CN113015800A - 核酸分离及相关方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使用果胶衍生物改性的固体载体。所述固体载体用于核酸分离、分离和检测方法。

Description

核酸分离及相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月17日提交的美国临时申请第62/765,149号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及包含改性的果胶的固体载体及其使用方法。
背景
与传统的诊断方法相比，借助各种自动化分析技术，例如聚合酶链反应(PCR)，利用核酸扩增和/或检测的分子诊断分析可以在更短的时间内提供快速而准确的结果，并且可以容易地自动化。然而，为了对生物样品进行分子诊断分析，必须从生物材料中分离核酸，以去除可能例如通过抑制聚合酶活性影响分析准确性的组分。即使存在多种用于核酸提取的方法，但是当前可用的方法通常涉及冗长的步骤，并且不易于自动化。因此，在扩增和检测特定靶标之前制备核酸样品是分子诊断学中最具挑战性的步骤。
需要简单且快速的核酸分离方法来制备不含扩增抑制剂的有质量的核酸，所述方法不需要大量样品处理并且可以适应临床实验室自动化。需要能够以与快速、自动化的核酸检测方法兼容的方式促进从包含核酸的生物样品中分离核酸的试剂。本发明满足了该需要，并提供了进一步的相关优点。
概述
一方面，本文提供了固体载体，其包含共价结合到所述固体载体的多个改性的果胶分子。在一些实施方案中，所述改性的果胶包含多个氨基。在一些实施方案中，所述改性的果胶是酰胺化果胶。在一些实施方案中，所述酰胺化果胶包含一个或多个由下式表示的单元，其异构体、盐或互变异构体：
Figure BDA0003005143840000021
其中
n是0、1、2或3；
R1为H或C1-C3烷基；
X在每次出现时独立地为C2-C4亚烷基或C4-C6杂亚烷基；
Y为C2-C3亚烷基或C4-C6杂亚烷基；和
R2和R3独立地为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，所述酰胺化果胶是用C4-C20多胺酰胺化的果胶。在一些实施方案中，所述多胺是乙二胺、腐胺、尸胺、精胺或亚精胺。
在一些实施方案中，所述酰胺化果胶包含一个或多个具有以下结构的单元，其异构体、盐或互变异构体：
Figure BDA0003005143840000022
其中
n是0、1、2或3；
m为2、3或4；
p为2、3或4；和
R1、R2和R3独立地为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，所述酰胺化果胶包含一个或多个具有以下结构的单元，其异构体、盐或互变异构体：
Figure BDA0003005143840000031
在一些实施方案中，所述酰胺化果胶为酰胺化柑橘果胶或酰胺化苹果果胶。在一些实施方案中，所述酰胺化果胶具有约4,000Da至约500,000Da、约5,000Da至约300,000Da、约100,000Da至约300,000Da或约50,000Da至约200,000Da的分子量。
在一些实施方案中，所述固体载体包含选自聚苯乙烯、玻璃、陶瓷、聚丙烯、聚乙烯、二氧化硅、氧化锆、二氧化钛、氧化铝、聚碳酸酯、乳胶、聚醚砜、PMMA、羧甲基纤维素、沸石和纤维素的材料。
在一些实施方案中，所述固体载体是磁珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、聚苯乙烯过滤器、聚碳酸酯过滤器、聚醚砜过滤器或玻璃过滤器。
在另一方面中，本文提供了从包含核酸的样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使所述样品与本文公开的固体载体接触，从而使所述核酸结合至所述固体载体；
(b)任选地洗涤结合到所述固体载体的所述核酸；和
(c)用洗脱剂从所述固体载体上洗脱所述核酸。
在一些实施方案中，所述洗脱剂包含氨或碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，所述洗脱剂具有约9以上、约10以上或约11以上的pH。在一些实施方案中，所述洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含聚阴离子。在一些实施方案中，所述聚阴离子是角叉菜胶或载体核酸。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含聚阴离子和碱，例如碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，所述洗脱剂包含i-角叉菜胶和KOH。
在一些实施方案中，所述方法包括在使所述样品与所述固体载体接触之前使所述样品与裂解溶液接触，从而将核酸释放到溶液中。在一些实施方案中，所述裂解溶液包括离液剂。在一些实施方案中，所述离液剂选自硫氰酸胍、盐酸胍、碱金属高氯酸盐、碱金属碘化物、脲、甲酰胺或其组合。在一些实施方案中，所述离液剂是硫氰酸胍或盐酸胍。在一些实施方案中，所述裂解溶液包含盐。在一些实施方案中，所述盐是氯化钠或氯化钙。在一些实施方案中，所述裂解溶液不包含离液剂。在一些实施方案中，所述裂解溶液包含缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂是Tris。在一些实施方案中，所述裂解溶液包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述裂解溶液包含消泡剂。
在一些实施方案中，将所述样品与固体载体接触在不存在离液剂的情况下进行。
在一些实施方案中，所述样品选自血液、血浆、血清、精液、组织活检、尿液、粪便、唾液、涂布标本、细菌培养物、细胞培养物、病毒培养物、PCR反应混合物或体外核酸修饰反应混合物。在一些实施方案中，所述组织活检是石蜡包埋的组织。在一些实施方案中，所述核酸包含基因组DNA。在一些实施方案中，所述核酸包含总RNA。在一些实施方案中，所述核酸包含微生物核酸或病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸是HBV DNA。在一些实施方案中，所述核酸是循环核酸。
在一些实施方案中，所述方法在自动化的药筒中进行。
在另一方面中，本文提供了用于检测样品中的核酸的方法，包括：
(a)使包含核酸的样品与本文公开的固体载体接触，从而使所述核酸结合至所述固体载体；
(b)任选地洗涤结合到所述固体载体的所述核酸；
(c)洗脱所述核酸；和
(d)检测所述核酸。
在一些实施方案中，检测所述核酸包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述核酸。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是巢式PCR、等温PCR或RT-PCR。
在另一方面中，本文提供了用于色谱法的分离材料，其包含固体载体，所述固体载体包含共价键合到其上的酰胺化果胶。
在一些实施方案中，酰胺化果胶具有一个或多个由下式表示的单元，其异构体、盐或互变异构体：
Figure BDA0003005143840000041
R2和R3独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C6环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基。
在一些实施方案中，所述固体载体是二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆或混合二氧化硅材料。
发明详述
一方面，本文提供了用于从包含核酸的样品中纯化核酸的固体载体，其包含一个或多个共价结合到表面的改性的果胶分子。在一些实施方案中，改性的果胶包含多个氨基。在一些实施方案中，改性的果胶是酰胺化果胶。如本文所使用，术语“固体载体”是指包含顺磁性颗粒、凝胶、可控孔度玻璃、磁珠、微球、纳米球、毛细管、滤膜、柱、布、揩巾、纸、平面载体、多孔板、多孔膜、多孔整料、晶片、梳齿过滤器(comb)或其任意组合的任意基质。固体载体可以包含任何合适的材料，包括但不限于玻璃、二氧化硅、氧化钛、氧化铁、烯键主链聚合物、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、陶瓷、纤维素、硝化纤维素和二乙烯基苯。优选地，固体载体包括选自聚苯乙烯、玻璃、陶瓷、聚丙烯、聚乙烯、二氧化硅、聚碳酸酯、乳胶、PMMA、沸石、聚醚砜、羧甲基纤维素、纤维素及其组合的材料。在一些实施方案中，固体载体不是果胶，例如未改性的果胶或改性的果胶。
在一些实施方案中，固体载体是磁珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、聚苯乙烯过滤器、聚碳酸酯过滤器、聚醚砜过滤器或玻璃过滤器。优选地，适用于制备本文公开的固体载体的材料例如在没有本文所述的果胶改性的情况下具有低的非特异性结合，这些材料不结合需要核酸分离的样品中的核酸、蛋白质或其他组分。
改性的果胶
在一些实施方案中，改性的果胶是酰胺化果胶。果胶是通常在植物细胞壁中发现的天然存在的复合多糖。果胶通常包含由鼠李糖残基插入并经中性糖侧链和非糖组分例如乙酰基、甲基和阿魏酸基团改性的α1-4连接的聚半乳糖醛酸主链。果胶中的半乳糖醛酸残基被部分酯化并作为甲酯存在。酯化度定义为被酯化的羧基的百分比。具有例如高于50％的酯化度的果胶被分类为高甲酯果胶(“HM”)或高酯果胶，酯化度低于50％的果胶被称为低甲酯(“LM”)果胶或低酯果胶。在水果和蔬菜中发现的大多数果胶是HM果胶。
如本文所使用，“酰胺化果胶”是指已经例如通过化学、物理或生物(包括酶促)手段或通过其某种组合在结构上改性的任何天然存在的果胶，其中一些酯或酸基团已转化为酰胺基团。可以通过使未改性的果胶与合适的胺溶液接触，从而将未改性的果胶的酯基转化为酰胺来制备酰胺化果胶。
Figure BDA0003005143840000061
供选择地，可以在合适的偶联剂的存在下，将未改性的果胶或水解的果胶(包括部分水解的果胶)与胺反应以形成酰胺化果胶。合适的偶联剂的非限制性实例包括碳二亚胺偶联剂，例如DCC和EDCI，以及鏻和亚铵类试剂，例如BOP、PyBOP、PyBrOP、TBTU、HBTU、HATU、COMU和TFFH。
Figure BDA0003005143840000062
在一些实施方案中，改性的果胶是通过高碘酸盐氧化的果胶的还原胺化而获得的改性的果胶。碳水化合物例如果胶的还原胺化方法是本领域已知的。
可以通过本文所述的任何方法由未改性的果胶获得改性的果胶。用于改性的果胶合成的特别有用的起始原料是苹果和柑橘果胶。在一些实施方案中，起始果胶的分子量为约4,000Da至约500,000Da、约5,000Da至约300,000Da、约10,000Da至约150,000Da或约10,000Da至约100,000Da。
在一些实施方案中，酰胺化果胶包含多个糖醛酸单元和一个或多个另外的单体单元。糖醛酸包括包含羰基(例如，醛或酮基)和羧酸(-COOH)官能团二者的糖酸。通常，糖醛酸衍生自末端羟基已被氧化成羧酸的糖，并且通常根据其母体糖来命名，例如，葡萄糖醛酸是衍生自葡萄糖的糖醛酸。衍生自己糖的糖醛酸称为己糖醛酸，并且衍生自戊糖的糖醛酸称为戊糖醛酸。
在一些实施方案中，除了一个或多个糖醛酸单元之外，酰胺化果胶还包含一个或多个选自以下的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure BDA0003005143840000071
其中R1选自任选取代的C1-C8烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的C3-C8杂环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基；和
R2和R3独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C6环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基。
在一些实施方案中，R3为任选取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R3为任选取代的C4-C20杂烷基，例如任选被一个或多个氨基取代的短PEG链。在一些实施方案中，
在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个包含不多于一个氨基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个不包含氨基。在一些实施方案中，R2和R3中的每一个包含一个或多个氨基。在一些实施方案中，R2为H，并且R3为任选取代的C4-C20杂烷基，例如多胺或包含2-6个乙二醇单元的低聚乙二醇，任选被一个或多个氨基取代。
在一些实施方案中，R1为甲基、乙基或丙基。在一些实施方案中，R2和R3均为H。在一些实施方案中，R2为H，并且R3为任选取代的C1-C8烷基。在一些实施方案中，R2为H，并且R3为H、CH3、CH2CH2NH2、CH2CH2N(CH3)2、CH2CH2OH或CH2CH2NHCH2CH2NH2。在一些实施方案中，R2和R3均为CH3。
在一些实施方案中，酰胺化果胶还包含一个或多个式(III)的单元，或其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure BDA0003005143840000072
其中：
R3为H、CH3、CH2CH2NH2、CH2CH2N(CH3)2、CH2CH2OH、(CH2)2O(CH2)2NH2或CH2CH2NHCH2CH2NH2。
应当理解，如果多糖包含两个或更多个式(II)或(III)的单元，则其R3在多糖内可以相同或不同。
在一些实施方案中，本文公开的酰胺化果胶包含一个或多个具有至少一个氨基的单体单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个具有VI的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure BDA0003005143840000081
其中：
n为0、1、2或3；
R4为H或C1-C3烷基；
X在每次出现时独立地为C2-C4亚烷基或C4-C6杂亚烷基；
Y为C2-C3亚烷基或C4-C6杂亚烷基；和
R5和R6独立地为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，本文公开的酰胺化果胶包含一个或多个具有式V的结构的单体单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure BDA0003005143840000082
其中：
n为0、1、2或3；
m在每次出现时独立地为2、3或4；
p为2、3或4；
R4为H或C1-C3烷基；和
R5和R6独立地为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个包含伯氨基的单体单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个包含季铵基的单体单元。在一些实施方案中，酰胺化果胶用多胺酰胺化。如本文所使用，多胺是包含两个或多个氨基的化合物。可以用于本文公开的固体载体的果胶的改性的多胺包括合成多胺和天然存在的多胺(例如亚精胺、精胺、腐胺)二者。在一些实施方案中，多胺选自精胺、亚精胺、尸胺、乙二胺和腐胺。在一些实施方案中，多胺是精胺或亚精胺。
在一些实施方案中，酰胺化果胶包含一个或多个具有式VI、式VII或式VIII的单元，包括其异构体、盐和互变异构体：
Figure BDA0003005143840000091
在一些实施方案中，酰胺化果胶包含多个由式I-VIII的结构表示的另外的单体单元。如本文所使用，术语“多个”是指多于一个。例如，多个单体单元是指至少两个单体单元、至少三个单体单元或至少单体单元等。如果本发明的实施方案包括多于一个单体单元，它们也可以被称为第一单体单元、第二单体单元、第三单体单元等。
如本文所使用，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状单价烃基及其组合，当它们未被取代时仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。有时在本文中描述每个这样的基团中的碳原子总数，例如，当该基团可以最多包含十个碳原子时，可以表示为1-10C、C1-C10、C1-C10、C1-10或C1-10。本文所使用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指其中一个或多个链碳原子已被杂原子替代的相应的烃。示例性的杂原子包括N、O、S和P。当允许杂原子替代碳原子时，例如在杂烷基中，描述该基团的数字尽管仍然书写为例如C3-C10，表示所述环或链中碳原子的数目加上作为所描述的环或链中碳原子的替代而被包括的这样的杂原子的数目之和。
单个基团可以包含多于一种类型的多重键，或多于一种的多重键；当这些基团包含至少一个碳-碳双键时，它们被包括在术语“烯基”的定义内，并且当这些基团包含至少一个碳-碳三键时，它们被包括在术语“炔基”内。
烷基、烯基和炔基可以任选地被取代至这样的取代在化学上有意义的程度。典型的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝NCN、＝NOR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，并且每个R任选地被卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝NCN、＝NOR'、＝NR'、OR'、NR'2、SR'、SO2R'、SO2NR'2、NR'SO2R'、NR'CONR'2、NR'C(O)OR'、NR'C(O)R'、CN、C(O)OR'、C(O)NR'2、OC(O)R'、C(O)R'和NO2取代，其中每个R'独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基也可以被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其各自可以被适合于特定基团的取代基取代。
虽然本文所使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基，但是术语“环烷基”在本文中用于描述经由环碳原子连接的碳环非芳族基团，而“环烷基烷基”用于描述通过烷基接头与分子连接的碳环非芳族基团。类似地，“杂环基”用于表示包含至少一个杂原子作为环成员并且通过环原子(可以是C或N)与分子连接的非芳族环状基团；“杂环基烷基”可以用于描述通过亚烷基接头与另一个分子连接的基团。如本文所使用，这些术语还包括含有一个或两个双键的环，只要该环不是芳族的即可。
“芳族”或“芳基”取代基或部分是指具有众所周知的芳香性特征的单环或稠合双环部分；芳基的实例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”是指这样的单环或稠合双环体系，其含有一个或多个杂原子作为环成员。合适的杂原子包括N、O和S，包含其允许在5元环以及6元环中具有芳香性。典型的杂芳族体系包括单环C5-C6芳族基团，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯基环或与任何杂芳族单环基团稠合以形成C8-C10双环基团而形成的稠合双环部分，所述C8-C10双环基团例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在整个环系统中，就电子分布而言，具有芳香性特征的任何单环或稠环双环系统都包括在该定义中。它还包括双环基团，其中至少直接与分子其余部分连接的环具有芳香性特征。通常，环系统包含5-14个环成员原子。通常，单环杂芳基包含5-6个环成员，而双环杂芳基包含8-10个环成员。
芳基和杂芳基部分可以被多种取代基取代，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基以及它们的杂化形式(heteroform)，其各自可以本身进一步被取代；芳基和杂芳基部分的其他取代基包括卤素(F、Cl、Br、I)、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，并且每个R如上文针对烷基所述的那样任选地被取代。芳基或杂芳基上的取代基还可以被本文所述的基团取代，所述基团适用于每种类型的这样的取代基或取代基的每种组分。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基部分上被本文描述的用于芳基的典型取代基取代，并且其可以在烷基部分上被本文描述的用于烷基的典型的或适合的取代基进一步取代。
如本文所使用的“任选取代的”表示所描述的特定基团可以具有一个或多个被非氢取代基替代的氢取代基。在一些任选取代的基团或部分中，所有氢取代基均被非氢取代基替代(例如，多氟烷基，如三氟甲基)。如果没有另外说明，则可以存在的这样的取代基的总数等于在所述基团的未取代形式上存在的H原子的数目。在任选的取代基通过双键，例如羰基氧或氧代(＝O)连接的情况下，该基团占据两个可用化合价，因此，根据可用化合价的数目，可以包括的取代基总数减少。
如本文所使用，除非另有说明，术语“氨基”包含伯、仲和叔氨基。
酰胺化果胶与固体载体的共价连接可以任何合适的方式实现，例如通过使多胺酰胺化的果胶与包含胺反应性基团的固体载体反应，所述胺反应性基团例如为环氧化物、醛、酮或活化的酯。包含伯氨基或仲氨基的酰胺化果胶还可以通过交联而连接到固体载体，例如氨基改性的固体表面。如本文所使用，交联是指通过共价键化学连接两个或更多个分子的过程。在一些情况下，可以使用交联剂将酰胺化果胶连接到固体载体上，从而形成果胶改性的固体载体。如本文所使用，交联试剂(或交联剂)是包含两个或更多个反应性末端的分子，所述反应性末端能够化学连接到分子和/或固体载体上的特定官能团(例如伯胺、羧基、巯基等)。将含有氨基的分子共价连接到官能化表面和固体载体的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，本发明的酰胺化果胶通过酰胺键(例如，在固体载体的羧基和酰胺化果胶的氨基之间形成的酰胺键)共价连接到固体载体。酰胺键的形成可以通过任何合适的方法进行。例如，可以在合适的偶联剂存在下，使包含一个或多个伯氨基的酰胺化果胶与包含一个或多个羧酸基的基质反应。合适的偶联剂的非限制性实例包括碳二亚胺偶联剂，例如DCC和EDCI，以及鏻和亚铵类试剂，例如BOP、PyBOP、PyBrOP、TBTU、HBTU、HATU、COMU和TFFH。在一些优选的实施方案中，可以将固体基质的羧酸基团转化为活化的酯，然后与酰胺化果胶的氨基反应。
在一些实施方案中，固体载体包含具有一个或多个由式(II)-(VIII)中任一个表示的单元的酰胺化果胶，其中该酰胺化果胶共价连接到该固体载体。
在另一方面中，本文提供了用于从包含核酸的样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使样品与本文公开的固体载体接触，从而使核酸结合到固体载体；
(b)任选地洗涤结合到固体载体的核酸；和
(c)通过使结合到固体载体的核酸与洗脱剂接触，从固体载体上洗脱核酸。
裂解溶液
在一些实施方案中，在与固体载体接触之前，使包含核酸的样品与裂解溶液接触，从而裂解样品中包含的细胞并将核酸释放到溶液中。样品裂解后，核酸可以结合到固体基质上，例如用本文所述的酰胺化果胶共价改性的二氧化硅或玻璃基质。在一些实施方案中，将固体载体掺入自动化药筒，例如
Figure BDA0003005143840000121
药筒中。结合后，然后除去上清液，并用洗脱缓冲液例如上所述的碱性溶液从基质上洗脱核酸。然后可以在药筒中处理洗脱液以检测目标靶基因。在一些实施方案中，洗脱液用于重构至少一些以冻干颗粒的形式存在于药筒中的PCR试剂。在一些实施方案中，PCR使用具有热启动功能的Taq聚合酶，例如AptaTaq(Roche，瑞士)。
在一些实施方案中，裂解溶液包含离液剂，例如硫氰酸胍、盐酸胍、碱金属高氯酸盐、碱金属碘化物、尿素、甲酰胺及其组合。在一些实施方案中，裂解溶液包含盐。优选地，盐是氯化钠或氯化钙。
在一些实施方案中，本文公开的方法不需要使用离液剂或高浓度盐来使核酸结合到本发明的固体载体。
在一些实施方案中，在添加多糖试剂溶液并随后沉淀核酸之前，通过使样品与裂解缓冲液接触来裂解样品。在一些实施方案中，裂解试剂添加到沉淀核酸的多糖试剂的溶液中。在一些实施方案中，本文所述的多糖试剂溶于裂解溶液。在一些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种蛋白酶。合适的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶，金属蛋白酶及其组合。说明性的合适蛋白酶包括但不限于蛋白酶k(广谱丝氨酸蛋白酶)、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。使用本文提供的教导和实例，本领域技术人员将可获得其他蛋白酶。
在一些实施方案中，本文描述的方法用于根据本文描述的任何方法从固定的石蜡包埋的生物组织样品中分离核酸(例如，DNA、RNA)；使用一对能够扩增靶核酸区域的寡核苷酸引物使沉淀的核酸扩增，以获得扩增样品；和确定靶核酸的存在和/或量。在一些实施方案中，靶核酸是DNA(例如基因)。在一些实施方案中，靶核酸是RNA(例如，mRNA、非编码RNA等)。在一些实施方案中，使用本文描述的方法分离的核酸非常适合用于诊断方法、预后方法、监测治疗(例如癌症治疗)的方法等。因此，在一些说明性的非限制性实施方案中，从固定的石蜡包埋的样品(例如，从FFPET样品)提取的核酸可以用于确定基因的存在和/或表达水平，和/或基因的突变状态。这样的方法特别适合于确定一种或多种癌症标志物的存在和/或表达水平和/或突变状态。因此，在一些实施方案中，使用本文描述的方法分离的核酸用于检测一种或多种癌症标志物的存在和/或拷贝数和/或表达水平和/或突变状态。
洗涤和洗脱
本文公开的检测和分离方法可以任选地包括洗涤步骤，即，可以任选地在固体载体上洗涤沉淀的核酸，例如以去除裂解缓冲液的组分。通常，在检测之前溶解浓缩的，例如沉淀的核酸。在一些实施方案中，将浓缩的核酸溶解在与PCR反应相容的缓冲液中。
在一些实施方案中，例如，当使用多胺改性的多糖沉淀核酸时，可以通过与合适的洗脱剂接触而从多胺洗脱沉淀的核酸。在一些实施方案中，洗脱剂包括氨或碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，洗脱剂具有碱性pH。在一些实施方案中，洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。优选地，洗脱剂的pH在10以上。优选地，洗脱剂包含其浓度足以破坏核酸与多糖试剂的结合的氢氧化铵、NaOH或KOH。示例性洗脱剂包含1％氨、15mM KOH或15mM NaOH。
在一些实施方案中，洗脱剂包含聚阴离子。在一些实施方案中，聚阴离子是包含多个阴离子基团的聚合物。在一些实施方案中，阴离子基团是磷酸根、膦酸根、硫酸根或磺酸根基团或其组合。在一些实施方案中，聚阴离子是在约7以上的pH下带负电荷的聚合物。合成的聚阴离子和天然存在的聚阴离子二者都可以用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，聚阴离子是角叉菜胶。在其他实施方案中，聚阴离子是载体核酸。如本文所使用的载体核酸是不干扰随后例如通过PCR检测浓缩核酸的核酸。示例性的载体核酸包括聚rA、聚dA、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA和其他本领域技术人员所熟知的。在一些实施方案中，洗脱剂包含角叉菜胶和碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH。
核酸
在一些实施方案中，本文描述的方法用于从包含核酸的溶液中分离核酸。包含核酸的溶液可以通过裂解包含核酸的材料获得。包含核酸的材料通常选自血液，组织活检例如石蜡包埋的组织，涂布标本，细菌培养物，病毒培养物，尿液，精液，细胞悬液和贴壁细胞，PCR反应混合物和体外核酸修饰反应混合物。包含核酸的材料可以包括人、细菌、真菌、动物或植物材料。在其他实施方案中，可以从核酸修饰反应或核酸合成反应获得包含核酸的溶液。在其他实施方案中，可以从核酸修饰反应或核酸合成反应获得包含核酸的溶液。
如本文所使用，术语“核酸”是指任何合成的或天然存在的核酸，例如DNA或RNA，其具有任何可能的构型，即，双链核酸的形式、单链核酸的形式、适配体的形式或其任何组合。核酸可以是DNA，例如基因组DNA。核酸也可以是RNA，例如总RNA。核酸可以是单链或双链核酸，例如短双链DNA片段。核酸可以是合成核酸。在一些实施方案中，核酸是循环核酸。
使用本文所述的方法和固体载体分离的核酸具有合适的质量，可以被扩增以检测和/或定量样品中的一种或多种靶核酸序列。本文描述的核酸分离方法和固体载体也可适用于旨在发现与疾病的诊断和预后有关的基因表达谱的基础研究。该方法还适用于疾病的诊断和/或预后、特定治疗方案的确定和/或治疗效果的监测。
在一些实施方案中，本文描述的方法用于从包含核酸的样品中沉淀核酸。包含核酸的材料可以选自血液，血清，组织活检例如石蜡包埋的组织，口腔液，涂布标本，细菌培养物，病毒培养物，尿液，精液，细胞悬液和贴壁细胞，PCR反应混合物和体外核酸修饰反应混合物。包含核酸的材料可以包括人、动物或植物材料。在一些实施方案中，核酸在溶液中。包含核酸的溶液包括细胞外核酸的溶液和通过裂解包含核酸的细胞而获得的溶液。在其他实施方案中，可以从核酸修饰反应或核酸合成反应获得包含核酸的溶液。
扩增方法
本文所述的方法简化了从生物样品中分离核酸，并有效地制备了非常适合用于RT-PCR系统的分离的核酸。在一些实施方案中，可以通过任何合适的已知核酸检测方法来检测使用本文所述的方法从包含核酸的样品中分离的核酸。尽管在一些实施方案中，提取的核酸用于扩增反应，但是也考虑其他用途。因此，例如，分离的核酸(或其(多种)扩增产物)可以用于各种测序或杂交方案中，包括但不限于基于核酸的微阵列和下一代测序。
一方面，本文提供了一种用于检测的核酸的方法，包括：
(a)使包含核酸的样品与本文公开的固体载体接触，从而使核酸结合到固体载体；
(b)任选地洗涤结合到固体载体的核酸；
(c)通过使结合到固体载体的核酸与洗脱试剂接触，从固体载体洗脱核酸；和
(d)检测核酸。
在一些实施方案中，检测方法包括核酸扩增。合适的非限制性示例性扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。
在一些实施方案中，扩增方法包括在约90℃至约100℃下初始变性约1至约10分钟，接着是包括以下的循环：在约90℃至约100℃下变性约1至约30秒，在约55℃至约75℃下退火约1至约30秒，并在约55℃至约75℃下延伸约5至约60秒。在一些实施方案中，对于初始变性之后的第一循环，省略了循环变性步骤。具体时间和温度将取决于被扩增的具体核酸序列，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。
在一些实施方案中，核酸的分离和检测在自动化样品处理和/或分析平台中进行。在一些实施方案中，利用可商购的自动化分析平台。例如，在一些实施方案中，利用GeneXpert系统(Cepheid，Sunnyvale，Calif.)。然而，本发明不限于特定的检测方法或分析平台。本领域技术人员认识到可以使用任何数量的平台和方法。
GeneXpert系统使用独立的一次性药筒。样品提取、扩增和核酸的检测都可以在这个独立的“药筒式实验室”中进行。参见例如第6,374,684号美国专利，其通过引用整体并入本文。药筒的组件包括但不限于包含试剂的处理室，过滤器，和用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术。阀使流体能够从一个腔室转移到另一个腔室，并包含核酸裂解和过滤组件。光学窗口可以实现实时光学检测。反应管可以实现非常快速的热循环。在一些实施方案中，GenXpert系统包括用于扩展的多个模块。每个模块都包括多个药筒，以及样品处理和分析组件。
用于色谱的固相
在一些实施方案中，本文公开了用于色谱的分离材料，其包括具有结合到其上的多糖的固体载体。在一些实施方案中，多糖是聚糖醛酸或酰胺化果胶。在一些实施方案中，多糖是吸附在固体载体表面上的酰胺化果胶。在其他实施方案中，将酰胺化果胶共价地、非共价地或通过共价键和非共价相互作用的组合固定在固体载体的表面上。
在一些实施方案中，分离材料包含结合到固体载体上的多糖，其中该多糖包含一个或多个由式II表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure BDA0003005143840000161
其中
R2和R3独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C6环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基。
在一些实施方案中，酰胺化果胶是包含一个或多个具有式II-VIII的结构的单元的果胶。
适用于制备分离材料的固体载体包括硅胶和其他无机材料，例如Al2O3(氧化铝)、TiO2(二氧化钛)或ZrO2(氧化锆)。有机聚合树脂也可用于制备本文公开的分离材料。某些使用杂化颗粒技术(HPT)的材料适用于制备本文公开的分离材料，例如杂化有机/无机材料，例如Waters BEH技术TM材料。HPT材料保留了二氧化硅的关键优势，例如纯度、机械强度、高度球形、可调整粒度、孔径、表面积和表面化学性质。同时，这样的杂化材料在碱性pH下是稳定的，例如pH在8以上时是稳定的。
优选地，用于制备分离材料的固体载体是多孔的。在一些实施方案中，分离材料是具有通过共价键或非共价相互作用结合到其上的酰胺化果胶的多孔颗粒。在其他实施方案中，分离材料是具有通过共价键或非共价相互作用结合到其上的酰胺化果胶的多孔整体载体。
在一些实施方案中，用于制备本文公开的分离材料的固体载体是硅胶或二氧化硅。二氧化硅的特征在于孔径、粒度和/或比表面积。基于硅胶的分离材料优选具有约30至约1000埃的孔径，约2至约300微米的粒度和约35m2/g至约1000m2/g的比表面积。在一些实施方案中，硅胶具有约40埃至约500埃、约60埃至约500埃、约100埃至约300埃和约150埃至约500埃的孔径。在一些实施方案中，硅胶具有约2至约25微米、约5至约25微米、约15微米、约63至约200微米、约75至约200微米的粒度；和约100m2/g至约350m2/g、约100m2/g至约500m2/g、约65m2/g至约550m2/g、约100m2/g至约675m2/g、约35至约750m2/g的比表面积。
在一些实施方案中，根据本发明的色谱材料包含磁性二氧化硅颗粒。磁性二氧化硅颗粒包括涂覆有含水氧化硅吸附表面(即具有硅烷醇或Si-OH基团的表面)的超顺磁性核。合适的市售磁性二氧化硅颗粒包括可从Promega Corporation(Madison,Wis.)获得的MagneSilTM颗粒。
在一些实施方案中，固体载体是氧化铝。示例性的氧化铝固体载体包括但不限于约150目和58埃的布罗克曼(Brockmann)氧化铝。
在一些实施方案中，酰胺化果胶经由接头化学键合到固体载体。固体载体和酰胺化果胶之间的接头可以包含亚烷基或杂亚烷基链。优选地，该接头包含2-20个碳原子，并且除了碳原子之外，还可以包含氮和氧原子。在一些实施方案中，接头是低聚乙烯接头，例如PEG低聚物。
分离材料的制备可以任何合适的方式实现。例如，固体载体可以与表面改性剂反应。如本文所使用，表面改性剂是赋予基础固体载体某些色谱功能的部分。表面改性剂，例如本文公开的酰胺化果胶，可以通过衍生化反应、非共价涂覆或其组合连接到基础固体载体上。在一些实施方案中，基础固体载体的有机基团与表面改性剂例如包含反应性基团的酰胺化果胶形成共价键。酰胺化果胶的这种共价连接可以通过本领域熟知的多种机理来实现，例如环加成以及亲核和亲电取代。
在一些实施方案中，基础固体载体是包含硅烷醇基团的硅胶。可以使这种硅胶固体载体与包含硅烷化基团的改性剂反应以获得本文公开的分离材料。例如，硅烷醇基团用具有式XaRbSi-L-Z的硅烷化试剂进行表面改性，其中X为Cl、Br、I、C1-C5烷氧基、二烷基氨基或三氟甲磺酸酯；a和b各自为0至3的整数，其中a和b之和等于3；R是C1-C6的直链、支链或环状烷基；L为任选的C1-C20亚烷基或杂亚烷基连接基团，其可以被任选地取代；Z是官能团。
在一些实施方案中，Z包含酰胺化果胶。在其他实施方案中，Z包含可以被酰胺化果胶进一步官能化的官能团，例如氨基、羰基或羧基。硅烷化剂的实例包括氨基硅烷化剂，例如3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、氨基烷基杂氮硅三环(aminoalkylsilatrane)、3-(2-氨基乙基)氨基丙基三乙氧基硅烷和3-(2-氨基乙基)氨基丙基三乙氧基硅烷。硅胶与氨基硅烷化剂的反应提供了包含表面氨基的硅胶，该表面氨基可以进一步被包含一个或多个反应性基团的酰胺化果胶改性和/或与包含一个或多个反应性基团的酰胺化果胶反应。在其他实施方案中，使硅胶与包含二氧化硅反应性基团的酰胺化果胶衍生物反应，例如杂氮硅三环或三烷氧基硅烷衍生物。
在一些实施方案中，本文公开了作为包含固体载体作为吸附剂或载体的柱、毛细管或药筒，所述固体载体包含表面和结合到该表面的一个或多个酰胺化果胶分子。
在一些实施方案中，本文公开的分离材料和色谱柱可用于例如从生物样品或化学反应混合物中分离、分开和纯化核酸。在一些实施方案中，通过高效液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法或电泳来实现分离。
在一些实施方案中，本文公开的分离材料适用于核酸的分离，包括但不限于dsDNA、ssDNA、RNA及其杂交体。可以通过增加洗脱液流动相的离子强度或通过逐步或以梯度方式增加洗脱剂的浓度来实现从分离材料上洗脱核酸及其分离。流动相可以任选地包含适用于HPLC分离的有机溶剂，例如乙腈或甲醇。离子强度的增加可以通过增加合适的盐例如氯化钠或胍盐的浓度来实现。
尽管本发明的每个要素在本文中被描述为包含多个实施方案，但是应该理解的是，除非另外指出，否则本发明给定要素的每个实施方案都能够与本发明的其他要素的每个实施方案一起使用，并且每种这样的使用均旨在形成本发明的不同实施方案。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅用于进一步说明而不应理解为限制性的。
实施例
实施例1：酰胺化果胶改性的固体载体的制备(EDC途径)
A.酰胺化果胶改性的珠的制备
除非另有说明，否则所有试剂均来自商业来源。
根据下述步骤制备用精胺酰胺化的果胶。以类似方式制备其他酰胺化果胶。
(A)在磁力搅拌下，将苹果果胶(2.5g)分批添加到250mL去离子水中，直至全部溶解。向该溶液中加入2.5mL 5M NaOH，搅拌20分钟，然后加入1M HCl，直到pH稳定在～4.5(然后加入～12mL 1M HCl)。然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl，2.5g)和0.75g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，并搅拌1小时以活化。然后立即加入精胺(Sigma，18.63g，7当量)。溶液变成凝胶状，并摇动直至所有物质溶解，并在室温下进一步孵育20小时。
(B)在搅拌下，将来自(A)的反应混合物倒入500mL MeOH中，形成凝胶状沉淀。然后将混合物搅拌30分钟，并通过500mL一次性塑料过滤器使用聚乙烯熔块(Opti-Chem，OP-6602-18)过滤。然后将收集的凝胶状滤饼用甲醇(100mL)冲洗，并使其进一步过滤过夜，从而形成干燥的棕色凝胶块。然后将该材料用另外的150mL MeOH洗涤，并在50℃下在真空烘箱中干燥18小时。在研钵中用研杵将形成的硬粒粉碎为粉末。
(C)洗涤
材料：
A.酸性洗液。在1000mL瓶中制备以下混合物：IPA(550mL，量筒)、去离子水(345mL)和浓盐酸(105mL)
B.中性洗液。在1000mL烧瓶中制备以下混合物：590mL IPA和410mL去离子水。
将来自步骤(B)的产物装入125mL烧瓶中，并将110mL洗涤溶液添加到粉状材料中。将悬浮液在室温下搅拌30分钟，在玻璃漏斗上过滤，并使用5×15-20mL的酸性洗液洗涤，随后用5×15-20mL的中性洗液洗涤，随后用2×35mL的MeOH洗涤。将该材料进一步风干60分钟，然后在0.15毫巴下风干17小时。
B.酰胺化果胶改性的珠的制备
根据以下步骤，使用酰胺化果胶改性以下固体载体(珠)材料：
二氧化硅微球，羧基，1.0μm(Polysciences，Warrington，PA，24754-1)
羧基-聚苯乙烯颗粒，5.11μm(Spherotec，德国，CP-50-10)
NHS活化的琼脂糖凝胶4Fast Flow(琼脂糖凝胶珠，GE healthcare，Chicago，IL，17-0906-01)；和
羧基改性的磁珠，5.7μm(Spherotec，德国)。
对于琼脂糖凝胶珠，使用NHS活化的珠形式，因此省略了EDC/NHS活化步骤。水解的NHS-琼脂糖凝胶珠用于非改性的珠测量。
在该实施例中，提供了用包含氨基的酰胺化果胶，例如来自实施例1的产物，将羧基改性的珠官能化的程序。
将用羧基(Spherotec，CP-50-10)改性的聚苯乙烯珠(约5微米，2mL5wt％的悬浮液)用去离子(DI)水(4mL)稀释并超声处理15分钟。向珠悬浮液中加入40mg EDC.HCl和40mgNHS。将悬浮液搅拌24小时以活化，以4000rpm短暂离心5分钟，并倾析上清液。将珠重悬于5ml去离子水中，并向其中加入1％的酰胺化果胶溶液(5mL)。通过在去离子水中搅拌酰胺化果胶18小时，然后以9000rpm离心30分钟以除去任何未溶解的物质，来制备酰胺化果胶溶液。将得到的悬浮液搅拌18小时，然后以9000rpm离心30分钟，用45mL水稀释并以相同方式冲洗。用0.1M NaOH(1x)、0.1M HCl(1x)和去离子水(2x)重复该过程。将珠重悬于5ml DIH2O中，超声处理30分钟，并通过在Speedvac中在真空下称量150μL等分试样干燥后留下的珠的量来测量浓度。
实施例2：酰胺化果胶改性的固体载体的制备(还原胺化途径)
在该实施例中，提供了通过氧化然后还原胺化用各种多胺改性多糖例如果胶的通用程序。
(A)氧化。在磁力搅拌下，将苹果果胶(2.5g)分批添加到250mL去离子水中，直至全部溶解。在搅拌下向其中分批加入高碘酸钾(2.43g)，并搅拌18小时。然后在三天内将反应混合物通过8kDa MWCO透析管用水进行透析。随后将所得的脱盐聚合物冻干，得到氧化果胶，为灰白色固体。可以通过羟胺滴定容易地测量醛的浓度(如Zhao,H.；Heindel,N.D.J.Pharm.Res.8(3),400-402.所述)。醛含量测定为4.9mmol/g(每个聚合物单元约1当量醛)。
(B)还原胺化。将来自步骤A的氧化果胶(1.0g)悬浮在100mL去离子水中，添加精胺(1.32g，1.25当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。向反应物中加入硼氢化钠颗粒(1.0g)，并将反应混合物搅拌18小时。然后在三天内将反应混合物通过8kDa MWCO透析管用水进行透析，随后冻干，得到200mg酰胺化果胶，为灰白色蓬松固体。
将以上反应的产物如以上实施例1中所述用于固体载体的改性。
实施例3：在过滤器上的改性的珠的核酸捕获的评估
该实验表明，如实施例1所述制备的示例性固体载体，例如酰胺化果胶改性的珠可以在过滤器上捕获DNA或RNA。
材料
实施例中使用了以下材料：基因组DNA(Promega Cat#G3041～202ng/μL)；RNA对照(Life Tech Cat#4307281,50ng/μL)；定量荧光Picogreen DNA染料(Thermo)；定量荧光Ribogreen RNA染料(Thermo)；适用于核酸荧光定量的Biotek荧光计和黑色分析板；校准过的移液器和移液器吸头；1x TE缓冲液(按照制造商的说明使用Thermo：
Figure BDA0003005143840000211
逆转录酶分析试剂盒，P/N E22064)或20mMTris，pH约为8.5；Whatman GF/F过滤器和Pall Supor0.2微米过滤器；过滤器架。
方法
以期望的最终浓度(例如100ng/mL)制备DNA或RNA在1x TE缓冲液中的测试溶液。向测试溶液(DNA或RNA的TE溶液)加入改性的珠。
作为对照，制备了不添加珠的DNA或RNA溶液。示例性测试溶液：
具有核酸的TE缓冲液，有0.1-1.5mg改性的珠；
具有核酸的TE缓冲液(阴性对照)，无珠；
具有核酸的TE缓冲液，无珠，未过滤。
将1mL核酸溶液样品与改性的珠混合15秒，以促进核酸与珠表面的混合和结合。将样品吸入1mL注射器中；使用注射器式过滤器装置或预制过滤器使其通过GF/F或其他感兴趣的过滤器。将洗脱液收集到2mL Eppendorf管中。由于捕获的核酸被保留在过滤器上的珠上，因此可以通过洗脱液中缺失的核酸间接评估捕获的核酸的量，如下所述。
按照制造商的说明制备DNA或RNA的标准曲线；在总共8个试管中制备了500μL的每种标准品和空白。通过在TE缓冲液中将染料以1:200稀释并避光保存来制备工作染料溶液。按照Biotek酶标仪中制造商的说明测量标准曲线样品和每种洗脱液样品的荧光。使用标准曲线计算洗脱液样品中核酸的浓度，并计算相对于理论浓度的捕获百分比。将测试样品与100％未过滤的对照进行比较，以确定核酸的回收百分比。过滤无珠对照样品以评估背景过滤器捕获，该背景过滤器捕获是最小的。未过滤100％对照。
表1-5显示过滤实验的结果，表明用酰胺化的果胶改性的固体载体可以有效地捕获核酸。
表1.Pall Supor 0.2微米过滤器上改性的玻璃珠的hgRNA和hgDNA捕获。
Figure BDA0003005143840000221
表2.Whatman GF/F过滤器上改性的琼脂糖凝胶珠的hgRNA和hgDNA捕获。
Figure BDA0003005143840000231
表3.Whatman GF/F过滤器上改性的聚苯乙烯珠的hgRNA和hgDNA捕获。
Figure BDA0003005143840000241
表4.Pall Supor 0.2微米过滤器上改性的聚苯乙烯珠的hgRNA和hgDNA捕获。
Figure BDA0003005143840000251
表5.Pall Supor 0.2微米过滤器上改性的聚苯乙烯珠的hgRNA和hgDNA捕获
Figure BDA0003005143840000261
实施例4从尿液和粪便中提取核酸
该实验证明本文公开的固体载体可用于从粪便和尿液样品中提取核酸，并且可通过PCR扩增检测分离的DNA。
尿液或粪便样品的制备
如下所示，将片段化的MTB DNA(fMTB DNA 200-400bp)掺入不同体积的尿液或粪便中。通过将等量的fMTB DNA直接掺入单独的RT-PCR反应中来制备该实验的对照，以具有表示100％提取和回收效率的比较。
使用示例性的酰胺化果胶改性的微粒从尿液或粪便中提取片段化的MTB DNA。
将1-10mL尿液/粪便样品添加到适当尺寸的离心管或Eppendorf管中。将示例性的酰胺化果胶改性的微粒添加到样品中。最佳添加量取决于每次实验所选择的珠批次、样品类型和样品体积。将样品充分混合，任选地孵育最长达60分钟以增加核酸结合，然后在台式离心机中高速离心2分钟以沉淀微粒。小心倾析上清液，以免扰动微粒丸粒。用一毫升水洗涤珠丸粒，轻轻混合以洗涤丸粒，并在台式离心机中高速离心两分钟以沉淀出微粒。小心倾析上清液，以免扰动微粒丸粒。将100μL低盐洗脱缓冲液添加到珠丸粒中，其由10mM KOH和0.01％i-角叉菜胶(Sigma)组成。轻轻地混合丸粒，并任选地孵育最长达60分钟以增加从微粒中的洗脱。小心地除去含有洗脱的核酸的上清液，以免扰动珠丸粒。然后将洗脱液直接用于RT-PCR反应中。如Chakravorty等mBio,J2017年7月/8月第8卷第4期e00812-17对XpertMTB/RIF Ultra分析所述进行PCR。
结果显示在下表6-8中。
表6从10mL尿液样品中提取的DNA的PCR分析。显示了用精胺酰胺化的果胶(EDC偶联或还原胺化)改性的微粒从10mL尿液中提取MTB DNA的性能。ΔCt计算为对照中100％加标得到的提取物Ct差异。
Figure BDA0003005143840000281
表7从1mL尿液样品中提取的DNA的PCR分析。显示了用精胺酰胺化的果胶(EDC偶联或还原胺化)改性的微粒从1mL尿液中提取MTB DNA的性能。ΔCt计算为对照中100％加标得到的提取物Ct差异。
Figure BDA0003005143840000291
表8从1mL粪便样品中提取的DNA的PCR分析。不同的微粒改性配方及其从1mL粪便样品中提取MTB DNA的性能。还原剂的存在表明通过还原胺化途径改性聚合物。没有还原剂(N/A)表明通过EDC/NHS改性聚合物。ΔCt计算为对照中100％加标得到的提取物Ct差异。
Figure BDA0003005143840000301
尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。

Claims (46)

1.一种固体载体，其包含共价结合到所述固体载体的多个改性的果胶分子。
2.权利要求1所述的固体载体，其中所述改性的果胶包含多个氨基。
3.权利要求1所述的固体载体，其中所述改性的果胶是酰胺化果胶。
4.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶包含一个或多个由下式表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure FDA0003005143830000011
其中，
n是0-3；
R1为H或C1-C3烷基；
X在每次出现时独立地为C2-C4亚烷基或C4-C6杂亚烷基；
Y为C2-C3亚烷基或C4-C6杂亚烷基；和
R2和R3独立地为H或C1-C3烷基。
5.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶是用C4-C20多胺酰胺化的果胶。
6.权利要求5所述的固体载体，其中所述多胺为乙二胺、腐胺、尸胺、精胺或亚精胺。
7.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶包含一个或多个具有以下结构的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure FDA0003005143830000021
其中
n为0、1、2或3；
m为2、3或4；
p为2、3或4；和
R1、R2和R3独立地为H或C1-C3烷基。
8.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶包含一个或多个具有以下结构的单元，或其异构体、盐或互变异构体：
Figure FDA0003005143830000022
9.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶是酰胺化柑橘果胶或酰胺化苹果果胶。
10.权利要求3所述的固体载体，其中所述酰胺化果胶具有约4,000Da至约500,000Da、约5,000Da至约300,000Da、约100,000Da至约300,000Da或约50,000Da至约200,000Da的分子量。
11.权利要求1所述的固体载体，其中所述固体载体包含选自聚苯乙烯、玻璃、陶瓷、聚丙烯、聚乙烯、二氧化硅、氧化锆、二氧化钛、氧化铝、聚碳酸酯、乳胶、PMMA、沸石、聚醚砜、羧甲基纤维素和纤维素的材料。
12.权利要求1所述的固体载体，其中所述固体载体是磁珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、聚苯乙烯过滤器、聚碳酸酯过滤器、聚醚砜过滤器或玻璃过滤器。
13.一种从包含核酸的样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使所述样品与权利要求1-12中任一项所述的固体载体接触，从而使所述核酸结合到所述固体载体；
(b)任选地洗涤结合到所述固体载体的所述核酸；和
(c)用洗脱剂从所述固体载体上洗脱所述核酸。
14.权利要求13所述的方法，其中所述洗脱剂包含氨或碱金属氢氧化物。
15.权利要求13所述的方法，其中所述洗脱剂具有约9以上、约10以上或约11以上的pH。
16.权利要求13所述的方法，其中所述洗脱剂具有约9至约12、约9.5至约12、约10至约12或约9至约11的pH。
17.权利要求13所述的方法，其中所述洗脱剂包含聚阴离子。
18.权利要求17所述的方法，其中所述聚阴离子是角叉菜胶。
19.权利要求17所述的方法，其中所述聚阴离子是载体核酸。
20.权利要求13所述的方法，其中所述洗脱剂包含角叉菜胶和KOH。
21.权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述方法包括在使所述样品与所述固体载体接触之前，使所述样品与裂解溶液接触，从而将核酸释放到溶液中。
22.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液包含离液剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述离液剂选自硫氰酸胍、盐酸胍、碱金属高氯酸盐、碱金属碘化物、脲、甲酰胺或其组合。
24.权利要求22所述的方法，其中所述离液剂是硫氰酸胍或盐酸胍。
25.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液包含盐。
26.权利要求25所述的方法，其中所述盐是氯化钠或氯化钙。
27.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液不包含离液剂。
28.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液包含缓冲剂。
29.权利要求28所述的方法，其中所述缓冲剂是Tris。
30.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液包含表面活性剂。
31.权利要求21所述的方法，其中所述裂解溶液包含消泡剂。
32.权利要求13所述的方法，其中使所述样品与固体载体接触在不存在离液剂的情况下进行。
33.权利要求13所述的方法，其中所述样品选自血液、血浆、血清、精液、组织活检、尿液、粪便、唾液、涂布标本、细菌培养物、细胞培养物、病毒培养物、PCR反应混合物或体外核酸修饰反应混合物。
34.权利要求33所述的方法，其中所述组织活检是石蜡包埋的组织。
35.权利要求13所述的方法，其中所述核酸包含基因组DNA。
36.权利要求13所述的方法，其中所述核酸包含总RNA。
37.权利要求13所述的方法，其中所述核酸包含微生物核酸或病毒核酸。
38.权利要求37所述的方法，其中所述病毒核酸是HBV DNA。
39.权利要求13所述的方法，其中所述核酸是循环核酸。
40.权利要求13-39中任一项所述的方法，其中所述方法在自动化的药筒中进行。
41.一种用于检测样品中的核酸的方法，包括：
(a)使包含核酸的样品与权利要求1-12中任一项所述的固体载体接触，从而使所述核酸结合到所述固体载体；
(b)任选地洗涤结合到所述固体载体的所述核酸；
(c)洗脱所述核酸；和
(d)检测所述核酸。
42.权利要求41所述的方法，其中检测所述核酸包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述核酸。
43.权利要求42所述的方法，其中所述聚合酶链反应是巢式PCR、等温PCR或RT-PCR。
44.一种用于色谱法的分离材料，其包含固体载体，所述固体载体包含化学键合到其上的酰胺化果胶。
45.根据权利要求44所述的分离材料，其中所述酰胺化果胶具有一个或多个由下式表示的单元，其异构体、盐、互变异构体或组合：
Figure FDA0003005143830000041
其中R2和R3独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C3-C6环烷基和任选取代的C2-C20杂烷基。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的分离材料，其中所述固体载体是二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆或混合二氧化硅材料。
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