CN103232985B - 一种高催化效率木聚糖酶xyn10b及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率木聚糖酶XYN10B及其基因和应用。本发明提供了一种新的高催化效率木聚糖酶XYN10B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的木聚糖酶最适pH5.5，并在pH4.0～10.0范围内具有80%以上的酶活力；最适温度75℃，具有很高的催化效率为3710ml s^-1mg^-1。此外，木聚糖酶XYN10B可有效降解各种不同类型的木聚糖。因此，本木聚糖酶将在饲料和食品工业的应用中显示出其巨大的潜力。

Description

一种高催化效率木聚糖酶XYN10B及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率木聚糖酶XYN10B及其基因和应用。

背景技术

植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成，三者通过共价键和非共价键结合形成一个紧密的结构。半纤维素主要存在于细胞壁的表面，约占细胞干重的30%～35%。其中木聚糖是植物半纤维素的主要组成成分之一，也是自然界中除纤维素之外重要的可再生资源。木聚糖的结构复杂，其完全降解需要多种酶协同作用来进行。其中木聚糖酶是木聚糖降解中的最关键酶，它能够有效地降解木聚糖主链的连接吡喃木糖的β-1,4糖苷键（Saha B.Hemicellulose bioconversion.J IndMicrobiol Biotechnol,2003,30:279-291.）。NCBI中数据库中收录的木聚糖酶基因的分布来看，来源于微生物的木聚糖酶最多，占所有序列的80%以上。而微生物来源的序列中，细菌和真菌来源的序列又占大多数。这可能因为木聚糖的降解终产物木糖可以作为微生物的碳源和能源，而微生物要利用木聚糖，就得合成能够降解木聚糖的酶。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶归类于糖苷水解酶家族10、11、39、43、52、62和67（Henrissat B,Bairoch A.New families in the classification of glycosylhydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem J,1993,293:781-788.）。

木聚糖酶在多个领域有着重要的应用。木聚糖酶用于纸浆漂白过程，并发现木聚糖处理后的纸浆需要的化学漂白剂的用量要比不用木聚糖酶处理少20%～40%。随后木聚糖酶在造纸工业上的研究越来越多。结果发现，用木聚糖酶预处理能够提高漂白效果、增强纸张的强度、优化和调整纸张的性能；木聚糖经木聚糖酶作用后的水解产物（低聚木糖）可用作增稠剂、脂肪替代物和抗冻食品添加剂等；饲料里添加酸性木聚糖酶可以有效地降低消化道中食糜的黏度、提高干物质的消化率和营养吸收，从而提高饲料的利用率和动物体的抗病性;

木聚糖酶在工业中有着广阔的应用前景。近几年，在啤酒酿造过程中添加含有木聚糖酶等的复合酶制剂，可以有效分解麦芽汁中的木聚糖和戊聚糖，降低麦芽汁中的粘度,改善其过滤性能。处理过程中需要温度在50～80℃，pH在5.0～6.0，因此，需要添加的外源木聚糖酶应该在此条件下酶活力最好。本发明的木聚糖酶最适pH5.5，最适温度75℃,能很好的满足工业生产的要求。此外，其与现在工业生产所用的木聚糖酶相比，具有更高的催化效率，能有效发挥催化作用，从而降低能耗，提高底物利用率，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种高催化效率木聚糖酶XYN10B。

本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率木聚糖酶的基因xyn10B。

本发明的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高催化效率木聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高催化效率木聚糖酶的应用。

本发明分离筛选出一种生产上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的毛壳菌C8。

本发明提供了一种高催化效率木聚糖酶XYN10B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

mhlassllflaslpmgmankgkpckkglnilakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadelrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapllwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa

其中，该酶包括371个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列（mhlassllflaslpmgma），因此，成熟的高催化效率木聚糖酶XYN10B的理论分子量为38.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

nkgkpckkglnilakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadelrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapllwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa

本发明的木聚糖酶XYN10B在碱性范围内具有优良的pH稳定性，而且具有很高的催化效率。本发明的木聚糖酶，其最适pH值为5.5，最适温度为75℃，在55℃具有良好的热稳定性。

本发明提供了编码上述高催化效率木聚糖酶基因xyn10B。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGCATCTCGCCTCCTCGCTGCTCTTCCTGGCCTCCCTGCCCATGGGGATGGCCAACAAGGGCAAGCCGTGCAAGAAGGGTCTCAACATCCTCGCTAAGCAGGCCGGTCTCAAGTACTTCGGCGCGGCCACCGACTCGCCCGGTCAGCGGGAGCGTGCCGGCTACGAGGCTGCCTACGCGCAGTATGACCAGATCATGTGGAAGTCGGGCGAGTTTGGCCAGACGACGCCCACCAACGGCCAGAAGTGGCTATTCAGCGAGCCCACGCGCGGCGGGTATAACTTCACCGAGGGCGAGATCGTAACGTCCCTGGCCAAGAAGCACGGCTACTACCTGCGGTGCCACGCGCTGGTGTGGCACAGCCAGCTTGCTCCCTGGGTCGAGACGACCGAGTGGACGGCCGACGAGCTGCGGCAGGTGATCGTCGACCACATCACACACGTGATGGGCCACTGGAAGGGCCAGTGCTACGCCTGGGACGTGGTCAACGAGGCGCTCAACGAGGATGGGACCTACCGCGAGTCTGTCTTCTACAAGGTGCTGGGCGAGGAGTACATCAAGCTGGCCTTCAAGACGGCCTCCGAGGTCGACCCGCACGCCAAGCTGTACTACAACGACTACAACCTCGAGTCGCCCAGCGGAAAGACGGCGGGGGCCGCCAATATCGTCAAGATGCTGCGCAAGGAGGGGATCCGCATCGACGGCGTCGGCCTGCAGGCGCATCTGACGGCGGAGCGCCACCCAACCCTCGACCAGCACATCGACGCCATCTCGAGCTTCACCGAGCTCGGCGTCGAGGTCGCCCTCACCGAGCTGGACGTGCGCATCACCATGCCCGCCACGGCCGAGAACCTGGCTCTGCAGAAGGAATCCTACAAGAATGCGGTCGGCGCATGCGTGCAGGTCCGCGGCTGCATCGGCGTGACCATCTGGGACTTCTACGACCCCTTCAGCTGGGTGCCCTACACCTTCCCCGGCCAGGGCGCCCCGCTGCTGTGGTTCGACAATTTCACGACCCACCCGGCGTATGACGGTGTGGTCGAGGCGTTGACTAACAAGACGAGTCGCGGCAAGGGCAAGGGCAATAGCCGGCGCGCGCAGTTGTGGTCTGCTTGA

本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn10B，cDNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN10B基因xyn10B全长1116bp。其中，信号肽的碱基序列：Atgcatctcgcctcctcgctgctcttcctggcctccctgcccatggggatggcc

因此，成熟的木聚糖酶XYN10B的基因序列如SEQ ID NO.4所示：aacaagggcaagccgtgcaagaagggtctcaacatcctcgctaagcaggccggtctcaagtacttcggcgcggccaccgactcgcccggtcagcgggagcgtgccggctacgaggctgcctacgcgcagtatgaccagatcatgtggaagtcgggcgagtttggccagacgacgcccaccaacggccagaagtggctattcagcgagcccacgcgcggcgggtataacttcaccgagggcgagatcgtaacgtccctggccaagaagcacggctactacctgcggtgccacgcgctggtgtggcacagccagcttgctccctgggtcgagacgaccgagtggacggccgacgagctgcggcaggtgatcgtcgaccacatcacacacgtgatgggccactggaagggccagtgctacgcctgggacgtggtcaacgaggcgctcaacgaggatgggacctaccgcgagtctgtcttctacaaggtgctgggcgaggagtacatcaagctggccttcaagacggcctccgaggtcgacccgcacgccaagctgtactacaacgactacaacctcgagtcgcccagcggaaagacggcgggggccgccaatatcgtcaagatgctgcgcaaggaggggatccgcatcgacggcgtcggcctgcaggcgcatctgacggcggagcgccacccaaccctcgaccagcacatcgacgccatctcgagcttcaccgagctcggcgtcgaggtcgccctcaccgagctggacgtgcgcatcaccatgcccgccacggccgagaacctggctctgcagaaggaatcctacaagaatgcggtcggcgcatgcgtgcaggtccgcggctgcatcggcgtgaccatctgggacttctacgaccccttcagctgggtgccctacaccttccccggccagggcgccccgctgctgtggttcgacaatttcacgacccacccggcgtatgacggtgtggtcgaggcgttgactaacaagacgagtcgcggcaagggcaagggcaatagccggcgcgcgcagttgtggtctgcttga

成熟蛋白理论分子量为39.5kDa，将木聚糖酶基因xyn10B序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLBST比对，证明所述木聚糖酶基因xyn10B是一种新的木聚糖酶基因。

本发明还提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xyn10B的重组载体，优选为pPIC9-xyn10B。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn10B。

本发明还提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xyn10B的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10B。

本发明还提供了一种制备上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN10B的表达；以及

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10B。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn10B。

本发明还提供了上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的应用，优选其在水解木聚糖及其在啤酒工业中的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在啤酒、饲料工业中应用的新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH5.5，并在pH5.0～10.0范围内具有很好的pH稳定性；最适温度75℃，在高温下具有很高的活性。此外，木聚糖酶XYN10B可有效降解各种不同类型的木聚糖。因此，本木聚糖酶将在啤酒工业的应用中显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，M：分子量标准蛋白质对照；1:纯化的XYN10B;2：脱糖基化的XYN10B。

图2重组木聚糖酶的最适pH。

图3重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4重组木聚糖酶的最适温度。

图5重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TAKARA公司，连接酶购自Promega公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）重组毕赤酵母菌培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1毛壳菌Chaetomium sp.C8产酶特性

将来源于宁夏沙漠表面样品经富集培养后（富集培养基：（NH₄）₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，CaCl₂0.2g/L，玉米芯粉0.5％，麸皮0.5%，pH5.0），按常规稀释后涂布于产酶培养基(（NH₄）₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，CaCl₂0.2g/L，木聚糖0.5%，1.5%琼脂糖,pH5.0)平板上,45℃培养5～6d,挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌葡聚糖酶的菌株。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为C8，经18SrDNA鉴定该菌株为毛壳菌，命名为Chaetomium sp.C8。

在PDA培养基培养5天后观察，菌落浅色，气生菌丝浅色。子囊果表生，球形，卵圆形，顶端有一孔口，子囊壳壁膜质，透明或不透。须根根状，起固定子囊壳和吸收养分的作用，侧生附属丝较短，似刚毛。内含8个子囊抱子，无隔，单细胞，球形、椭圆形等，成熟前多为灰白色，成熟后呈褐色，柠檬形，厚壁，两侧平滑，两端突起，有一个明显的顶生萌发孔。

实施例2木聚糖酶编码基因XYN10B的克隆

提取毛壳菌C8（Chaetomium sp.C8）基因组DNA：

培养3天后将菌丝离心后取入研钵中，液氮冻制研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，加入2mL CTAB提取液，70℃水浴锅裂解2h，每隔10min混匀一次,在4℃下12000rpm离心10min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置10min后，4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入0.2mL TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守序列(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；

P2:5'-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3'。

以毛壳菌C8（Chaetomium sp.C8）基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃降落45℃（每个循环降落0.5℃）退火30sec，72℃延伸30s，十个循环；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃保温10min。得到一约256bp片段，将该片段回收后与pEBSY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，第二条引物的位置设计在第一条引物的内侧。每两个引物之间的距离为50bp左右，引物长度一般20～30nt，退火温度在60℃。并将它们分别命名为usp1,usp2，usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYN10B TBIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后再通过RT-PCR方法获得XYN10B木聚糖酶基因全长1116bp（SEQ ID NO.4），编码371个氨基酸（SEQ ID NO.1）和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端18个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为23.1kDa。

实施例3重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将扩增到编码木聚糖酶的cDNA基因xyn10B（不含信号肽）双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有木聚糖酶基因xyn10B的重组质粒pPIC9-xyn10B并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10B；同样，将包含有信号肽序列的木聚糖酶XYN10B的cDNA通过酶切、连接方法插入已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码木聚糖酶的基因xyn10B的重组质粒pPIC-xyn10B-1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10B-1。

分别取含有两种重组质粒的GS115菌株，分别接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组菌株GS115/xyn10B的重组木聚糖酶的表达量为102.5U mL^-1，相比之下，重组菌株GS115/xyn10B-1的重组木聚糖酶的表达量低于前者。重组木聚糖酶GS115/xyn10B的比活为767U mg^-1。SDS-PAGE结果表明（图1），重组木聚糖酶GS115/xyn10B的表达两种不同程度N-糖基化修饰的蛋白，分子量分别为45and48kDa，经Endo-H处理后两种蛋白分子量均变成39.5kDa，与理论分子量相当。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

纯化重组菌株GS115/XYN10B所产重组木聚糖酶，使用DNS法进行活性分析。

DNS法：具体方法如下：在pH5.5，75℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5重组木聚糖酶XYN10B的性质测定

1、重组木聚糖酶XYN10B的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下测定其最适pH。桦木木聚糖在不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行酶活力测定。结果(图2)表明，重组酶XYN10B的最适pH为5.5。木聚糖酶在以上各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果（图3）表明木聚糖酶在pH5.0～10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70%以上，这说明此酶在酸性范围内具有很好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH5.5）缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图4）表明其最适温度为75℃。酶的热稳定性性试验表明（图5），XYN10B在55℃下温育1h，酶活力几乎不丧失，而在65℃下温育1h后酶活力剩余40%。

3、木聚糖酶的动力学参数的测定方法如下：

以不同浓度的桦木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（Ph5.5）缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其动力学参数。经测定，K_m，V_max，k_cat分别为0.20mg ml^–1，1150μmol min^–1mg^–1,and759s^–1。其催化效率(k_cat/K_m)was3710ml s^-1mg^-1，高于目前报道的大多数10家族木聚糖酶。

4、不同金属离子化学试剂对XYN10B酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入1mmol/L的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在75℃、pH5.5条件下测定酶活性。结果表明（表2），Pb²⁺、Ca²⁺对酶活有部分抑制作用，SDS强烈抑制其活性，而巯基乙醇对酶活都有一定的促进作用，其它金属离子、SDS和EDTA对酶活的影响不大。

表2.各种化学试剂及离子的对木聚糖酶XYN10B的影响

5、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶可作用于可溶性小麦阿拉伯木聚糖外，对于榉木木聚糖、桦木木聚糖也有较高的降解作用（表3），但该酶不降解纤维素钠。其桦木木聚糖降解产物主要为木糖、木二糖、木三糖和其他寡糖。

表3.木聚糖酶XYN10B底物特异性

6、木聚糖酶对大麦麦芽汁粘度和过滤速度的影响

大麦麦芽经粉碎机处理，过0.2mm筛网，溶于100mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。添加40重组木聚糖酶XYN10B或商业化葡聚糖酶Glu-66，以及两者混合酶。然后分别在50℃处理30min,60℃处理60min,70℃处理30min,最后煮沸5min灭活。实验对照为不添加任何酶。用滤纸测定其过滤速度。取5ml过滤液用黏度剂测定其黏度数值。结果表明，添加木聚糖酶XYN10B或混合葡聚糖酶添加后能有效提高大麦芽流速，并有效的降低粘度。

表4木聚糖酶XYN10B与商业化葡聚糖酶Glu-66对大麦芽流速和粘度的影响

Claims (9)

1.一种木聚糖酶XYN10B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种木聚糖酶基因xyn10B，其特征在于，编码权利要求1所述的高催化效率木聚糖酶XYN10B。

3.根据权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn10B，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

4.包含权利要求2或3所述木聚糖酶基因xyn10B的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-xyn10B，其中，将表达载体pPIC9进行EcoR I、Not I双酶切，同时将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的木聚糖酶基因xyn10B进行EcoR I、Not I双酶切，切出的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有木聚糖酶基因xyn10B的重组载体pPIC9-xyn10B。

6.包含权利要求2或3所述木聚糖酶基因xyn10B的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备木聚糖酶XYN10B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN10B的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10B。

9.权利要求1所述木聚糖酶XYN10B用于水解木聚糖的应用。