JP2017035651A - Dna吸着担体及びその利用方法 - Google Patents
Dna吸着担体及びその利用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017035651A JP2017035651A JP2015157026A JP2015157026A JP2017035651A JP 2017035651 A JP2017035651 A JP 2017035651A JP 2015157026 A JP2015157026 A JP 2015157026A JP 2015157026 A JP2015157026 A JP 2015157026A JP 2017035651 A JP2017035651 A JP 2017035651A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- apatite
- sample
- apatite particles
- adsorption
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
【解決手段】ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むDNA吸着担体を用いる。
【選択図】なし
Description
1.ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むDNA吸着担体。
2.ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されている上記1に記載のDNA吸着担体。
3.液体採取用ピペットの吸液部内に設置される上記1または2に記載のDNA吸着担体。
4.上記1〜3のいずれか1項に記載のDNA吸着担体を用いて、DNAを含む試料溶液からDNAを吸着分離し、濃度0.05〜0.3モル/Lでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したDNAを脱着し、得られたDNAを含む水溶液を試料としてPCR法による核酸増幅に用いるDNA吸着担体の利用方法。
5.上記1に記載のDNA吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いるDNA吸着担体の利用方法。
本発明は、DNA吸着担体としてストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いることで、各種DNAを選択的に効率よく吸着するとともに、吸着したDNAを比較的低濃度のリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着担体から脱着することができることを見出したことにより成された。すなわち、本発明者らは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子がタンパク質よりもDNAを優先的に吸着し、かつ吸着したDNAが、後述するように比較的低濃度のリン酸塩水溶液を用いることで容易に該アパタイト粒子から脱着することを見出した。このことは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対するDNAの吸着が穏和な状態で維持されており、これに対して、該アパタイト粒子のタンパク質に対する吸着力が、DNAと比べて更にいっそう弱いことを意味している。具体的な吸着や脱着に関する条件については後述する実施例の中で詳しく説明する。
ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径の上限は特に限定されないが、例えば、1000μm以下であることが好ましい。なお本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径は、光回折法又は光散乱法により測定される。
本発明においては、ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されていることが好ましい。
本発明のDNA吸着担体を用いてDNAを含む試料溶液からDNAを分離し精製する方法は特に限定されない。例えば、DNA吸着担体を用いて、DNAを含む試料溶液からDNAを吸着分離し、リン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したDNAを脱着することにより、DNAを分離精製して回収することができる。
上記DNA吸着担体を用いて、DNAを含む試料溶液からDNAを吸着分離する方法は特に限定されず、例えば、DNAを含む試料溶液と、該DNA吸着担体とを接触させてDNA吸着担体にDNAを吸着させ、次いで該DNAを吸着させたDNA吸着担体と、試料溶液とを分離することにより、DNAを含む試料溶液からDNAを吸着分離することができる。
DNA吸着担体に吸着したDNAの脱着は、DNAを吸着したDNA吸着担体を、リン酸塩を含む水溶液と接触させることにより行うことができる。リン酸塩を含む水溶液とDNA吸着担体とを接触させることにより、吸着していたDNAがストロンチウムを含むアタパイト粒子から脱着して、DNAを含む水溶液を得ることができる。
このような方法により、試料溶液に含まれるDNAを分離し精製することができる。得られるDNAを含む水溶液は、PCR法による核酸増幅に用いる試料等として好適に用いることができる。
(i)試料溶液を、該アパタイト粒子を設置したピペット吸液部に吸入する。
(ii)吸入した試料溶液をピペット吸液部外に排出する。
(iii)必要であれば手順(i)及び(ii)を複数回繰り返す。
(iv)純水(イオン交換水や蒸留水など)を用いてピペット吸液部内部を洗浄する。
(v)リン酸塩を溶解した水溶液を用いて、ピペット吸液部内部の該アパタイト粒子に吸着したDNAを脱着させる。
特に(iii)の段階で、複数の試料溶液からDNAの吸着を行うことで、これらに含まれるDNAを濃縮した状態で分離回収することが可能である。
(各種アパタイトの合成)
1Lの三角フラスコ内に、塩化ストロンチウム六水和物(和光純薬工業社製)と塩化カルシウム二水和物(和光純薬工業社製)をそれぞれ表1に示す割合で秤取り、イオン交換水350gを加えて溶解した。これとは別に、500mLのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム(和光純薬工業社製)40g(0.3モル)及び炭酸ナトリウム(和光純薬工業社製)16g(0.15モル)を秤取り、イオン交換水300gを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ中で、50℃に調整した水浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を1時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のpHは6.5であった。滴下終了後更に1時間加熱攪拌を行った。その後水浴上から三角フラスコを移し、室温まで冷却した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、60℃に調節した乾燥器内で1昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物の収量は、各々の理論収量に対してほぼ100%の収量であった。生成物を、X線回折装置(ミニフレックス、リガク社製)を用いて広角X線回折により解析した結果、アパタイトに特有の結晶回折パターンを示し、結晶性は比較的低いもののアパタイトに帰属される以外の回折ピークは認められなかった。更に、FT−IR測定において何れの試料も1460cm−1、1405cm−1及び870cm−1付近にB型炭酸アパタイトに特有の吸収が認められた。
比較例2として、市販されるヒドロキシアパタイトであるHAP−100(医薬品グレード高純度ヒドロキシアパタイト:Ca10(PO4)6(OH)2、太平化学産業社製)を用いて、先の実施例及び比較例と同様にして試料作製及びHPLC測定を行った。図6に結果を示す。図6は比較例2において、市販のヒドロキシアパタイトを用いた際の、DNA及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のHPLC測定チャートを示す。図6中、実線が吸着処理前の試料のチャートであり、破線が吸着処理後の試料のチャートである。この場合、吸着処理後においてDNAは該アパタイトに少量吸着されており、一方アルブミンに対する吸着性がより高い結果であった。この例では、試料溶液中からDNAを選択的に吸着分離することはできなかった。
実施例2で用いたカルシウムとストロンチウムを1:4のモル比で含むアパタイト粒子を用いて、乾式ボールミルにより微粉砕を行い、体積平均粒子径が5μmである微粉体を得た。次に、ガラス製パスツールピペットの先端内面部分にカット綿を詰めて層とし、これに水中でスラリーにした上記アパタイト微粉体を通液してカット綿上でろ過を行い、該アパタイト微粉体をカット綿の上面及び内部に固定化した。蒸留水を用いて数回このパスツールピペットの内部を洗浄した場合、内部に固定化された該アパタイト微粉体が流出しないことを確認した。次に、先の実施例及び比較例で使用したサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液10mLを液温20℃にして、このパスツールピペットのアパタイト微粉体を含むカット綿の層に通液し、回収した液について先と同様にしてHPLC測定を行った。その結果、試料溶液に含まれていたDNAのうち約50%が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。
実施例2で用いたカルシウムとストロンチウムをモル比で各々1:4の比率で含むアパタイト粒子を用いて、メディアミルにより湿式分散処理を行い、ストロンチウムを含むアパタイトの微粒子を作製した。すなわち、上記の実施例2で得たストロンチウムを含むアパタイト20gを0.2リットルのポリプロピレン容器に移し、更にポリメタクリル酸メチル4gとテトラヒドロフラン76g及び粒径0.3mmのジルコニアビーズを160g加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して6時間湿式分散処理を行った。その後、濾布を使用して分散物からジルコニアビーズを分離した。得られた分散液に含まれる、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の大きさを測定するために、光散乱回折式粒度分布計(粒度分布測定装置LA−920、堀場製作所社製)を使用して測定したところ、体積平均粒子径は0.8μmであった。
(BCG菌を利用したPCR法による結核菌DNAの増幅試験)
BCG菌を利用した結核菌PCR検査に対するモデル試験を以下のように実施した。マクファーランドNo.1.0に調製したBCG菌液(BCG菌濃度3×108cfu/mL)0.1mLを喀痰0.9mLに加えてBCG菌株含有喀痰A液(BCG菌濃度3×107cfu/mL)を調製した。次いで、菌濃度が段階的に1/10ずつ低下するよう、喀痰にて希釈した喀痰液を調製し、順にB液(BCG菌濃度3×106cfu/mL)、C液(BCG菌濃度3×105cfu/mL)、D液(BCG菌濃度3×104cfu/mL)、E液(BCG菌濃度3×103cfu/mL)、F液(BCG菌濃度3×102cfu/mL)、G液(BCG菌濃度3×10cfu/mL)とし、比較(ブランク)としてBCG菌液を加えない喀痰液をH液として使用した。これらの100μLを、各々ビーズ入りのマイクロチューブに加え、次いで濃度2%の水酸化ナトリウム100μLと濃度1モル/Lのジチオスレイトール20μLをそれぞれに加えて1分間振盪撹拌した。これを37℃で10分間加温後、濃度1モル/Lのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)200μLをそれぞれに加えて中和し、各々の試料溶液とした。次いで、各試料溶液200μLに対して実施例2で得られた、カルシウムとストロンチウムをモル比で1:4の比率で含むアパタイト粒子を50mg添加して攪拌しながら、37℃で10分間加温した。その後、アパタイト粒子を濾過により分離し、該粒子を1mLのTE緩衝液で3回洗浄を行った。次いで、濃度0.15モル/LでNa2HPO4と、濃度0.15モル/LでKH2PO4を含むリン酸塩水溶液(pH6.8)を100μL用いて吸着したDNAを溶出(脱着)し、得られたDNA溶出液中のBCG菌株DNAをリアルタイムPCR法で定量した。プライマー及びプローブはアプライドバイオシステムズ社製TaqMan(登録商標)プローブキット(蛍光色素:FAM)を使用した。結果を図7に示した。図7は、実施例7において、段階的に希釈した濃度でBCG菌を含む試料から分離したBCG菌DNAをリアルタイムPCR法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子を示す。この図より、BCG菌株含有喀痰のBCG菌濃度がE液に相当する3×103cfu/mL以上であれば、本方法で菌体の存在を検出することが可能であることが分かった。
(DNA吸着担体からのDNAの溶出性試験)
実施例8、9及び10として、各々実施例1、実施例2及び実施例4の合成方法で得られたストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた。実施例7と同様にして、BCG菌液を喀痰に加えて調整したBCG菌株含有喀痰を水酸化ナトリウムとジチオスレイトールで処理後、トリス塩酸緩衝液で中和処理を行った試料溶液を調製し、その試料溶液700μL中に、各々のアパタイト粒子0.2gを添加して37℃で10分間加温しながら撹拌を行い、試料中に含まれるDNAの吸着を行った。同様に、比較例4として比較例1の合成法で得られた炭酸アパタイトを用い、比較例5として比較例3で用いたヒドロキシアパタイトを用いて、上記と同様にして用いてDNAの吸着を行った。得られたそれぞれのDNAを吸着したアパタイト粒子に対し、リン酸塩濃度を0.1モル/L、0.2モル/L及び0.3モル/Lに調節した3水準の濃度のリン酸塩水溶液(Na2HPO4とKH2PO4をモル比1/1で含有)を用いて溶出(脱着)処理を行い、得られた溶出液を試料として用いて実施例7と同様にしてリアルタイムPCR法を用いてDNAの増幅試験を行った。その結果、比較例4では、濃度0.2モル/Lと濃度0.3モル/Lのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、PCRによるDNAの増幅が確認されたが、濃度0.1モル/Lの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したDNA濃度が希薄なため、PCR法でサイクル数を増加させてもDNAの増幅は確認されなかった。また、比較例5では濃度0.3モル/Lのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、PCRによるDNAの増幅が確認されたが、濃度0.2モル/Lと濃度0.1モル/Lの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したDNA濃度が希薄なため、PCR法でサイクル数を増加させてもDNAの増幅は確認されなかった。これに対して実施例8〜10では、何れの濃度のリン酸緩衝液を用いて溶出した試料でもPCR法で顕著なDNAの増幅が確認された。
Claims (5)
- ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むDNA吸着担体。
- ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されている請求項1に記載のDNA吸着担体。
- 液体採取用ピペットの吸液部内に設置される請求項1または2に記載のDNA吸着担体。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のDNA吸着担体を用いて、DNAを含む試料溶液からDNAを吸着分離し、濃度0.05〜0.3モル/Lでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したDNAを脱着し、得られたDNAを含む水溶液を試料としてPCR法による核酸増幅に用いるDNA吸着担体の利用方法。
- 請求項1に記載のDNA吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いるDNA吸着担体の利用方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015157026A JP6588765B2 (ja) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | Dna吸着担体及びその利用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015157026A JP6588765B2 (ja) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | Dna吸着担体及びその利用方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017035651A true JP2017035651A (ja) | 2017-02-16 |
JP6588765B2 JP6588765B2 (ja) | 2019-10-09 |
Family
ID=58048479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015157026A Active JP6588765B2 (ja) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | Dna吸着担体及びその利用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6588765B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7446576B2 (ja) | 2020-02-28 | 2024-03-11 | 学校法人常翔学園 | 核酸の分離方法及び増幅方法 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01135792A (ja) * | 1987-11-20 | 1989-05-29 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 核酸の分離・精製方法 |
US5296254A (en) * | 1991-06-06 | 1994-03-22 | Bestex Kabushiki-Kaisha | Method of producing a filtering material |
US5310548A (en) * | 1989-04-21 | 1994-05-10 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Deodorants, deodorant sheets, filter sheets and functional papers as well as filtering mediums for exhaust gas |
JP2000023668A (ja) * | 1998-07-08 | 2000-01-25 | National Research Institute Of Aquaculture | Dnaの精製方法 |
US6645377B1 (en) * | 1998-05-27 | 2003-11-11 | Battelle Memorial Institute | Systems for column-based separations, methods of forming packed columns, and methods of purifying sample components |
JP2005512070A (ja) * | 2001-11-27 | 2005-04-28 | シファーゲン バイオシステムズ, インコーポレイテッド | ヒドロキシアパタイトが充填された細孔を有する酸化鉱物ビーズからなる複合クロマトグラフィー吸着媒 |
JP2005283550A (ja) * | 2004-03-27 | 2005-10-13 | Japan Science & Technology Agency | 化学バイオセンサおよびその製造方法 |
JP2006509838A (ja) * | 2002-11-12 | 2006-03-23 | 財団法人理工学振興会 | 細胞導入剤、細胞導入方法、細胞導入剤の製造方法、細胞導入剤製造用組成物、および、細胞導入剤製造用キット |
WO2007021037A1 (ja) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Kyoto University | 無機系多孔質体及びその製造方法 |
JP2013003065A (ja) * | 2011-06-20 | 2013-01-07 | Gl Sciences Inc | 多孔質体およびその製造方法 |
JP2016186036A (ja) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | 三菱製紙株式会社 | ストロンチウムアパタイト微粒子分散液の製造方法 |
-
2015
- 2015-08-07 JP JP2015157026A patent/JP6588765B2/ja active Active
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01135792A (ja) * | 1987-11-20 | 1989-05-29 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 核酸の分離・精製方法 |
US5310548A (en) * | 1989-04-21 | 1994-05-10 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Deodorants, deodorant sheets, filter sheets and functional papers as well as filtering mediums for exhaust gas |
US5296254A (en) * | 1991-06-06 | 1994-03-22 | Bestex Kabushiki-Kaisha | Method of producing a filtering material |
US6645377B1 (en) * | 1998-05-27 | 2003-11-11 | Battelle Memorial Institute | Systems for column-based separations, methods of forming packed columns, and methods of purifying sample components |
JP2000023668A (ja) * | 1998-07-08 | 2000-01-25 | National Research Institute Of Aquaculture | Dnaの精製方法 |
JP2005512070A (ja) * | 2001-11-27 | 2005-04-28 | シファーゲン バイオシステムズ, インコーポレイテッド | ヒドロキシアパタイトが充填された細孔を有する酸化鉱物ビーズからなる複合クロマトグラフィー吸着媒 |
JP2006509838A (ja) * | 2002-11-12 | 2006-03-23 | 財団法人理工学振興会 | 細胞導入剤、細胞導入方法、細胞導入剤の製造方法、細胞導入剤製造用組成物、および、細胞導入剤製造用キット |
JP2005283550A (ja) * | 2004-03-27 | 2005-10-13 | Japan Science & Technology Agency | 化学バイオセンサおよびその製造方法 |
WO2007021037A1 (ja) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Kyoto University | 無機系多孔質体及びその製造方法 |
JP2013003065A (ja) * | 2011-06-20 | 2013-01-07 | Gl Sciences Inc | 多孔質体およびその製造方法 |
JP2016186036A (ja) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | 三菱製紙株式会社 | ストロンチウムアパタイト微粒子分散液の製造方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7446576B2 (ja) | 2020-02-28 | 2024-03-11 | 学校法人常翔学園 | 核酸の分離方法及び増幅方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6588765B2 (ja) | 2019-10-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3067694A1 (en) | Lateral flow-based nucleic acid sample preparation device, integrated with passive fluid flow control | |
CN106085863B (zh) | 微生物浓集方法以及用于其中的浓集剂 | |
BR112013012967B1 (pt) | processo de concentração, dispositivo de concentração adaptado para ligar ou capturar pelo menos um analito celular alvo, kit e processo para a preparação de um dispositivo de concentração adaptado para ligar ou capturar pelo menos um analito celular alvo | |
Sim et al. | Development and evaluation of antimicrobial activated carbon fiber filters using Sophora flavescens nanoparticles | |
MXPA06001646A (es) | Metodos y dispositivos para la preparacion de muestras. | |
CN105462956B (zh) | 一种提取生物气溶胶中微生物总dna的样品前处理方法 | |
JPWO2006123781A1 (ja) | 微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキット | |
Lian et al. | Selective extraction and concentration of mebendazole in seawater samples using molecularly imprinted polymer as sorbent | |
JP6588765B2 (ja) | Dna吸着担体及びその利用方法 | |
US8691559B2 (en) | Micro channel, device for recovering nucleic acid and method for recovering nucleic acid | |
JP5636685B2 (ja) | ノロウイルス検出用材料および該材料を用いるノロウイルスの検出方法 | |
WO2015159979A1 (ja) | 短鎖核酸の回収方法 | |
JP2009065849A (ja) | 核酸の抽出方法 | |
Deng et al. | N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis | |
KR20210045452A (ko) | 핵산 단리 및 관련 방법 | |
JP5685377B2 (ja) | 微小生物捕獲材、微小生物捕獲装置、微小生物捕獲方法および微小生物捕獲材製造方法 | |
JP7446576B2 (ja) | 核酸の分離方法及び増幅方法 | |
JP2007068534A (ja) | 核酸回収方法、微小流路、並びに核酸回収装置 | |
CN117046441B (zh) | 磁性氧化石墨烯粒子、制备方法及其应用 | |
JP2021133347A (ja) | 核酸吸着材 | |
JP2006308508A (ja) | シリンドロスパーモプシンの簡易精製法 | |
RU2653130C1 (ru) | Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот | |
KR101897177B1 (ko) | 전처리 방법 및 그것에 사용되는 핵산 추출 키트 | |
US6268183B1 (en) | Method of purifying thuringiensin | |
WO2022049383A1 (en) | Filter |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180629 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20180629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180629 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190422 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190704 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190820 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190913 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6588765 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |