下流に連結する
ことによって、配列番号３で示した塩基配列部分の３’
末端側とこのpUC18由来の塩基配列との接続部位は、制
限酵素EcoRI切断部位を構成している。
端がRVと同じ配列を示し３’末端側にはpUC18由来の断
片（EcoRIの切断部位を含む）の塩基配列を示すものの
代表的なクローンについて、該クローンに含まれている
Streptococcus zooepidemicusの染色体由来のＤＮＡの
塩基配列部分を、配列表の配列番号１に示す。該塩基配
列部分の５’末端側にはプライマーRVと同一の塩基配列
が連結している。また３’末端側に示されているグアニ
ン（g）は、制限酵素EcoRIの認識配列である「gaattc」
の５’側のグアニン（g）であり、これに残りの配列「a
attc」を介してpUC18由来の塩基配列が下流に連結する
ことによって、配列番号３で示した塩基配列部分の３’
末端側とこのpUC18由来の塩基配列との接続部位は、制
限酵素EcoRI切断部位を構成している。
【００３２】 Streptococcus zooepidemicusの染色体
由来の該ＤＮＡ該塩基配列部分を基に予測した予測した
部分アミノ酸配列を、配列表の配列番号２に示す。この
部分アミノ酸配列につきBLAST（Basic Local Alignment
Search Tool）ソフトウェアにより相同性検索を行った
ところ、デオキシグアノシンキナーゼ／デオキシアデノ
シンキナーゼ サブユニット２（デオキシグアノシンキ
ナーゼ）（Lactobacillus acidphilus）と205残基中115
残基（56％）、デオキシグアノシンキナーゼ／デオキシ
アデノシンキナーゼ サブユニット１（デオキシアデノ
シンキナーゼ）（Lactobacillus acidphilus）と199残
基中104残基(52％)が同じであった。しかも、ＡＴＰ結
合部位に特徴的なグリシン・リッチな配列（ＩＧＡＧＫ
ＳＳＬ）、核酸結合部位に関連するＤＲＦモチーフ及び
ＡＴＰホスフェート基の結合に関与していると考えられ
ているアルギニン・リッチな部位（ＲＩＥＫＲＧＲ）が
存在することが判明した。これらのことから、このS. z
ooepidemicus由来の遺伝子フラグメントは、デオキシグ
アノシンキナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼに似た
遺伝子であると考えられる。従来から、抗白血病化学療
法剤として使用されている核酸類縁体は、細胞内のデオ
キシリボヌクレオシドキナーゼによりリン酸化され、Ｄ
ＮＡ合成を抑制する。最近、Chaoyong, Zhu等（1998,
J. Biol. Chem., vol. 273, pp.14707-14711）は、ミト
コンドリアのデオキシグアノシンキナーゼを癌細胞内で
過剰発現させ、核酸類縁体［（２−クロロ−２’−デオ
キシアデノシン（CdA）、９−β−Ｄ−アラビノフラノ
シルグアニン（araG）、２’，２’−ジフルオロデオキ
シグアノシン（dFdG）］の癌細胞に対する細胞毒性を増
強させることを報告している。これらに照らし、上記で
得られた、S. zooepidemicus由来のデオキシグアノシン
キナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼ類似遺伝子も、
類似の機能を有すると期待される。
由来の該ＤＮＡ該塩基配列部分を基に予測した予測した
部分アミノ酸配列を、配列表の配列番号２に示す。この
部分アミノ酸配列につきBLAST（Basic Local Alignment
Search Tool）ソフトウェアにより相同性検索を行った
ところ、デオキシグアノシンキナーゼ／デオキシアデノ
シンキナーゼ サブユニット２（デオキシグアノシンキ
ナーゼ）（Lactobacillus acidphilus）と205残基中115
残基（56％）、デオキシグアノシンキナーゼ／デオキシ
アデノシンキナーゼ サブユニット１（デオキシアデノ
シンキナーゼ）（Lactobacillus acidphilus）と199残
基中104残基(52％)が同じであった。しかも、ＡＴＰ結
合部位に特徴的なグリシン・リッチな配列（ＩＧＡＧＫ
ＳＳＬ）、核酸結合部位に関連するＤＲＦモチーフ及び
ＡＴＰホスフェート基の結合に関与していると考えられ
ているアルギニン・リッチな部位（ＲＩＥＫＲＧＲ）が
存在することが判明した。これらのことから、このS. z
ooepidemicus由来の遺伝子フラグメントは、デオキシグ
アノシンキナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼに似た
遺伝子であると考えられる。従来から、抗白血病化学療
法剤として使用されている核酸類縁体は、細胞内のデオ
キシリボヌクレオシドキナーゼによりリン酸化され、Ｄ
ＮＡ合成を抑制する。最近、Chaoyong, Zhu等（1998,
J. Biol. Chem., vol. 273, pp.14707-14711）は、ミト
コンドリアのデオキシグアノシンキナーゼを癌細胞内で
過剰発現させ、核酸類縁体［（２−クロロ−２’−デオ
キシアデノシン（CdA）、９−β−Ｄ−アラビノフラノ
シルグアニン（araG）、２’，２’−ジフルオロデオキ
シグアノシン（dFdG）］の癌細胞に対する細胞毒性を増
強させることを報告している。これらに照らし、上記で
得られた、S. zooepidemicus由来のデオキシグアノシン
キナーゼ／デオキシアデノシンキナーゼ類似遺伝子も、
類似の機能を有すると期待される。
【００３３】 前記のクローニングで得られたクローン
のうち、５’末端がmgaF417と同じ配列を示し３’末端
側にはpUC18由来の断片（EcoRIの切断部位を含む）の塩
基配列を示すものの代表的なクローンについて、該クロ
ーンに含まれているStreptococcus zooepidemicusの染
色体由来のＤＮＡの塩基配列部分を、配列表の配列番号
３に示す。該塩基配列部分の５’末端側にはプライマー
mgaF417と同一の塩基配列が連結している。また３’末
端側に示されている配列「gaattc」は、制限酵素EcoRI
の認識配列であり、これを介してpUC18由来の塩基配列
が下流に連結することにより、配列番号３に示した塩基
配列部分の３’末端側とこのpUC18由来の塩基配列との
接続部位は、制限酵素EcoRI切断部位を構成している。
のうち、５’末端がmgaF417と同じ配列を示し３’末端
側にはpUC18由来の断片（EcoRIの切断部位を含む）の塩
基配列を示すものの代表的なクローンについて、該クロ
ーンに含まれているStreptococcus zooepidemicusの染
色体由来のＤＮＡの塩基配列部分を、配列表の配列番号
３に示す。該塩基配列部分の５’末端側にはプライマー
mgaF417と同一の塩基配列が連結している。また３’末
端側に示されている配列「gaattc」は、制限酵素EcoRI
の認識配列であり、これを介してpUC18由来の塩基配列
が下流に連結することにより、配列番号３に示した塩基
配列部分の３’末端側とこのpUC18由来の塩基配列との
接続部位は、制限酵素EcoRI切断部位を構成している。
【００３４】 Streptococcus zooepidemicusの染色体
由来の該塩基配列部分を基に予測した２つの部分アミノ
酸配列を、配列表の配列番号４及び５にそれぞれに示
す。これらの部分アミノ酸配列につきBLAST（Basic Loc
al Alignment Search Tool）ソフトウェアにより相同性
検索を行ったところ、配列番号４で示したアミノ酸配列
は、ヒドロキシミリストイル−（アシルキャリアータン
パク質）デヒドラターゼ（Bacuillus subtilis）と121
残基中72残基（59％）が同じであり、配列番号５で示し
たアミノ酸配列は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサ
ブユニット（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）
とＮ末端の63残基中45残基（71％）が同じであった。こ
れらの結果は、配列番号３で示したS. zooepidemicus由
来の遺伝子断片が、ヒドロキシミリストイル−（アシル
キャリアータンパク質）デヒドラターゼ及びアセチルＣ
ｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ビオチンカルボキ
シラーゼサブユニット）類似の遺伝子断片であることを
示している。
由来の該塩基配列部分を基に予測した２つの部分アミノ
酸配列を、配列表の配列番号４及び５にそれぞれに示
す。これらの部分アミノ酸配列につきBLAST（Basic Loc
al Alignment Search Tool）ソフトウェアにより相同性
検索を行ったところ、配列番号４で示したアミノ酸配列
は、ヒドロキシミリストイル−（アシルキャリアータン
パク質）デヒドラターゼ（Bacuillus subtilis）と121
残基中72残基（59％）が同じであり、配列番号５で示し
たアミノ酸配列は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサ
ブユニット（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）
とＮ末端の63残基中45残基（71％）が同じであった。こ
れらの結果は、配列番号３で示したS. zooepidemicus由
来の遺伝子断片が、ヒドロキシミリストイル−（アシル
キャリアータンパク質）デヒドラターゼ及びアセチルＣ
ｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ビオチンカルボキ
シラーゼサブユニット）類似の遺伝子断片であることを
示している。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば新規遺伝子断片を簡便に
スクリーニングできるため、本発明は、治療薬開発のた
めの重要な遺伝子の検索を従来よりも容易且つ迅速に行
うことを可能にする。
スクリーニングできるため、本発明は、治療薬開発のた
めの重要な遺伝子の検索を従来よりも容易且つ迅速に行
うことを可能にする。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> A cloning method for DNA fragments using arbitrarily primed PCR <130> P54-99 <160> 7 <210> 1 <211> 627 <212> DNA <213> Streptococcus zooepidemicus <220> <221> CDS <222> (2)...(616) <400> 1 a atc ggc gca ggc aag agt tcc ctt gct gct gca ctg ggt gag cat tta 49 Ile Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Ala Ala Ala Leu Gly Glu His Leu 1 5 10 15 gga aca gag gta ttt tac gag gct gtt gat aac aat cct gtt ctt gat 97 Gly Thr Glu Val Phe Tyr Glu Ala Val Asp Asn Asn Pro Val Leu Asp 20 25 30 ctg tat tac caa gac cct aaa aaa tat gcc ttt tta ttg caa att ttc 145 Leu Tyr Tyr Gln Asp Pro Lys Lys Tyr Ala Phe Leu Leu Gln Ile Phe 35 40 45 ttt ttg aat aag cgc ttc aaa tct att aaa gag cct atc cag gca gac 193 Phe Leu Asn Lys Arg Phe Lys Ser Ile Lys Glu Pro Ile Gln Ala Asp 50 55 60 aat aat att ctt gac cgc tca atc ttt gaa gat gag ctc ttc ttg aca 241 Asn Asn Ile Leu Asp Arg Ser Ile Phe Glu Asp Glu Leu Phe Leu Thr 65 70 75 80 ctt aac tat aaa aat gga aat gtt acc aag aca gat ctt gaa att tac 289 Leu Asn Tyr Lys Asn Gly Asn Val Thr Lys Thr Asp Leu Glu Ile Tyr 85 90 95 caa gag ctc tta gcc aat atg cta gag gag ctt gag gga atg cct aaa 337 Gln Glu Leu Leu Ala Asn Met Leu Glu Glu Leu Glu Gly Met Pro Lys 100 105 110 aaa cgt cct gac ctg ctg att tat att gat gtc tcc ttt gag aag atg 385 Lys Arg Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Ile Asp Val Ser Phe Glu Lys Met 115 120 125 cta gag cgc att gaa aag cgt ggc agg cgg ttc gag cag gtt gat gac 433 Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Gly Arg Arg Phe Glu Gln Val Asp Asp 130 135 140 aat cct gac cta gag gcc tat tac cat cag gta cat ggc gaa tac cca 481 Asn Pro Asp Leu Glu Ala Tyr Tyr His Gln Val His Gly Glu Tyr Pro 145 150 155 160 acc tgg tac gag cgt tat gac gtc tca cct aag atg agg att gat gga 529 Thr Trp Tyr Glu Arg Tyr Asp Val Ser Pro Lys Met Arg Ile Asp Gly 165 170 175 aac aag ctt gat ttt gtg caa aac cca gag gat ctg gca acc gtc ctg 577 Asn Lys Leu Asp Phe Val Gln Asn Pro Glu Asp Leu Ala Thr Val Leu 180 185 190 caa atg att gat gaa aag cta aaa acc tta gat tta ctg taaaaacaag g 627 Gln Met Ile Asp Glu Lys Leu Lys Thr Leu Asp Leu Leu 195 200 205 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Streptococcus zooepidemicus <400> 2 Ile Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Ala Ala Ala Leu Gly Glu His Leu 1 5 10 15 Gly Thr Glu Val Phe Tyr Glu Ala Val Asp Asn Asn Pro Val Leu Asp 20 25 30 Leu Tyr Tyr Gln Asp Pro Lys Lys Tyr Ala Phe Leu Leu Gln Ile Phe 35 40 45 Phe Leu Asn Lys Arg Phe Lys Ser Ile Lys Glu Pro Ile Gln Ala Asp 50 55 60 Asn Asn Ile Leu Asp Arg Ser Ile Phe Glu Asp Glu Leu Phe Leu Thr 65 70 75 80 Leu Asn Tyr Lys Asn Gly Asn Val Thr Lys Thr Asp Leu Glu Ile Tyr 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Ala Asn Met Leu Glu Glu Leu Glu Gly Met Pro Lys 100 105 110 Lys Arg Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Ile Asp Val Ser Phe Glu Lys Met 115 120 125 Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Gly Arg Arg Phe Glu Gln Val Asp Asp 130 135 140 Asn Pro Asp Leu Glu Ala Tyr Tyr His Gln Val His Gly Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Thr Trp Tyr Glu Arg Tyr Asp Val Ser Pro Lys Met Arg Ile Asp Gly 165 170 175 Asn Lys Leu Asp Phe Val Gln Asn Pro Glu Asp Leu Ala Thr Val Leu 180 185 190 Gln Met Ile Asp Glu Lys Leu Lys Thr Leu Asp Leu Leu 195 200 205 <210> 3 <211> 630 <212> DNA <213> Streptococcus zooepidemicus <220> <221> CDS <222> (1)...(402) <220> <221> CDS <222> (437)...(628) <400> 3 caa gaa gca ctg cca cat cgt tgc cca atg ctg ctt gtt gat agg att 48 Gln Glu Ala Leu Pro His Arg Cys Pro Met Leu Leu Val Asp Arg Ile 1 5 10 15 tta gag gct tca gac gat gaa att gtt gcc atc aaa aat gtc act atc 96 Leu Glu Ala Ser Asp Asp Glu Ile Val Ala Ile Lys Asn Val Thr Ile 20 25 30 aat gag ccc ttc ttt aac ggt cat ttt cct cag tat cca gtc atg cca 144 Asn Glu Pro Phe Phe Asn Gly His Phe Pro Gln Tyr Pro Val Met Pro 35 40 45 ggt gtt ttg atc atg gag gcc ttg gca caa act gct ggc gtc ttg gag 192 Gly Val Leu Ile Met Glu Ala Leu Ala Gln Thr Ala Gly Val Leu Glu 50 55 60 cta tca aaa gag gaa aat aaa ggc aag ctt gtt ttt tac gct ggt atg 240 Leu Ser Lys Glu Glu Asn Lys Gly Lys Leu Val Phe Tyr Ala Gly Met 65 70 75 80 gac aag gta gaa ttt aaa aag cag gtg gtt ccg gga gac cag cta gtc 288 Asp Lys Val Glu Phe Lys Lys Gln Val Val Pro Gly Asp Gln Leu Val 85 90 95 atg aca gct agg ttt att aag cgt cgt ggg aca ata gca gtt gtt gag 336 Met Thr Ala Arg Phe Ile Lys Arg Arg Gly Thr Ile Ala Val Val Glu 100 105 110 gcc aag gca gag gtt gat ggc aaa tta cca gct agt ggg acc ttg act 384 Ala Lys Ala Glu Val Asp Gly Lys Leu Pro Ala Ser Gly Thr Leu Thr 115 120 125 ttt gct ttt ggg cag taa aagactaatc gtctgtggag gaaaaaagaa acct atg 439 Phe Ala Phe Gly Gln Met 130 1 ttt aac aaa atc tta att ccc aat cgt ggt gaa ata tca gtg cgg att 487 Phe Asn Lys Ile Leu Ile Pro Asn Arg Gly Glu Ile Ser Val Arg Ile 5 10 15 att cgt gca gca cga gaa tta ggc att tcc aca gtt gct gtt tat tcc 535 Ile Arg Ala Ala Arg Glu Leu Gly Ile Ser Thr Val Ala Val Tyr Ser 20 25 30 gag gcc gat aaa gag gct tta cat acg atc ttg gca gac cag gcc atc 583 Glu Ala Asp Lys Glu Ala Leu His Thr Ile Leu Ala Asp Gln Ala Ile 35 40 45 tgt att gga ccg tca aga tca aag gaa tcc tat ctc cat atg aat tc 630 Cys Ile Gly Pro Ser Arg Ser Lys Glu Ser Tyr Leu His Met Asn 50 55 60 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Streptococcus zooepidemicus <400> 4 Gln Glu Ala Leu Pro His Arg Cys Pro Met Leu Leu Val Asp Arg Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ser Asp Asp Glu Ile Val Ala Ile Lys Asn Val Thr Ile 20 25 30 Asn Glu Pro Phe Phe Asn Gly His Phe Pro Gln Tyr Pro Val Met Pro 35 40 45 Gly Val Leu Ile Met Glu Ala Leu Ala Gln Thr Ala Gly Val Leu Glu 50 55 60 Leu Ser Lys Glu Glu Asn Lys Gly Lys Leu Val Phe Tyr Ala Gly Met 65 70 75 80 Asp Lys Val Glu Phe Lys Lys Gln Val Val Pro Gly Asp Gln Leu Val 85 90 95 Met Thr Ala Arg Phe Ile Lys Arg Arg Gly Thr Ile Ala Val Val Glu 100 105 110 Ala Lys Ala Glu Val Asp Gly Lys Leu Pro Ala Ser Gly Thr Leu Thr 115 120 125 Phe Ala Phe Gly Gln 130 <210> 5 <211> 64 <212> PRT <213> Streptococcus zooepidemicus <400> 5 Met Phe Asn Lys Ile Leu Ile Pro Asn Arg Gly Glu Ile Ser Val Arg 1 5 10 15 Ile Ile Arg Ala Ala Arg Glu Leu Gly Ile Ser Thr Val Ala Val Tyr 20 25 30 Ser Glu Ala Asp Lys Glu Ala Leu His Thr Ile Leu Ala Asp Gln Ala 35 40 45 Ile Cys Ile Gly Pro Ser Arg Ser Lys Glu Ser Tyr Leu His Met Asn 50 55 60 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Bacteriophage M13 <400> 6 caggaaacagctatgac 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 7 ggagatgaacaccagatt 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 BA08 BA10 BA80 CA01 CA20 DA06 EA04 FA10 GA11 GA19 GA27 HA19 4B065 AA01X AA26X AA49Y AA57X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA01 BB01 BC31 CA27 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA11 DA75 DA89 EA20 EA50 FA74
Claims (6)
- 【請求項１】（ａ） プラスミド由来のベクターＤＮＡ
を制限酵素で切断するステップと、（ｂ） 得られた切
断ＤＮＡの末端を脱リン酸化するステップと、（ｃ）
別に、対象生物の染色体由来のＤＮＡを前記制限酵素と
同じ制限酵素で切断してＤＮＡ断片混合物を得るステッ
プと、（ｄ） ステップ（ｂ）で得られた脱リン酸化Ｄ
ＮＡとステップ（ｃ）で得られたＤＮＡ断片混合物とを
用いてライゲーションを行い連結ＤＮＡの混合物を得る
ステップと、（ｅ） 得られた連結ＤＮＡの混合物を鋳
型とし、任意のプライマーを用いてＰＣＲを行って連結
ＤＮＡを増幅するステップと、（ｆ） 得られたＰＣＲ
産物をクローニングベクターに組み込んでコンピテント
な細胞に導入するステップとを含む、遺伝子断片のクロ
ーニング方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法によりStreptococcus zo
oepidemicusの染色体由来ＤＮＡより得ることのでき
る、配列表の配列番号１又は３に示す塩基配列を有する
ＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号２、４又は５に示すア
ミノ酸配列を有するタンパク質。 - 【請求項４】 請求項２の塩基配列を有するＤＮＡの何
れかを含んだ発現ベクター。 - 【請求項５】 請求項４の発現ベクターによって形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項３のアミノ酸配列の何れかを有す
るタンパク質に対する抗体。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP11064432A JP2000253885A (ja) | 1999-03-11 | 1999-03-11 | 任意プライマーｐｃｒを用いるｄｎａ断片クローニング方法 |
| EP00104485A EP1035202A3 (en) | 1999-03-11 | 2000-03-09 | A cloning method for DNA fragments using arbitrarily primed PCR |
| US09/738,769 US20020055148A1 (en) | 1999-03-11 | 2000-12-18 | Cloning method for DNA fragments using arbitrarily primed PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11064432A JP2000253885A (ja) | 1999-03-11 | 1999-03-11 | 任意プライマーｐｃｒを用いるｄｎａ断片クローニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000253885A true JP2000253885A (ja) | 2000-09-19 |
Family
ID=13258122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11064432A Withdrawn JP2000253885A (ja) | 1999-03-11 | 1999-03-11 | 任意プライマーｐｃｒを用いるｄｎａ断片クローニング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1035202A3 (ja) |
| JP (1) | JP2000253885A (ja) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1396540B1 (en) * | 1990-09-27 | 2007-02-07 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| US5731171A (en) * | 1993-07-23 | 1998-03-24 | Arch Development Corp. | Sequence independent amplification of DNA |
| US5849491A (en) * | 1995-09-22 | 1998-12-15 | Terragen Diversity Inc. | Method for isolating xylanase gene sequences from soil DNA, compositions useful in such method and compositions obtained thereby |
| AU3025597A (en) * | 1996-05-10 | 1997-12-05 | Novo Nordisk A/S | Method of providing novel dna sequences |
| AU6497296A (en) * | 1996-07-16 | 1998-02-09 | Periannan Senapathy | Method for contiguous genome sequencing |
-
1999
- 1999-03-11 JP JP11064432A patent/JP2000253885A/ja not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-03-09 EP EP00104485A patent/EP1035202A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1035202A2 (en) | 2000-09-13 |
| EP1035202A3 (en) | 2000-11-22 |
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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