JP4951116B2 - 光応答性プローブを用いたメチルシトシンの検出法 - Google Patents
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Description
[1]
塩基部分として、次の式I、式II、式III、又は式IV:
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R2は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R5は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R7及びR9は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R8は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R11は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
で表される基を有する核酸類(ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる)。
[2]
R2,R5,R8及びR11が、C1〜C12の炭素数を有する炭化水素基である、[1]に記載の核酸類(ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる)。
[3]
[1]〜[2]の何れかに記載の核酸類からなる、メチルシトシン光連結剤。
[4]
[1]〜[2]の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
[5]
[1]〜[2]の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
[6]
[1]〜[2]の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
[7]
[1]又は[2]に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。
[8]
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式I、式II、式III、又は式IVで表される基とが、隣接して配置される配列である、[7]に記載の方法。
[9]
標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、[7]〜[8]の何れかに記載の方法。
[10]
[1]又は[2]に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
塩基部分として、次の式I、式II、式III、又は式IV:
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R2は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R5は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R7及びR9は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R8は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R11は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
で表される基を有する核酸類(ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる)を、メチルシトシン光連結剤として使用して、メチルシトシンを光連結することにより、メチルシトシンを検出することができる。すなわち、上記塩基部分として、次の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を有する核酸類(ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる)を、光応答性メチルシトシン検出剤として使用することができる。
の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法によって、行うことができる。
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式I、式II、式III、又は式IVで表される基とが、隣接して配置される配列であることが好ましい。
式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸、が用意されて、これらがハイブリッド形成(ハイブリダイズ)可能な条件下におかれることによって、ハイブリッド形成(ハイブリダイズ)している。
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キットにもある。
次の式(1)の流れに従いメチルシトシン検出に用いる光応答性核酸の合成を行った。
5−ヨード−2’−デオキシウリジン(1)(500 mg、1.41 mmol)をDMF(2.5 ml)とジオキサン(2.5 ml)に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート(31 mg、 0.14 mmol)を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン(340μl、1.41 mmol)、1−ヘプテン(5 ml、3.53 mmol)を加えマイクロウェーブによる加熱で100℃、20分間の反応を行った。反応後のサンプルはTLC(CHCl3:MeOH=9:1)で原料が9割以上減少を確認し、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をCHCl3:MeOH=9:1にして精製した。HUは445 mg、 1.36 mmolで収率は97%であった。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。またMALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した。(calcd. for C16H25N2O5 [M+H]+ 325.179, found 325.801)
1H NMR (CDCl3): 7.59 (s, 1H, H-C(6)); 6.29-6.13 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 6.00 (d,1H, J=16.5 vinylic H); 4.58 (m, 1H, H-C(3')); 4.03 (m, 1H, H-C(4')); 3.90-3.80 (m, 2H, H-C(5')); 2.38 (m, 2H, H-C(2')); 1.95-0.84 (m, 11H, CH3(CH2)2).
化合物(2a)(340 mg、1.05 mmol)を脱水ピリジンで3回共沸した。そこへ脱水ピリジン(2.0 ml)を加え1時間脱気した4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(427 mg、1.26 mmol)を加え、続けてDMAP(38 mg、0.31 mmol)を添加した。最後に、トリエチルアミン(170μl、1.26 mmol)を加えて室温で13時間撹拌した。TLC(CHCl3:MeOH=95:5)で生成物を確認した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて展開溶媒をCHCl3:MeOH=98:2から95:5に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物(3a)(304 mg、0.49 mmol、収率46%)を得た。1H NMRにて目的化合物を測定し固定した。また、 MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した。(calcd. for C37H43N2O7 [M+H]+ 627.306, found 627.455)
1H NMR (CDCl3): 8.46 (br.s, 1H, NH); 7.63 (s, 1H, H-C(6)); 7.49-7.23 (m, 8H,
arom. H); 6.87-6.82 (m, 5H, arom. H); 6.45-6.16 (m, 3H, H-C(l'), vinylic H); 4.56 (m,1H, H-C(3')); 4.09-4.04 (m, 1H, H-C(4')); 3.76 (s, 6H, OMe); 3.53-3.33 (m, 2H, H-C(5')); 2.44-2.20 (m, 2H, H-C(2')); 1.79-1.63 (m, 11H, CH3(CH2)2).
アセトニトリル(0.5 mL)で共沸した化合物(3a)(233 mg、0.37 mmol)にアセトニトリル(1.5 ml)を加えた。反応溶液に2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホアミダイト(120μL、0.38 mmol)と0.45M テトラゾールのアセトニトリル溶液(910μL、0.41 mmol)を加えて、反応溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで3回抽出し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層をMgS04で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し3回共沸し、目的化合物(4a)(収量320 mg、0.39 mmol, quant)を得た。 MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C46H60N4O8P [M+H]+ 827.414, found 827.731)。
5−ヨード−2’−デオキシウリジン(1)(505 mg、1.42 mmol)をDMF(2.5 mL)とジオキサン(2.5 mL)に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート(33 mg、0.14 mmol)を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン(340μl、1.41 mmol)、ビニルシクロヘキサン(2.0 mL、14.1 mmol)を加えマイクロウェーブによる加熱で100℃、20分間の反応を行った。原料の消失をTLC(CHCl3:MeOH=9:1)にて確認した。その後、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をCHCl3:MeOH=9:1にして精製した。(2b)は400 mg、1.19 mmolで収率は84%であった。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。またMALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C17H25N2O5 [M+H]+ 337.176, found 337.156)。
1H NMR (CDCl3): 7.62 (s, 1H, H-C(6)); 6.36-6.28 (m, 1H, vinylic H); 6.21-6.13 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 6.03 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 4.61 (m, 1H, H-C(3')); 4.04 (m, 1H, H-C(4')); 3.97-3.81 (m, 2H, H-C(5')); 2.51-2.33 (m, 2H, H-C(2')); 2.14-1.06 (m,11H, C6H11).
化合物(2b)(320 mg、0.95 mmol)を脱水ピリジンで3回共沸した。そこへ脱水ピリジン(1.5 mL)を加え、4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(380 mg、1.12 mmol)を加え、続けてDMAP(41 mg、0.34 mmol)を添加した。最後に、トリエチルアミン(160μl、1.14 mmol)を加えて室温で21時間撹拌した。TLC(CHCl3:MeOH=9:1)で生成物を確認した後、シリカゲルカラムにて、展開溶媒をCHCl3:MeOH=98:2から95:5に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物(3b)(329 mg、0.52 mmol、収率54%)を得た。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。また、MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C38H43N2O7 [M+H]+ 639.306, found 639.496)。
1H NMR (CDCl3): 8.17 (br. s, 1h, NH); 7.68 (s, 1H, H-C(6)); 7.44-7.22 (m, 8H, arom. H); 6.82 (m, 6H, arom. H, vinylic H); 6.42-6.19 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 4.54(m, 1H, H-C(3')); 4.04(m, 1H, H-C(4')); 3.79 (s, 6H, OMe) 3.50 (dd, 1H, J=10.5, 3.0, H-C(5')); 2.99 (dd, 1H, J=10.5, 3.0, H-C(5'); 2.42-2.26 (m, 2H, H-C(2')); 1.99-1.22 (m, 11H, C6H11).
アセトニトリル(0.5 mL)で共沸した化合物(3b)(320 mg、0.50 mmol)にアセトニトリル(2.5 ml)を加えた。反応溶液に2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホアミダイト(160μL、0.50 mmol)と0.45M テトラゾールのアセトニトリル溶液(1.2 mL、0.55 mmol)を加えて、反応溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで3回抽出し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層をMgS04で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し3回共沸し、目的化合物(4b)(収量432 mg、0.51 mmol、quant.)を得た。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C47H60N4O8P [M+H]+ 839.414, found 839.330)。
5−ヨードデオキシウリジン(1)(0.5 g、1.41 mmol)をDMF(2.5 mL)とジオキサン(2.5 mL)に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート(32.0 mg、 0.14 mmol)を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン(340μl、1.41 mmol)、3,3−ジメチル−1−ブテン(5.5 mL、42.3 mmol)を加えマイクロウェーブによる加熱で100℃で15分間、反応を行った。TLC(CHCl3:MeOH=9:1)にて原料6割以上の消失を確認し、反応を終了した。その後、さらに、この操作をもう一度行い、合成した後に、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をCHCl3:MeOH=9:1にして精製した。目的化合物(2c)(271 mg、0.87 mmol、 収率31%)を得た。1H NMRにて目的化合物を固定した。また、MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C15H23N2O5 [M+H]+ 311.160, found 311.355)。
1H NMR (DMSO): 8.03 (s, 1H, H-C(6)); 6.44 (d, 1H, J=16.5, vinylic H); 6.17 (t, 1H, J=6.6, H-C(1')); 5.96(d, 1H, J=16.5, vinylic H); 5.24 (m, 1H, 3'-0H); 5.13 (t, 1H, J=5.0, 5'-0H); 4.25 (m, 1H, H-C(3')); 3.78 (m, 1H, H-C(4')); 3.65-3.54 (m, 2H, H-C(5')); 2.12 (m, 2H, H-C(2')); 1.59-1.49 (m, 2H, (CH3)3C); 1.40-1.24(m, 2H, (CH3)3C); 1.04(m, 5H, (CH3)3C).
化合物(2c)(497 mg、1.60 mmol)を脱水ピリジンで3回共沸した。そこへ脱水ピリジン(2.0 ml)を加え4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(666 mg、 1.97 mmol)を加え、続けてDMAP(67 mg、0.55 mmol)を添加した。最後に、トリエチルアミン(270μl、1.92 mmol)を加えて室温で19時間撹拌した。TLC(CHCl3:MeOH=9:1)で生成物を確認した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて展開溶媒をCHCl3:MeOH=97:3から95:5に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物(3c)(601 mg、0.98 mmol、収率61%)を得た。1H NMRにて目的化合物を同定した。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C36H41N2O7 [M+H]+ 613.291, found 613.699)。
1H NMR (DMSO): 11.5(br. s, 1H, NH); 8.32 (s, 1H, H-C(6)); 7.43-7.22 (m, 8H, arom. H); 6.89-6.85 (m, 5H, arom. H); 6.41 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 6.23 (t, 1H, J=6.3, H-C(1')); 5.72 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 5.32 (t, 1H, J=4.5, 3'-0H); 4.26 (m, 1H, H-C(3')); 3.91(m, 1H, H-C(4')); 3.73 (s, 6H, OMe); 3.27-3.11 (m, 2H, H-C(5')); 2.35-2.25 (m, 1H, H-C(2')); 2.21-2.13 (m, 1H, H-C(2')); 0.90-0.76 (m, 9H, (CH3)3C).
アセトニトリル(0.5 mL)で共沸した化合物(3b)(186 mg、0.25 mmol)にアセトニトリル(1.5 ml)を加えた。反応溶液に2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホアミダイト(80μL、0.25 mmol)と0.45Mテトラゾールのアセトニトリル溶液(600μL、0.27 mmol)を加えて、反応溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで3回抽出し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層をMgS04で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し3回共沸し、目的化合物(4b)(収量197 mg、0.24 mmol、収率99%)を得た。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C45H58N4O8P [M+H]+ 813.399, found 814.770)。
式(1)の流れによる合成で得られた光応答性核酸をABI 3400 DNA 合成機を用いて1μmolスケールで合成した。28%アンモニア水溶液によるCPGの切り出し後、55℃で8時間インキュベートして脱保護を行い、speed vacにてアンモニアを除去した。凍結乾燥後、HPLCにより精製を行いODN(HU)、ODN(HVU)、ODN(BuVU)を得た。その後、質量分析をMALDI-TOF-MSにて行った。
ODN(HVU):5'-HVUGACGTGTATCGCATTGGSSSS-NH2-3'
ODN(BuVU):5'-BuVUGACGTGTATCGCATTGGSSSS-NH2-3'
calcd. for ODN(HVU):[(M+H)+] 7197.09, found 7197.59.
calcd. for ODN(BuVU):[(M+H)+] 7171.05, found 7171.20.
次の表1に示した配列を用いて、ガラス基板上でのメチルシトシン検出を、以下の式(2)の流れに従って行った。
2μM ODN(HU)、50mMカコジル酸ナトリウム、100mM NaClになる水溶液を調整した。ODN(HVU)、ODN(BuVU)に関しても、それぞれ同様の水溶液を調整した。これらをガラス基板上に2.0μLずつスポットし、基板上に固定化する為に16時開静置した。固定終了後に、室温で、0.1%(w/v)SDS水溶液で2回洗浄し、その後さらに超純水で2回洗浄した。室温で乾燥させたガラス基板上にNaBH4(3.75 mg)をPBS(リン酸緩衝サリン溶液:pH7.2)(1.5 mL)、エタノール(375μL)に溶かした溶液を全面に滴下して5分開静置した。その後に超純水で洗浄し、98℃の熱水で3分間煮沸し、煮沸後、室温で乾燥させた。
10μM target(C)、10μM template、50mM カコジル酸ナトリウム、100mM NaClになる水溶液を調整し、(1)で作製したガラス基板上の光応答性プローブを固定化した位置に4.0μLずつスポットした。target(mC)に関しても同様の水溶液を調整して4.0μLずつスポットした。このガラス基板を0℃の条件下でトランスイルミネーターを用いて366nmの光照射を1時間行った。光照射後に98℃の熱水で5分間煮沸して、未反応のtarget(C)、target(mC)とtemplateを洗い流した。
5μM ODN(Cy3)、10μM template、50mM カコジル酸ナトリウム、100mM NaClになる水溶液を調整した。この水溶液を(2)のガラス基板上に50μL滴下して、カバーガラスを上から載せて全面に広げ、4℃で24時開静置してハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスをつけたまま、洗浄液1(1xSSC、0.2%SDS)を満たした容器に入れてカバーガラスが外れるまで軽く震盪した。別の容器に洗浄液1を満たしてカバーガラスの外れたプレートを入れて室温で適度に震盪しながら5分開静置した。さらに別の容器に洗浄液2(0.1XSSC、0.2%SDS)を満たしてプレートを入れて、室温で適度に震盪しながら5分開静置し、更に同じ操作を別の容器でもう一度繰り返した。別の容器に洗浄液3(0.1XSSC)を満たしてプレートを入れて、室温で適度に震盪しながら1分開静置し、更に同じ操作を別の容器でもう一度繰り返した。最後にMilli Qを満たしたビーカにプレートを軽く浸して洗浄した。プレート用のスピナーで水分を取り除いた後にプレートリーダーにて蛍光の検出を行った。
プレートリーダーで蛍光強度を読み取った結果を図1(a)に示す。その強度を
target(C)とtarget(mC)とで比較したグラフが図1(b)に示す。ODN(HU)、ODN(HVU)、ODN(BuVU)のいずれの構造も、メチルシトシンとの連結効率が検出可能な程度に高いものであった。 target(C)とtarget(mC)の蛍光強度の比をとると、ODN(HU)を用いた場合に、メチルシトシン(mC)の蛍光強度はシトシン(C)の蛍光強度と比較して4.2倍という高い値であった。ODN(HVU)では、メチルシトシン(mC)の蛍光強度はシトシン(C)の蛍光強度と比較して4.1倍、ODN(BuVU)ではメチルシトシン(mC)の蛍光強度はシトシン(C)の蛍光強度と比較して2.6倍という高い値であった。
Claims (9)
- 塩基部分として、次の式I、式II、式III、又は式IV:
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R2は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R5は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R7及びR9は、それぞれ独立に、水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1〜C6のアシル基を示し、
R8は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
R11は、C1〜C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
で表される基を有する核酸類(ただし、核酸類は、核酸、又はペプチド核酸である)からなる、メチルシトシン光連結剤。 - R2,R5,R8及びR11が、C1〜C12の炭素数を有する炭化水素基である、請求項1に記載の核酸類(ただし、核酸類は、核酸、又はペプチド核酸である)からなる、メチルシトシン光連結剤。
- 請求項1〜2の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
- 請求項1〜2の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
- 請求項1〜2の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
- 請求項1又は請求項2に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。 - 鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式I、式II、式III、又は式IVで表される基とが、隣接して配置される配列である、請求項6に記載の方法。 - 標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、請求項6〜7の何れかに記載の方法。
- 請求項1又は請求項2に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
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