JP4285767B2 - 熱安定性キシラナーゼ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規な微生物及び新規な酵素、特に熱安定性キシラナーゼに関する。
これらのキシラナーゼは、嫌気性好熱性バクテリアから得られ、紙・パルプ工業で使用される条件、即ちｐＨ９以上、温度７０℃以上の条件下で使用出来、この酵素は特に温度８０℃で活性である。
発明の背景
キシランは、植物ヘミセルロースの一構成成分であり、キシランは、１，４−グルコシド結合のβ−Ｄ−キシロース基質から成る。普通、キシランは、キシロース及び他のペントース、ヘキソース、ウロン酸及びアセチル基を含む側鎖又は基を有する。
紙の製造方法において、パルプの漂白は最も重要な工程である。紙・パルプ工業においてパルプ処理に使用される方法は、図式的には次の様に行われる。
パルプは、所謂酸素脱リグニン工程で、大部分のリグニンを除去する為に、ｐＨ１０〜１２で、温度８０℃で処理される。処理後のパルプは、２〜５％のリグニンを含む。このリグニンは、パルプを褐色にする。次いで、このパルプは、多段漂白方法で漂白される。この漂白方法で、塩素、二酸化塩素、過酸化水素及び／又はオゾンの様な化学物質が使用され、高品質紙の白色パルプが得られる。
塩素及び塩素含有化学物質は、この漂白方法でよく使用される。然しながら、これら化学物質の使用は、ダイオキシン及びその他の塩素化有機化合物を形成する事となり、それらは環境への脅威となる。それ故、この種の廃棄生成物を発生する化学物質の使用を制限する傾向が出てきている。
これは、無塩素方法、つまり完全無塩素（ＴＣＦ）及び基本的無塩素（ＥＣＦ）の方法の開発傾向を促進した。これらの方法では、過酸化水素又はオゾンが漂白の為に使用される。然しながら、これらの酸化化学物質の使用は、紙の品質、特に紙の強度においてマイナス効果を持つ可能性がある。
或る種の酵素は、漂白剤をより一層受容可能なパルプとし、それにより漂白量を減少させる事が分かっている。特に、キシラナーゼは、紙・パルプ処理において非常に有用である事が分かっている。キシラナーゼがパルプからのリグニンの抽出性を増大する事は報告されている。現在の方法では、キシラナーゼは、それらが酸素脱リグニンの際に使用される条件下では活性ではなく、生存しないので、酸素脱リグニン工程の後で使用されるのが殆どである。
キシラナーゼは、リグニンのセルロースの網目構造への密着に関与するヘミセルロース鎖を開裂する。キシラナーゼ処理後、リグニンは、次工程において一層容易に除去される。
それ故、キシラナーゼの使用は、２５〜３０％の予備漂白で、活性塩素の消費の減少につながる。塩素のこの減少は、得られる紙の品質係数に影響しない（Viikari et al., 1986. Proc. of the third Int. Conf. Biotechnology in Pulp and Paper Ind., Stockholm, p.67-69 and Bajpai and Bajpai. 1992. Process Biochemistry. 27: 319-325）。
又、キシラナーゼ処理は、漂白方法での他の化学物質、例えば過酸化水素の必要性を減少する。
クラフトパルプの漂白での菌源由来のキシラナーゼの使用が報告されている。それらは酸性キシラナーゼであり、この酵素の最適ｐＨ及び温度は、ｐＨ＝３〜５、温度＝３０〜５０℃である。これらの値は、効果的な条件が、ｐＨ≧９で温度≧７０℃である漂白方法での使用には理想的ではない。
最適な高いｐＨ及び／又は温度を持つバクテリア源由来のキシラナーゼが、漂白方法に使用される事は報告されている。これらの幾つかは、次の種由来のものである（括弧内は報告されたキシラナーゼ活性の最適ｐＨと温度である）：
バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）（pH=７〜９、温度＝４０℃，Nissen et al., 1992. Progress in Biotechnology 7: 325-337）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（pH＝７、温度＝６５℃、国際特許出願WO 91/10724）、ディクトボグロマス・サーモフィリウム（Dictvoglomus thermophirium）（pH=６〜８、温度＝７０℃、ヨーロッパ特許出願EPO 511933）、ロードサーマス（Rhodothermus）（pH=5.5〜6.5、温度=80〜100℃、ヨーロッパ特許出願EPO 538177）、サーモトーガ（Thermotoga）（pH=５〜６、温度＝９０℃、国際特許出願WO 93/19171）及びサーモアナエロバクテル・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus（温度=68℃、Deblois and Wiegel. 1992. Progress in Biotechnology 7: 487-490）。
漂白用としてこれらのキシラナーゼの幾つかの使用が請求されているが、≧80℃の温度で、顕著な脱リグニン活性として望ましい特性を有する事は、今日まで報告されていない。
発明の要約
本発明は、ニュージーランドの温泉から純粋培養で単離された嫌気性好熱性微生物から得られるキシラナーゼを開示する。この微生物は、1994年４月14日付けで、オランダ国のバルン（Baarn）の中央微生物寄託所（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）（CBS）に寄託された。
また、本発明は、少なくとも80℃の温度で相当なキシラナーゼ活性を有する酵素を開示する。更に、本発明は、前記キシラナーゼが、少なくとも80℃の温度で顕著な脱リグニン活性を有する事を開示する。前記酵素は寄託された株から得られる。
更に、本発明は、80℃の温度で活性なキシラナーゼの調製方法を開示する。この方法は、適当な培地での本発明の寄託微生物の培養と、次いで表示した活性を有するこの酵素の回収を含む。
又、本発明は、上記キシラナーゼをコードする遺伝子のクローニングを開示する。また、宿主細胞でのこれら遺伝子の発現が開示される。この酵素は、この方法で得られた時は略純粋である。この様に、また本発明は、キシラナーゼを得る為のその他の方法、即ち組み換えDNAの発現を開示する。
更に、本発明は、高温で、高いpHを使用する工業的適用条件に等しい条件下でのキシラナーゼの適用を開示する。
【図面の簡単な説明】
図１は、６つのエクストレモフィル株（extremophilic strains）の内部共通配列（internal consensus sequence）の系統分析を示す。配列は、次の順に命名される：微生物／前進プライマー／組み換え数。表示された枝番は、この配列のブーツストラップ分析（boot-strap analysis）から得た値である。
図２は、ファミリーＧの内部共通配列の順次配列を示す。
図３は、pJLA602中のSphl-BamHlフラグメントとして挿入されたTG456由来のxynDのキシラナーゼドメインを示す。
図４は、実施例１５で開示されている漂白された広葉樹パルプＴＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン−リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図５は、実施例１５で開示されている漂白された広葉樹パルプＥＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図６は、実施例１５で開示されている漂白された針葉樹パルプＴＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図７は、実施例１５で開示されている漂白された針葉樹パルプＥＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図８は、ＴＣＦ（Ａ）及びＥＣＦ（Ｂ）漂白広葉樹パルプ及びＴＣＦ（Ｃ）及びＥＣＦ（Ｄ）漂白針葉樹パルプの、実施例１５で決定される精製曲線を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。
図９は、TG456 xynDキシラナーゼと、パルプチームHB（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）の最適pH（A）と最適温度（B）との比較を示す。
図10は、80℃、pH7.0（A）と65℃、pH9.0（B）での、TG456 xynDキシラナーゼと、パルプチームHB（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）の熱安定性の比較を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ニュージーランドの温泉から単離された微生物を開示する。これら微生物は、嫌気性好熱性バクテリアとしての特徴を持ち、レイニイ（Rainey）（1992. PhD thesis, University of Waikato, Hamilton, New Zealand）によって分類された。
この微生物は、キシラン−アガー分散アッセイを使用して順次スクリーンされた。このテストで透明帯を示した株は潜在的キシラナーゼ産生株として選択された。この株は、ｐＨ7.0と、微生物による温度75又は80℃の嫌気性条件下で増殖した。限外ろ過で濃縮後、培養ブロスのキシラナーゼ活性を、pH=6.5及び９、温度＝８０℃でのアッセイで分析した（実施例１）。
６つの異なる株が、表示された条件下でキシラナーゼ活性を産生する事が分かった。これら微生物は、１９９４年４月１４日付で、寄託番号ＣＢＳ211.94、ＣＢＳ212.94、ＣＢＳ213.94、ＣＢＳ214.94、ＣＢＳ215.94及びＣＢＳ216.94で寄託された。
又、本発明は、キシラナーゼ活性を有する酵素、特に少なくとも80℃の温度で、且つpH６以上で顕著なキシラナーゼ活性を有する酵素を開示する。前記酵素は、寄託株の突然変異株及び変種からも得られる。
「顕著な活性」なる表現は、本発明の酵素が、少なくとも８０℃で、少なくとも４０％の活性を有する事を意味するので、これらは、７０℃では、好ましくはこれは少なくとも６０％であり、より好ましくは約少なくとも８０％であり、より一層好ましくは約２００％である。
更に、本発明は、約８０℃の温度で活性であるか、又はこれらの条件下で顕著な活性を有するキシラナーゼの調製方法を開示する。この方法は、適当な培地で本発明の寄託された微生物の培養、次いで表示の活性を有する酵素の回収を含む。キシラナーゼの単離及び精製は、常法に従って行う事が出来る。
酵素の部分的精製は、実施例２で例示される。この実施例では、細胞は、まず始めに中空繊維ろ過（hollow fiber filtration）で除去される。次いで、タンパク質が、１Ｍの最終濃度までの硫酸アンモニウムの添加によって更に精製される。この溶液を、次いでフェニルセファロースカラムに入れ、タンパク質が、１Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。最後に、このタンパク質が、限外ろ過で濃縮され、塩は隔膜ろ過（diafiltration）で除去される。
アルカリｐＨでのキシラナーゼのキシラン分解能を確認するため、ｐＨ７及び９で、表示の株から単離したキシラナーゼの活性の比較を、異なる基質を使用して、７０℃で行った（実施例３）。このキシラナーゼは、アルカリｐＨで著しい活性を有する事を示した。基質及びアッセイによって、ｐＨ９では、このキシラナーゼは、ｐＨ７でそれらが有する活性の約２０％以上を有する。或るキシラナーゼは、ｐＨ９で、ｐＨ７での活性の８０％を保持する事を示した。
表示の株から単離されたキシラナーゼの熱安定性は、著しく変化する。幾つかのキシラナーゼは、非常に熱安定性である。それらは、pH=9で、温度80℃で２時間以上の半減期を有する（実施例４参照）。本発明のキシラナーゼのpH=9で、温度80℃での半減期は、少なくとも１０分、好ましくはこれらの条件下で２０分以上、より好ましくは３０分以上、なお一層好ましくは６０分以上で、最も好ましくは、半減期は１２０分以上である。
又、本発明は、嫌気性好熱性株から得られるキシラナーゼをコードする事を特徴とするＤＮＡ配列のクローン化及び発現を開示する。本発明は、本発明のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む事を特徴とする発現ベクターを含むベクターを開示する。それらのベクターの一つで形質転換される事を特徴とする微生物宿主細胞も開示される。
本発明のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列の配列分析は、得られる配列が二つの酵素類、即ちギルケス等（Gilkes et al.）（1991、Microbiol. Rev. 55: 303-315）によって以前に定義されたF-型及びG-型に分類される事を示した。
本発明の微生物から得られるxynA、xynB及びxynC配列は、F-型キシラナーゼに属する。これらの微生物から得られるxynD配列は、G-型キシラナーゼに属する（実施例６、７、８及び９参照）。好熱性微生物由来のG-型キシラナーゼが、今までで最上のものである事を既に開示したものはない。本発明のキシラナーゼの源であるこの好熱性微生物は、ここにおいて、65℃より高い最適増殖温度を持つ微生物と定義される。好ましくは、この最適増殖温度は68℃より高く、より好ましくはこの最適増殖温度は70℃より高く、最も好ましくはこの最適増殖温度は75℃以上である。大腸菌での本発明の、F-型及びG-型二つのキシラナーゼDNA配列の発現は、活性タンパク質を与える事が示される（実施例１０及び１１参照）。このタンパク質は、８０℃の温度で活性である。
本発明開示の実施例で証明されたクローン化及び発現は、相同性微生物での遺伝子の発現を可能とする。また、発現は、適切な発現と分泌調節配列（secretion regulating sequences）を使用して、他の微生物において行う事も出来る。使用される微生物としては、酵母、菌及びバクテリアが挙げられる。特定の微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）及びバチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）から選ばれた株が挙げられる。
本発明の酵素は、オートスペルト（oat spelt）キシラン及びカンバ材キシランに関して著しい活性を有する事を示した。更に、本発明の酵素は、それらの漂白能力が試験された。この漂白能力は本発明の酵素の脱リグニン化活性によって決定される。本発明は、幾つかの木材パルプで測定された様な、顕著な脱リグニン化活性を有する酵素を開示する。酵素調製物、キシラナーゼは、少なくとも80℃の温度で、木材パルプの脱リグニン化を可能とする。「木材パルプ」なる表現は、広い意味で理解されるべきもので、一切のリグノセルロース物質を含む事を意図するものである。
この酵素は、広葉樹及び針葉樹パルプの両方について、それらの漂白能力が試験された。リグニン除去は、二種類の方法で測定された（実施例５）。培地でのリグニンは、Ａ３００試験で決定された。この試験で、全ての調製物が、広葉樹、針葉樹のいずれについても、８０℃で顕著な脱リグニン化活性を示した。ｐＨ９で、８０℃で針葉樹についての活性は、ｐＨ６での活性の少なくとも４３％であり、広葉樹については、３つの株が、ｐＨ９で、ｐＨ６での活性に比べて５０％以上の活性を示し、他の３つが１８〜３０％の活性を示した。又、針葉樹パルプの漂白は、カッパ（kappa）試験を使用して、パルプのリグニン含量の減少を決定する事によって測定された。カッパ値（kappa number）は、キシラナーゼ調製物で以て、pH９の８０℃でのパルプ培養後に、0.5〜0.4単位減少した。
更に、本発明の酵素の漂白能力は、例えば、常法で処理されたパルプで造られた紙、更に前記の酵素で培養したパルプで造られた紙と、酵素無しの培養で造られた紙とを比較して、そのＩＳＯ白色度の増加でもって測定出来る。前記の常法処理は、従来技術により過酸化水素、オゾン、塩素ガス或いは二酸化塩素の如き漂白剤への曝露を含む。
大腸菌で発現される本発明のクローン化F-型及びG-型キシラナーゼは、針葉樹及び広葉樹パルプ両方についてのECF漂白実験で、それらの性能が試験された（実施例１２参照）。驚くべきことに、G-型キシラナーゼ（xynD遺伝子でコード化された）は、最上のF-型キシラナーゼで、せいぜい1.2%ISO白色度増加に比べて、酵素無しの対照より6.8%ISOデルタ白色度までの、F-型キシラナーゼと比較して、針葉樹及び広葉樹の両方の漂白処理において一層良好な性能を示す事が観察された。更に、熱安定性G-型キシラナーゼの試験は、これらが、針葉樹及び広葉樹パルプ双方についてのTCF漂白実験でも優れた結果を生む事を示した（実施例１４及び１５参照）。この様にして漂白されたパルプから造られた紙の性質の検証は、酵素無しの対照の紙と殆ど変わらない事を示した。
クローン化G-型キシラナーゼは、高いpHにおいても極めて熱安定性である。８０℃、pH7.0で、３０分以上の半減期が測定された。６５℃、ｐＨ9.0では、この酵素の半減期は、１２０分の培養後でも顕著に減少しない（実施例１６参照）。
本発明のG-型キシラナーゼの、pH９．０で６５℃での半減期は、少なくとも１０分であり、好ましくはこれらの条件下での半減期は、２０分以上、より好ましくは３０分以上、なお一層好ましくは６０分以上で、最も好ましくは半減期は１２０分以上である。
本発明は、その内部共通フラグメント（internal consensus fragment）（ICF）が、配列番号12のICFと80%以上の同一性を示す熱安定性G-型キシラナーゼをコード化するＤＮＡ配列を開示する。このG-型ICFは、ここにおいて、配列番号12において、配列番号４及び配列番号５に相当する配列の間（ヌクレオチド位置２９５〜６２３）に在るフラグメント、と定義される。好ましくは、このG-型ICFとの同一性は、87%以上、より好ましくはこの同一性は95%以上、最も好ましくは、この同一性は99%以上である。
更に、その他の実施態様において、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列で、少なくとも70%の同一性を共有するG-型キシラナーゼを開示する。好ましくは、このアミノ酸同一性は、80%以上、より好ましくは、このアミノ酸同一性は90%以上、なお一層好ましくはこのアミノ酸同一性は95%以上、最も好ましくはこのアミノ酸同一性は99%以上である。
本発明の酵素は、上に述べたパルプ調製方法での酸素脱リグニン工程後に直ちに使用出来る。この酵素の温度並びにpH特性の結果として、高価な冷却及びpH調節が避けられる。本発明のまた別の実施態様では、この酵素は酸素脱リグニン工程の前又は工程中で使用される。この工程前ではリグニン濃度が高く、従ってキシラナーゼの適用効果は一層大きい。
更に、本発明の酵素調製物の適用として、特に、木材が本発明による前記酵素調製物で処理される方法が開示される。
同様に、フラッフパルプ（fluff pulp）が、本発明の酵素調製物で処理出来る。
更に、本発明は、本発明の酵素調製物で処理された木材パルプから作られる紙、ボード及びフラッフパルプに関する。
実施例１
熱安定性キシラナーゼ活性産生株の単離
キシラナーゼ産生微生物を、ニュージーランドの様々な高温地域にある温泉から得た。この株は、７０℃以上の温度で、６．０〜８．５の間のｐＨの温泉から、基質としてオートスペルトキシランを使用して、現場での濃縮で単離された。株の培養物は、サンプルが採取された現場の温度に相当する温度（７０°、７５°又は８５℃）で、２／１培地＋キシランの実験室での、更なる嫌気性培養で得られた。
２／１培地＋キシランの組成は次の通りである。
株の純粋培養物は、アガー・ロールチューブの単一コロニーから得た。限外ろ過で得た培養濃縮物を、染色キシラン法（dyed xylan method）（以下で参照）及びＰＡＨＢＡＨ法（実施例３参照）を使用して、７０℃及び８０℃で、ｐＨ６．５及び９．０でのキシラナーゼ活性について試験した。
ＣＢＳ（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）に寄託した６つの株は、表１に示される。
レマゾールブリリアントブルーＲ（Remazol Brilliant Blue R）（シグマ）に結合したカラマツ樹キシランから成る染色キシランを、ビーリイ等（Biely et al.）（1985. Anal. Biochem 144, 142-146）により開示された方法に従って調製した。
カラマツ樹キシラン（6.7g）を、250mlの水に入れ、数時間、室温で攪拌して溶解した。レマゾールブリリアントブルーＲ（10.0g）をこの混合物に添加した。溶解後、20mlの酢酸ナトリウム溶液（20mlの蒸留水中に2.7gの酢酸ナトリウム）滴状で添加した。次いで、水70ml中の水酸化ナトリウム6gの溶液を添加し、攪拌を18時間続けた。形成された染色キシランを、96%エタノール700mlを添加して沈殿させた。６時間静置した後、沈殿物をろ過（Whatman GF/A）で分離した。フィルターケークを、96%エタノール/0.05M酢酸ナトリウムの2:1の混合物の３ｌで、次いで96%エタノール１ｌ及びアセトン３ｌで、ろ液が透明になるまで洗浄した。収量は10.5g染色キシランであった。
酵素アッセイの為、5.1gの染色キシランを、150mlの0.1M MOPSバッファー、pH6.8に溶解した。混合物を、70℃で、４時間攪拌して溶解した。室温まで冷却後、不溶解物を、10,000x gで、遠心分離機で除去した。活性アッセイの為、3.34% w/v染色キシランを含む貯蔵溶液を、0.1M MOPSバッファー、pH6.8で希釈して、0.5%染色キシラン作業溶液を得た。
染色キシランを使用する酵素アッセイは、混合しながら、適当なバッファーで、0.9ml染色キシラン溶液（0.5%）を、0.6ml酵素調製物に添加して行った。この混合物の一部（0.4ml）を、対照（ブランク）として96%エタノールの0.8ml中に移した。残りの溶液を、70℃で、90分間培養した。この試験混合物の0.4mlを、96%エタノールの0.8mlに移す事によって、反応を停止させた。この溶液を、未開裂染色キシランを沈殿させる為に、室温で、30分間放置した。この試験サンプルを、ベックマンマイクロフュージE（Beckman Microfuge E)で、全速力で５分間遠心分離に掛け、上澄み液の吸光度を、分光光度計で、５９５ｎｍで測定した。
実施例２
酵素調製物の単離
嫌気性醗酵を、７５又は８０℃のいづれかの温度（培養される微生物による）で、２４時間、静置培養で、２／１＋キシラン培地の１８００ｍｌを含む２ｌのスコット瓶（Schott bottle）中で行った。ウエル増殖培養物の１０ｌから、０．０１％トリトンX１００（Amicon DC 10 LA及びAmicon 0.1μm H5MP01-43フィルター）を使用して、中空繊維ろ過で、細胞を除去した。最終濃度の１Ｍまで、硫酸アンモニウムを、細胞無しの培養培地に添加した。得られた溶液を、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡にされたフェニルセファロース（Pharmacia-Fast Flow-low置換）の１ｌを含む９ｘ１５cmのカラムにポンプで送った。流速は150-200ml/分であった。カラムを、５ｌの１Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄した。キシラナーゼを５ｌの１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。画分を、500-1000ml容量で収集した。キシラナーゼ活性をその画分で決定し（実施例３で開示されるＰＡＨＢＡＨ法で）、活性画分をプールし、少容量まで限外ろ過し、ＹＭ２膜を備えたアミコン攪拌セル（Amicon Stirred Cell）（Model 2000A又は8400）を使用して、塩濃度を低下させる為に隔膜ろ過した。
実施例３
部分的精製酵素調製物のキシラナーゼ活性の特徴
分析方法
キシラナーゼ活性のアッセイは、サムナーアッセイ（Sumner assay）（Sumner et al., 1921. J. Biol. Chem. 47: 5-9）を変更した方法を使用して行った。別に、キシラナーゼ活性を、レバー（Lever）（1973. Biol. Med. 1: 274-281）の方法を基本とした、変更PAHBAHアッセイを使用して決定した。
方法１
オートスペルトキシランについてのキシラナーゼ活性のサムナーアッセイ
オートスペルトキシラン基質溶液を、次の様にして調製した。
４ｇのオートスペルトキシランを、１００ｍｌの蒸留水に懸濁し、この懸濁液を６分間、超音波処理し（超音波装置：ソニックアンドマテリアルス、ビブラセル タイプＶＣ２５０Ｂ）、１００℃で、１０分間培養し、ソーバルＲＣ−５Ｂ遠心分離機で、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に掛けた。この上澄み液を基質溶液として使用した。約２％のオートスペルトキシランを含有する。
アッセイは、次の様にして行った。
試験管を、２００μｌのオートスペルトキシラン溶液、適当なバッファーで希釈した酵素調製物（実施例２）の６００μｌ液で充たした。この試験管を、水浴中で、１５分間、測定条件下で培養した。培養後、７．２ｍｌのＤＮＳ（dinitrosalicylic acid、ジニトロサリチル酸）試薬を添加した。この混合物を、水浴中、１００℃で１０分間加熱し、その後、この試験管を氷上で冷却した。吸光度は、５７５ｎｍで測定した。この酵素試料のバックグラウンド吸光度を取り除く為、対照実験を次の様にして行った。
酵素調製物無しの基質を含む試験管を、前記試験試料と同様の条件下で培養した。１５分の培養後、７．２ｍｌのＤＮＳと酵素試料を、この順序で添加した。
一単位のキシラナーゼ活性（ｘＵ）とは、還元糖として測定される、１μモルのキシロース当量を産生する酵素の量と定義される。
実際の測定条件は、ｐＨ７．０、９．０及び７０℃であった。ｐＨ７では、５０ｍＭリン酸塩バッファーを使用し、ｐＨ９では、５０ｍＮほう酸塩／ＫＯＨバッファーを使用した。
方法２
カバ材キシランについてのキシラナーゼ活性のサムナーアッセイ
方法１で開示の方法と殆ど同じ方法を使用した。オートスペルトキシラン溶液に代えて、カバ材キシラン懸濁液を使用した。カバ材キシラン基質溶液は、次の様にして調製した。
４ｇのカバ材キシランを、０．２ＮＮａＯＨ５０ｍｌに懸濁し、明らかに溶解するまで震盪した。溶液のｐＨを氷酢酸で７．０に調整し、水を加えて１００ｍｌとし、この溶液を、ソーバルＲＣ−５Ｂ遠心分離機で、１０，０００ｒｐｍで遠心分離に掛けた。この上澄み液を基質溶液として使用した。約３％のカバ材キシランを含有する。試験条件は、ｐＨ７及び９で、７０℃であった。結果を表３に示す。
方法３
オートスペルトキシランについてのキシラナーゼ活性のＰＡＨＢＡＨアッセイ
ＰＡＨＢＡＨ法（Lever, 1973）の変更は、ＰＡＨＢＡＨ試薬に対して行い、次の通りである：
０．０５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム、０．０２Ｍ塩化カルシウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び０．１Ｍｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）。
酵素調製物のアッセイの為、０．０５ｍｌ又は０．１ｍｌの酵素調製物を、０．３ｍｌの基質バッファー（５０ｍＭビス−トリス−プロパン、必要とされるｐＨ、＋０．２％オートスペルトキシラン懸濁液）と混合した。適当量の水を、最終容量が０．５ｍｌになるまで添加した。培養は、通常通り、７０℃、３０分間で行った。反応停止の為、１．０ｍｌのＰＡＨＢＡＨ試薬を培養後に添加し、この試料を、１００℃で６分間加熱した。ブランクは、酵素がＰＡＨＢＡＨ試薬の後に添加される試料と同じに培養した基質バッファーから成る。４２０ｎｍでの吸光度を決定する前に、上澄み液から、懸濁したキシランを除去する為に、全ての試料をベックマンマイクロフュージE（Beckman Microfuge E）で、全速力で１分間遠心分離に掛けた。結果を表４に示す。この表から、ｐＨ９．０、８０℃で、全ての株は、ｐＨ６．０、７０℃に比較して、尚顕著な活性を有する事が結論付けられる。
実施例４
キシラナーゼ活性の熱安定性
酵素調製物のキシラナーゼ活性の半減期は、次の様にして決定した。
酵素調製物を、１００ｍＭＴＡＰＳバッファー（８０℃でｐＨ９．０）中で、１／１０に希釈し、８０℃で培養した。試料を、０、１０、２０、４０、６０及び１２０分で取り出し、この最終アッセイに都合のよい１／２０〜１／１００の最終希釈まで、氷上の１００ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（７０℃でｐＨ６．０）に添加した。この試料を、それらが実施例３の方法３に記載されたＰＡＨＢＡＨアッセイ法を使用して、７０℃、ｐＨ６．０でアッセイされるまで氷上に保持した。結果を表５に示す。
実施例５
脱リグニン活性
キシラナーゼの脱リグニン性能は、二種類の方法で決定した。Ａ３００法を使用して、酵素処理後にパルプから放出されたリグニン量を推定した。カッパアッセイ（kappa assay）を使用して、処理後のパルプの残留リグニン含有量を測定した。
方法１：Ａ３００試験
Ａ３００アッセイで脱リグニンを測定する為、酵素調製物を、針葉樹又は広葉樹パルプと一緒に、湿潤パルプのグラム当たり２ＰＡＨＢＡＨ単位の濃度（乾燥パルプのグラム当たり約６ＰＡＨＢＡＨ単位）で培養した。培養は、８０℃で、ＭＯＰＳバッファーで、ｐＨ６．０とＴＡＰＳバッファーで、ｐＨ９．０の両方で２時間行った。培養でのパルプ濃度は、０．１ｇ湿潤重量／ｍｌであった。二種類のパルプを使用した。即ち、酸素脱リグニン後のクラフト針葉樹パルプ及び酸素脱リグニン後のクラフト広葉樹パルプである。これらパルプの性質を表６に示す。
パルプから除去されたリグニンの量は、焼結ガラスフィルターの上に支持されたワットマンＧＦ／Ｃフィルターでの吸引ろ過でパルプから上澄み液を分離した後、３００ｎｍでのその上澄み液の吸光度を測定して決定した。Ａ３００試験の結果を表７に示す。このアッセイで、≧０．２のデルタＡ３００値は、バックグラウンド水準より著しく高かった。それ故、この試料は、酵素が、８０℃で著しい脱リグニン化活性を持つ事を示す。
方法２：カッパ試験
カッパ試験は、ＴＡＰＰＩプロトコルＴ２３６（ＴＡＰＰＩ、Technology Park, Atranta, USA、から入手可能）に依り、幾らかの変更を加えて行った。酵素調製物を、10xU/ｇパルプ（乾燥重量）の投与量で添加し、ｐＨ９、８０℃で２時間培養した。対照として、パルプを、同じ時間、同じ条件下で、酵素添加無しで培養した。表６で示した性質の酸素脱リグニン化針葉樹パルプを使用した。
酵素添加のカッパ値と、酵素添加無しのカッパ値の間の相違は、カッパ減少と呼び、脱リグニンの値である。カッパ減少は、表８に示される。このアッセイで、≧０．５の値は、バックグラウンド水準より著しく高い値である。それ故、前の実施例同様に、この試料は、酵素が、８０℃で著しい脱リグニン化活性を持つ事を示す。
実施例６
熱安定性F-型キシラナーゼをコード化する遺伝子の内部一致フラグメントのコローニング及び配列決定
６．１ キシラナーゼ遺伝子の内部フラグメントのＰＣＲ増幅
３つのＰＣＲプライマーを、キシラナーゼ遺伝子の内部共通フラグメントを増幅するのに使用した。即ち、２種類の前進プライマー（xynFA、｛５′CAC ACK CTK GTK TGG CA ３′、配列番号１｝及びxynFB、｛５′CAT ACK TTK GTT TGG CA ３′、配列番号２｝）及び１種類の復帰プライマー（xynR、｛TMG TTK ACM ACR TCC CA、配列番号３｝）。xynFA及びxynFBプライマーは、同じ場所に結合しているが、前進共通領域でのキシラナーゼ遺伝子の配列における僅かな相違で配列において僅かに相違する。PCR条件は、次の通りであった：（94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分）ｘ３０。全てのファミリーＦ内部共通フラグメントは、略３５０ｂｐであった。
６．２ ＰＣＲ生成物の配列決定
全ての内部キシラナーゼＰＣＲ−生成物（約３５０ｂｐ）は、Ｍ１３ｍｐ１０配列ベクターのＳｍａｌ（ホスファターゼ化）部位にクローニングする前に、以下に記述の様に、末端修復（逆充填）された。
ステップ１−酢酸アンモニウム沈殿：
（ａ）５０μｌＰＣＲ混合物を、ＴＥバッファー（１０ｍＭTris-Cl、１ｍＭEDTA、pH8.0）で１００μｌとする。（ｂ）１００μｌの4M酢酸アンモニウムと250μｌの100%エタノールを添加する。（ｃ）氷上で１５分間（又は−２０℃で一昼夜）培養する。（ｄ）１６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離に掛け、上澄み液を棄てる。（ｅ）５００μｌの冷い７０％エタノール中でペレットを洗浄する。再遠心分離（１６，０００ｒｐｍで５分間）に掛け、上澄み液を棄てる。（ｆ）ペレットを、真空下で５分間乾燥し、２０μｌのＴＥバッファーに再懸濁する。
ステップ２−ＰＣＲフラグメントの末端修復：
（ａ）２０μｌの沈殿ＤＮＡに、３μｌの１０ｘリガーゼバッファー（ベーリンガーマンハイム）、１μｌの１２．５ｍＭｄＮＴＰ’ｓ（ファーマシアＤＮＡ重合混合物）、０．５μｌ（５Ｕ）の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼラージ（クレノウ（Klenow））フラグメント（ＢＲＬテクノロジーLtd.）、０．２５μｌ（２．５Ｕ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）、０．２５μｌ（２．５Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム）及び水を、３０μｌまで添加する。（ｂ）３７℃で３０分間培養し、７０℃、１０分間の培養で酵素を熱的に死滅させる。
ステップ３−末端修復されたキシラナーゼフラグメントのゲル精製：
（ａ）ＤＮＡを、１ｘトリス−アセテートバッファー（ｐＨ７．８）の２％ＬＭＰアガロースに通す。（ｂ）アガロースから、３５０ｂｐキシラナーゼバンドを削除する。（ｃ）ジェンクリーン方法（GeneClean procedure）（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．）を使用して、アガローススライスからＤＮＡを精製する。
ステップ４−Ｍ１３ｍｐ１０（Smal-ホスファターゼ化）中への連結反応：
（ａ）１μｌのＭ１３ｍｐ１０ベクターＤＮＡ（約１０ｎｇ／μｌまで適当に希釈した）、２０〜５０ｎｇのインサートＤＮＡ（キシラナーゼ共通プライマーフラグメント）、１μｌの１０ｘリガーゼバッファー（ベーリンガーマンハイム）、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム）及び水を１０μｌまで混合する。（ｂ）室温で、一昼夜培養する。
ステップ５−大腸菌株ＪＭ１０１への連結反応混合物の形質転換：
（ａ）チュン等（Chung et al.）（1989. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175.）のDMSO−仲介形質転換技術を使用して、全体で１０μｌの連結反応混合物でＪＭ１０１を形質転換する。（ｂ）Ｍ１３／ＪＭ１０１をプレートにして、標準方法（サムブルック等（Sambrook et al.）、1989. Cold Spring Harbour Laboratory Press）を使用して、組み換えM13プラスミドを単離する。
内部キシラナーゼ共通フラグメントを含む組み換えＭ１３ファージを、染色−プライマー化学を使用して（使用されたシークエンスプライマーは、一般的なＭ１３前進（染色標識化）プライマー（ＡＢＩ Ltd.）であった）、アプライドバイオシステム３７３Ａ自動化ＤＮＡシークエンサーで、ssＤＮＡ（Sambrook et al. 1989）から配列した。全てのＤＮＡ配列データは、シリコングラフィックパーソナルイリスワークステーション（Silicon Graphics Personal Iris Workstation）で作動するG C G配列分析ソフト（イリスに装着されている）を使用して分析、処理された。
ファミリーＦキシラナーゼ内部フラグメント配列結果：
キシラナーゼ共通プライマーを使用して、表１に示される６つの株から増幅されたＰＣＲフラグメントを基にして、各微生物は、ファミリーＦキシラナーゼ遺伝子を１〜３の間で含む事が予測された。この結果は、公知のブートストラップ分析（boot-strap analysis）（Wisconsin Molecular Biology Pakage, Devereux, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-394）で分析された。図１において、種々のキシラナーゼ及び株の系統樹が示される。ファミリーＦ共通フラグメントのヌクレオチド配列から、各微生物は３つの異なるファミリーＦ遺伝子を含む事が明らかである。各微生物のファミリーＦキシラナーゼ遺伝子の各々は、クラスターＡ、クラスターＢ及びクラスターＣと表示される別々のキシラナーゼクラスター（ヌクレオチドと１級アミノ酸配列相同性を基とした）に属する。ＴＧ４５６から増幅された完全な長さのキシラナーゼは、クラスターＡに属し、後にＴＧ４５６ xynAと命名された。更に、ＴＧ４５６クラスターＢキシラナーゼ（ＴＧ４５６ xynB）とクラスターＣキシラナーゼ（ＴＧ４５６ xynC）から内部共通フラグメントが同定された。
実施例７
熱安定性G-型キシラナーゼをコード化する遺伝子の内部共通フラグメントのクローニング及び配列決定
７．１ Ｇ−型キシラナーゼ遺伝子の内部フラグメントのＰＣＲ増幅
ファミリーＧの内部共通フラグメント（ICFs）を、前進及び復帰ファミリーＧ共通プライマー（ＧＦ及びＧＲ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で単離した。このＰＣＲの内容は次の通りであった。注：℃は摂氏度を表し、ｘはサイクルの数を表す（即ち、ｘ１は１サイクルに等しい）。
（94℃で４分）ｘ１
（94℃で１分、45℃で１分、72℃で１分）ｘ３５
（94℃で１分、45℃で１分、72℃で６分）ｘ１
ＰＣＲは、５０μｌの反応中で、次の成分を使用して行った：１００ｎｇのＧＦプライマー、１００ｎｇのＧＲプライマー、０．２５ｍＭｄＮＴＰｓ、１単位のタックポリメラーゼ（Taq Polymerase）、０．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．８、５０ｍＭ塩化カリ、０．００１％ゼラチン、１〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ。
２つのＰＣＲプライマーを、キシラナーゼ遺伝子の共通フラグメントを増幅するのに使用した：
６つの株全てで、ＰＣＲフラグメントは、共通プライマーでの増幅によって見出された。
２種類のＰＣＲ生成物（ＤＮＡフラグメント）が増幅された：予想通りのサイズの３００ｂｐフラグメントと、予想外の６００ｂｐＰＣＲ生成物−この６００ｂｐフラグメントは３００ｂｐＰＣＲ−生成物の頭−尾ディマーであった：多分、この６００ｂｐ種は、ＧＦとＧＲプライマーの間の相同の結果として、ＰＣＲ反応中での自己プライミング（self-priming）の結果である。
７．２ ＰＣＲ生成物の配列決定
各微生物から増幅された３００ｂｐフラグメントが末端修復された（実施例６参照）。
末端修復されたフラグメントを、次いでジェンクリーン方法（GeneClean procedure）（Ｂｉｏ １０１、La Jolla、Calif.）を使用して、１％低溶融温度アガロースゲルから精製した（トリス−アセテート実行バッファー中で実行する）。凡そ１０ｎｇの末端修復された、ゲル精製300ICFsが、10μlの反応中で、BM T4 DNAリガーゼを使用して、M13mp10のSmal部位に連結された。
７．３ ＰＣＲ生成物の配列決定
株ＴＧ４５７とＴＧ５３由来の６つの独立ファージを配列した。これらの株の各々には、一本鎖のＧ−型キシラナーゼ遺伝子のみが存在する事が、この配列（図２）から明らかである。更に、ＴＧ４５３、ＴＧ４５６、ＴＧ４７９及びＴＧ６３１由来のファミリーＧ−ＩＣＦsから成るM13mp10組み換え体を配列した。これらの微生物は、ＤＮＡ配列での変化は１３％までであるが、殆ど同じキシラナーゼをコード化する全てのファミリーＧキシラナーゼ遺伝子から成っていた。
実施例８
完全な長さのＦ−型キシラナーゼの配列
内部ＰＣＲフラグメントの基体につき、３つの異なるタイプのＦ−キシラナーゼ遺伝子が同定された：xynA、xynB及びxynC。
ゲノムウオーキングPCR（Genome Walking PCR）（GWPRCR）を使用して、完全な長さのキシラナーゼ遺伝子が、殆どの株から単離された。
ＴＧ４５６xynA遺伝子の完全に長い配列が決定された。xynA遺伝子の完全な配列は、配列番号６で与えられる。ＴＧ４５６キシラナーゼＡのコード化アミノ酸配列は、配列番号７で与えられる。
xynB及びxynCに対しては、遺伝子が、１つのキシラナーゼドメインで複数ドメイン酵素をコード化する事が発見された。これらのキシラナーゼドメインは、キシラナーゼドメインの境界にある配列上で設計されたＰＣＲプライマーを使用してサブクローン化された。
ＴＧ４５６由来のxynB及びxynCの為の部分配列情報は、配列番号８及び配列番号１０のそれぞれで与えられる。ＴＧ４５６キシラナーゼＢ及びＣのコード化されたアミノ酸配列は、配列番号９及び配列番号１１のそれぞれで与えられる。
実施例９
Ｇ−型キシラナーゼ遺伝子の完全な配列
ゲノムウオーキングPCR（Genome Walking PCR）（GWPRCR）を使用して、完全な長さのxynD遺伝子が、殆どの株から単離された。
ＴＧ４５６のxynD遺伝子の完全な配列は、配列番号12で与えられ、コード化ＴＧ４５６キシラナーゼＤアミノ酸配列は配列番号１３で与えられる。
実施例１０
クローン化遺伝子からのキシラナーゼ産生の為の発現ベクターと宿主の構築
共通ＰＣＲプライマーにおいて、適当な発現ベクターでキシラナーゼ遺伝子のサブクローニングを許す適当な制限部位が設計された。
xynA及びxynC遺伝子は、フレーム融合（in-flame fusion）の為に、ランブダL及びRプロモーター（lambda L and R promorters）［Gibbs, M. G. Saul D. J, Luthi, E., and Bergquist, P. L.（1992）．「カルドセラムサッカロリチカム」（Caldocellum saccharolyticum）由来のβ-マンナナースは、複数ドメイン酵素の一部である。Appl. Environ. Microbiol. 58（12）: 3864-3867］で以て、pJLA602の発現ベクターのNcol-BamHIの中に挿入される［Schauder, B., Bluker, H., Frank R., and McCarthy, J. E. G.（1987）. Inducible Expression Vectors Incorporating the Escherichia coli atpE Transcriptional Initiation Region. Gene 52: 279-283］。
xynB及びxynD遺伝子は、pJLA602の非反復Sphl-BamHI部位に挿入された。
構築物は、標準の形質転換技術を使用して、大腸菌JM101及び大腸菌DH５α中に転移された。
図３は、Sphl-BamHIフラグメントのpJLA602に挿入されたTG456由来のxynDのキシラナーゼドメインの配列を示す。
実施例１１
クローン化キシラナーゼの産生及び回収
クローン化F-型キシラナーゼ由来のタンパク質試料を得る為に、大腸菌クローンを、10.0リットル容量のLH醗酵器（シリーズ２１０）で醗酵させた。この培養物を、通気（４．８ｌ／分）、震盪（５００rpm）、及びpH調節（pH7.1）を続けながら、誘導（42℃）まで30℃に維持した。使用した培地及びその他の添加物は以下の通りである。
ルリアブロス（接種培養用）：
トリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
水 １０００ｍｌまで
醗酵器実行用ＢＧＭ２バルク増殖培地（量は最終培地用、即ち８．５ｌの２バッチ）：
塩化アンモニウム ３．２２ｇ
リン酸二水素カリウム １．０５ｇ
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．１３５ｇ
硫酸カリウム ０．０４３ｇ
硫酸第一鉄・７水和物 ０．００３ｇ
ＳＬ−１０微量元素 １ｍｌ
トリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ４．７ｇ
グリセロール ３４ｍｌ
水 １０００ｍｌまで
その中に水約６リットルの入った醗酵容器を１２１℃で３０分間、加圧加熱処理で殺菌した後、３０℃に冷却した。培地濃縮物（８．５折り畳み濃縮物（fold concentrate））を、殺菌した０．２μｍカートリッジフィルター（Sartorius）を通して汲み上げた。培養前に、次の様な添加を行った。
消泡剤（ベバロイド5901） １０ｍｌ（加圧加熱処理）
塩化カルシウム １ｍｌ（加圧加熱処理）
アンピシリン ８５０ｍｇ（フィルター殺菌処理）
チアミン（JM101培養物のみ） ８．７ｍｇ（フィルター殺菌処理）
液容量を、次いで８．５ｌに調整した。培地のｐＨを７．１に調整した。４．８ｌ／分の流速で、醗酵器を通してフィルター殺菌した空気を散布した。フィンガープローブを通して、温冷水循環で醗酵器温度を３０℃に保持した。ｐＨ調節は、オートクレーブ下の水酸化ナトリウム（５Ｍ）又は硫酸（２Ｍ）の添加によって行った。醗酵器の攪拌速度は５００ｒｐｍであった。
培養は、０．２〜０．４のＯＤ650の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと、ルリアブロスで増殖した大腸菌クローンの新鮮な培養物の液（約１０．０ｍｌ）で開始した。この細胞を、３０℃で１１〜１３の間のＯＤ650に増殖し、次いで、培地濃縮物で回分飼育（fed-batced）し、回収し、１４〜１６の間のＯＤ650に増殖した。これらは、温度を４２℃に上昇する事によって、続いて誘発された。
細胞は、最大ＯＤ650が達成された後４時間で採取された。この細胞を、中空繊維ろ過（０．１μｍ、アミコン）で回収し、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、７．５ｍＭＥＤＴＡ、７．５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．０２％ＰＭＳＦ、１．０μＭペプスタチンＡ、０．０２％ＤＮアーゼ及び０．０２％リゾチーム中に再懸濁し、４℃で１時間培養した（全容量約１ｌ）。この細胞を、溶解するまで（顕微鏡で観察される）１分ブラストで４〜６分間、１６０ｍｌバッチで、氷上で超音波処理した。５６ｍＭＰＭＳＦの液（イソプロパノール中）を、それぞれ２分の超音波処理に対して、１ｍＭＰＭＳＦ未満の最終濃度まで添加した（それぞれの添加は１６０μＭに相当）。溶解が完結後、細胞の残骸を遠心分離で除去した。上澄み液を、タンパク質の明らかな沈殿が生起するまで（普通約２０〜３０分）７０℃で加熱処理し、この変性タンパク質を遠心分離で除去した。フェニル−セファロースクロマトグラフィーの前に、硫酸アンモニウムを、この加熱処理した上澄み液に、１．０Ｍの最終濃度まで添加した（これを、１°加熱処理抽出物と名付ける）。超音波処理細胞からの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノールの１リットル懸濁液で再抽出し、次いで７０℃で１５分間の第二加熱処理し、沈殿したタンパク質を遠心分離で再度除去した。これは、更に２０〜４０％のキシラナーゼを抽出した事が分かった。これを２°加熱処理抽出物と名付けた。硫酸アンモニウムを、この２°加熱処理抽出物に、１．０Ｍまで添加し、１°及び２°加熱処理抽出物をフェニル−セファロース分離前にプールした。キシラナーゼ活性を、１．０Ｍ塩化ナトリウムを使用して、１１００ｍｌベッド容量フェニル−セファロースカラムから段階的に溶出し（１．０Ｍ硫酸アンモニウムでの多量な洗浄後に、ベースラインへ戻す）、この溶出タンパク質を濃縮して、ＹＭ３隔膜（アミコン）の限外ろ過で塩分除去した。調製物の最終濃度は、２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノール、約２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０％グリセロール及び０．０５％ナトリウムアジドである。
Ｇ−型キシラナーゼの産生の為のこの方法は、抽出（ｐＨ８．０）及び脱塩（ｐＨ７．３）工程の為のトリス−塩酸に代えてＨＥＰＥＳバッファーが使用された以外は上述の方法と殆ど同じである。最終の調製物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．０５％ナトリウムアジド、２０．０％グリセロール及び±２５０ｍＭ塩化ナトリウムのバッファー組成を有した。
全部で、６つのＦ−型調製物（５つのxynA及び１つのxynB）と、２つのＧ−型調製物の十分な純度のものが得られた。Ｆ−型及びＧ−型調製物のタンパク質濃度は、標準ＢＣＡ法（Pierce,Rockford, IIIinois, USA）で決定した。試料の純度は、SDS-PADEゲル（Phast-system, Pharmacia, 20% gel）を使用して、F-型の約40kDa、及びG-型の約25kDaでのバンドの厚さを、不純物のバンドの厚さと比較する事によって概算で推定した。試料の純度は、20〜70％の間で変化した（表９）。
実施例１２
クローン化Ｆ−及びＧ−型キシラナーゼでのＥＣＦ漂白結果
ＥＣＦ漂白を、スウェーデンのパルプ工場からの酸素脱リグニン化クラフトパルプを使用して行った。この針葉樹パルプ（ＳＷ）は、１６．０のカッパ値を有し、広葉樹パルプ（ＨＷ）は１０．６のカッパ値を有していた。表１０で示される条件下で、ＸＤＥＤの順序が使用された。
これらの実験結果は、表１１に示される。酵素タンパク質の基体について比較すると、Ｇ−型キシラナーゼは、Ｆ−型キシラナーゼに比べて極めて良好に作用する事が分かる。
実施例１３
クローン化Ｇ−型キシラナーゼでのＥＣＦ投与−応答曲線
実施例１２に記載されたものと同じＸＤＥＤ漂白順序を使用して、２つのＧ−型キシラナーゼの投与量を変えた。結果を表１２に示す。１〜３μｇ／ｇパルプの投与量は、少なくとも２点のＩＳＯ白色度で増加を示す。
実施例１４
クローン化Ｇ−型キシラナーゼでのＴＣＦ漂白結果
２つのＧ−型キシラナーゼを、以下の実施例１５で記載されるＸＱＰＰ順序を使用して、ＴＣＦ漂白順序で試験した。酸素脱リグニン化広葉樹クラフトパルプを使用した（３０ｇ o.d./試料）。Ｇ−型キシラナーゼの投与量は表１３で示した様に変化させた。Ｘ、Ｐ１及びＰ２段階後に各試料に対して得られたＩＳＯ白色度値は、表１３に示される。この値は、２つの試料の平均値を表す。
この実験を、３及び６μｇタンパク質／ｇパルプの投与量を使用して繰り返した。Ｐ２段階後に得られた白色度値のみを決定した。結果を表１４に示す。
実施例１５
ＥＣＦ及びＴＣＦの結果と紙の性質
スウエーデンのパルプ工場から供給されたクラフトＨ／ＷとクラフトＳ／ＷパルプのＥＣＦ及びＴＣＦでの漂白効果について、キシラナーゼ試料を試験した。ＴＧ４５６xynDとＴＧ５３xynD（実施例中では、それぞれ７１５及び７１６と呼ぶ）を、「酵素無し」の参考例（Ref）と比較した。ランペンボールミル（Lampen ball mill）での精製試験は、715が、引き裂き係数で顕著な改善を、そして引っ張り及び破裂係数で著しい低下なしに、全体にわたって最高の効果を与える事を示した。
スクリーニングプロトコル
上記実験で得られた結果を、表１５（広葉樹）及び表１６（針葉樹）に示す。
紙の性質の検証
全ての順序が完全に漂白された後、30gの試料を取り、ランペンボールミルで、10,000、20.000及び30,000回転で精製した。ショッパーリーグラー（Schopper-Rieglers）を測定し、その後、引っ張り係数、空隙率、引き裂き係数及び破裂係数測定の為に、約２ｇのシートを作製した。このシートを、２３℃で、５０％相対湿度で２４時間の条件に置いた。得られた結果を図４〜８に示す。
実施例１６
ＴＧ４５６xynDの最適pH、最適温度及び熱安定性
基質としてオートスペルトキシランを用いて、実施例２の方法１で活性を測定した。全てのアッセイは、５０ｍＭリン酸バッファー中で、ｐＨ及び温度は指示の通りにして行った。結果を図９及び１０に示す。
ＴＧ４５６キシラナーゼＤは、参考の酵素パルプチーム（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）と比較して、より一層熱安定性であり、僅かに高い最適ｐＨを有する。
配列表
(1) 配列番号：１の情報
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：xynFA
配列：配列番号：１：
(2) 配列番号：２の情報
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：xynFB
配列：配列番号：２：
(3) 配列番号：３の情報
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
個体・単離クローン名：xynR
配列：配列番号：３：
(4) 配列番号：４の情報
配列特性
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：GF
配列：配列番号：４：
(5) 配列番号：５の情報
配列特性
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
個体・単離クローン名：GR
配列：配列番号：５：
(6) 配列番号：６の情報
配列特性
配列の長さ：1065塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：3..1058
他の情報：産物＝キシラナーゼ A、遺伝子：xynA
配列：配列番号：６:
(7) 配列番号：７の情報
配列特性
配列の長さ：351アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：７：
(8) 配列番号：８の情報
配列の特徴
配列の長さ：1633塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1632
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ B、遺伝子＝xynB
配列：配列番号：８：
(9) 配列番号：９の情報
配列特性
配列の長さ：544アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：９：
(10) 配列番号：10の情報
配列の特徴
配列の長さ：1125塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1125
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ C、遺伝子＝xynC
配列：配列番号：10：
(11) 配列番号：11の情報
配列特性
配列の長さ：375アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：11：
(12) 配列番号：12の情報
配列の特徴
配列の長さ：1244塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1107
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ D、遺伝子＝xynD
配列：配列番号：12：
(13) 配列番号：13の情報
配列特性
配列の長さ：368アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：13：
本発明は、新規な微生物及び新規な酵素、特に熱安定性キシラナーゼに関する。
これらのキシラナーゼは、嫌気性好熱性バクテリアから得られ、紙・パルプ工業で使用される条件、即ちｐＨ９以上、温度７０℃以上の条件下で使用出来、この酵素は特に温度８０℃で活性である。
発明の背景
キシランは、植物ヘミセルロースの一構成成分であり、キシランは、１，４−グルコシド結合のβ−Ｄ−キシロース基質から成る。普通、キシランは、キシロース及び他のペントース、ヘキソース、ウロン酸及びアセチル基を含む側鎖又は基を有する。
紙の製造方法において、パルプの漂白は最も重要な工程である。紙・パルプ工業においてパルプ処理に使用される方法は、図式的には次の様に行われる。
パルプは、所謂酸素脱リグニン工程で、大部分のリグニンを除去する為に、ｐＨ１０〜１２で、温度８０℃で処理される。処理後のパルプは、２〜５％のリグニンを含む。このリグニンは、パルプを褐色にする。次いで、このパルプは、多段漂白方法で漂白される。この漂白方法で、塩素、二酸化塩素、過酸化水素及び／又はオゾンの様な化学物質が使用され、高品質紙の白色パルプが得られる。
塩素及び塩素含有化学物質は、この漂白方法でよく使用される。然しながら、これら化学物質の使用は、ダイオキシン及びその他の塩素化有機化合物を形成する事となり、それらは環境への脅威となる。それ故、この種の廃棄生成物を発生する化学物質の使用を制限する傾向が出てきている。
これは、無塩素方法、つまり完全無塩素（ＴＣＦ）及び基本的無塩素（ＥＣＦ）の方法の開発傾向を促進した。これらの方法では、過酸化水素又はオゾンが漂白の為に使用される。然しながら、これらの酸化化学物質の使用は、紙の品質、特に紙の強度においてマイナス効果を持つ可能性がある。
或る種の酵素は、漂白剤をより一層受容可能なパルプとし、それにより漂白量を減少させる事が分かっている。特に、キシラナーゼは、紙・パルプ処理において非常に有用である事が分かっている。キシラナーゼがパルプからのリグニンの抽出性を増大する事は報告されている。現在の方法では、キシラナーゼは、それらが酸素脱リグニンの際に使用される条件下では活性ではなく、生存しないので、酸素脱リグニン工程の後で使用されるのが殆どである。
キシラナーゼは、リグニンのセルロースの網目構造への密着に関与するヘミセルロース鎖を開裂する。キシラナーゼ処理後、リグニンは、次工程において一層容易に除去される。
それ故、キシラナーゼの使用は、２５〜３０％の予備漂白で、活性塩素の消費の減少につながる。塩素のこの減少は、得られる紙の品質係数に影響しない（Viikari et al., 1986. Proc. of the third Int. Conf. Biotechnology in Pulp and Paper Ind., Stockholm, p.67-69 and Bajpai and Bajpai. 1992. Process Biochemistry. 27: 319-325）。
又、キシラナーゼ処理は、漂白方法での他の化学物質、例えば過酸化水素の必要性を減少する。
クラフトパルプの漂白での菌源由来のキシラナーゼの使用が報告されている。それらは酸性キシラナーゼであり、この酵素の最適ｐＨ及び温度は、ｐＨ＝３〜５、温度＝３０〜５０℃である。これらの値は、効果的な条件が、ｐＨ≧９で温度≧７０℃である漂白方法での使用には理想的ではない。
最適な高いｐＨ及び／又は温度を持つバクテリア源由来のキシラナーゼが、漂白方法に使用される事は報告されている。これらの幾つかは、次の種由来のものである（括弧内は報告されたキシラナーゼ活性の最適ｐＨと温度である）：
バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）（pH=７〜９、温度＝４０℃，Nissen et al., 1992. Progress in Biotechnology 7: 325-337）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（pH＝７、温度＝６５℃、国際特許出願WO 91/10724）、ディクトボグロマス・サーモフィリウム（Dictvoglomus thermophirium）（pH=６〜８、温度＝７０℃、ヨーロッパ特許出願EPO 511933）、ロードサーマス（Rhodothermus）（pH=5.5〜6.5、温度=80〜100℃、ヨーロッパ特許出願EPO 538177）、サーモトーガ（Thermotoga）（pH=５〜６、温度＝９０℃、国際特許出願WO 93/19171）及びサーモアナエロバクテル・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus（温度=68℃、Deblois and Wiegel. 1992. Progress in Biotechnology 7: 487-490）。
漂白用としてこれらのキシラナーゼの幾つかの使用が請求されているが、≧80℃の温度で、顕著な脱リグニン活性として望ましい特性を有する事は、今日まで報告されていない。
発明の要約
本発明は、ニュージーランドの温泉から純粋培養で単離された嫌気性好熱性微生物から得られるキシラナーゼを開示する。この微生物は、1994年４月14日付けで、オランダ国のバルン（Baarn）の中央微生物寄託所（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）（CBS）に寄託された。
また、本発明は、少なくとも80℃の温度で相当なキシラナーゼ活性を有する酵素を開示する。更に、本発明は、前記キシラナーゼが、少なくとも80℃の温度で顕著な脱リグニン活性を有する事を開示する。前記酵素は寄託された株から得られる。
更に、本発明は、80℃の温度で活性なキシラナーゼの調製方法を開示する。この方法は、適当な培地での本発明の寄託微生物の培養と、次いで表示した活性を有するこの酵素の回収を含む。
又、本発明は、上記キシラナーゼをコードする遺伝子のクローニングを開示する。また、宿主細胞でのこれら遺伝子の発現が開示される。この酵素は、この方法で得られた時は略純粋である。この様に、また本発明は、キシラナーゼを得る為のその他の方法、即ち組み換えDNAの発現を開示する。
更に、本発明は、高温で、高いpHを使用する工業的適用条件に等しい条件下でのキシラナーゼの適用を開示する。
【図面の簡単な説明】
図１は、６つのエクストレモフィル株（extremophilic strains）の内部共通配列（internal consensus sequence）の系統分析を示す。配列は、次の順に命名される：微生物／前進プライマー／組み換え数。表示された枝番は、この配列のブーツストラップ分析（boot-strap analysis）から得た値である。
図２は、ファミリーＧの内部共通配列の順次配列を示す。
図３は、pJLA602中のSphl-BamHlフラグメントとして挿入されたTG456由来のxynDのキシラナーゼドメインを示す。
図４は、実施例１５で開示されている漂白された広葉樹パルプＴＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン−リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図５は、実施例１５で開示されている漂白された広葉樹パルプＥＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図６は、実施例１５で開示されている漂白された針葉樹パルプＴＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図７は、実施例１５で開示されている漂白された針葉樹パルプＥＣＦから調製された紙の紙質を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。ショッペン-リーグラー値（Schoppen-Riegler values）に関する引っ張り係数（A）、空隙率（B）、引き裂き（C）及び破裂（D）が与えられる。
図８は、ＴＣＦ（Ａ）及びＥＣＦ（Ｂ）漂白広葉樹パルプ及びＴＣＦ（Ｃ）及びＥＣＦ（Ｄ）漂白針葉樹パルプの、実施例１５で決定される精製曲線を示す。Refは酵素無し、715はTG456 xynD、716はTG53 xynDである。
図９は、TG456 xynDキシラナーゼと、パルプチームHB（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）の最適pH（A）と最適温度（B）との比較を示す。
図10は、80℃、pH7.0（A）と65℃、pH9.0（B）での、TG456 xynDキシラナーゼと、パルプチームHB（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）の熱安定性の比較を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ニュージーランドの温泉から単離された微生物を開示する。これら微生物は、嫌気性好熱性バクテリアとしての特徴を持ち、レイニイ（Rainey）（1992. PhD thesis, University of Waikato, Hamilton, New Zealand）によって分類された。
この微生物は、キシラン−アガー分散アッセイを使用して順次スクリーンされた。このテストで透明帯を示した株は潜在的キシラナーゼ産生株として選択された。この株は、ｐＨ7.0と、微生物による温度75又は80℃の嫌気性条件下で増殖した。限外ろ過で濃縮後、培養ブロスのキシラナーゼ活性を、pH=6.5及び９、温度＝８０℃でのアッセイで分析した（実施例１）。
６つの異なる株が、表示された条件下でキシラナーゼ活性を産生する事が分かった。これら微生物は、１９９４年４月１４日付で、寄託番号ＣＢＳ211.94、ＣＢＳ212.94、ＣＢＳ213.94、ＣＢＳ214.94、ＣＢＳ215.94及びＣＢＳ216.94で寄託された。
又、本発明は、キシラナーゼ活性を有する酵素、特に少なくとも80℃の温度で、且つpH６以上で顕著なキシラナーゼ活性を有する酵素を開示する。前記酵素は、寄託株の突然変異株及び変種からも得られる。
「顕著な活性」なる表現は、本発明の酵素が、少なくとも８０℃で、少なくとも４０％の活性を有する事を意味するので、これらは、７０℃では、好ましくはこれは少なくとも６０％であり、より好ましくは約少なくとも８０％であり、より一層好ましくは約２００％である。
更に、本発明は、約８０℃の温度で活性であるか、又はこれらの条件下で顕著な活性を有するキシラナーゼの調製方法を開示する。この方法は、適当な培地で本発明の寄託された微生物の培養、次いで表示の活性を有する酵素の回収を含む。キシラナーゼの単離及び精製は、常法に従って行う事が出来る。
酵素の部分的精製は、実施例２で例示される。この実施例では、細胞は、まず始めに中空繊維ろ過（hollow fiber filtration）で除去される。次いで、タンパク質が、１Ｍの最終濃度までの硫酸アンモニウムの添加によって更に精製される。この溶液を、次いでフェニルセファロースカラムに入れ、タンパク質が、１Ｍ塩化ナトリウムで溶出される。最後に、このタンパク質が、限外ろ過で濃縮され、塩は隔膜ろ過（diafiltration）で除去される。
アルカリｐＨでのキシラナーゼのキシラン分解能を確認するため、ｐＨ７及び９で、表示の株から単離したキシラナーゼの活性の比較を、異なる基質を使用して、７０℃で行った（実施例３）。このキシラナーゼは、アルカリｐＨで著しい活性を有する事を示した。基質及びアッセイによって、ｐＨ９では、このキシラナーゼは、ｐＨ７でそれらが有する活性の約２０％以上を有する。或るキシラナーゼは、ｐＨ９で、ｐＨ７での活性の８０％を保持する事を示した。
表示の株から単離されたキシラナーゼの熱安定性は、著しく変化する。幾つかのキシラナーゼは、非常に熱安定性である。それらは、pH=9で、温度80℃で２時間以上の半減期を有する（実施例４参照）。本発明のキシラナーゼのpH=9で、温度80℃での半減期は、少なくとも１０分、好ましくはこれらの条件下で２０分以上、より好ましくは３０分以上、なお一層好ましくは６０分以上で、最も好ましくは、半減期は１２０分以上である。
又、本発明は、嫌気性好熱性株から得られるキシラナーゼをコードする事を特徴とするＤＮＡ配列のクローン化及び発現を開示する。本発明は、本発明のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む事を特徴とする発現ベクターを含むベクターを開示する。それらのベクターの一つで形質転換される事を特徴とする微生物宿主細胞も開示される。
本発明のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列の配列分析は、得られる配列が二つの酵素類、即ちギルケス等（Gilkes et al.）（1991、Microbiol. Rev. 55: 303-315）によって以前に定義されたF-型及びG-型に分類される事を示した。
本発明の微生物から得られるxynA、xynB及びxynC配列は、F-型キシラナーゼに属する。これらの微生物から得られるxynD配列は、G-型キシラナーゼに属する（実施例６、７、８及び９参照）。好熱性微生物由来のG-型キシラナーゼが、今までで最上のものである事を既に開示したものはない。本発明のキシラナーゼの源であるこの好熱性微生物は、ここにおいて、65℃より高い最適増殖温度を持つ微生物と定義される。好ましくは、この最適増殖温度は68℃より高く、より好ましくはこの最適増殖温度は70℃より高く、最も好ましくはこの最適増殖温度は75℃以上である。大腸菌での本発明の、F-型及びG-型二つのキシラナーゼDNA配列の発現は、活性タンパク質を与える事が示される（実施例１０及び１１参照）。このタンパク質は、８０℃の温度で活性である。
本発明開示の実施例で証明されたクローン化及び発現は、相同性微生物での遺伝子の発現を可能とする。また、発現は、適切な発現と分泌調節配列（secretion regulating sequences）を使用して、他の微生物において行う事も出来る。使用される微生物としては、酵母、菌及びバクテリアが挙げられる。特定の微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）及びバチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）から選ばれた株が挙げられる。
本発明の酵素は、オートスペルト（oat spelt）キシラン及びカンバ材キシランに関して著しい活性を有する事を示した。更に、本発明の酵素は、それらの漂白能力が試験された。この漂白能力は本発明の酵素の脱リグニン化活性によって決定される。本発明は、幾つかの木材パルプで測定された様な、顕著な脱リグニン化活性を有する酵素を開示する。酵素調製物、キシラナーゼは、少なくとも80℃の温度で、木材パルプの脱リグニン化を可能とする。「木材パルプ」なる表現は、広い意味で理解されるべきもので、一切のリグノセルロース物質を含む事を意図するものである。
この酵素は、広葉樹及び針葉樹パルプの両方について、それらの漂白能力が試験された。リグニン除去は、二種類の方法で測定された（実施例５）。培地でのリグニンは、Ａ３００試験で決定された。この試験で、全ての調製物が、広葉樹、針葉樹のいずれについても、８０℃で顕著な脱リグニン化活性を示した。ｐＨ９で、８０℃で針葉樹についての活性は、ｐＨ６での活性の少なくとも４３％であり、広葉樹については、３つの株が、ｐＨ９で、ｐＨ６での活性に比べて５０％以上の活性を示し、他の３つが１８〜３０％の活性を示した。又、針葉樹パルプの漂白は、カッパ（kappa）試験を使用して、パルプのリグニン含量の減少を決定する事によって測定された。カッパ値（kappa number）は、キシラナーゼ調製物で以て、pH９の８０℃でのパルプ培養後に、0.5〜0.4単位減少した。
更に、本発明の酵素の漂白能力は、例えば、常法で処理されたパルプで造られた紙、更に前記の酵素で培養したパルプで造られた紙と、酵素無しの培養で造られた紙とを比較して、そのＩＳＯ白色度の増加でもって測定出来る。前記の常法処理は、従来技術により過酸化水素、オゾン、塩素ガス或いは二酸化塩素の如き漂白剤への曝露を含む。
大腸菌で発現される本発明のクローン化F-型及びG-型キシラナーゼは、針葉樹及び広葉樹パルプ両方についてのECF漂白実験で、それらの性能が試験された（実施例１２参照）。驚くべきことに、G-型キシラナーゼ（xynD遺伝子でコード化された）は、最上のF-型キシラナーゼで、せいぜい1.2%ISO白色度増加に比べて、酵素無しの対照より6.8%ISOデルタ白色度までの、F-型キシラナーゼと比較して、針葉樹及び広葉樹の両方の漂白処理において一層良好な性能を示す事が観察された。更に、熱安定性G-型キシラナーゼの試験は、これらが、針葉樹及び広葉樹パルプ双方についてのTCF漂白実験でも優れた結果を生む事を示した（実施例１４及び１５参照）。この様にして漂白されたパルプから造られた紙の性質の検証は、酵素無しの対照の紙と殆ど変わらない事を示した。
クローン化G-型キシラナーゼは、高いpHにおいても極めて熱安定性である。８０℃、pH7.0で、３０分以上の半減期が測定された。６５℃、ｐＨ9.0では、この酵素の半減期は、１２０分の培養後でも顕著に減少しない（実施例１６参照）。
本発明のG-型キシラナーゼの、pH９．０で６５℃での半減期は、少なくとも１０分であり、好ましくはこれらの条件下での半減期は、２０分以上、より好ましくは３０分以上、なお一層好ましくは６０分以上で、最も好ましくは半減期は１２０分以上である。
本発明は、その内部共通フラグメント（internal consensus fragment）（ICF）が、配列番号12のICFと80%以上の同一性を示す熱安定性G-型キシラナーゼをコード化するＤＮＡ配列を開示する。このG-型ICFは、ここにおいて、配列番号12において、配列番号４及び配列番号５に相当する配列の間（ヌクレオチド位置２９５〜６２３）に在るフラグメント、と定義される。好ましくは、このG-型ICFとの同一性は、87%以上、より好ましくはこの同一性は95%以上、最も好ましくは、この同一性は99%以上である。
更に、その他の実施態様において、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列で、少なくとも70%の同一性を共有するG-型キシラナーゼを開示する。好ましくは、このアミノ酸同一性は、80%以上、より好ましくは、このアミノ酸同一性は90%以上、なお一層好ましくはこのアミノ酸同一性は95%以上、最も好ましくはこのアミノ酸同一性は99%以上である。
本発明の酵素は、上に述べたパルプ調製方法での酸素脱リグニン工程後に直ちに使用出来る。この酵素の温度並びにpH特性の結果として、高価な冷却及びpH調節が避けられる。本発明のまた別の実施態様では、この酵素は酸素脱リグニン工程の前又は工程中で使用される。この工程前ではリグニン濃度が高く、従ってキシラナーゼの適用効果は一層大きい。
更に、本発明の酵素調製物の適用として、特に、木材が本発明による前記酵素調製物で処理される方法が開示される。
同様に、フラッフパルプ（fluff pulp）が、本発明の酵素調製物で処理出来る。
更に、本発明は、本発明の酵素調製物で処理された木材パルプから作られる紙、ボード及びフラッフパルプに関する。
実施例１
熱安定性キシラナーゼ活性産生株の単離
キシラナーゼ産生微生物を、ニュージーランドの様々な高温地域にある温泉から得た。この株は、７０℃以上の温度で、６．０〜８．５の間のｐＨの温泉から、基質としてオートスペルトキシランを使用して、現場での濃縮で単離された。株の培養物は、サンプルが採取された現場の温度に相当する温度（７０°、７５°又は８５℃）で、２／１培地＋キシランの実験室での、更なる嫌気性培養で得られた。
２／１培地＋キシランの組成は次の通りである。
ＣＢＳ（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）に寄託した６つの株は、表１に示される。
カラマツ樹キシラン（6.7g）を、250mlの水に入れ、数時間、室温で攪拌して溶解した。レマゾールブリリアントブルーＲ（10.0g）をこの混合物に添加した。溶解後、20mlの酢酸ナトリウム溶液（20mlの蒸留水中に2.7gの酢酸ナトリウム）滴状で添加した。次いで、水70ml中の水酸化ナトリウム6gの溶液を添加し、攪拌を18時間続けた。形成された染色キシランを、96%エタノール700mlを添加して沈殿させた。６時間静置した後、沈殿物をろ過（Whatman GF/A）で分離した。フィルターケークを、96%エタノール/0.05M酢酸ナトリウムの2:1の混合物の３ｌで、次いで96%エタノール１ｌ及びアセトン３ｌで、ろ液が透明になるまで洗浄した。収量は10.5g染色キシランであった。
酵素アッセイの為、5.1gの染色キシランを、150mlの0.1M MOPSバッファー、pH6.8に溶解した。混合物を、70℃で、４時間攪拌して溶解した。室温まで冷却後、不溶解物を、10,000x gで、遠心分離機で除去した。活性アッセイの為、3.34% w/v染色キシランを含む貯蔵溶液を、0.1M MOPSバッファー、pH6.8で希釈して、0.5%染色キシラン作業溶液を得た。
染色キシランを使用する酵素アッセイは、混合しながら、適当なバッファーで、0.9ml染色キシラン溶液（0.5%）を、0.6ml酵素調製物に添加して行った。この混合物の一部（0.4ml）を、対照（ブランク）として96%エタノールの0.8ml中に移した。残りの溶液を、70℃で、90分間培養した。この試験混合物の0.4mlを、96%エタノールの0.8mlに移す事によって、反応を停止させた。この溶液を、未開裂染色キシランを沈殿させる為に、室温で、30分間放置した。この試験サンプルを、ベックマンマイクロフュージE（Beckman Microfuge E)で、全速力で５分間遠心分離に掛け、上澄み液の吸光度を、分光光度計で、５９５ｎｍで測定した。
実施例２
酵素調製物の単離
嫌気性醗酵を、７５又は８０℃のいづれかの温度（培養される微生物による）で、２４時間、静置培養で、２／１＋キシラン培地の１８００ｍｌを含む２ｌのスコット瓶（Schott bottle）中で行った。ウエル増殖培養物の１０ｌから、０．０１％トリトンX１００（Amicon DC 10 LA及びAmicon 0.1μm H5MP01-43フィルター）を使用して、中空繊維ろ過で、細胞を除去した。最終濃度の１Ｍまで、硫酸アンモニウムを、細胞無しの培養培地に添加した。得られた溶液を、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡にされたフェニルセファロース（Pharmacia-Fast Flow-low置換）の１ｌを含む９ｘ１５cmのカラムにポンプで送った。流速は150-200ml/分であった。カラムを、５ｌの１Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄した。キシラナーゼを５ｌの１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。画分を、500-1000ml容量で収集した。キシラナーゼ活性をその画分で決定し（実施例３で開示されるＰＡＨＢＡＨ法で）、活性画分をプールし、少容量まで限外ろ過し、ＹＭ２膜を備えたアミコン攪拌セル（Amicon Stirred Cell）（Model 2000A又は8400）を使用して、塩濃度を低下させる為に隔膜ろ過した。
実施例３
部分的精製酵素調製物のキシラナーゼ活性の特徴
分析方法
キシラナーゼ活性のアッセイは、サムナーアッセイ（Sumner assay）（Sumner et al., 1921. J. Biol. Chem. 47: 5-9）を変更した方法を使用して行った。別に、キシラナーゼ活性を、レバー（Lever）（1973. Biol. Med. 1: 274-281）の方法を基本とした、変更PAHBAHアッセイを使用して決定した。
方法１
オートスペルトキシランについてのキシラナーゼ活性のサムナーアッセイ
オートスペルトキシラン基質溶液を、次の様にして調製した。
４ｇのオートスペルトキシランを、１００ｍｌの蒸留水に懸濁し、この懸濁液を６分間、超音波処理し（超音波装置：ソニックアンドマテリアルス、ビブラセル タイプＶＣ２５０Ｂ）、１００℃で、１０分間培養し、ソーバルＲＣ−５Ｂ遠心分離機で、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に掛けた。この上澄み液を基質溶液として使用した。約２％のオートスペルトキシランを含有する。
アッセイは、次の様にして行った。
試験管を、２００μｌのオートスペルトキシラン溶液、適当なバッファーで希釈した酵素調製物（実施例２）の６００μｌ液で充たした。この試験管を、水浴中で、１５分間、測定条件下で培養した。培養後、７．２ｍｌのＤＮＳ（dinitrosalicylic acid、ジニトロサリチル酸）試薬を添加した。この混合物を、水浴中、１００℃で１０分間加熱し、その後、この試験管を氷上で冷却した。吸光度は、５７５ｎｍで測定した。この酵素試料のバックグラウンド吸光度を取り除く為、対照実験を次の様にして行った。
酵素調製物無しの基質を含む試験管を、前記試験試料と同様の条件下で培養した。１５分の培養後、７．２ｍｌのＤＮＳと酵素試料を、この順序で添加した。
一単位のキシラナーゼ活性（ｘＵ）とは、還元糖として測定される、１μモルのキシロース当量を産生する酵素の量と定義される。
実際の測定条件は、ｐＨ７．０、９．０及び７０℃であった。ｐＨ７では、５０ｍＭリン酸塩バッファーを使用し、ｐＨ９では、５０ｍＮほう酸塩／ＫＯＨバッファーを使用した。
カバ材キシランについてのキシラナーゼ活性のサムナーアッセイ
方法１で開示の方法と殆ど同じ方法を使用した。オートスペルトキシラン溶液に代えて、カバ材キシラン懸濁液を使用した。カバ材キシラン基質溶液は、次の様にして調製した。
４ｇのカバ材キシランを、０．２ＮＮａＯＨ５０ｍｌに懸濁し、明らかに溶解するまで震盪した。溶液のｐＨを氷酢酸で７．０に調整し、水を加えて１００ｍｌとし、この溶液を、ソーバルＲＣ−５Ｂ遠心分離機で、１０，０００ｒｐｍで遠心分離に掛けた。この上澄み液を基質溶液として使用した。約３％のカバ材キシランを含有する。試験条件は、ｐＨ７及び９で、７０℃であった。結果を表３に示す。
オートスペルトキシランについてのキシラナーゼ活性のＰＡＨＢＡＨアッセイ
ＰＡＨＢＡＨ法（Lever, 1973）の変更は、ＰＡＨＢＡＨ試薬に対して行い、次の通りである：
０．０５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム、０．０２Ｍ塩化カルシウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び０．１Ｍｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）。
酵素調製物のアッセイの為、０．０５ｍｌ又は０．１ｍｌの酵素調製物を、０．３ｍｌの基質バッファー（５０ｍＭビス−トリス−プロパン、必要とされるｐＨ、＋０．２％オートスペルトキシラン懸濁液）と混合した。適当量の水を、最終容量が０．５ｍｌになるまで添加した。培養は、通常通り、７０℃、３０分間で行った。反応停止の為、１．０ｍｌのＰＡＨＢＡＨ試薬を培養後に添加し、この試料を、１００℃で６分間加熱した。ブランクは、酵素がＰＡＨＢＡＨ試薬の後に添加される試料と同じに培養した基質バッファーから成る。４２０ｎｍでの吸光度を決定する前に、上澄み液から、懸濁したキシランを除去する為に、全ての試料をベックマンマイクロフュージE（Beckman Microfuge E）で、全速力で１分間遠心分離に掛けた。結果を表４に示す。この表から、ｐＨ９．０、８０℃で、全ての株は、ｐＨ６．０、７０℃に比較して、尚顕著な活性を有する事が結論付けられる。
キシラナーゼ活性の熱安定性
酵素調製物のキシラナーゼ活性の半減期は、次の様にして決定した。
酵素調製物を、１００ｍＭＴＡＰＳバッファー（８０℃でｐＨ９．０）中で、１／１０に希釈し、８０℃で培養した。試料を、０、１０、２０、４０、６０及び１２０分で取り出し、この最終アッセイに都合のよい１／２０〜１／１００の最終希釈まで、氷上の１００ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（７０℃でｐＨ６．０）に添加した。この試料を、それらが実施例３の方法３に記載されたＰＡＨＢＡＨアッセイ法を使用して、７０℃、ｐＨ６．０でアッセイされるまで氷上に保持した。結果を表５に示す。
脱リグニン活性
キシラナーゼの脱リグニン性能は、二種類の方法で決定した。Ａ３００法を使用して、酵素処理後にパルプから放出されたリグニン量を推定した。カッパアッセイ（kappa assay）を使用して、処理後のパルプの残留リグニン含有量を測定した。
方法１：Ａ３００試験
Ａ３００アッセイで脱リグニンを測定する為、酵素調製物を、針葉樹又は広葉樹パルプと一緒に、湿潤パルプのグラム当たり２ＰＡＨＢＡＨ単位の濃度（乾燥パルプのグラム当たり約６ＰＡＨＢＡＨ単位）で培養した。培養は、８０℃で、ＭＯＰＳバッファーで、ｐＨ６．０とＴＡＰＳバッファーで、ｐＨ９．０の両方で２時間行った。培養でのパルプ濃度は、０．１ｇ湿潤重量／ｍｌであった。二種類のパルプを使用した。即ち、酸素脱リグニン後のクラフト針葉樹パルプ及び酸素脱リグニン後のクラフト広葉樹パルプである。これらパルプの性質を表６に示す。
カッパ試験は、ＴＡＰＰＩプロトコルＴ２３６（ＴＡＰＰＩ、Technology Park, Atranta, USA、から入手可能）に依り、幾らかの変更を加えて行った。酵素調製物を、10xU/ｇパルプ（乾燥重量）の投与量で添加し、ｐＨ９、８０℃で２時間培養した。対照として、パルプを、同じ時間、同じ条件下で、酵素添加無しで培養した。表６で示した性質の酸素脱リグニン化針葉樹パルプを使用した。
酵素添加のカッパ値と、酵素添加無しのカッパ値の間の相違は、カッパ減少と呼び、脱リグニンの値である。カッパ減少は、表８に示される。このアッセイで、≧０．５の値は、バックグラウンド水準より著しく高い値である。それ故、前の実施例同様に、この試料は、酵素が、８０℃で著しい脱リグニン化活性を持つ事を示す。
熱安定性F-型キシラナーゼをコード化する遺伝子の内部一致フラグメントのコローニング及び配列決定
６．１ キシラナーゼ遺伝子の内部フラグメントのＰＣＲ増幅
３つのＰＣＲプライマーを、キシラナーゼ遺伝子の内部共通フラグメントを増幅するのに使用した。即ち、２種類の前進プライマー（xynFA、｛５′CAC ACK CTK GTK TGG CA ３′、配列番号１｝及びxynFB、｛５′CAT ACK TTK GTT TGG CA ３′、配列番号２｝）及び１種類の復帰プライマー（xynR、｛TMG TTK ACM ACR TCC CA、配列番号３｝）。xynFA及びxynFBプライマーは、同じ場所に結合しているが、前進共通領域でのキシラナーゼ遺伝子の配列における僅かな相違で配列において僅かに相違する。PCR条件は、次の通りであった：（94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分）ｘ３０。全てのファミリーＦ内部共通フラグメントは、略３５０ｂｐであった。
６．２ ＰＣＲ生成物の配列決定
全ての内部キシラナーゼＰＣＲ−生成物（約３５０ｂｐ）は、Ｍ１３ｍｐ１０配列ベクターのＳｍａｌ（ホスファターゼ化）部位にクローニングする前に、以下に記述の様に、末端修復（逆充填）された。
ステップ１−酢酸アンモニウム沈殿：
（ａ）５０μｌＰＣＲ混合物を、ＴＥバッファー（１０ｍＭTris-Cl、１ｍＭEDTA、pH8.0）で１００μｌとする。（ｂ）１００μｌの4M酢酸アンモニウムと250μｌの100%エタノールを添加する。（ｃ）氷上で１５分間（又は−２０℃で一昼夜）培養する。（ｄ）１６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離に掛け、上澄み液を棄てる。（ｅ）５００μｌの冷い７０％エタノール中でペレットを洗浄する。再遠心分離（１６，０００ｒｐｍで５分間）に掛け、上澄み液を棄てる。（ｆ）ペレットを、真空下で５分間乾燥し、２０μｌのＴＥバッファーに再懸濁する。
ステップ２−ＰＣＲフラグメントの末端修復：
（ａ）２０μｌの沈殿ＤＮＡに、３μｌの１０ｘリガーゼバッファー（ベーリンガーマンハイム）、１μｌの１２．５ｍＭｄＮＴＰ’ｓ（ファーマシアＤＮＡ重合混合物）、０．５μｌ（５Ｕ）の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼラージ（クレノウ（Klenow））フラグメント（ＢＲＬテクノロジーLtd.）、０．２５μｌ（２．５Ｕ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）、０．２５μｌ（２．５Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム）及び水を、３０μｌまで添加する。（ｂ）３７℃で３０分間培養し、７０℃、１０分間の培養で酵素を熱的に死滅させる。
ステップ３−末端修復されたキシラナーゼフラグメントのゲル精製：
（ａ）ＤＮＡを、１ｘトリス−アセテートバッファー（ｐＨ７．８）の２％ＬＭＰアガロースに通す。（ｂ）アガロースから、３５０ｂｐキシラナーゼバンドを削除する。（ｃ）ジェンクリーン方法（GeneClean procedure）（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．）を使用して、アガローススライスからＤＮＡを精製する。
ステップ４−Ｍ１３ｍｐ１０（Smal-ホスファターゼ化）中への連結反応：
（ａ）１μｌのＭ１３ｍｐ１０ベクターＤＮＡ（約１０ｎｇ／μｌまで適当に希釈した）、２０〜５０ｎｇのインサートＤＮＡ（キシラナーゼ共通プライマーフラグメント）、１μｌの１０ｘリガーゼバッファー（ベーリンガーマンハイム）、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム）及び水を１０μｌまで混合する。（ｂ）室温で、一昼夜培養する。
ステップ５−大腸菌株ＪＭ１０１への連結反応混合物の形質転換：
（ａ）チュン等（Chung et al.）（1989. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175.）のDMSO−仲介形質転換技術を使用して、全体で１０μｌの連結反応混合物でＪＭ１０１を形質転換する。（ｂ）Ｍ１３／ＪＭ１０１をプレートにして、標準方法（サムブルック等（Sambrook et al.）、1989. Cold Spring Harbour Laboratory Press）を使用して、組み換えM13プラスミドを単離する。
内部キシラナーゼ共通フラグメントを含む組み換えＭ１３ファージを、染色−プライマー化学を使用して（使用されたシークエンスプライマーは、一般的なＭ１３前進（染色標識化）プライマー（ＡＢＩ Ltd.）であった）、アプライドバイオシステム３７３Ａ自動化ＤＮＡシークエンサーで、ssＤＮＡ（Sambrook et al. 1989）から配列した。全てのＤＮＡ配列データは、シリコングラフィックパーソナルイリスワークステーション（Silicon Graphics Personal Iris Workstation）で作動するG C G配列分析ソフト（イリスに装着されている）を使用して分析、処理された。
ファミリーＦキシラナーゼ内部フラグメント配列結果：
キシラナーゼ共通プライマーを使用して、表１に示される６つの株から増幅されたＰＣＲフラグメントを基にして、各微生物は、ファミリーＦキシラナーゼ遺伝子を１〜３の間で含む事が予測された。この結果は、公知のブートストラップ分析（boot-strap analysis）（Wisconsin Molecular Biology Pakage, Devereux, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-394）で分析された。図１において、種々のキシラナーゼ及び株の系統樹が示される。ファミリーＦ共通フラグメントのヌクレオチド配列から、各微生物は３つの異なるファミリーＦ遺伝子を含む事が明らかである。各微生物のファミリーＦキシラナーゼ遺伝子の各々は、クラスターＡ、クラスターＢ及びクラスターＣと表示される別々のキシラナーゼクラスター（ヌクレオチドと１級アミノ酸配列相同性を基とした）に属する。ＴＧ４５６から増幅された完全な長さのキシラナーゼは、クラスターＡに属し、後にＴＧ４５６ xynAと命名された。更に、ＴＧ４５６クラスターＢキシラナーゼ（ＴＧ４５６ xynB）とクラスターＣキシラナーゼ（ＴＧ４５６ xynC）から内部共通フラグメントが同定された。
実施例７
熱安定性G-型キシラナーゼをコード化する遺伝子の内部共通フラグメントのクローニング及び配列決定
７．１ Ｇ−型キシラナーゼ遺伝子の内部フラグメントのＰＣＲ増幅
ファミリーＧの内部共通フラグメント（ICFs）を、前進及び復帰ファミリーＧ共通プライマー（ＧＦ及びＧＲ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で単離した。このＰＣＲの内容は次の通りであった。注：℃は摂氏度を表し、ｘはサイクルの数を表す（即ち、ｘ１は１サイクルに等しい）。
（94℃で４分）ｘ１
（94℃で１分、45℃で１分、72℃で１分）ｘ３５
（94℃で１分、45℃で１分、72℃で６分）ｘ１
ＰＣＲは、５０μｌの反応中で、次の成分を使用して行った：１００ｎｇのＧＦプライマー、１００ｎｇのＧＲプライマー、０．２５ｍＭｄＮＴＰｓ、１単位のタックポリメラーゼ（Taq Polymerase）、０．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．８、５０ｍＭ塩化カリ、０．００１％ゼラチン、１〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ。
２つのＰＣＲプライマーを、キシラナーゼ遺伝子の共通フラグメントを増幅するのに使用した：
２種類のＰＣＲ生成物（ＤＮＡフラグメント）が増幅された：予想通りのサイズの３００ｂｐフラグメントと、予想外の６００ｂｐＰＣＲ生成物−この６００ｂｐフラグメントは３００ｂｐＰＣＲ−生成物の頭−尾ディマーであった：多分、この６００ｂｐ種は、ＧＦとＧＲプライマーの間の相同の結果として、ＰＣＲ反応中での自己プライミング（self-priming）の結果である。
７．２ ＰＣＲ生成物の配列決定
各微生物から増幅された３００ｂｐフラグメントが末端修復された（実施例６参照）。
末端修復されたフラグメントを、次いでジェンクリーン方法（GeneClean procedure）（Ｂｉｏ １０１、La Jolla、Calif.）を使用して、１％低溶融温度アガロースゲルから精製した（トリス−アセテート実行バッファー中で実行する）。凡そ１０ｎｇの末端修復された、ゲル精製300ICFsが、10μlの反応中で、BM T4 DNAリガーゼを使用して、M13mp10のSmal部位に連結された。
７．３ ＰＣＲ生成物の配列決定
株ＴＧ４５７とＴＧ５３由来の６つの独立ファージを配列した。これらの株の各々には、一本鎖のＧ−型キシラナーゼ遺伝子のみが存在する事が、この配列（図２）から明らかである。更に、ＴＧ４５３、ＴＧ４５６、ＴＧ４７９及びＴＧ６３１由来のファミリーＧ−ＩＣＦsから成るM13mp10組み換え体を配列した。これらの微生物は、ＤＮＡ配列での変化は１３％までであるが、殆ど同じキシラナーゼをコード化する全てのファミリーＧキシラナーゼ遺伝子から成っていた。
実施例８
完全な長さのＦ−型キシラナーゼの配列
内部ＰＣＲフラグメントの基体につき、３つの異なるタイプのＦ−キシラナーゼ遺伝子が同定された：xynA、xynB及びxynC。
ゲノムウオーキングPCR（Genome Walking PCR）（GWPRCR）を使用して、完全な長さのキシラナーゼ遺伝子が、殆どの株から単離された。
ＴＧ４５６xynA遺伝子の完全に長い配列が決定された。xynA遺伝子の完全な配列は、配列番号６で与えられる。ＴＧ４５６キシラナーゼＡのコード化アミノ酸配列は、配列番号７で与えられる。
xynB及びxynCに対しては、遺伝子が、１つのキシラナーゼドメインで複数ドメイン酵素をコード化する事が発見された。これらのキシラナーゼドメインは、キシラナーゼドメインの境界にある配列上で設計されたＰＣＲプライマーを使用してサブクローン化された。
ＴＧ４５６由来のxynB及びxynCの為の部分配列情報は、配列番号８及び配列番号１０のそれぞれで与えられる。ＴＧ４５６キシラナーゼＢ及びＣのコード化されたアミノ酸配列は、配列番号９及び配列番号１１のそれぞれで与えられる。
実施例９
Ｇ−型キシラナーゼ遺伝子の完全な配列
ゲノムウオーキングPCR（Genome Walking PCR）（GWPRCR）を使用して、完全な長さのxynD遺伝子が、殆どの株から単離された。
ＴＧ４５６のxynD遺伝子の完全な配列は、配列番号12で与えられ、コード化ＴＧ４５６キシラナーゼＤアミノ酸配列は配列番号１３で与えられる。
実施例１０
クローン化遺伝子からのキシラナーゼ産生の為の発現ベクターと宿主の構築
共通ＰＣＲプライマーにおいて、適当な発現ベクターでキシラナーゼ遺伝子のサブクローニングを許す適当な制限部位が設計された。
xynA及びxynC遺伝子は、フレーム融合（in-flame fusion）の為に、ランブダL及びRプロモーター（lambda L and R promorters）［Gibbs, M. G. Saul D. J, Luthi, E., and Bergquist, P. L.（1992）．「カルドセラムサッカロリチカム」（Caldocellum saccharolyticum）由来のβ-マンナナースは、複数ドメイン酵素の一部である。Appl. Environ. Microbiol. 58（12）: 3864-3867］で以て、pJLA602の発現ベクターのNcol-BamHIの中に挿入される［Schauder, B., Bluker, H., Frank R., and McCarthy, J. E. G.（1987）. Inducible Expression Vectors Incorporating the Escherichia coli atpE Transcriptional Initiation Region. Gene 52: 279-283］。
xynB及びxynD遺伝子は、pJLA602の非反復Sphl-BamHI部位に挿入された。
構築物は、標準の形質転換技術を使用して、大腸菌JM101及び大腸菌DH５α中に転移された。
図３は、Sphl-BamHIフラグメントのpJLA602に挿入されたTG456由来のxynDのキシラナーゼドメインの配列を示す。
実施例１１
クローン化キシラナーゼの産生及び回収
クローン化F-型キシラナーゼ由来のタンパク質試料を得る為に、大腸菌クローンを、10.0リットル容量のLH醗酵器（シリーズ２１０）で醗酵させた。この培養物を、通気（４．８ｌ／分）、震盪（５００rpm）、及びpH調節（pH7.1）を続けながら、誘導（42℃）まで30℃に維持した。使用した培地及びその他の添加物は以下の通りである。
ルリアブロス（接種培養用）：
トリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ５ｇ
塩化ナトリウム １０ｇ
水 １０００ｍｌまで
醗酵器実行用ＢＧＭ２バルク増殖培地（量は最終培地用、即ち８．５ｌの２バッチ）：
塩化アンモニウム ３．２２ｇ
リン酸二水素カリウム １．０５ｇ
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．１３５ｇ
硫酸カリウム ０．０４３ｇ
硫酸第一鉄・７水和物 ０．００３ｇ
ＳＬ−１０微量元素 １ｍｌ
トリプトン １０ｇ
酵母抽出物 ４．７ｇ
グリセロール ３４ｍｌ
水 １０００ｍｌまで
その中に水約６リットルの入った醗酵容器を１２１℃で３０分間、加圧加熱処理で殺菌した後、３０℃に冷却した。培地濃縮物（８．５折り畳み濃縮物（fold concentrate））を、殺菌した０．２μｍカートリッジフィルター（Sartorius）を通して汲み上げた。培養前に、次の様な添加を行った。
消泡剤（ベバロイド5901） １０ｍｌ（加圧加熱処理）
塩化カルシウム １ｍｌ（加圧加熱処理）
アンピシリン ８５０ｍｇ（フィルター殺菌処理）
チアミン（JM101培養物のみ） ８．７ｍｇ（フィルター殺菌処理）
液容量を、次いで８．５ｌに調整した。培地のｐＨを７．１に調整した。４．８ｌ／分の流速で、醗酵器を通してフィルター殺菌した空気を散布した。フィンガープローブを通して、温冷水循環で醗酵器温度を３０℃に保持した。ｐＨ調節は、オートクレーブ下の水酸化ナトリウム（５Ｍ）又は硫酸（２Ｍ）の添加によって行った。醗酵器の攪拌速度は５００ｒｐｍであった。
培養は、０．２〜０．４のＯＤ650の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと、ルリアブロスで増殖した大腸菌クローンの新鮮な培養物の液（約１０．０ｍｌ）で開始した。この細胞を、３０℃で１１〜１３の間のＯＤ650に増殖し、次いで、培地濃縮物で回分飼育（fed-batced）し、回収し、１４〜１６の間のＯＤ650に増殖した。これらは、温度を４２℃に上昇する事によって、続いて誘発された。
細胞は、最大ＯＤ650が達成された後４時間で採取された。この細胞を、中空繊維ろ過（０．１μｍ、アミコン）で回収し、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、７．５ｍＭＥＤＴＡ、７．５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．０２％ＰＭＳＦ、１．０μＭペプスタチンＡ、０．０２％ＤＮアーゼ及び０．０２％リゾチーム中に再懸濁し、４℃で１時間培養した（全容量約１ｌ）。この細胞を、溶解するまで（顕微鏡で観察される）１分ブラストで４〜６分間、１６０ｍｌバッチで、氷上で超音波処理した。５６ｍＭＰＭＳＦの液（イソプロパノール中）を、それぞれ２分の超音波処理に対して、１ｍＭＰＭＳＦ未満の最終濃度まで添加した（それぞれの添加は１６０μＭに相当）。溶解が完結後、細胞の残骸を遠心分離で除去した。上澄み液を、タンパク質の明らかな沈殿が生起するまで（普通約２０〜３０分）７０℃で加熱処理し、この変性タンパク質を遠心分離で除去した。フェニル−セファロースクロマトグラフィーの前に、硫酸アンモニウムを、この加熱処理した上澄み液に、１．０Ｍの最終濃度まで添加した（これを、１°加熱処理抽出物と名付ける）。超音波処理細胞からの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノールの１リットル懸濁液で再抽出し、次いで７０℃で１５分間の第二加熱処理し、沈殿したタンパク質を遠心分離で再度除去した。これは、更に２０〜４０％のキシラナーゼを抽出した事が分かった。これを２°加熱処理抽出物と名付けた。硫酸アンモニウムを、この２°加熱処理抽出物に、１．０Ｍまで添加し、１°及び２°加熱処理抽出物をフェニル−セファロース分離前にプールした。キシラナーゼ活性を、１．０Ｍ塩化ナトリウムを使用して、１１００ｍｌベッド容量フェニル−セファロースカラムから段階的に溶出し（１．０Ｍ硫酸アンモニウムでの多量な洗浄後に、ベースラインへ戻す）、この溶出タンパク質を濃縮して、ＹＭ３隔膜（アミコン）の限外ろ過で塩分除去した。調製物の最終濃度は、２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノール、約２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０％グリセロール及び０．０５％ナトリウムアジドである。
Ｇ−型キシラナーゼの産生の為のこの方法は、抽出（ｐＨ８．０）及び脱塩（ｐＨ７．３）工程の為のトリス−塩酸に代えてＨＥＰＥＳバッファーが使用された以外は上述の方法と殆ど同じである。最終の調製物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１ｍＭＥＤＴＡ、７ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．０５％ナトリウムアジド、２０．０％グリセロール及び±２５０ｍＭ塩化ナトリウムのバッファー組成を有した。
全部で、６つのＦ−型調製物（５つのxynA及び１つのxynB）と、２つのＧ−型調製物の十分な純度のものが得られた。Ｆ−型及びＧ−型調製物のタンパク質濃度は、標準ＢＣＡ法（Pierce,Rockford, IIIinois, USA）で決定した。試料の純度は、SDS-PADEゲル（Phast-system, Pharmacia, 20% gel）を使用して、F-型の約40kDa、及びG-型の約25kDaでのバンドの厚さを、不純物のバンドの厚さと比較する事によって概算で推定した。試料の純度は、20〜70％の間で変化した（表９）。
クローン化Ｆ−及びＧ−型キシラナーゼでのＥＣＦ漂白結果
ＥＣＦ漂白を、スウェーデンのパルプ工場からの酸素脱リグニン化クラフトパルプを使用して行った。この針葉樹パルプ（ＳＷ）は、１６．０のカッパ値を有し、広葉樹パルプ（ＨＷ）は１０．６のカッパ値を有していた。表１０で示される条件下で、ＸＤＥＤの順序が使用された。
クローン化Ｇ−型キシラナーゼでのＥＣＦ投与−応答曲線
実施例１２に記載されたものと同じＸＤＥＤ漂白順序を使用して、２つのＧ−型キシラナーゼの投与量を変えた。結果を表１２に示す。１〜３μｇ／ｇパルプの投与量は、少なくとも２点のＩＳＯ白色度で増加を示す。
クローン化Ｇ−型キシラナーゼでのＴＣＦ漂白結果
２つのＧ−型キシラナーゼを、以下の実施例１５で記載されるＸＱＰＰ順序を使用して、ＴＣＦ漂白順序で試験した。酸素脱リグニン化広葉樹クラフトパルプを使用した（３０ｇ o.d./試料）。Ｇ−型キシラナーゼの投与量は表１３で示した様に変化させた。Ｘ、Ｐ１及びＰ２段階後に各試料に対して得られたＩＳＯ白色度値は、表１３に示される。この値は、２つの試料の平均値を表す。
ＥＣＦ及びＴＣＦの結果と紙の性質
スウエーデンのパルプ工場から供給されたクラフトＨ／ＷとクラフトＳ／ＷパルプのＥＣＦ及びＴＣＦでの漂白効果について、キシラナーゼ試料を試験した。ＴＧ４５６xynDとＴＧ５３xynD（実施例中では、それぞれ７１５及び７１６と呼ぶ）を、「酵素無し」の参考例（Ref）と比較した。ランペンボールミル（Lampen ball mill）での精製試験は、715が、引き裂き係数で顕著な改善を、そして引っ張り及び破裂係数で著しい低下なしに、全体にわたって最高の効果を与える事を示した。
スクリーニングプロトコル
全ての順序が完全に漂白された後、30gの試料を取り、ランペンボールミルで、10,000、20.000及び30,000回転で精製した。ショッパーリーグラー（Schopper-Rieglers）を測定し、その後、引っ張り係数、空隙率、引き裂き係数及び破裂係数測定の為に、約２ｇのシートを作製した。このシートを、２３℃で、５０％相対湿度で２４時間の条件に置いた。得られた結果を図４〜８に示す。
実施例１６
ＴＧ４５６xynDの最適pH、最適温度及び熱安定性
基質としてオートスペルトキシランを用いて、実施例２の方法１で活性を測定した。全てのアッセイは、５０ｍＭリン酸バッファー中で、ｐＨ及び温度は指示の通りにして行った。結果を図９及び１０に示す。
ＴＧ４５６キシラナーゼＤは、参考の酵素パルプチーム（Pulpzyme HB）（ノボノルディスク社）と比較して、より一層熱安定性であり、僅かに高い最適ｐＨを有する。
配列表
(1) 配列番号：１の情報
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：xynFA
配列：配列番号：１：
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：xynFB
配列：配列番号：２：
配列特性
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
個体・単離クローン名：xynR
配列：配列番号：３：
配列特性
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
個体・単離クローン名：GF
配列：配列番号：４：
配列特性
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
個体・単離クローン名：GR
配列：配列番号：５：
配列特性
配列の長さ：1065塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：3..1058
他の情報：産物＝キシラナーゼ A、遺伝子：xynA
配列：配列番号：６:
配列特性
配列の長さ：351アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：７：
配列の特徴
配列の長さ：1633塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1632
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ B、遺伝子＝xynB
配列：配列番号：８：
配列特性
配列の長さ：544アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：９：
配列の特徴
配列の長さ：1125塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1125
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ C、遺伝子＝xynC
配列：配列番号：10：
配列特性
配列の長さ：375アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：11：
配列の特徴
配列の長さ：1244塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：エクストレモフィル（Extremophile）
個体・単離クローン名：TG456
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1107
他の情報：部分的、産物＝キシラナーゼ D、遺伝子＝xynD
配列：配列番号：12：
配列特性
配列の長さ：368アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：配列番号：13：
Claims (18)
- ８０℃以上の温度及びｐＨ９．０で、顕著な脱リグニン化活性を有する事を特徴とするキシラナーゼであって、前記キシラナーゼのアミノ酸配列が配列番号１３の全配列と少なくとも９５％の同一性を有する事を特徴とするキシラナーゼ。
- ８０℃及びｐＨ９．０で、１０分より長い半減期を持つ、請求項１記載のキシラナーゼ。
- ａ）キシラナーゼがＧ−型キシラナーゼであり、そしてｂ）キシラナーゼが、６５℃を越える最適増殖温度を持つ好熱性微生物由来のものである事を特徴とする、請求項１又は２記載のキシラナーゼ。
- 好熱性微生物が嫌気性である事を特徴とする、請求項３記載のキシラナーゼ。
- キシラナーゼが、８０℃及びｐＨ７．０で、１０分より長い半減期を持つ事を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキシラナーゼ。
- キシラナーゼが、６５℃及びｐＨ９．０で、１０分より長い半減期を持つ事を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキシラナーゼ。
- キシラナーゼが、寄託番号ＣＢＳ２１１．９４、２１２．９４、２１３．９４、２１４．９４、２１５．９４及び２１６．９４で寄託された株からなる群から選ばれる株由来のものである事を特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載のキシラナーゼ。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載のキシラナーゼをコードする、単離され精製されたＤＮＡ。
- 請求項８記載のＤＮＡを含むベクター。
- 請求項９記載のベクターで形質転換され、または請求項８記載のＤＮＡを外来ＤＮＡとして含む事を特徴とする、微生物宿主細胞。
- 嫌気性及び好熱性バクテリアであり、寄託番号ＣＢＳ２１１．９４、２１２．９４、２１３．９４、２１４．９４２１５．９４又は２１６．９４を有する事を特徴とする、単離された微生物。
- 適当な培地で、請求項１０記載の宿主細胞又は請求項１１記載の微生物を培養し、キシラナーゼを回収する事を特徴とする、キシラナーゼの調製方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載のキシラナーゼを、キシランを含有する組成物と接触させることを特徴とする、キシランの分解方法。
- キシラナーゼが、８０℃以上の温度で使用される、請求項１３記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載のキシラナーゼを、キシラナーゼが活性となる条件下、８０℃以上の温度で木材パルプと接触させることを特徴とする、木材パルプの脱リグニン化方法。
- キシラナーゼが、酸素脱リグニン工程の前又は工程中又は工程後に使用される事を特徴とする、請求項１５記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載のキシラナーゼを含む、キシランの分解用又は木材パルプの処理用の組成物。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載のキシラナーゼ、又は請求項１０記載の微生物宿主細胞の、キシランの分解又は木材パルプの脱リグニンのための、使用方法。
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