KR20210045452A - 핵산 단리 및 관련 방법 - Google Patents

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pectin
amidated
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알렉스 아이. 쿠티아빈
올리버 제트. 나나시
드미트리 세르귀브
알렉산더 에이. 갈
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세페이드
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Abstract

펙틴 유도체로 변형된 고체 지지체가 제공된다. 상기 고체 지지체는 핵산의 단리, 분리, 및 검출 방법에 유용하다.

Description

핵산 단리 및 관련 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 17일자, 미국 가출원번호 제62/765,149호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 변형된 펙틴을 포함하는 고체 지지체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
중합 효소 사슬 반응 (PCR)과 같은 다양한 자동화 분석 기법에 의한 핵산의 증폭 및/또는 검출을 활용하는 분자 진단 분석은 기존의 진단 방법에 비해 짧은 시간에 빠르고 정확한 결과를 제공하며, 용이하게 자동화될 수 있다. 그러나, 생물학적 샘플의 분자 진단 분석을 수행하기 위해, 핵산은 생물학적 물질로부터 단리되어, 예를 들어, 중합 효소 활성을 억제하여 분석의 정확성에 영향을 미칠 수 있는 성분을 제거해야 한다. 핵산 추출을 위한 다양한 방법이 존재하지만, 현재 사용 가능한 방법은 일반적으로 긴 단계를 포함하며 자동화에 쉽게 적용할 수 없다. 이에 따라, 특정 표적의 증폭 및 검출 전에 핵산 샘플을 준비하는 것은 분자 진단의 가장 어려운 단계이다.
증폭 억제제가 없는 고품질의 핵산을 생산하기 위해 광범위한 샘플 처리가 필요하지 않고 임상 실험실 자동화에 적용 할 수 있는 간단하고 신속한 핵산 분리 방법이 필요하다. 빠르고 자동화된 핵산 검출 방법과 호환되는 방식으로 핵산 함유 생물학적 샘플로부터 핵산 분리를 촉진할 수있는 시약이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 추가적인 관련 이점을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 명세서에는 고체 지지체에 공유 결합된 복수의 변형된 펙틴 분자를 포함하는, 고체 지지체가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 복수의 아미노 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 아미드화 펙틴(amidated pectin)이다. 일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 화학식으로 나타낸 단위:
Figure pct00001
,
이의 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체를 포함하며,
화학식 중
n은 0, 1,2, 또는 3이고;
R1은 H 또는 C1-C3 알킬이고;
X는, 각각의 경우에, 독립적으로 C2-C4 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
Y는 C2-C3 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
R2 및 R3는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 C4-C20 폴리아민을 아미드된 펙틴이다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 에틸렌다이아민, 푸트레신, 카다베린, 스페르민, 또는 스페르미딘이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 구조를 가지는 단위:
Figure pct00002
,
이의 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체를 포함하며,
화학식 중
n은 0, 1, 2, 또는 3이고;
m은 2, 3, 또는 4이고;
p는 2, 3, 또는 4이고;
R1, R2, 및R3는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 구조를 가지는 단위:
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
이의 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체를 포함한다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 아미드 시트러스 펙틴 또는 아미드 사과 펙틴이다. 일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 분자량이 약 4,000 Da 내지 약 500,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 300,000 Da, 약 100,000 Da 내지 약 300,000 Da, 또는 약 50,000 Da 내지 약 200,000 Da이다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 폴리스티렌, 유리, 세라믹, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 지르코니아, 티타니아, 알루미나, 폴리카보네이트, 라텍스, 폴리에터설폰, PMMA, 카복시메틸셀룰로스, 제올라이트, 및 셀룰로스로부터 선택되는 물질을 포함한다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 자기 비드, 유리 비드, 폴리스티렌 비드, 폴리스티렌 필터, 폴리카보네이트 필터, 폴리에터설폰, 또는 유리 필터이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에는 핵산 함유 샘플로부터 핵산의 단리 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 샘플을 본 명세서에 개시된 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
(b) 선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계; 및
(c) 용리 시약으로 고체 지지체로부터 핵산을 용리하는 단계.
일부 구현예에서, 용리제는 암모니아 또는 알칼리 금속 수산화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리제는 pH가 약 9 이상, 약 10 이상, 또는 약 11 이상이다. 일부 구현예에서, 용리 시약은 pH가 약 9 내지 약 12, 약 9.5 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11이다. 일부 구현예에서, 용리 시약은 다중 음이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 음이온은 카라기난 또는 담체 핵산이다. 일부 구현예에서, 용리제는 다중 음이온 및 염기, 예를 들어, 알칼리 하이드록사이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리제는 i-카라기난 및 KOH를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 용해 용액과 접촉시킨 후, 샘플을 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 용액으로 방출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 무질서 유발제(chaotropic agent)를 포함한다. 일부 구현예에서, 무질서 유발제는 구아니디움 싸이오시아네이트, 구아니디움 하이드로클로라이드, 알칼리 퍼클로레이트, 알칼리 아이오다이드, 우레아, 폼아미드, 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 무질서 유발제는 구아니디움 싸이오시아네이트 또는 구아니디움 하이드로클로라이드이다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 소듐 클로라이드 또는 칼슘 클로라이드이다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 무질서 유발제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 Tris이다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 계면 활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 소포제(defoaming agent)를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계는 무질서 유발 시약의 존재 없이 수행된다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 조직 생검, 소변, 대변, 타액, 도말 제제, 박테리아 배양, 세포 배양, 바이러스 배양, PCR 반응 혼합물, 또는 시험관 내 핵산 변형 반응 혼합물로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조직 생검은 파라핀 포매 조직이다. 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 전체 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 미생물 핵산 또는 바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 핵산은 HBV DNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 순환 핵산이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 자동화된 카트리지에서 수행된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 핵산을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 핵산 함유 샘플을 본 명세서에 개시된 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
(b) 선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계;
(c) 핵산을 용리시키는 단계; 및
(d) 핵산을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 핵산 검출 단계는 중합 효소 사슬 반응 (PCR)에 의해 핵산의 증폭을 포함한다. 일부 구현예에서, 중합 효소 사슬 반응은 중첩 PCR, 등온 PCR, 또는 RT-PCR이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에는 공유 결합된 아미드화 펙틴을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 크로마토그래피를 위한 분리 물질이 제공된다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 화학식으로 나타낸 단위:
Figure pct00005
,
이의 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체를 포함하며,
R2 및 R3는 H, 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 임의 치환된 C2-C20 헤테로알킬으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아, 또는 하이브리드 실리카 물질이다.
하나의 양태에서, 본 명세서에는 표면에 공유 결합된 하나 이상의 변형된 펙틴 분자를 포함하는 핵산 함유 샘플로부터 핵산을 정제하기 위한 고체 지지체가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 복수의 아미노 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 아미드화 펙틴(amidated pectin)이다. 본 명세서에서 사용 시, 용어 "고체 지지체"는 상자성 입자, 겔, 제어된 공극 유리, 자기 비드, 미세구(microsphere), 나노구(nanosphere), 모세관, 필터 막, 컬럼, 포(cloth), 와이프(wipe), 종이, 편평한 지지체, 다중 웰 플레이트, 다공성 막, 다공성 단일체, 웨이퍼, 빗(comb), 또는 이의 임의의 조합을 비롯한 임의의 기질을 지칭한다. 고체 지지체는 유리, 실리카, 티타늄 옥사이드, 산화철, 에틸렌 백본 중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 세라믹, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 및 다이비닐벤젠을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게, 고체 지지체는 폴리스티렌, 유리, 세라믹, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 폴리카보네이트, 라텍스, PMMA, 제올라이트, 폴리에터설폰, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스, 및 이의 조합으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 펙틴이 아니며, 예를 들어, 변형되지 않은 펙틴 또는 변형된 펙틴이 아니다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 자기 비드, 유리 비드, 폴리스티렌 비드, 폴리스티렌 필터, 폴리카보네이트 필터, 폴리에터설폰 필터, 또는 유리 필터이다. 바람직하게, 본 명세서에 개시된 고체 지지체의 제조에 적합한 물질은 낮은 비특이적 결합을 가지며, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 펙틴 변형물의 부재하에, 이러한 물질은 핵산이 단리가 바람직한 샘플의 핵산, 단백질, 또는 다른 성분에 결합하지 않는다.
변형된 펙틴
일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 아미드화 펙틴이다. 펙틴은 일반적으로 식물 세포벽에서 발견되는 자연적으로 발생한 복합 다당류이다. 펙틴은 람노스 잔기에 의해 개재되고 중성 당 측쇄로 변형된 알파 1-4 연결된 폴리갈락투론산 백본 및 비-당 성분 예컨대 아세틸렌, 메틸, 및 페룰산 기를 포함한다. 펙틴의 갈락투론산 잔기는 부분적으로 에스터화되어 메틸 에스터로 존재한다. 에스터화 정도는 에스터화된 카복실 기의 백분율로 정의된다. 예를 들어, 에스터화 정도가 50% 이상인 펙틴은, 고메틸 에스터 ("HM") 펙틴 또는 고 에스터 펙틴으로 분류되며, 에스터화 정도가 50% 미만인 펙틴은 저메틸 에스터 ("LM") 펙틴 또는 저 에스터 펙틴으로 지칭된다. 과일 및 채소에서 발견되는 대부분의 펙틴은 HM 펙틴이다.
본 명세서에서 사용 시, "아미드화 펙틴"은 예를 들어, 화학적, 물리적, 또는 생물학적 (효소 포함) 수단으로, 또는 이의 일부 조합으로, 구조적으로 변형된 자연에 존재하는 임의의 펙틴을 지칭하며, 여기서 에스터 또는 산 기는 아미드 기로 변환된다. 아미드화 펙틴은 변형되지 않은 펙틴을 적합한 아민 용액과 접촉시켜 변형되지 않은 펙틴의 에스터 기를 아미드로 전환함으로써 제조될 수 있다.
Figure pct00006
택일적으로, 변형되지 않은 펙틴 또는 부분적으로 가수분해된 펙틴을 비롯한 가수분해된 펙틴은 적합한 커플링제의 존재하에 아민과 반응하여 아미드화 펙틴을 형성할 수 있다. 적합한 커플링제의 예로는 카보다이이미드 커플링제 예컨대 DCC 및 EDCI, 그리고 포스포늄 및 이모늄 유형의 시약 예컨대 BOP, PyBOP, PyBrOP, TBTU, HBTU, HATU, COMU, 및 TFFH를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00007
일부 구현예에서, 변형된 펙틴은 과아이오딘산염(periodate)-산화 펙틴의 환원적 아미노화에 의해 수득된 변형된 펙틴이다. 펙틴과 같은 탄수화물의 환원적 아미노화 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다.
변형된 펙틴은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 변형되지 않은 펙틴으로부터 수득될 수 있다. 변형된 펙틴 합성에 특히 유용한 출발 물질은 사과 및 시트러스 펙틴이다. 일부 구현예에서, 출발 펙틴은 분자량이 약 4,000 Da 내지 약 500,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 300,000 Da, 약 10,000 Da 내지 약 150,000 Da, 또는 약 10,000 Da 내지 약 100,000 Da이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 복수의 우론산 단위 및 하나 이상의 추가적인 단량체 단위를 포함한다. 우론산은 카보닐 (예를 들어, 알데하이드 또는 케토 기) 및 카복실 산 (-COOH) 작용기를 모두 포함하는 당 산을 포함한다. 일반적으로, 우론산은 말단 하이드록실 기가 카복실 산으로 산화된 당으로부터 유도되며, 일반적으로 모체 당에 따라 명명되고, 예를 들어, 갈락투론산(glucuronic acid)은 글루코스(glucose)로부터 유도된 우론산이다. 헥소스(hexose)로부터 유도된 우론산은 헥수론산(hexuronic acid)으로 알려져 있으며, 펜토스(pentose)로부터 유도된 우론산은 펜투론산(penturonic acid)으로 알려져 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 우론산 단위 이외에도, 아미드화 펙틴은:
Figure pct00008
(I),
Figure pct00009
(II),
이의 이성질체, 염, 호변 이성질체, 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 단위를 추가로 포함하며,
화학식 중 R1은 임의 치환된 C1-C8 알킬, 임의 치환된 C3-C8 사이클로알킬, 임의 치환된 C3-C8 헤테로사이클로알킬, 및 임의 치환된 C2-C20 헤테로알킬으로부터 선택되고;
R2 및 R3는 H, 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 임의 치환된 C2-C20 헤테로알킬으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, R3는 임의 치환된 C1-C6 알킬 일부 구현예에서, R3는 임의 치환된 C4-C20 헤테로알킬, 예를 들어, 하나 이상의 아미노 기로 임의 치환된 짧은 PEG 사슬이다.
일부 구현예에서, R1, R2, 및 R3 각각은 하나 이하의 아미노 기를 포함한다. 일부 구현예에서, R1, R2, 및 R3 각각은 아미노 기를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, R2 및 R3 각각은 하나 이상의 아미노 기를 포함한다. 일부 구현예에서, R2는 H이고 R3는 임의 치환된 C4-C20 헤테로알킬, 예를 들어, 폴리아민 또는 하나 이상의 아미노 기로 임의 치환된 2-6 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 올리고머 에틸렌 글리콜이다.
일부 구현예에서, R1은 메틸, 에틸, 또는 프로필이다. 일부 구현예에서, R2 및 R3는 모두 H이다. 일부 구현예에서, R2는 H이고, R3는 임의 치환된 C1-C8 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 H이고, R3는 H, CH3, CH2CH2NH2, CH2CH2N(CH3)2, CH2CH2OH, 또는 CH2CH2NHCH2CH2NH2이다. 일부 구현예에서, R2 및 R3는 모두 CH3이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 추가적으로 하나 이상의 화학식 (III)의 단위:
Figure pct00010
(III), 또는
이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 중:
R3는 H, CH3, CH2CH2NH2, CH2CH2N(CH3)2, CH2CH2OH, (CH2)2O(CH2)2NH2, 또는 CH2CH2NHCH2CH2NH2이다.
다당류가 화학식 (II) 또는 (III)의 둘 이상의 단위를 포함하는 경우, R3는 다당류 내에서 동일하거나 또는 상이할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 아미드화 펙틴은 적어도 하나의 아미노 기를 가지는 하나 이상의 단량체 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 화학식 VI의 구조를 가지는 단량체 단위:
Figure pct00011
(IV),
이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 중:
n은 0, 1, 2, 또는 3이고;
R4는 H이거나, 또는 C1-C3 알킬이고;
X는, 각각의 경우에, 독립적으로 C2-C4 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
Y는 C2-C3 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 아미드화 펙틴은 하나 이상의 화학식 V 구조를 가지는 단량체 단위:
Figure pct00012
(V),
이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 중:
n은 0, 1, 2, 또는 3이고;
m은, 각각의 경우에, 독립적으로 2, 3, 또는 4이고;
p는 2, 3, 또는 4이고;
R4는 H이거나, 또는 C1-C3 알킬이고;
R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 1차 아미노 기를 포함하는 하나 이상의 단량체 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 4차 암모늄 기를 포함하는 하나 이상의 단량체 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 폴리아민으로 아미드화된 아미드이다. 본 명세서에서 사용 시, 폴리아민은 둘 이상의 아미노 기를 포함하는 화합물이다. 본 명세서에 개시된 고체 지지체의 펙틴 변형에 사용될 수 있는 폴리 아민으로는 합성 폴리아민 및 천연에 존재하는 폴리아민, 예를 들어, 스페르미딘, 스페르민, 푸트레신 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 스페르민, 스페르미딘, 카다베린, 에틸렌다이아민, 및 푸트레신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 스페르민 또는 스페르미딘이다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 화학식 VI, 화학식 VII, 또는 화학식 VIII의 구조:
Figure pct00013
(VI),
Figure pct00014
(VII), 또는
Figure pct00015
(VIII),
그리고 이의 이성질체, 염, 및 호변 이성질체의 하나 이상의 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 화학식 I-VIII의 구조로 나타낸 복수의 추가적인 단량체 단위를 포함한다. 본 명세서에서 사용 시, 용어 "복수"는 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, 복수의 단량체 단위는 적어도 두 개의 단량체 단위, 적어도 3 개의 단량체 단위, 또는 적어도 단량체 단위, 등을 의미한다. 본 발명의 구현예가 하나 이상의 단량체 단위를 포함하는 경우, 제1 단량체 단위, 제2 단량체 단위, 제3 단량체 단위, 등으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 "알킬," "알케닐," 및 "알키닐"은 직선형-사슬, 분지형-사슬, 및 사이클릭 1가 하이드로카빌 라디칼, 및 이들의 조합을 포함하며, 이들은 치환되지 않을 때 오직 C 및 H만을 함유한다. 예로는 메틸, 에틸, 아이소뷰틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸에틸, 2-프로페닐, 3-뷰티닐, 등을 포함한다. 이러한 각각의 기의 전체 탄소 원자 수가 종종 본 명세서에 기재되며, 예를 들어, 기가 최대 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 경우, 1-10C, C1-C10, C1-10 또는 C1-10로서 나타낼 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, 용어 "헤테로알킬," "헤테로알케닐," 및 "헤테로알키닐"은 하나 이상의 사슬 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 상응하는 탄화수소를 의미한다. 예시적인 헤테로원자로는 N, O, S, 및 P를 포함한다. 헤테로원자가, 예를 들어 헤테로알킬 기 내의 탄소 원자를 대체할 수 있는 경우, 기를 설명하는 숫자는, 예를 들어 C3-C10으로서 표기되지만, 이는 고리 또는 사슬 내 탄소 원자의 수와, 기재된 고리 또는 사슬 내 탄소 원자에 대한 대체물로서 포함된 헤테로원자 수의 합을 나타낸다.
단일 기는 하나 이상의 유형의 다중 결합 또는 하나 이상의 다중 결합을 포함할 수 있고; 이러한 기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 경우 용어 "알케닐"의 정의 내에 포함되며, 이들이 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 경우 용어 "알키닐"에 포함된다.
알킬, 알케닐, 및 알키닐 기는 이러한 치환이 화학적으로 타당한 정도로 임의 치환될 수 있다. 일반적인 치환기로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 할로겐 (F, Cl, Br, I), =O, =NCN, =NOR, =NR, 또는, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, 및 NO2, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, 또는 C5-C10 헤테로아릴이고, 각각의 R은 할로겐 (F, Cl, Br, I), =O, =NCN, =NOR', =NR', 또는', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'C(O)OR', NR'C(O)R', CN, C(O)OR', C(O)NR'2, OC(O)R', C(O)R', 및 NO2으로 임의 치환되며, 각각의 R'은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 또한 C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴, 또는 C5-C10 헤테로아릴으로 치환될 수 있으며, 상기 각각은 특정 기에 적절한 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시 "알킬"은 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬 기를 포함하며, 용어 "사이클로알킬"은 본 명세서에서 고리 탄소 원자를 통해 연결된 카보사이클릭 비-방향족 기를 설명하도록 사용되며, "사이클로알킬알킬"은 알킬 링커를 통해 분자에 연결된 카보사이클릭 비-방향족 기를 설명하도록 사용된다. 이와 유사하게, "헤테로사이클릴"은 고리 구성원으로서 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하고 고리 원자 (이는 C 또는 N일 수 있음)를 통해 분자에 연결되는 비-방향족 사이클릭 기를 식별하는데 사용되며; "헤테로사이클릴알킬"은 알킬렌 링커를 통해 또 다른 분자에 연결된 기를 설명하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, 이러한 용어는 또한 고리가 방향족이 아닌 한 이중 결합 또는 2 개를 함유하는 고리를 포함한다.
"방향족" 또는 "아릴" 치환체 또는 모이어티는 잘 알려진 방향족 특성을 가지는 모노사이클릭 또는 접합된 바이사이클릭 모이어티를 지칭하며; 아릴의 예로는 페닐 및 나프틸을 포함한다. 이와 유사하게, "헤테로방향족" 및 "헤테로아릴"은 고리 구성원으로서 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 모노사이클릭 또는 접합된 바이사이클릭 고리 시스템을 지칭한다. 적합한 헤테로원자로는 N, O, 및 S를 포함하며, 이를 포함하여 5-원 고리 뿐만 아니라 6-원 고리의 방향족성을 허용한다. 일반적인 헤테로방향족 시스템으로는 모노사이클릭 C5-C6 방향족 기 예컨대 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 싸이에닐, 퓨라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 싸이아졸릴, 옥사졸릴, 및 이미다졸릴, 및 C8-C10 바이사이클릭 기를 형성하기 위해 이러한 모노사이클릭 기 중 하나를 페닐 고리와 또는 임의의 헤테로방향족 모노사이클릭 기와 접합하여 형성된 접합된 바이사이클릭 모이어티, 예컨대 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트라이아졸릴, 아이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조싸이아졸릴, 벤조퓨란일, 피라졸로피리딜, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 시놀린일, 등을 포함한다. 고리 시스템 전체에 걸친 전자 분포의 측면에서 방향족 특성을 가지는 임의의 모노사이클릭 또는 접합된 고리 바이사이클릭 시스템이 이러한 정의에 포함된다. 또한 방향족의 특성을 가지는 분자의 나머지 부분에 직접적으로 부착되는 바이사이클릭 기를 포함한다. 일반적으로, 고리 시스템은 5-14개의 고리 구성원 원자를 포함한다. 일반적으로, 모노사이클릭 헤테로아릴은 5-6 개의 고리 구성원을 포함하며, 바이사이클릭 헤테로아릴은 8-10 개의 고리 구성원을 포함한다.
아릴 및 헤테로아릴 모이어티는 다양한 치환기, 예를 들어 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-C12 아릴, C1-C8 아실, 및 이의 헤테로폼으로 치환될 수 있고, 상기 각각은 그 자체가 추가로 치환될 수 있다; 아릴 및 헤테로아릴 모이어티에 대한 다른 치환기로로는 다음을 포함한다: 할로겐 (F, Cl, Br, I), 또는, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, 및 NO2, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이며, 각각의 R은 알킬 기에 대해 상기 기재된 바와 같이 임의 치환된다. 아릴 또는 헤테로아릴 기 상의 치환기는 본 명세서에서 치환기의 각 유형 또는 치환기의 각 성분에 대해 적합한 것으로 기재된 기로 추가로 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 아릴알킬 치환체는 아릴 부분에서 아릴 기에 대해 전형적인 것으로 본 명세서에 기재된 치환기로 치환될 수 있으며, 알킬 부분에 알킬 기에 전형적이거나 적합한 것으로 본 명세서에 기재된 치환기로 추가적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "임의 치환"은 기재되는 구체적인 기가 비-수소 치환체로 대체된 하나 이상의 수소 치환기를 가질 수 있음을 나타낸다. 일부 임의 치환된 기 또는 모이어티에서, 모든 수소 치환기는 비-수소 치환체로 치환된다 (예를 들어, 트라이플루오로메틸과 같은 폴리플루오로화 알킬). 달리 명시되지 않는 경우, 존재할 수 있는 이러한 치환기의 총 개수는 기재되는 기의 비치환 형태에 존재하는 H 원자의 개수와 동일하다. 임의 치환기가 카보닐 산소 또는 옥소 (=O)와 같이 이중 결합을 통해 부착되는 경우, 이러한 기는 2 개의 가용 원자가를 차지하므로, 포함될 수 있는 총 치환기 수는 사용 가능한 원자가 수에 따라 감소한다.
본 명세서에서 사용 시, 달리 명시되지 않는 한, 용어 “아미노 기”는 1차, 2차, 및 3차 아미노 기를 포함한다.
고체 지지체에 대한 아미드화 펙틴의 공유 부착은 임의의 적합한 방식으로, 예컨대 폴리아민-아미드화 펙틴을, 아민-반응성 기, 예를 들어, 에폭사이드, 알데하이드, 케톤, 또는 활성화된 에스터를 포함하는 고체 지지체와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 1차 또는 2차 아미노 기를 포함하는 아미드화 펙틴은 또한 가교에 의해 고체 지지체, 예를 들어, 아미노-변형된 고체 표면에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, 가교는 공유 결합에 의해 둘 이상의 분자를 화학적으로 연결하는 과정을 의미한다. 일부 예시에서, 가교제를 사용하여 아미드화 펙틴을 고체 지지체에 부착하여 펙틴-변형된 고체 지지체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, 가교제 (crosslinking agent 또는 crosslinker)는 분자 및/또는 고체 지지체 상에 특정 작용기 (예컨대 1차 아민, 카복실, 설프하이드릴, 등)을 화학적으로 부착할 수 있는, 둘 이상의 작용성 말단을 포함하는 분자이다. 아미노 기를 포함하는 분자를 작용기화된 표면 및 고체 지지체에 공유적으로 연결하는 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 아미드화 펙틴은 아미드 결합, 예를 들어, 고체 지지체의 카복시 기와 아미드화 펙틴의 아미노 기 사이에 형성되는 아미드 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 아미드 결합의 형성은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 1차 아미노 기를 포함하는 아미드화 펙틴은 적합한 커플링제의 존재하에 하나 이상의 카복실산 기를 포함하는 기질과 반응할 수 있다. 적합한 커플링제의 예로는 카보다이이미드 커플링제 예컨대 DCC 및 EDCI, 포스포늄 및 이모늄 유형의 시약 예컨대 BOP, PyBOP, PyBrOP, TBTU, HBTU, HATU, COMU, 및 TFFH를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, 고체 기질의 카복실산 기는 활성화된 에스터로 전환된 다음, 아미드화 펙틴의 아미노 기와 반응할 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 화학식 (II)-(VIII) 중 임의의 하나로 표현되는 하나 이상의 단위를 가지는 아미드화 펙틴을 포함하며, 이러한 아미드화 펙틴은 고체 지지체에 공유적으로 부착된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에는 핵산 함유 샘플로부터 핵산의 단리 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 샘플을 본 명세서에 개시된 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
(b)선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계; 및
(c) 고체 지지체에 결합된 핵산을 용리 시약과 접촉시켜, 고체 지지체로부터 핵산을 용리시키는 단계.
용해 용액
일부 구현예에서, 핵산 함유 샘플은 용해 용액과 접촉된 후, 고체 지지체와 접촉하여, 샘플 내 포함된 세포를 용해하고 핵산을 용액으로 방출한다. 샘플이 용해된 후, 핵산은 본 명세서에 기재된 아미드화 펙틴으로 공유 변형된 실리카 또는 유리 기질과 같은 고체 기질에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 자동화 카트리지, 예컨대 GenXpert® 카트리지로 통합된다. 결합 후, 상등액은 제거되고, 핵산은 용리 완충액, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 알칼리 용액으로 기질로부터 용리된다. 용리액은 관심의 표적 유전자를 검출하기 위해 카트리지에서 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 건조된 입자로서 카트리지에 존재하는 PCR 시약의 적어도 일부를 재구성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, PCR은 AptaTaq (Roche, 스위스)과 같은 핫 스타트 기능을 가진 Taq 중합 효소를 사용한다.
일부 구현예에서, 용해 용액은 무질서 유발제, 예컨대 구아니디움 싸이오시아네이트, 구아니디움 하이드로클로라이드, 알칼리 퍼클로레이트, 알칼리 아이오다이드, 우레아, 폼아미드, 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 염을 포함한다. 바람직하게, 염은 소듐 클로라이드 또는 칼슘 클로라이드이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 핵산을 본 발명의 고체 지지체에 결합시키기 위해 무질서 유발 시약 또는 고농도의 염의 사용을 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 샘플은 다당류 시약 용액을 첨가하고, 이어서 핵산의 침전 이전에, 샘플을 용해 완충액과 접촉시킴으로써 용해된다. 일부 구현예에서, 용해 시약은 핵산-침전 다당류 시제의 용액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 다당류 시약은 용해 용액에 용해된다. 일부 예시에서, 용해 용액은 하나 이상의 프로테아제를 포함한다. 적합한 프로테아제로는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 메탈로 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 적합한 프로테아제로는 프로테니아제 k (광범위한 스펙트럼 세린 프로테아제), 서브틸리신 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 제공된 교시 및 예를 사용하여, 다른 프로테아제가 당업자에게 이용 가능할 것이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 고정 파라핀 포매 생물학적 조직 샘플로부터 핵산 (예를 들어, DNA, RNA)을 단리시키는 단계, 증폭된 샘플을 수득하기 위해 표적 핵산의 영역을 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 침전된 핵산을 증폭시키는 단계; 및 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 결정하는 단계에 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 DNA (예를 들어, 유전자)이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 RNA (예를 들어, mRNA, 비-코딩 RNA, 등)이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 단리된 핵산은 진단 방법, 예방 방법, 치료 (예를 들어, 암 치료) 모니터링 방법, 등에 사용하기에 매우 적합하다. 따라서, 일부 예시적이고, 비제한적인 구현예에서, 고정 파라핀 포매 샘플로부터 (예를 들어, FFPET 샘플로부터) 추출된 핵산은 유전자의 존재 및/또는 발현 수준, 및/또는 유전자의 돌연변이 상태를 식별하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 특히 하나 이상의 암 마커의 존재 및/또는 발현 수준, 및/또는 돌연변이 상태의 식별에 매우 적합하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 단리된 핵산은 하나 이상의 암 마커의 존재, 및/또는 카피 수, 및/또는 발현 수준, 및/또는 돌연변이 상태를 검출하는데 사용된다.
세척 및 용리
본 명세서에 개시된 검출 및 단리 방법은 세척 단계를 선택적으로 포함할 수 있으며, 즉, 침전된 핵산은, 예를 들어, 용해 완충액의 성분을 제거하기 위해, 고체 지지체에서 선택적으로 세척될 수 있다. 일반적으로, 농축된, 예를 들어, 침전된 핵산은 검출 전에 용해된다. 일부 구현예에서, 농축된 핵산은 PCR 반응과 상용성이 있는 완충액에 용해된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 폴리아민-변형된 다당류가 핵산을 침전기키기 위해 사용되는 경우, 침전된 핵산은 적합한 용리제와 접촉함으로서 폴리아민으로부터 용리될 수 있다. 일부 구현예에서, 용리제는 암모니아 또는 알칼리 금속 수산화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리제는 염기성 pH이다. 일부 구현예에서, 용리제는 pH가 약 9 내지 약 12, 약 9.5 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11이다. 바람직하게, 용리제의 pH는 10 이상이다. 바람직하게, 용리제는 핵산과 다당류 시제가 결합하는 것을 방해하기에 충분한 농도의 암모늄 하이드록사이드, NaOH, 또는 KOH를 포함한다. 예시적인 용리제는 1% 암모니아, 15 mM KOH, 또는 15 mM NaOH를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리제는 다중 음이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 음이온은 복수의 음이온 기를 포함하는 중합체이다. 일부 구현예에서, 음이온 기는 포스페이트, 포스포네이트, 설페이트, 또는 설포네이트 그룹, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 다중 음이온은 약 7 이상의 pH에서 음으로 하전된 중합체이다. 합성 다중 음이온 및 천연 존재의 다중 음이온 모두 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 음이온은 카라기난이다. 다른 구체예에서, 다중 음이온은 담체 핵산이다. 본 명세서에서 사용 시, 담체 핵산은, 예를 들어, PCR에 의해 농축된 핵산의 후속 검출을 방해하지 않는 핵산이다. 예시적인 담체 핵산은 폴리 rA, 폴리 dA, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, 당업자에게 잘 알려진 기타 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리제는 카라기난 및 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어, NaOH 또는 KOH를 포함한다.
핵산
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 핵산 함유 용액으로부터 핵산을 단리하기 위해 사용된다. 핵산 함유 용액은 핵산 함유 물질로부터 용해에 의해 수득될 수 있다. 핵산 함유 물질은 일반적으로 혈액, 조직 생검 예컨대 파라핀 포매 조직, 도말 제제, 박테리아 배양물, 바이러스 매양물, 소변, 정액, 세포 현탁액 및 부착성 세포, PCR 반응 혼합물, 및 시험관 내 핵산 변형 반응 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 핵산 함유 물질은 인간, 박테리아, 진균, 동물, 또는 식물 물질을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 함유 용액은 핵산 변형 반응 또는 핵산 합성 반응으로부터 수들될 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 함유 용액은 핵산 변형 반응 또는 핵산 합성 반응으로부터 수들될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 "핵산"은, 임의의 가능한 구성의, 즉, 이중 가닥 핵산, 단일 가닥 핵산, 압타머, 또는 임의의 이의 조합의 형태의, 임의의 합성 또는 천연 존재의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 핵산은 DNA, 예컨대 게놈 DNA일 수 있다. 핵산은 또한 RNA, 예컨대 전체 RNA일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산, 예컨대 짧은 이중 가닥 DNA 단편일 수 있다. 핵산은 합성 핵산일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 순환 핵산이다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 단리된 핵산 및 본 명세서에 기재된 고체 지지체는 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 서열을 검출 및/또는 정량화하기 위해 증폭되기 적합한 품질이다. 본 명세서에 기재된 핵산 단리 방법 및 고체 지지체는 질병의 진단 및 예후에 관련된 유전자 발현 프로파일의 발견을 목표로 하는 기본적인 연구에 사용할 수 있다. 상기 방법은 또한 질병의 진단 및/또는 예후, 특정 치료 요법의 결정 및/또는 치료 효과의 모니터링에 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 핵산 함유 샘플로부터 핵산을 침전시키는데 사용된다. 핵산 함유 물질은 일반적으로 혈액, 혈청, 조직 생검 예컨대 파라핀 포매 조직, 구강액, 도말 제제, 박테리아 배양물, 바이러스 매양물, 소변, 정액, 세포 현탁액 및 부착성 세포, PCR 반응 혼합물, 및 시험관 내 핵산 변형 반응 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 핵산 함유 물질은 인간, 동물, 또는 식물 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 용액에 있다. 핵산 함유 용액은 세포 외 핵산 용액 및 핵산 함유 세포의 용해에 의해 수득된 용액을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 함유 용액은 핵산 변형 반응 또는 핵산 합성 반응으로부터 수들될 수 있다.
증폭 방법
본 명세서에 기재된 방법은 생물학적 샘플로부터 핵산의 단리를 단순화하고 RT-PCR 시스템에 사용하기에 매우 적합한 단리된 핵산을 효율적으로 생산한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 핵산 함유 샘플으로부터 단리된 핵산은 임의의 적합한 공지된 핵산 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서 추출된 핵산이 증폭 반응에 사용되지만, 다른 용도가 또한 고려된다. 이에 따라, 예를 들어, 단리된 핵산 또는 이의 증폭 산물(들)은 핵산-기반 마이크로어레이 및 차세대 시퀀싱을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 시퀀싱 또는 혼성화 프로토콜에 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 명세서에는 핵산을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 핵산 함유 샘플을 본 명세서에 개시된 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
(b) 선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계;
(c) 고체 지지체에 결합된 핵산을 용리 시약과 접촉시켜, 고체 지지체로부터 핵산을 용리시키는 단계; 및
(d) 핵산을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 검출 방법은 핵산 증폭을 포함한다. 적합한 비제한적인 예시적인 증폭 방법으로는 중합 효소 사슬 반응 (PCR), 역전사효소 PCR, 실시간 PCR, 중첩 PCR, 다중 PCR, 정량적 PCR (Q-PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 전사 매개 증폭 (TMA), 결찰효소 사슬 반응 (LCR), 롤링 서클 증폭 (RCA), 및 가닥 변위 증폭 (SDA)을 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 방법은 약 1 내지 약 10 분간 약 90 ℃ 내지 약 100 ℃에서 초기 변성을 포함하며, 약 1 내지 약 30 초간 약 90 ℃ 내지 약 100 ℃에서 변성, 약 1 내지 약 30 초간 약 55 ℃ 내지 약 75 ℃에서 어닐링, 및 약 5 내지 약 60 초간 55 ℃ 내지 약 75 ℃에서의 연장을 포함하는 사이클을 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 변성 이후 제1 사이클 동안, 사이클 변성 단계는 생략된다. 구체적인 시간 및 온도는 증폭되는 특정 핵산 서열에 따라 달라지며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산의 단리 및 검출은 자동화 샘플 취급 및/또는 분석 플랫폼에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 자동화 분석 플랫폼이 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GeneXpert 시스템 (Cepheid, 캘리포니아 써니베일 소재)이 사용된다. 그러나, 본 발명은 특정 검출 방법 또는 분석 플랫폼에 제한되지 않는다. 당업자는 임의의 수의 플랫폼 및 방법이 이용될 수 있음을 인식한다.
GeneXpert 시스템은 독립형(self-contained), 일회용 카트리지를 사용한다. 샘플 추출, 증폭, 및 핵산의 검출은 모두 이러한 독립형 "카트리지의 실험실" 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,374, 684를 참조하며, 상기 특허는 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 카트리지의 구성 성분으로는, 표적 핵산을 추출, 정제 및 증폭하기에 유용한 시약, 필터, 및 포획 기술을이 포함된 처리 챔버가 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 밸브는 챔버에서 챔버로의 유체 이동을 가능하게 하며 핵산 용해 및 여과 구성 요소를 포함한다. 광학 창을 통해 실시간 광학 감지가 가능하다. 반응 튜브는 매우 빠른 열적 사이클을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, GenXpert 시스템은 확장성을 위해 복수의 모듈을 포함한다. 각각의 모듈은 샘플 취급 및 분석 구성 성분과 함께 복수의 카트리지를 포함한다.
크로마토그래피용 고체상
일부 구현예에서, 본 명세서에는 다당류가 결합된 고체 지지체를 포함하는 크로마토그래피를 위한 분리 물질이 개시된다. 일부 구현예에서, 다당류는 폴리 우론산 또는 아미드화 펙틴이다. 일부 구현예에서, 다당류는 고체 지지체의 표면에 흡착된 아미드화 펙틴이다. 다른 구체예에서, 아미드화 펙틴은 공유, 비공유, 또는 공유 결합 및 비공유 상호 작용의 조합을 통해 고체 지지체의 표면에 고정된다.
일부 구현예에서, 분리 물질은 고체 지지체에 결합된 다당류를 포함하며, 상기 다당류는 하나 이상의 화학식 II으로 나타낸 단위:
Figure pct00016
(II),
이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 중
R2 및 R3는 H, 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 임의 치환된 C2-C20 헤테로알킬으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 화학식 II-VIII의 구조를 가지는 하나 이상의 단위를 포함하는 펙틴이다.
분리 물질의 제조에 적합한 고체 지지체로는 실리카 겔 및 다른 무기 물질, 예컨대 Al2O3 (알루미나), TiO2 (티타니아), 또는 ZrO2 (지르코니아)를 포함한다. 유기 중합체 수지가 또한 본 명세서에 개시된 분리 물질의 제조에 사용될 수 있다. 하이브리드 입자 기술 (HPT)을 가지는 특정 재료, 예를 들어, 하이브리드 유기/무기 물질, 예컨대 Waters BEH TechnologyTM 물질이 본 명세서에 개시된 분리 물질의 제조에 적합하다. HPT 물질은 순도 기계적 강도, 높은 구형 모양, 입자 크기 조정 능력, 기공 직경, 표면적 및 표면 화학과 같은 실리카의 주요 이점을 유지한다. 동시에, 이러한 하이브리드 물질은 염기성 pH, 예를 들어 8 이상의 pH에서 안정하다.
바람직하게, 분리 물질의 제조에 사용되는 고체 지지체는 다공성이다. 일부 구현예에서, 분리 물질은 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통해 결합된 아미드화 펙틴을 가지는 다공성 입자이며, 다른 구체예에서, 분리 물질은 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통해 결합된 아미드화 펙틴을 가지는 다공성 단일 지지체(monolithic support)이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 분리 물질의 제조에 사용되는 고체 지지체는 실리카 겔 또는 실리카이다. 실리카는 기공 직경, 입자 크기, 및/또는 비표면적을 특징으로 한다. 실리카 겔-기반 분리 물질은 바람직하게 기공 직경이 약 30 내지 약 1000 Angstroms이고, 입자 크기가 약 2 내지 약 300 마이크론이며, 비표면적이; 약 35 m2/g 내지 약 1000　m2/g이다. 일부 구현예에서, 실리카 겔은 기공 직경이 약 40　Angstroms 내지 약 500 Angstroms, 약 60 Angstroms 내지 약 500 Angstroms, 약 100 Angstroms 내지 약 300 Angstroms, 및 약 150 Angstroms 내지 약 500 Angstroms이다. 일부 구현예에서, 실리카 겔은 입자 크기가 약 2 내지 약 25 마이크론, 약 5 내지 약 25 마이크론, 약 15 마이크론, 약 63 내지 약 200　마이크론, 및 약 75 내지 약 200 마이크론이고; 비표면적이 약 100　m2/g 내지 약 350 m2/g, 약 100 m2/g 내지 약 500 m2/g, 약 65 m2/g 내지 약 550 m2/g, 약 100 m2/g 내지 약 675 m2/g, 및 약 35 내지 약 750 m2/g이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 크로마토그래피 물질은 자기 실리카 입자를 포함한다. 자기 실리카 입자는 수화 실리카 산화물 흡착 표면 (즉, 실란올 또는 Si-OH 기를 가지는 표면)으로 코팅된 초상자성 코어를 포함한다. 적합한 상업적으로 입수 가능한 자기 실리카 입자로는 Promega Corporation (위스콘신, 매디슨 소재)로부터 입수 가능한 MagneSilTM 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 산화 알루미늄이다. 예시적인 산화 알루미늄 고체 지지체로는 약 150 mesh 및 58 angstroms인 Brockmann 산화 알루미늄을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 아미드화 펙틴은 링커를 통해 고체 지지체에 화학적으로 결합된다. 고체 지지체와 아미드화 펙틴 사이의 링커는 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게, 링커는 2-20개의 탄소 원자를 포함하며 탄소 원자 이외에 질소 및 산소 원자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 올리고에틸렌 링커, 예를 들어, PEG 올리고머이다.
분리 물질의 제조는 임의의 적합한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 표면 개질제와 반응할 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, 표면 개질제는 베이스 고체 지지체에 일부 크로마토그래피 기능을 부여하는 모이어티이다. 본 명세서에 개시된 아미드화 펙틴과 같은 표면 개질제는, 유도체화 반응, 비공유 코팅, 또는 이의 조합을 통해 베이스 고체 지지체에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 고체 지지체의 유기 기는 반응성 기를 포함하는 아미드화 펙틴과 같은 표면 개질제와 공유 결합을 형성한다. 아미드화 펙틴의 이러한 공유 부착은 고리화 첨가 및 친햇겅 및 친전자성 치환과 같은 기술 분야 내 잘 알려진 다수의 메커니즘을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 베이스 고체 지지체는 실란올 기를 포함하는 실리카 겔이다. 이러한 실리카 겔 고체 지지체는 본 명세서에 개시된 분리 물질을 수득하기 위해 실란화 기를 포함하는 개질제와 반응할 수 있다. 예를 들어, 실란올 기는 화학식 XaRbSi-L-Z를 가지는 실란화 시약으로 표면-변형되는데, 화학식 중 X는 Cl, Br, I, C1-C5 알콕시, 다이알킬아미노, 또는 트라이플루오로메탄설포네이트이고; a 및 b는 각각 0 내지 3의 정수이며 a와 b의 합은 3이고; R은 C1-C6 직선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬이고; L은 임의 C1-C20 알킬렌 또는 임의 치환될 수 있는 헤테로알킬렌 링커 그룹이고; Z는 작용기이다.
일부 구현예에서, Z는 아미드화 펙틴을 포함한다. 다른 구체예에서, Z는 아미드화 펙틴으로 추가로 작용기화될 수 있는 작용기, 예컨대 아미노, 카보닐, 또는 카복실 기를 포함한다. 실란화제의 예로는 아미노 실란화제, 예컨대 3-아미노프로필트라이메톡시실란, 3-아미노프로필트라이에톡시실란, 아미노알킬실라트란, 3-(2-아미노에틸)아미노프로필-트라이에톡시실란, 및 3-(2-아미노에틸)아미노프로필트라이에톡시실란을 포함한다. 실리카 겔과 아미노 실란화제의 반응은 하나 이상의 반응성 기를 포함하는 아미드화 펙틴으로 추가로 변형 및/또는 이와 반응할 수 있는 표면 아미노 기를 포함하는 실리카 겔을 제공한다. 다른 구체예에서, 실리카 겔은 실리카-반응성 기, 예컨대 실라트란 또는 트라이알콕시실란 유도체를 포함하는 아미드화 펙틴 유도체와 반응한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에는, 흡착제 또는 지지체로서, 표면 및 표면에 부착된 하나 이상의 아미드화 펙틴 분자를 포함하는 고체 지지체를 포함하는 컬럼, 모세관, 또는 카트리지가 개시된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 분리 물질 및 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어, 생물학적 샘플 또는 화학 반응 혼합물로부터 핵산의 단리, 분리, 및 정제에 유용하다. 일부 구현예에서, 분리는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 크기 배제 크로마토그래피, 또는 전기 영동에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 분리 물질은 dsDNA, ssDNA, RNA, 및 이의 하이브리드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 핵산의 분리에 적합하다. 분리 물질로부터 핵산의 용리 및 이의 분리는 용리액 이동상의 이온 강도를 증가시키거나 용리제의 농도를 단계적으로 또는 구배 방식으로 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이동상은 HPLC 분리에 적합한 유기 용매, 예컨대 아세토나이트릴 또는 메탄올을 선택적으로 포함할 수 있다. 이온 강도의 증가는 적합한 염, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 구아니디움 염의 농도를 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 요소 각각이 여러 구체예를 포함하는 것으로 본 명세서에 기재되어 있지만, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 주어진 요소의 구체예 각각은 본 발명의 다른 요소의 구체예 각각과 함께 사용될 수 있고, 이러한 각각의 사용은 본 발명의 상이한 구체예를 형성하는 것으로 의도된 것임을 이해해야 한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 단지 추가적인 예시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 아미드화 펙틴-변형된 고체 지지체의 제조 (EDC 경로)
A. 아미드화 펙틴-변형된 비드의 제조
모든 시약은 달리 명시하지 않는 한 상업적 공급원으로부터 입수하였다.
하기 기재된 절차에 따라 스페르민으로 아미드화된 펙틴을 제조하였다. 다른 아미드화 펙틴을 유사한 방식으로 제조하였다.
(A) 사과 펙틴 (2.5g)을 자기 교반하면서 모두 용해될 때까지 탈이온수 250mL에 부분적으로 첨가하였다. 상기 용액에, 2.5 mL의 5M NaOH를 첨가하고 20 분간 교반한 뒤, pH가 ~4.5에서 안정화될 때까지 1M HCl를 첨가하였다 (~12 mL의 1M HCl를 첨가). 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl, 2.5 g) 및 0.75 g의 N-하이드록시석신이미드 (NHS)를 첨가하고 활성화를 위해 1 시간동안 교반하였다. 스페르민 (Sigma, 18.63 g, 7 eq)을 한 번에 첨가하였다. 용액은 젤처럼 되었고 모든 것이 용해될 때까지 흔들어주고, 실온에서 20 시간 동안 추가적으로 인큐베이션 하였다.
(B) (A)의 반응 혼합물을 교반하면서 MeOH 500 mL에 부어, 겔과 같은 침전물을 형성하였다. 혼합물을 30 분 동안 교반하고 폴리에틸렌 프릿 (Opti-Chem, OP-6602-18)이 장착된 500 mL 플라스틱 일회용 필터를 통해 여과하였다. 수집된 겔형 케이크를 메탄올 (100 mL)로 세정하고 밤새 추가로 여과하여, 건조된 갈색 젤 덩어리를 형성하였다. 이어서, 상기 물질을 또 다른 150 mL MeOH로 세척하고 진공 오븐에서 18 시간 동안 50 °C에서 건조시켰다. 형성된 단단한 펠릿을 막자 사발에서 가루로 분쇄하였다.
(C) 세척
물질:
A. 산성 세척. 1000 mL 보틀에 다음 혼합물을 제조하였다: IPA (550 mL, graduated cylinder), 탈이온수 (345 mL) 및 진한 HCl (105 mL)
B. 중성 세척. 1000 mL 플라스크에 다음 혼합물을 제조하였다: 410 mL 탈이온수를 포함하는 590 mL IPA
단계 (B)의 생성물을 125 mL 플라스크에 로딩하고 110 mL의 세척 용액을 분말 물질에 첨가하였다 현탁액을 30 분간 실온에서 교반하고 유리 깔대기에서 여과하고, 5 x 15-20 mL의 산 세척에 이어, 5 x 15-20 mL의 중성 세척, 그리고 2 x 35 mL MeOH으로 세척하였다. 물질을 60 분 동안 추가로 공기 건조시킨 다음, 0.15 mbar에서 17 시간 동안 건조시켰다.
B. 아미드화 펙틴-변형된 비드의 제조
하기 기재된 절차에 따라 다음의 고체 지지체 (비드) 물질을 아미드화 펙틴으로 변형시켰다:
실리카 미세구, 카복실, 1.0μm (펜실베니아 워링턴 소재의 Polysciences, 24754-1)
카복실-폴리스티렌 입자, 5.11 μm (독일 소재의 Spherotech, CP-50-10)
NHS-활성화 세파로스 4 패스트 플로우 (일리노이 시카고 소재의 GE healthcare, 세파로스 비드, 17-0906-01); 및
카복실-변형된 자기 비드, 5.7 μm (독일 소재의 Spherotech).
세파로스 비드의 경우, NHS 활성화 비드 형태를 사용하고 EDC/NHS 활성화 단계를 생략하였다. 가수 분해된 NHS-세파로스 비드를 변형되지 않은 비드 측정에 사용하였다.
이러한 실시예에서, 실시예 1의 생성물과 같은 아민 함유 아미드화 펙틴을 사용하는 카복실 변형된 비드의 작용기화를 위한 절차가 제공된다.
카복실 기 (Spherotech, CP-50-10)로 변형된 폴리스티렌 비드 (~5 마이크론, 2 mL의 5 중량% 현탁액)을 탈이온수 (4 mL)로 희석하고 15 분 동안 초음파 처리하였다. 비드 현탁액에, 40　mg의 EDC.HCl 및 40　mg의 NHS를 첨가하였다. 활성화를 위해 현탁액을 24 시간 동안 교반하고, 4000 rpm에서 5 분 동안 간단히 원심 분리하고 상등액을 상층 분리하였다. 비드를 5 mL 탈이온수에 재현탁하고, 여기에 아미드화 펙틴 1 % 용액 (5 mL)을 첨가하였다. 아미드화 펙틴 용액은 탈이온수에서 18 시간 동안 아미드화된 펙틴으로 제조한 다음, 용해된 물질을 제거하기 위해 9000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리 하였다. 생성된 현탁액을 18 시간 동안 교반한 다음, 9000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리하고, 45 mL의 물로 희석하고 동일한 방식으로 세정하였다. 0.1　M NaOH (1x), 0.1 M HCl (1x), 및 탈이온수 (2x)으로 공정을 반복하였다. 비드를 5 mL 탈이온수에 재현탁하고, 30 분 동안 초음파 처리하고. SpeedVac에서 진공하에 150 μL 분취량을 건조시킨 후, 남은 비드의 양을 측정하여 농도를 측정하였다.
실시예 2: 아미드화 펙틴-변형된 고체 지지체의 제조 (환원적 아미노화 경로)
상기 실시에서는, 산화 후 환원적 아미노화를 통해 다양한 폴리아민을 사용한 다당류, 예를 들어, 펙틴의 변형에 대한 일반적인 절차가 제공된다.
(A). 산화. 사과 펙틴 (2.5 g)을 자기 교반하면서 모두 용해될 때까지 탈이온수 250mL에 부분적으로 첨가하였다. 여기에, 교반하면서 포타슘 페리오데이트 (2.43 g)를 부분적으로 첨가하고 18 시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 3 일에 걸쳐 8 kDa MWCO 투석 튜브를 통해 물에 대해 투석하였다. 생성된 탈염된 중합체를 후속적으로 동결 건조하여 회백색 고체로서 산화된 펙틴을 수득하였다. 알데하이드의 농도는 하이드록시아민 적정을 통해 용이하게 측정될 수 있다 (예를 들어, Zhao, H.; Heindel, N. D. J. Pharm. Res. 8(3), 400-402. 참조). 알데하이드 함량은 4.9 mmol/g (중합체 단위 당 ~1 당량의 알데하이드)로 측정되었다.
(B). 환원적 아미노화. 단계 A (1.0 g)에서 산화된 펙틴을 100 mL의 탈이온수에 현탁시키고, 스페르민 (1.32 g, 1.25 eq)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 소듐 보로 하이드라이드 펠렛 (1.0g)을 반응에 첨가하고 혼합물을 18 시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 3 일에 걸쳐 8kDa MWCO 투석 튜브를 통해 물에 대해 투석한 뒤 동결 건조하여, 회백색의 푹신한 고체로서 아미드화 펙틴 200mg을 수득하였다.
상기 반응으로부터의 생성물은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 고체 지지체의 변형에 사용하였다.
실시예 3: 필터에서 변형된 비드에 의한 핵산 포획 평가
상기 실험은 예시적인 고체 지지체, 예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 아미드화 펙틴-변형된 비드가 필터에서 DNA 또는 RNA를 포획할 수 있음을 입증하였다.
재료
실시예에서는 다음 재료를 사용하였다: 게놈 DNA (Promega Cat#G3041 ~202 ng/μL); RNA 대조군 (Life Tech Cat# 4307281, 50 ng/μL); 정량적 형광 Picogreen DNA 염료 (Thermo); 정량적 형광 Ribogreen RNA 염료 (Thermo); Biotek 형광계 및 핵산의 형광 정량화에 적합한 검은색 분석 플레이트; 보정된 피펫 및 피펫 팁; 1x TE 완충액 (제조업체의 지침에 따라 Thermo: EnzChek®Reverse Transcriptase Assay Kit, P/N E22064 ), 또는 pH ~8.5으로 제조된 20 mM Tris; Whatman GF/F 필터 및 Pall Supor 0.2 마이크론 필터; 필터 홀더
방법
1x TE 완충액에서 DNA 또는 RNA의 테스트 용액을 원하는 최종 농도 (예를 들어, 100 ng/mL)로 제조하였다. 테스트 용액에 TE 중의 DNA 또는 RNA와 함께 변형된 비드를 첨가하였다. 대조군으로서, 비드가 첨가되지 않은 DNA 또는 RNA 용액을 제조하였다. 예시적인 테스트 용액:
0.1-1.5 mg의 변형된 비드와 핵산을 포함하는TE 완충액;
비드를 포함하지 않고 핵산을 포함하는 TE 완충액 (음성 대조군);
비드를 포함하지 않고 핵산을 포함하는 TE 완충액, 여과하지 않음;
핵산 용액의 1 mL 샘플을 변형된 비드와 15 초간 혼합하여 혼합 및 비드 표면에 대한 핵산의 결합을 촉진하였다. 샘플을 1mL 주사기로 흡인하고; 주사기 필터 장치 또는 미리 만들어진 필터를 사용하여 GF/F 또는 기타 관심 필터를 통과시켰다. 용리액을 2 mL Eppendorf 튜브에 수집하였다. 포획된 핵산이 필터의 비드에 유지되었기 때문에, 포획된 핵산의 양은 다음과 같이 용리액 내 핵산의 부재로 간접적으로 평가될 수 있다.
DNA 또는 RNA에 대한 표준 곡선은 제조업체의 지침에 따라 준비하였다; 총 8개의 튜브에 500 μL의 각 표준 및 블랭크를 준비하였다. 작업 염료 용액은 TE 버퍼에서 염료를 1:200으로 희석하여 준비하고 빛으로부터 보호하였다. 표준 곡선 샘플 및 각 용리액 샘플의 형광도는 Biotek 플레이트 판독기의 제조업체 지침에 따라 측정하였다. 표준 곡선은 용리액 샘플에서 핵산의 농도를 계산하고 이론적 농도에 대한 포획 백분율을 계산하는데 사용하였다. 핵산의 회수율을 결정하기 위해 테스트 샘플을 100 % 여과되지 않은 대조군과 비교하였다. 최소한의 백그라운드 필터 포획을 평가하기 위해 비드를 포함하지 않는 대조군 샘플을 여과시켰다. 100% 대조군은 여과되지 않았다.
표 1-5는 아미드화 펙틴으로 변형된 고체 지지체가 핵산을 효율적으로 포획할 수 있음을 보여주는 여과 실험 결과를 보여준다.
표 1. Pall Supor 0.2 마이크론 필터 상에서 변형된 유리 비드에 의한 hgRNA 및 hgDNA 포획.
비드 유형 개질제 hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL 비드 1.5 mg/mL 비드
유리 1 μm 없음 0% 12% 6% 8% 1%
유리 1 μm 스페르민 11% 7% 12% 18% 9%
유리 1 μm 스페르미딘 9% 12% 15% 10% 19%
유리 1um 펙틴-스페르민 11% 8% 12% 10% 19%
유리 1 μm 펙틴-스페르미딘 12% 9% 15% 22% 25%
유리 1 μm 펙틴 에틸렌다이아민 12% 16% 14% 25% 27%
없음 N/A 0% 0% 0% 0% 0%
hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL 비드 1.5 mg/mL 비드
유리 1 μm 없음 13% 58% 64% 80% 85%
유리 1 μm 스페르민 49% 64% 72% 84% 86%
유리 1 μm 스페르미딘 48% 68% 72% 81% 85%
유리 1 μm 펙틴-스페르민 37% 55% 68% 80% 86%
유리 1 μm 펙틴-스페르미딘 53% 51% 62% 78% 75%
유리 1 μm 펙틴-에틸렌다이아민 45% 66% 65% 77% 75%
없음 N/A 16% 16% 16% 16% 16%
표 2. Whatman GF/F 필터에서 변형된 세파로스 비드에 의한 hgRNA 및 hgDNA 포획.
hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL
비드		 0.25 mg/mL
비드		 0.5 mg/mL
비드		 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
세파로스 없음 16% 13% 18% 33% 34%
세파로스 스페르민 34% 51% 52% 60% 71%
세파로스 스페르미딘 7% 30% 41% 62% 66%
세파로스 펙틴-스페르민 0% 14% 38% 55% 52%
세파로스 펙틴-스페르미딘 38% 54% 65% 65% 64%
세파로스 펙틴-에틸렌다이아민 23% 14% 19% 35% 42%
없음 N/A 38% 38% 38% 38% 38%
hgDNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL
비드		 0.25 mg/mL
비드		 0.5 mg/mL
비드		 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
세파로스 없음 20% 7% 8% 19% 12%
세파로스 스페르민 47% 84% 91% 97% 93%
세파로스 스페르미딘 52% 40% 36% 38% 47%
세파로스 펙틴-스페르민 검출되지 않음 15% 37% 68% 75%
세파로스 펙틴-스페르미딘 5% 32% 44% 64% 71%
세파로스 펙틴-에틸렌다이아민 18% 15% 26% 13% 31%
없음 N/A 38% 38% 38% 38% 38%
표 3. Whatman GF/F 필터에서 변형된 폴리스티렌 비드에 의한 hgRNA 및 hgDNA 포획.
hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
폴리스티렌 없음 35% 35% 47% 41% 21%
폴리스티렌 스페르민 42% 59% 58% 74% 85%
폴리스티렌 스페르미딘 42% 37% 44% 70% 76%
폴리스티렌 펙틴-스페르민 29% 41% 63% 83% 86%
폴리스티렌 펙틴-스페르미딘 38% 56% 72% 86% 81%
폴리스티렌 펙틴-에틸렌다이아민 8% 12% 28% 39% 46%
없음 N/A 38% 38% 38% 38% 38%
hgDNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
폴리스티렌 없음 21% 24% 32% 36% 17%
폴리스티렌 스페르민 98% 99% 94% 100% 100%
폴리스티렌 스페르미딘 16% 17% 26% 35% 35%
폴리스티렌 펙틴-스페르민 35% 53% 68% 84% 90%
폴리스티렌 펙틴-스페르미딘 47% 74% 82% 94% 89%
폴리스티렌 펙틴-에틸렌다이아민 29% 35% 23% 30% 27%
없음 N/A 38% 38% 38% 38% 38%
표 4. Pall Supor 0.2 마이크론 필터 상에서 변형된 폴리스티렌 비드에 의한 hgRNA 및 hgDNA 포획.
　hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
세파로스 없음 16% 17% 18% 17% 18%
세파로스 스페르민 29% 41% 51% 65% 83%
세파로스 스페르미딘 26% 37% 49% 69% 69%
세파로스 펙틴-스페르민 30% 38% 42% 70% 90%
세파로스 펙틴-스페르미딘 15% 11% 13% 28% 28%
세파로스 펙틴-에틸렌다이아민 19% 23% 25% 35% 50%
없음 N/A 10% 10% 10% 10% 10%
　hgRNA 포획 (100 ng 중 %)　
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
세파로스 없음 15% 18% 17% 16% 16%
세파로스 스페르민 10% 34% 27% 42% 49%
세파로스 스페르미딘 15% 18% 29% 52% 56%
세파로스 펙틴-스페르민 19% 23% 48% 68% 83%
세파로스 펙틴-스페르미딘 17% 21% 37% 35% 51%
세파로스 펙틴-에틸렌다이아민 18% 15% 26% 13% 31%
없음 N/A 26% 26% 26% 26% 26%
표 5. Pall Supor 0.2 마이크론 필터 상에서 변형된 폴리스티렌 비드에 의한 hgRNA 및 hgDNA 포획.
　hgRNA 포획 (100 ng 중 %)
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
폴리스티렌 없음 0% 0% 0% 8% 8%
폴리스티렌 스페르민 33% 61% 88% 104% 105%
폴리스티렌 스페르미딘 15% 21% 19% 24% 17%
폴리스티렌 펙틴-스페르민 35% 40% 67% 87% 93%
폴리스티렌 펙틴-스페르미딘 12% 36% 48% 66% 77%
폴리스티렌 펙틴-에틸렌다이아민 18% 11% 11% 7% 9%
없음 N/A 10% 10% 10% 10% 10%
　hgDNA 포획 (100 ng 중 %)　
비드 유형 개질제 0.1 mg/mL 비드 0.25 mg/mL 비드 0.5 mg/mL 비드 1 mg/mL
비드		 1.5 mg/mL 비드
폴리스티렌 없음 10% 10% 24% 17% 22%
폴리스티렌 스페르민 21% 44% 54% 79% 95%
폴리스티렌 스페르미딘 18% 36% 18% 32% 35%
폴리스티렌 펙틴-스페르민 33% 43% 57% 82% 90%
폴리스티렌 펙틴-스페르미딘 37% 58% 70% 83% 91%
폴리스티렌 펙틴-에틸렌다이아민 27% 27% 17% 20% 30%
없음 N/A 26% 26% 26% 26% 26%
실시예 4. 소변 및 대변으로부터 핵산 추출
상기 실험은 본 명세서에 개시된 고체 지지체가 대변 및 소변 샘플에서 핵산을 추출하는데 사용될 수 있으며, 분리된 DNA가 PCR 증폭에 의해 검출될 수 있음을 입증한다.
소변 또는 대변 샘플의 제조
단편화된 MTB DNA (fMTB DNA 200-400 bp)를 하기 표시된 대로 다양한 부피의 소변 또는 대변 샘플에 스파이킹(spike)하였다. 상기 실험에 대한 대조군은 100% 추출 및 회수 효율을 나타내는 비교를 갖기 위해 동일한 양의 fMTB DNA를 별도의 RT-PCR 반응에 직접 스파이킹하여 제조하였다.
아미드화 펙틴으로 변형된 예시적인 미세구를 사용하여 소변 또는 대변으로부터 단편화된 MTB DNA의 추출.
1-10 mL 소변/대변 샘플을 적절한 크기의 원심 분리 튜브 또는 Eppendorf 튜브에 첨가하였다. 아미드화 펙틴으로 변형된 예시적인 미세 입자를 샘플에 첨가하였다. 추가하는 최적의 양은 각 실험에 대해 선택한 비드 로트, 샘플 유형 및 샘플 볼륨에 따라 다르다. 샘플을 완전히 혼합하고, 선택적으로 최대 60 분 동안 배양하여 핵산 결합을 증가시키고, 그 후 탁상용 원심 분리기에서 2 분 동안 고속으로 회전시켜 미세 입자를 침전시켰다. 미세 입자 펠렛을 방해하지 않도록 상등액을 조심스럽게 상층분리하였다. 1 mL의 물을 사용하여 비드 펠릿을 세척하고, 부드럽게 혼합하여 펠릿을 세척한 다음, 탁상용 원심 분리기에서 2 분 동안 고속으로 회전시켜 미세 입자를 침전시켰다. 미세 입자 펠렛을 방해하지 않도록 상등액을 조심스럽게 상층분리하였다. 0.01 % i-카라기난 (Sigma)과 함께 10mM KOH로 구성된 비드 펠렛에 100 μL의 저염 용리 완충액을 첨가하였다. 펠릿을 부드럽게 혼합하고 선택적으로 최대 60 분까지 배양하여 미세 입자로부터 용리를 증가시켰다. 용리된 핵산을 포함하는 상등액은 비드 펠릿을 방해하지 않도록 조심스럽게 제거하였다. 그런 다음 용리액을 RT-PCR 반응에 직접 사용하였다. Xpert MTB/RIF Ultra Assay에 대해 Chakravorty et al가 설명하는 [mBio, July/August 2017 Volume 8 Issue 4 e00812-17]에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하였다.
결과가 표 6-8에 나타난다.
표 6. 10 mL의 소변 샘플로부터 추출된 DNA의 PCR 분석. 10 mL 소변으로부터 MTB DNA를 추출하는 스페르민으로 아민화된 (EDC 커플링 또는 환원적 아미드) 펙틴으로 변형된 미세 입자의 성능이 나타난다.ΔCt는 대조군의 100% 스파이크로부터 얻은 추출 Ct 차이로서 계산된다.
펙틴 개질제/
절차		 베이스 비드
(2.5　mL의 2.5% 용액)		 EDC/NHS
(mg)		 화합물
(mg)		 시간, 날짜 세척 mL 당 μL 입자
(2.5%)		 100% 대조군으로부터 Δ
스페르민/
EDC 커플링		 카복실화된
산화철 나노 입자		 50/200 10 1 10 mM KOH, 0.01% Tween 10-20 1.5-2.5
스페르민/
EDC 커플링		 Thermo 자기 비드
(1-4　μm)		 31/156 18.75 1 0.1 M HCl, 0.01% Tween 10-15 5.5-5.9
스페르민/
환원적 아미노화		 Spherotech
자기 비드
(5.7　μm)		 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10-20 1.2-2.8
스페르민/
환원적 아미노화		 Spherotech
자기 비드
(5.7　μm)		 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 20-40 2.5-2.8
스페르민/
환원적 아미노화		 Spherotech
자기 비드
(5.7　μm)		 25/50 4 1 10 mM KOH, 0.01% Tween 15-20 2.8-5.3
표 7. 1 mL의 소변 샘플로부터 추출된 DNA의 PCR 분석. 1 mL 소변으로부터 MTB DNA를 추출하는 스페르민으로 아민화된 (EDC 커플링 또는 환원적 아미드) 펙틴으로 변형된 미세 입자의 성능이 나타난다. Δ는 대조군의 100% 스파이크로부터 얻은 추출 Ct 차이로서 계산된다.
펙틴 개질제/
절차		 베이스 비드
(2.5　mL의 2.5% 용액)		 EDC/NHS (mg) 아미드화 펙틴 (mg) 시간, 날짜 세척 mL 당 uL 입자
(2.5%)		 100% 대조군으로부터 Δ
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 20 mM KOH, 0.01% Tween 10-100 1.5-4
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10-100 0.7-4.7
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10-100 1-3.5
스페르민/환원적 아미노화 (STABH) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 20 mM KOH, 0.01% Tween 10-100 No Ct -3
표 8. 1 mL의 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 PCR 분석. 1 mL 대변 샘플로부터 MTB DNA를 추출하는 상이한 미세 입자 변형 배합물 및 이의 성능. 환원제의 존재는 환원적 아미노화 경로를 통한 중합체 변형을 나타낸다. 환원제 없음 (N/A)은 EDC/NHS를 통한 중합체 변형을 나타낸다. Δ는 대조군의 100% 스파이크로부터 얻은 추출 Ct 차이로서 계산된다.
펙틴 개질제/
절차		 베이스 비드
(2.5　mL의 2.5% 용액)		 EDC/NHS
(mg)		 CP
(mg)		 시간; 날짜 세척 mL 당 uL 입자 (2.5%) 100% 대조군으로부터 Δ
스페르민/
EDC 커플링		 Spherotech 자기 비드 (2.8 μm) 50/200 20 1 10 mM KOH, 0.01% Tween 10.00 3.2
스페르민/
EDC 커플링		 카복실화된 산화철 나노 입자 50/200 10 1 10 mM KOH, 0.01% Tween 100-200 2-2.4
스페르민/
EDC 커플링		 Thermo 자기 비드 (1-4 μm) 31/156 6.25 1 0.1 M HCl, 0.01% Tween 10 1.7
스페르민/
EDC 커플링		 Thermo 자기 비드 (1-4 μm) 31/156 12.5 1 0.1 M HCl, 0.01% Tween 10 0.8
스페르민/
EDC 커플링		 Thermo 자기 비드 (1-4 μm) 31/156 18.75 1 0.1 M HCl, 0.01% Tween 10 0.2
스페르민/
EDC 커플링		 Thermo 자기 비드 (1-4 μm) 31/156 25 1 0.1 M HCl, 0.01% Tween 10 3.7
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10-50 1.7-3.5
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.7　μm) 25/100 20 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10 3.8
스페르민/환원적 아미노화 (NaBH4) Spherotech 자기 비드 (5.1　μm) 25/100 5 3 10 mM KOH, 0.01% Tween 10 3.6
예시적인 구체예가 예시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (46)

  1. 고체 지지체에 공유 결합된 복수의 변형된 펙틴 분자를 포함하는 고체 지지체.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 펙틴은 복수의 아미노 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  3. 제1항에 있어서, 변형된 펙틴은 아미드화 펙틴인 것인 고체 지지체.
  4. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 화학식으로 나타낸 단위:
    Figure pct00017
    ,
    이의 이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며,
    화학식 중
    n은 0-3이고;
    R1은 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    X는, 각각의 경우에, 독립적으로 C2-C4 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
    Y는 C2-C3 알킬렌 또는 C4-C6 헤테로알킬렌이고;
    R2 및 R3는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬인 것인 고체 지지체.
  5. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 C4-C20 폴리아민으로 아미드화된 펙틴인 고체 지지체.
  6. 제5항에 있어서, 폴리아민은 에틸렌다이아민, 푸트레신, 카다베린, 스페르민, 또는 스페르미딘인 것인 고체 지지체.
  7. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 구조를 가지는 단위:
    Figure pct00018
    ,
    이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 중
    n은 0, 1, 2, 또는 3이고;
    m은 2, 3, 또는 4이고;
    p는 2, 3, 또는 4이고;
    R1, R2, 및R3는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬인 것인 고체 지지체.
  8. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음의 구조를 가지는 단위:
    Figure pct00019
    ,
    Figure pct00020
    ,
    Figure pct00021
    , 또는
    이의 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체를 포함하는 것인 고체 지지체.
  9. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 아미드 시트러스 펙틴 또는 아미드 사과 펙틴인 것인 고체 지지체.
  10. 제3항에 있어서, 아미드화 펙틴은 분자량이 약 4,000 Da 내지 약 500,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 300,000 Da, 약 100,000 Da 내지 약 300,000 Da, 또는 약 50,000 Da 내지 약 200,000 Da인 것인 고체 지지체.
  11. 제1항에 있어서, 고체 지지체는 폴리스티렌, 유리, 세라믹, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 지르코니아, 티타니아, 알루미나, 폴리카보네이트, 라텍스, PMMA, 제올라이트, 폴리에터설폰, 카복시메틸셀룰로스, 및 셀룰로스로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 고체 지지체.
  12. 제1항에 있어서, 고체 지지체는 자기 비드, 유리 비드, 폴리스티렌 비드, 폴리스티렌 필터, 폴리카보네이트 필터, 폴리에터설폰, 또는 유리 필터인 것인 고체 지지체.
  13. 핵산 함유 샘플로부터 핵산을 단리하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 샘플을 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
    (b) 선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계; 및
    (c) 용리제로 고체 지지체로부터 핵산을 용리하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 용리제는 암모니아 또는 알칼리 금속 수산화물을 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 용리제는 pH가 약 9 이상, 약 10 이상, 또는 약 11 이상인 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 용리제는 pH가 약 9 내지 약 12, 약 9.5 내지 약 12, 약 10 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11인 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 용리제는 다중 음이온(polyanion)을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 다중 음이온은 카라기난(carrageenan)인 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 다중 음이온은 담체 핵산인 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 용리제는 카라기난 및 KOH를 포함하는 것인 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플을 용해 용액과 접촉시킨 후, 샘플을 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 용액으로 방출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 용해 용액은 무질서 유발제(chaotropic agent)를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 무질서 유발제는 구아니디움 싸이오시아네이트, 구아니디움 하이드로클로라이드, 알칼리 퍼클로레이트, 알칼리 아이오다이드, 우레아, 폼아미드, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 무질서 유발제는 구아니디움 싸이오시아네이트 또는 구아니디움 하이드로클로라이드인 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 용해 용액은 염을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 염은 소듐 클로라이드 또는 칼슘 클로라이드인 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 용해 용액은 무질서 유발제를 포함하지 않는 것인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 용해 용액은 완충제를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 완충제는 Tris인 것인 방법.
  30. 제21항에 있어서, 용해 용액은 계면 활성제를 포함하는 것인 방법.
  31. 제21항에 있어서, 용해 용액은 소포제를 포함하는 것인 방법.
  32. 제13항에 있어서, 샘플과 고체 지지체의 접촉 단계는 무질서 유발 시약의 존재 없이 수행되는 것인 방법.
  33. 제13항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 조직 생검, 소변, 대변, 타액, 도말 제제, 박테리아 배양, 세포 배양, 바이러스 배양, PCR 반응 혼합물, 또는 시험관 내 핵산 변형 반응 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 조직 생검은 파라핀 포매 조직인 것인 방법.
  35. 제13항에 있어서, 핵산은 게놈 DNA를 포함하는 것인 방법.
  36. 제13항에 있어서, 핵산은 전체 RNA포함하는 것인 방법.
  37. 제13항에 있어서, 핵산은 미생물 핵산 또는 바이러스 핵산을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 바이러스 핵산은 HBV DNA인 것인 방법.
  39. 제13항에 있어서, 핵산은 순환 핵산인 것인 방법.
  40. 제13항 내지 제39항에 있어서, 상기 방법은 자동화 카트리지에서 수행되는 것인 방법.
  41. 샘플에서 핵산을 검출하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 핵산 함유 샘플을 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 고체 지지체와 접촉시켜, 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
    (b) 선택적으로 고체 지지체에 결합된 핵산을 세척하는 단계;
    (c) 핵산을 용리시키는 단계; 및
    (d) 핵산을 검출하는 단계.
  42. 제41항에 있어서, 핵산 검출 단계는 중합 효소 사슬 반응 (PCR)에 의한 핵산의 증폭을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 중합 효소 사슬 반응은 중첩 PCR, 등온 PCR, 또는 RT-PCR인 것인 방법.
  44. 고체 지지체에 화학적으로 결합된 아미드화 펙틴을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 크로마토그래피를 위한 분리 물질.
  45. 제44항에 있어서, 아미드화 펙틴은 하나 이상의 다음으로 나타낸 화학식의 단위:
    Figure pct00022
    ,
    이의 이성질체, 염, 호변 이성질체, 또는 이의 조합을 가지며,
    화학식 중 R2 및 R3는 H, 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 임의 치환된 C2-C20 헤테로알킬으로부터 독립적으로 선택되는 것인 분리 물질.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 고체 지지체는 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아, 또는 하이브리드 실리카 물질인 것인 분리 물질.
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