JPH03292899A - 核酸塩基配列の変異又は特定の塩基配列を有する核酸の存在を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は核酸上で起こった突然変異等の塩基配列の変異
ならびに特定の塩基配列を有する核酸の存在を検出する
為の試薬及びそれに用いられる担体に関する。

［従来の技術］ 近年、遺伝子工学の進歩に伴い、動物、植物、細菌、ウ
ィルス等の生物の遺伝情報が明らかになりつつある。特
に人間の遺伝子に対する解析は急速に進んでおり、遺伝
病、癌等においては核酸の塩基配列のレベルで明らかに
なりつつある。

その結果、ある種の遺伝病は核酸の塩基配列の僅か一部
分の変異、即ち点突然変異により起こることが知られて
いる。従って、核酸の塩基配列を調べ正常な塩基配列と
比較することにより、正確な遺伝病等の診断が可能であ
る。

突然変異の測定法の一つに温度勾配ＤＮＡカラムクロマ
トグラフィーがあるｆＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　５ｅｒｉｅｓ　
　Ｎｏ、１９．　４９−５２（１９８８））、この方法
によればカラムに充填した多孔質の担体に固定化された
核酸（以下、核酸プローブと言う）と、試料中に含まれ
る核酸プローブに相補的な塩基配列を含む核酸とをハイ
ブリッド形成させ、ハイブリッドしなかった核酸その他
の夾雑物を溶出除去する。その次にハイブリッドを形成
している核酸分子間の水素結合を切るようにカラムの温
度を徐々に上げ、ハイブリッドしていた核酸を解離させ
溶出する。核酸の検出は紫外吸収等により行い、カラム
から溶出されて来る温度を測定する。ミスマ・ンチ塩基
配列を持つ核酸は、相補的な塩基配列をもつ核酸に比ベ
ハイブリッドの安定性が低いため、完全に相補的なもの
より早く溶出される。しかし多孔質の担体を用いたこの
方法では、溶出ピーク幅が広いため、核酸プローブと試
料中の核酸とのミスマツチの割合が小さかったり、また
ミスマツチの位置が相補的部分の末端に近い部分に存在
する場合、該ミスマツチに起因するハイブリッドの安定
性の変化が小さく、溶出ピークの分離度が悪くなり測定
しにくくなるという問題点があった。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、核酸の塩基配列の変異測定及
び特定の塩基配列を有する核酸の検出を鋭敏に行なうこ
とができる核酸の塩基配列変異測定及び核酸検出用試薬
及びそれに用いられる担体を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、従来技術にみられる問題点を解決すべく
鋭意研究を行った結果、表面が非多孔質であって粒径０
．１〜１０ｕｍの高分子担体表面に、１０以上のヌクレ
オチドから成る一本鎖の核酸を固定化した試薬を用いる
ことにより、温度勾配カラムクロマトグラフィーの分離
度を改善できることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、非多孔質の表面を有し１表面に水
酸基を有し、前記水酸基の活性化工程において使用され
る有機溶媒に不溶でかつ水に不溶な高分子化合物の粒子
であって、その粒径が０．１〜１０ｕｍであるものから
成る核酸の塩基配列変異測定及び核酸検出用担体を提供
する。

さらにまた、本発明は、前記本発明の担体の表面に、１
０以上のヌクレオチドから成る一本鎖の核酸の５末端が
下記式［Ｉ］に示す結合により固定化されて成る、核酸
の塩基配列変異測定及び核酸検出用試薬を提供する。

（ただし、スペーサは、骨格部分の原子数が２〜５０の
直鎖又は分岐鎖を有する化合物である。）［発明の効果
］ 本発明の試薬を用いると、多孔質の担体を用いた従来の
試薬では検出することができなかった、相補的部分が長
くミスマツチ部分の割合が小さい場合やミスマツチが相
補的部分の末端に近い部分に存在する場合のハイブリッ
ドの安定性の小さな差を検出することができるようにな
った６従って、本発明の試薬を用いることにより、核酸
の塩基配列の変異の検出及び特定の塩基配列を有する核
酸の検出を鋭敏に行なうことができるようになった。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、本発明の担体は非多孔質の表面を有する
。表面が「非多孔質」であるとは、孔径が１０ｎｍ以上
である孔を粒子表面に実質的に有さないことを意味する
。

本発明の担体は、表面に後述の核酸プローブを結合する
ための水酸基を有する。

本発明の担体は、前記水酸基の活性化工程において使用
される、例えばアセトニトリルやアセトンのような有機
溶媒に不溶である。

また、カラムクロマトグラフィーに担体を使用する際、
水性媒体又は有機溶媒を含む水性媒体が通常用いられる
ので、本発明の担体は水に不渚である。

本発明の担体は粒子状であり、その粒径は０．１〜１０
ＬＬＩ＋である。もつとも、粒径が１μ■以下であると
、凝縮しやすく、カラムへ充填する際高圧を要するので
粒径は１μ■〜ｌＯμ■が好ましい。

本発明の担体を構成する、上記諸性質を有する高分子化
合物の好ましい例としては、スチレン、クロルスチレン
、り四ロメチルスチレン、ａ−メチルスチレン、ジビニ
ルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）
アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アク
リル酸エチル、（メタ）アクリル酸−〇−ブチル、（メ
タ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アク
リル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシ
ジル、エチレングリコール−ジー（メタ）アクリル酸エ
ステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メ
タ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ
）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミ
ド、ブタジェン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリ
ジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル
等の芳香族ビニル化合物、α、β−不飽和カルボン酸の
エステル類若しくはアミド類、α。

β−不飽和二トリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、
共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステルか
ら成るビニル系単量体の一種以上を重合して得られる水
不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学的に
変成して得られる水不溶性でかつ非膨潤性の有機高分子
物質を挙げることができる。

これらの高分子粒子は、乳化重合、懸濁重合、溶液沈殿
重合等の公知の方法によって製造することができる。ま
た、有機高分子溶液を非溶媒中に分散したり、架橋した
り、又は溶媒を揮散させること等によって該高分子粒子
を得ることができるが、高分子粒子の製造方法はこれら
に限定されるものではない。

また、水酸基を有しない高分子粒子の表面に水酸基を導
入するには、薬品処理、紫外線処理、プラズマ処理等種
々の公知の方法を利用することができる。

このような化合物から成る非多孔質の粒子は一部市販さ
れており、本発明においては、このような市販の担体を
も好ましく用いることができる。

本発明の試薬は、上記本発明の担体の表面に、１０以上
のヌクレオチドから成る一本鎖の核酸（以下、核酸プロ
ーブと言う）が、上記式［Ｉ］に示す結合により固定化
されて成るものである。

核酸プローブは、試料中の変異の有無又はその存在を調
べたい核酸部分とハイブリッド可能な状態で固定化され
ていな（ではいけない。このように固定化するためには
、核酸の末端を固定化することが好ましい。

固定化−は、次のようにして行なうことができる。すな
わち、本発明の担体を、活性化剤であるバラ−トルエン
スルホニルクロライド、トレシルクロライド又は２−フ
ルオロ−１−メチルピリジニウム−パラ−トルエンスル
ホネート等で活性化する。活性化は例えば次のようにし
て行なうことができる。すなわち、脱水したアセトニト
リルやアセトン等の有機溶媒に担体を懸濁した後、さら
にピリジン又はＮ−ジメチルピリジン等の塩基を加え、
撹拌下で上記活性化剤を加え、１時間反応させる。フィ
ルターで担体をろ過しアセトニトリルやアセトン等で未
反応物を洗浄後、さらに、希塩酸で洗浄して塩基を除い
た後、水冷した水で洗浄した後、凍結乾燥により脱水す
ることにより調製される６担体は０℃以下で保存するこ
とが好ましい。

次に、活性化した担体に、好ましくは核酸の末端にスペ
ーサを介して、第１級アミノ基を有し、かつ１０以上の
ヌクレオチドから成る一本鎖の核酸プローブを反応させ
ることにより、上記式［Ｉ］に示す結合により核酸プロ
ーブを固定化することができる。

５′末端にスペーサを介して第一級アミノ基を有する核
酸プローブ（ここではＤＮＡの場合について説明する）
は、亜リン酸アミダイト法やハイドロジエンホスホネー
ト法などの固相合成法で合成されたＤＮＡ中間体に、５
′−アミノアルキル−オリゴデオキシリボヌクレオチド
（特開昭６１−３３１９５号）や、Ｎ−トリフルオロア
セチルアミノアルキル−６−オキシ−Ｂ−シアノエチル
−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホアミタイド（Ｂ
ｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
　Ｎｏ、　１０４１等を縮合した反応物又はＮ、Ｎ−カ
ルポニルジイミダゾルで活性化したものに両末端にアミ
ン基をもつスペーサを反応させた後、反応物の保護基を
除去し、固相から切り出すことにより得ることができる
。Ｎ、Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化した場合
の条件をさらに詳細に述べると、上記固相合成法で合成
されたＤＮＡ中間体を、アセトニトリルに溶解したＮ、
Ｎ−カルボニルジイミダゾール０．５Ｍで１５分反応さ
せた後、アセトニトリルに溶解した１、０Ｍのジアミン
と室温で１５分反応させる。この後、室温条件下、２８
重量％、アンモニア溶液中で１時間処理することにより
オリゴヌクレオチドを固相から切り出し、該溶液中で５
５℃条件下で１７時間、脱保護を行なうことにより得る
ことができる。

スペーサは、骨格部分の原子数が２〜５０の直鎖又は分
岐鎖を有する化合物である。スペーサとして好ましいも
のの例としてはエチレンジアミン、トリメチレンジアミ
ン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン
、ヘキサメチレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ビス（３−アミノ
プロピル）メチルアミン、ビス（３−アミノプロピル）
エテル、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル
）エーテル、ジエチレングリコールビス（３−アミノプ
ロピル）エーテル、１．４−ブタンジオールビス（３−
アミノプロピル）エーテル等を挙げることができる。

本発明では、試料に含まれる核酸と核酸プローブとの結
合特異性を得るために、１ｏ塩基以上の長さを有する核
酸プローブを用いることが望ましい。また、例えば試料
に含まれる核酸と対応する核酸プローブのハイブリッド
が１００塩基以上となる場合においては、試料に含まれ
る核酸中の変異が少数であると、ミスマツチに起因する
ハイブリッドの安定性の変化は小さく測定しにくくなる
。従って、用いる核酸プローブはｌＯ〜１００塩基、更
に好ましくは１５〜８０塩基程度のものが好ましい。但
し、ハイブリッド中のミスマツチが複数存在する場合、
さらには試料に含まれる核酸中の変異が複数個の塩基の
欠失あるいは挿入によるときはこの限りではない。

本発明の試薬を用いて、核酸塩基配列における変異及び
特定の塩基配列を有する核酸の存在を検出することがで
きる。本発明の試薬は、常法による温度勾配ＤＮＡ　（
又はＲＮＡ）カラムクロマトグラフィーの充填剤として
用いることができ、より具体的には例えば、本発明の試
薬を充填剤として用いて以下のように温度勾配カラムク
ロマトグラフィーを行なうことにより、核酸塩基配列に
おける変異及び特定の塩基配列を有する核酸の存在を検
出することができる。すなわち、ｆｉ＋非多孔質の担体
に固定化した核酸プローブに対し核酸を含む試料をハイ
ブリッドさせ、（２）ハイブリッドしなかった核酸を溶
出除去した後、 （３）ハイブリッド形成時の温度から１００℃を超えな
い温度までカラムの温度を上昇させて、ハイブリッドし
た核酸を解離させ、 （４）核酸が解離した温度を求めることにより核酸塩基
配列における変異が測定できる。

核酸を含む試料と非多孔質の担体に固定化した核酸プロ
ーブとをハイブリッドさせるには、通常知られた方法、
例えば核酸を含む試料を熱変性させた後に適当な温度で
固定化核酸プローブと接触させればよい。ハイブリッド
を形成しなかった核酸は溶出除去する。ハイブリッド形
成した核酸は、引続き該温度を上昇させることにより再
び解離させるにのとき、核酸と核酸プローブの間にＡ−
Ｔ　（Ａ−ＴＪ）、Ｇ−Ｃ結合以外のミスマツチした部
分が存在するハイブリッドでは、完全に相補的に結合し
たハイブリッドに比べて安定性が低いため比較的低い温
度で核酸の解離が起こる。完金相補的にハイブリッドし
た核酸であっても高塩濃度下では９０〜１００℃で解離
しているので、温度は核酸と核酸プローブがハイブリッ
ドを形成した時の温度から１００℃を超えない温度まで
温度を上昇させれば良い、解離してきた核酸は、例えば
紫外域の吸光度、また操作に先立って該核酸をラジオア
イソトープあるいは蛍光物質等の標識を施した場合には
、それら標識を測定することにより行えばよい、また溶
出してきた核酸をポストラベルし測定してもよい。

本発明の試薬を用いて検査を行なう被検試料としては、
動物細胞例えば白血球細胞、腎細胞、肝細胞等、また細
菌、ウィルス等の微生物、さらには植物細胞等から抽出
した核酸を用いることができるが、これらに限定される
ものでないことは明らかである。

［実施例］ 以下の実施例により本発明のさらに詳細な説明を行うが
、本発明はこれら実施例に限定されるのものではない。

実ｍ 核酸プローブ固定化カラムの調製 非多孔質担体ＮＰＲ（東ソー（株）社製）をトレシルク
ロライドで活性化した。活性化の条件は乾燥した担体１
’　ｇを、脱水アセトン１０＋ｎｌに懸濁し、ピリジン
０．２　ｍｌを加えた後、撹拌しながらトレシルクロラ
イドを０．１　ｍｌ加えて１時間常温で反応させた。次
に担体をガラスフィルターでろ通抜、アセトンで数回洗
浄した後さらに、塩酸（５ｍＭ、）で洗浄した後、水冷
した水で洗浄した。

担体を凍結乾燥して一２０℃で保存した。活性化した担
体を０．５ｇ取り、核酸プローブとして５′末端にアミ
ノ基を有する２１ｍａｒのオリゴデオキシチミジンを濃
醇したリン酸バッファ（ＬＭ、ｐＨ９，０１に懸濁し、
常温で１時間反応させた。次に遠心し担体を沈降させ、
上清を捨てた後、トリス−塩酸バッファ（０，１Ｍ　ｐ
Ｈ８，０１に再懸濁し残存活性基をつぶした。

また比較のために、上記ＮＰＲと実質的に同一の組成を
有するが表面が多孔質である担体６５０Ｍ（孔径１００
　ｎｍ、東ソー（株）社製）を上記と同様にトレシルク
ロライドで活性化し、同様にアミン基を有する核酸プロ
ーブを反応させた。各担体ｌ　ｍｇ　（乾燥重量）に核
酸プローブは、約ｌｕｇずつ固定化された。これら核酸
プローブが固定化された担体をカラム（内径６＋ｏｍｘ
長さ４　ｃｍ）に充填した。

試１口引上 実施例１で調製したカラムを温度勾配槽内にセットし、
緩衝溶液（７５０ｍＭ　ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７，０）で平衡化後、槽内の温度を３５
℃に保ちつつ、サンプル注入バルブより核酸（ポリデオ
キシアデニン）を注入した。核酸注入後、最初の１０分
間は相補的な核酸をハイブリッドさせるため３５℃に保
ちつつ、ハイブリッドしなかった試料を製出除去した。

１０分後に温度グラジェント（１°Ｃ／ｍｉｎ、ｌ　を
開始し、カラム内でハイブリッドしている試料を溶出さ
せ、溶出してきた核酸を紫外吸収（２６０ｎｍ）でモニ
ターし検出した。

結果を図１に示す。図中、点線は多孔質の担体６５０Ｍ
を用いたときの分離を示し、実線は非多孔質の担体ＮＰ
Ｒを用いたときの分離を示す。

なお、本実施例における液体の流速は全て０５ｍ１／分
とした。図１に示されるように、本発明の非多孔質の担
体を用いた場合の方が、従来の多孔質の担体を用いた場
合よりも溶出ピークの幅が狭くなっており、すなわち、
鋭敏に検出を行なうことができることがわかる。

なお、図１に示されるように、多孔質担体を用いた場合
の方が、非多孔質担体を用いた場合よりもピークが早い
時間に現われている。これは、次のような理由によるも
のと考えられる。すなわち、非多孔質担体の方が、多孔
質担体よりも比重が大きいので、一定のカラム体積当り
に充填される重量が多くなる。ところが、多孔質担体も
非多孔質担体も同じ条件で核酸を付加しているので、一
定重量当りの核酸担持量はほぼ等しい。従って、カラム
当りの核酸プローブの量が、上記の試験例１では、非多
孔質担体を用いた場合の方が多孔質担体を用いた場合の
約２倍になっている。温度を上昇させることによって解
離した被検試料中の一本鎖ＤＮＡは、下方に移動してカ
ラムの下端より排出されるが、下方に移動する際に、下
方にある担体に担持された核酸プローブと相互作用を行
ないながら移動していくので、結局、カラム全体の核酸
プローブの量が多い方が溶出が遅れる。

多孔性担体の表面の孔に物理的に捕捉されることによる
遅れよりも、このような、下方の担体上の核酸プローブ
との相互作用による遅れの方が大きいので、非多孔質担
体を用いた場合の方が多孔質担体を用いた場合よりも溶
出ピークが遅く現われるものと考えられる。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の担体及び比較例の担体を用いて温度勾
配ＤＮＡカラムクロマトグラフィーを行なった際の結果
を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）非多孔質の表面を有し、表面に水酸基を有し、前
   記水酸基の活性化工程において使用される有機溶媒に不
   溶でかつ水に不溶な高分子化合物の粒子であって、その
   粒径が０．１〜１０μｍであるものから成る核酸の塩基
   配列変異測定及び核酸の検出用担体。
2. （２）前記担体は、水に対して非膨潤性である請求項１
   記載の担体。
3. （３）請求項１または２に記載の担体の表面に、１０以
   上のヌクレオチドから成る一本鎖の核酸が下記式［ I
   ］に示す結合により固定化されて成る、核酸の塩基配列
   変異測定及び核酸の検出用試薬。 核酸−スペーサ−Ｎ−ＣＨ＿２−担体・・［ I ］（た
   だし、スペーサは、骨格部分の原子数が２〜５０の直鎖
   又は分岐鎖を有する化合物である。）（４）前記核酸は
   、その末端がスペーサを介して前記担体に結合されてい
   る請求項３記載の試薬。