JP3083297B2 - 末端標識したヌクレオチドプローブ - Google Patents

末端標識したヌクレオチドプローブ

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JP3083297B2 JP01044981A JP4498189A JP3083297B2 JP 3083297 B2 JP3083297 B2 JP 3083297B2 JP 01044981 A JP01044981 A JP 01044981A JP 4498189 A JP4498189 A JP 4498189A JP 3083297 B2 JP3083297 B2 JP 3083297B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特定結合検定の為のシグナル発生システム
に関するものである。更に特別には、本発明は、ビオチ
ンと他の公知標識化部分のような非放射性部分による核
酸ハイブリッド形成プローブの標識化における改良に関
するものである。
（従来の技術と発明が解決しようとする課題） オリゴデオキシヌクレオチドを包含するオリゴヌクレ
オチド（オリゴマー）は、特定遺伝子及び核酸配列の検
出の為のプローブとして現在広く使用されている。オリ
ゴヌクレオチドの標識化の為の最も普通の方法は、同位
元素32Pの組込みである。このアプローチは実験目的に
は適しているけれども、安全予防措置が必要とすること
と相俟って、32Pの比較的に短い半減期は、効果的でか
つ非放射性標識化方法の検索が刺激されている。
今まで報告されている各種の非放射性標識の内、ビタ
ミンビオチン（及びイミノビオチンのようなビオチン類
似体）が、使用される検出システムの感度に加えて、ア
ビシンとストレプタビジンと結合する高い親和力、融通
性、及び取扱い容易によって可なりの注目を引いてき
た。ビオチン化プローブは、レアリ等、プロシーディン
グス ナショナル アカデミー サイエンス（PNAS）、
第80巻、第4045頁（1983）に示されるように、ニトロセ
ルロースフィルター上の標的核酸配列の感光比色的検出
に対して、更に、ランゲル−サファー等、PNAS、第79
巻、第4381頁（1982）に示されるように標的DNAの生体
内原位置における検出に対して使用されている。
DNA中にビオチンの酵素的組込みは、相当に文献が提
出されており、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸の組込
みは、ランゲル等、PNAS、第78巻、第6633頁（1981）に
検討されているように、ニックトランスレーション法に
より、又は、キングスバリ等（編集者）におけるブラケ
ル等、「感染性因子の迅速検出と同定」、アカデミック
プレス、ニューヨーク、第235〜243頁（1985）及びリ
レイ等、ディーエヌエー（DNA）、第５巻、第333頁（19
86）に記載されるように末端デオキシヌクレオチド転移
酵素による末端付加により達成出来る。ビオチン標識は
また、光化学方法を使用してDNA中に導入されている。
例えば、ホルステル等、ヌクレイックアシッド リサー
チ（Nuc.Ac.Res.）、第13巻、第745頁（1985）参照。
幾つかの研究グループが、コレット等、ヌクレイック
アシッド リサーチ（Nuc.Ac.Res.）、第13巻、第1529
頁（1985）及びバクテル等、ヌクレイックアシッド リ
サーチ（Nuc.Ac.Res.）、第14巻、第7985頁（1986）に
おけるようにリン酸アミド化を経るか、又はリン酸ジエ
ステル結合を経るかのいずれかにより、オリゴヌクレオ
チドの５′−末端に単一ビオチンの結合方法の改良に集
中している。後者に関して、ケンペ等、ヌクレイックア
シッド リサーチ、第13巻、第45頁（1985）、アグラバ
ル等、ヌクレイックアシッドリサーチ、第14巻、第6227
頁（1986）、及びチュー等、ディーエヌエー（DNA）、
第４巻、第327頁（1985）参照のこと。これらの方法は
オリゴヌクレオチドプローブを付与するのに使用出来る
が、オリゴマー当たりたった一つのビオチンしかこれら
の方法により導入されるに過ぎない。
ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブの感度を増大
する為に、オリゴマーのハイブリッド形成が損なわれな
い方法で幾つかのビオチンを導入する努力がなされて来
た。このことは、リレイ等、上記文献、のように末端転
移酵素を使用する、又は村杉等、ディーエヌエー（DN
A）、第３巻、第269頁（1984）におけるようにクレノウ
断片を使用する酵素的方法により達成されている。ま
た、プローブの内部ヌクレオチドに結合するサイドアー
ムに多くのビオチンを導入する化学的方法も、ブリアン
等、ディーエヌエー（DNA）、第３巻、第124頁（1984）
による予告報告に記載されている。
（課題を解決するための手段） 本発明は、末端標識化、特に末端ビオチン化ヌクレオ
チドを提供するもので、このヌクレオチドは、核酸ハイ
ブリッド形成検定の成分として有用である。特に、記載
される新規化合物は、ヌクレオチド及びデオキシポリヌ
クレオチドプローブのシグナル発生アウトプットを促進
し、それによりこのようなプローブを利用する検定がよ
り敏感とされる。
従って、本発明の主とする見解は、ヌクレオチドの
５′並びに３′末端又はヌクレオチドの末端領域の各々
に直接的に又は間接的に、オリゴ−又はポリ−ヌクレオ
チドの標的にハイブリッド形成する能力を実質的に阻害
しない方法で結合する少なくとも１つのビオチン又は他
の非放射性検出部分を有するオリゴ−又はポリ−ヌクレ
オチドから成る新規化合物、及び核酸ハイブリッド形成
検定システム、並びにこの新規化合物を含みかつ使用す
る方法を提供するものである。
一つの見解において、ビオチンの少なくとも一つが、
ハイブリッド形成を妨げない連鎖群を介して結合する。
もう一つの見解において、末端ヌクレオチドの少なくと
も一つが、ポリビオチン化ポリマーに結合する。本発明
の更にもう一つの見解において、新規オリゴ−が、ピリ
ミジン環の５−位置に結合する官能基を有するヌクレオ
チドリン酸アミド化物から合成される。本発明のオリゴ
−又はポリヌクレオチドを含む核酸ハイブリッド形成検
定組成物は、更に追加的試薬を含むことが出来る。
試験が実施される試料液体は、生物学的、生理学的、
工業的、環境的、及び他のタイプの液体を含む。特に関
心のある液体は、血清、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、
乳、スープ及び他の培養液、及び上澄み並びにこれらど
れかの画分のような生物学的液体である。関心のある生
理学的液体は、浸出液溶液、緩衝液、防腐溶液又は抗菌
溶液などを含む。工業的液体は、例えば、薬品、乳製品
及び麦芽飲料の製造において使用される発酵液及び他の
加工液を含む。従来の方法により試験される試料液の他
の源は、使用されるような試料液という用語で意図され
ており、かつ本発明により検定されることが出来る。
「アナライト」という用語は、その存在が試料液中に
定量的又は定性的に決定されるべきどの物質に、又は関
連する物質のクラスに関するものである。本発明の検定
は、特定結合相手があるアナライトの検出に、かつ逆に
アナライトを結合する為のアナライト液の能力の検出に
適用出来る（普通、試料中のアナライトに対する結合相
手の存在に起因する）。アナライトは普通、特定結合相
手が存在するか、又は付与され得るオリゴ−又はポリヌ
クレオチドである。アナライトは、機能的用語におい
て、相補的核酸配列が存在するか、又は調製可能なRNA
又はDNAから普通選択される。
「アナライト−特定液」という用語は、分子の特別な
空間と極性構成、即ち、エピトープ的部位、又はたの配
列に優先する核酸配列のような特別な情報配列を認識出
来るどの化合物又は複合物にも関係する。大部分の実施
態様において、アナライト−特定液は、核酸ハイブリッ
ド形成検定プローブのような特定結合検定試薬であろ
う。特に関心のあるアナライト−特定液は、疾患起因生
物体、例えば、N.淋菌又はヒト乳頭腫ウイルスに特異な
DNAハイブリッド形成検定オリゴヌクレオチドプロー
ブ、又は遺伝的障害、例えばデイ−サックス病又は網膜
芽腫を示すポリヌクレオチド遺伝子配列を含む。
アナライト−特定部分は、直接的に又はビオチン又は
ビオチン類似体のような他の部分を伴う非干渉性連鎖群
を介して結合され得る。直接的に結合される場合、この
ような結合は、共有又は非共有のいずれかで有り得る。
結合が非干渉性連鎖群を介して結合される場合、この非
干渉性連鎖群は、このアナライト−特定部分があるアナ
ライトと結合する特徴的能力を実質的に阻害しない一つ
である。更に、このような連鎖群は、これらがエネルギ
ー放出又はこれらが結合されるある部分の他の特性を実
質的に阻害しないことを特徴とする。連鎖群は、非荷電
であり得、又は一つ又はそれ以上の荷電官能性を含み得
る。アナライト−特性部分の他の部分との結合はまた、
重合性化合物を介して達成され得る。このような化合物
は、上述の連鎖群の非干渉性特徴を、普通発揮するであ
ろう。アナライト特定部分がアナライトに結合する場合
の検出は、検出可能な分子を使用する各種の手段により
達成可能である。検出可能な分子は、酵素、蛍光色素、
色素原又は直接的にまた間接的にアナライト特定部分に
結合され得るような物などが挙げられる。例えば、アナ
ライト特定部分に結合するビオチンは、アビジン又はス
トレプタビジン及びビオチン化酵素からなる前形成の検
出可能な分子により検出され得る。検出可能な分子とア
ナライト特定部分との間に形成された反応生成物の複合
体は、検定組成物のシグナル報告部分として上述の理由
で役立つことが出来る。
（実施例） 以下の実施例により本発明を説明するが、これらは本
発明を制限する為のものでは無い。
残留ビオチンの位置と数の関数としてビオチン標識付
けオリゴマープローブの有効性を研究する為に、各種の
位置のビオチン−11−dUMPを含む一連のオリゴマーを合
成し、かつこれらと、ビオチン−11−dUTPと末端デオキ
シヌクレオチド転移酵素で酵素的に末端標識化すること
により調製したオリゴマーとの比較が、ハイブリッド化
／検出研究においてなされた。保護アリルアミノのサイ
ドアームを含むデオキシウリジンリン酸アミド化物を合
成し、かつ17−塩基オリゴヌクレオチド配列内の各種の
位置で残留アリルアミノを有するオリゴヌクレオチドを
調製するのに使用した。続いて、ビオチン置換物を、Ｎ
−ビオチンニル−６−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステルと反応させることによりアリ
ルアミノ サイドアームに結合させた。これらのオリゴ
マーは、ミクロタイターウエル（エリザ プレート）上
に固定された標的DNAに対合させ、かつ基質として過酸
化水素を、色素原としてｏ−フェニレンジアミンを使用
するストレプタビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体により検出された。この定量的の比色的
なハイブリッド形成／検出方法を使用して、ハイブリッ
ド形成配列の近く又は末端におけるオリゴヌクレオチド
含有ビオチン標識が、オリゴマー含有内部的ビオチン標
識よりもより効果的なプローブであることを見いだし
た。ビオチン−dUMP残留の数を増加する追加的効果が、
幾つかの標識付け配置において見いだされた。下記実施
例は、実験を詳しく説明すると共に、その結果を報告し
ている。
別に述べない限り、化学的試薬はアルドリッヒ社から
購入され、更に精製することなく使用した。薄層クロマ
トグラフィーは、シリカゲル60F254プレート（メルク）
を使用して実施され、かつシリカフラッシュカラムクロ
マトグラフィーは、シリカゲル品質60（メルク）を使用
して実施された。塩化メチレンは、無水炭酸カリウム添
加して蒸留することにより乾燥し、N,N−ジイソプロピ
ルエチルアミンは蒸留により精製した。Ｎ−ビオチニル
−６−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸エス
テル（エンゾチン、登録商標名）は、エンゾ ビオケム
社により供給された。1Hnmrスペクトルは、ニコレットQ
E300装置で実施され、かつ31Pスペクトルは、JEOL GX−
400分光計で実施された。
デテク（登録商標名）１−hrp、末端デオキシヌクレ
オチド転移酵素、及びビオチン−11−dUTPは、エンゾ
ビオケム社から入手された。ｏ−フェニレンジアミン
ジヒドロクロライド（OPD）、ウシ血清アルブミン（30
％無菌溶液）、H2O2、トリトンＸ−100は、シグマ社か
ら購入された。イムロン（登録商標名）２マイクロタイ
ター［エリザ（ELISA）］プレートは、ダイナテク社か
ら購入された。硫酸デキストランは、ファルマシア社か
ら、及びホルムアミドはフルカ社から購入された。１本
鎖バクテリオファージ標的DNAは、M13mp18バクテリオフ
ァージの組換え体（大腸菌R I部位の無関係2.5キロ塩基
挿入断片を含む組換えDNA）により感染された大腸菌JM1
03上澄みから標準的方法により調製され、この方法は、
マニアチス等、「分子クローニング、実験室便覧」（19
82）、及びカドンガ等、ヌクレオイックアシッド リサ
ーチ（Nuc.Ac.Res.）、第13巻、第1733〜1745頁（198
5）を参照のこと。対照の１本鎖標的DNAは、野生型（無
ラック配列又はポリリンカー配列）M13−感染細胞上澄
みから調製された。
下記ハイブリッド形成／検出検定の各種段階で使用し
た緩衝液は、１）SSC:20X SSCは3M NaCl、0.3Mクエン酸
ナトリウムであり;2）SSPE:20X SSPEは3.6M NaCl、0.2M
リン酸ナトリウムpH7.4、及び0.02Mエチレンジアミン四
酢酸（EDTA）であり;3）クエン酸塩リン酸塩緩衝液、pH
6.0:0.05M pH6.0に調節されたクエン酸と0.1M Na2HPO4;
及び４）PBS:10XPBSは1.5M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液pH7.2±0.2である。
ビオチン化ヌクレオチドの合成 ｉ）保護アリルアミノ−デオキシウリジン リン酸アミ
ド化物 トリフルオロアセチルアリルアミド（２）． トリフルオロ無水酢酸（56ml,397mモル）を1.5時間を
要して０℃のアリルアミン溶液（40.5g,60ml,800mモ
ル）中に撹拌しながら滴下する。生成赤色溶液を一晩室
温で保存し、次いで酢酸エチルと炭酸水素ナトリウム水
溶液（各々500ml）の間に分配させる。酢酸エチル層を
炭酸水素ナトリウム溶液（２×500ml）と水（２×500m
l）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で一晩乾燥
する。濾過後、溶液を蒸発乾固し、真空で蒸留する。再
蒸留により無色油としての化合物２（第１図）を得る。
収量:45.2g（37％）、沸点109℃/10cm、nmr（CDC13）d
6.58,br s,1NH,5.86,m,1,CH,5.3,m,2,CH2,4.0,t,2,CH
2N。
C2H6F3NOに対する元素分析 計算値:C39.22,H3.95,F37.23,N9.15 測定値:C39.00,H4.18,F37.50,N8.91 ５（３−トリフルオロアセチルアミノブロペニル）−
２′−デオキシウリジン（３） ５−塩化水銀−２′−デオキシウリジン（１）（12.6
g,27.2mモル）の酢酸ナトリウム緩衝液（0.1N,pH5）中
の分散物を、トリフルオロアセチルアリルアミド（２）
（26g,175mモル）と処理し、次いでカリウムテトラクロ
ロパラデート（8.98g,27.5mモル）の水（100ml）溶液に
より処理する。混合液を18時間室温で撹拌し、次いでセ
ライトを介して濾過して水銀とパラジウムの黒色沈澱を
除去する。濾液を撹拌下に水素化ホウ素ナトリウム（３
×100mg）で処理し、次いで再びセライトを介して濾過
する。濾液を約300mlまで蒸発させ、次いで酢酸エチル
（６×200ml）で抽出する。一緒にした酢酸エチル層を
蒸発乾固し、これを２つの部分に分ける。各々の部分を
溶剤として酢酸エチルを使用してシリカゲル（250g）上
フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、各
々のカラムからの画分95〜180（20ml画分）を組み合わ
せ、これを蒸発乾固して白色結晶塊としての化合物
（３）を得る,3.8g（37％）。試料を酢酸エチル／ヘキ
サンから再結晶化して白色結晶としての分析的に純粋な
化合物３を得る，融点184〜185℃,nmr（Me2SO−d6）d1
1.5,s,1,NH;9.7,t,1,NH;8.1,s,1,C6H;6.4,m,1,CH＝;6.
2,m,2,C１′H,CH＝;5.3,d,1,C３′OH;5.1,t,1,C５′OH;
4.3,m,1,CH;3.8〜3.9,m,3,CH,CH2N;3.6,m,2,CH2;2.1,m,
2,C２′Ｈ、uv（H2O）max241nm,e7980;294nm,e6830。
５′−ジメトキシトリチル−５（３−トリフルオロアセ
チルアミノプロペニル）−２′−デオキシウリジン
（４） 無水ピリジン（5ml）中の化合物３の溶液（570mg,1.5
2mモル）を室温で一晩4,4′−ジメトキシトリチルクロ
ライド（617mg,1.82mモル）で処理した。薄層クロマト
グラフィー（TLC;シリカ，塩化メチレン：メタノール,1
0:1）は、出発原料がまだ存在することを示したので、
ジメトキシトリチルクロライド（254mg）を追加して添
加し、次いで溶液を３時間室温で保持した。メタノール
（1ml）を添加し、次いで溶液を蒸発乾固し、真空中で
一晩保持した。黄色泡が塩化メチルンと水（各々70ml）
の間に分配され、塩化メチレン層を水（２×70ml）で洗
浄し、次いで硫酸ナトリウム上で一晩乾燥した。溶液を
濾過し、濾液を蒸発乾固し、溶剤として塩化メチレン：
メタノール（25:1）を使用してシリカ（150g）上でフラ
ッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
チューブ34−50（20ml画分）は、TLC純粋原料を含
む、かつ組み合わされ、かつ蒸発乾固された。残留物を
乾燥ベンゼン（２×5ml）で共蒸発させ、一晩真空中で
乾燥して白色非晶質固体としての化合物４（第１図）を
593mg（57％）得た。nmr（CDCL3）d7.90,s,1,C6H;7.3−
7.5,m,9,芳香族;6.89,d,4,芳香族;6.44,m,2,C１′H,CH
＝;5.32,d,2,CH＝;4.65,s,1,CH;4.14,s,2,CH2N;3.83,s,
6,OCH3;3.7,m,1,CH;3.54,m,2,C５′H;2.42,m,2,CH2。
５′−ジメトキシトリチル−５（３−トリフルオロアセ
チルアミノプロペニル）−２′−デオキシウリジン−
３′−N,N−ジ−イソプロピル−メトキシ−ホスホール
アミダイト（５） 隔膜密封フラスコ中の乾燥塩化メチレン（4ml）の化
合物４の溶液（340mg,0.5mモル）を、N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン（0.286ml,1.5mモル）で処理し、次い
でクロロ−N,N−ジイソプロピルエチルアミノメトキシ
フォスフィン（0.145ml,0.75mモル）により処理し、両
方の試薬は注射器を介して添加した。溶液を20分間室温
で保持し、次いで水と酢酸エチル（各々25ml）の間で分
配した。酢酸エチル層を炭酸水素ナトリウム水溶液（１
×25ml）、水（１×25ml）で洗浄し、次いで一晩無水硫
酸マグネシウム上で乾燥した。固体を濾別し、濾液を蒸
発乾固し、乾燥ベンゼン（２×5ml）で共蒸発させ、次
いで一晩真空で乾燥した。残留物を乾燥ベンゼン（2.5m
l）に溶解し、溶液を激しく撹拌される０℃の乾燥ヘキ
サンの溶液へ添加することにより沈澱させた。沈澱物を
濾過により集め、冷ヘキサン（６×20ml）で洗浄し、一
晩真空中で乾燥して白色非晶質固体としての化合物５を
311mg（74％）得た。31Pnmr（CDCl3）d149.44,148.91,
不純物d8.37.tlc（CH2Cl2/MeOH,20:1）Rf0.4,不純物Rf
0.2。
ii）オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドを、メチルホスホールアミダイト
と製造会社により供給される試薬を使用してアプライド
バイオシステム社の装置、モデル380Bに基づくホスホ
ールアミダイト方法により合成した。0.2μモルと１μ
モルの両方の合成サイクルを使用した。修飾ホスホール
アミダイト（化合物５）を乾燥アセトニトリルに溶解
し、次いでガラス綿プラーグを介して濾過して直ぐ後で
前記装置に負荷した。ホスホールアミダイト添加をトリ
チル陽イオンの放出により監視し、かつ修飾化合物５は
未修飾ホスホールアミダイト中と同じ程度に混合され
た。ここに報告されるように合成されたオリゴヌクレオ
チドのヌクレオチド配列は、下記実施例1,第１表に説明
される。合成の完成後、オリゴマーを一晩55℃でアンモ
ニアで処理することにより脱保護化し、これは尚トリフ
ルオロアセチル基を開裂して、選択される位置にアリル
アミノ サイド アームを有するオリゴヌクレオチドを
生成するのに役立った。
iii）オリゴヌクレオチドのビオチン化 上述のようにして調製した粗製オリゴヌクレオチド
を、溶出緩衝液として20mM炭酸水素トリエチルアンモニ
ウムpH7（TEAB）を使用してセファデックスG25カラム
（１×16cm）を介して通すことにより最初に精製した。
画分４−６（1ml画分）を集め、蒸発乾固し、水に溶解
し、次いでuv分光学により検定した。精製オリゴヌクレ
オチドの各々の水（100μｌ）中のアリコート（20OD260
ユニット）を、0.1mホウ酸ナトリウムと組み合わさせ、
次いでジメチルスルホキサイドを添加した。得られた溶
液を、ジメチルスルホキサイド（125μｌ）中のＮ−ビ
オチニル−６−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸エステル（5mg）の新たに調製した溶液と組み合わ
せ、次いで得られた反応混合物を一晩室温で温置した。
次いで、得られた反応混合物を２部分に分け、各々を20
mMTEABで平衡されたセファデックスG25カラム（１×16c
m）を通して精製した。各々のオリゴヌクレオチドに関
して、平行して通した２つのカラムの各々からの画分４
−６（1ml画分）を混合し、次いで蒸発して粗製ビオチ
ン化オリゴマーを得、次いでこれを下記のゲル電気泳動
により精製した。
iv）ゲル電気泳動によるビオチン化オリゴマーの精製 上述のようにして調製したビオチン化オリゴマーを、
更に0.4mm厚さのゲル上で20％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（アクリルアミド：ビスアクリルアミド,40:1
及び7M尿素を含有）により精製した。次いで、各々のビ
オチン化オリゴヌクレオチドの20OD260ユニットを、0.0
9Mトリスベース、0.09Mホウ酸、0.25M EDTA（1X TB
A）、40％ホルムアミド及び0.25％ブロムフェノールブ
ルーを含む溶液100μｌに溶解した。各々のオリゴヌク
レオチド溶液を20個の8mmウエルに塗布し、３−４時間1
X TBE緩衝液において30ミリアンペアで電気泳動した。
バンドを、背景としてシリカゲルオ60F254（メルク）の
シートを使用して短波uvランプで可視化した。最もゆっ
くりと移動した生成物のバンドを切り取り、次いで60℃
で18時間100mMトリスベース、0.5M NaCl、5mM EDTA、pH
8に浸漬した。この溶液をデカントし、セップ−プァッ
ク（Sep−Pak）カートリッジ（ミリポール）を使用して
脱塩した。溶液をカートリッジに入れ、水（20ml）で洗
浄して塩類を除去し、次いでオリゴマーをメタノール／
水1:1（3ml）で溶出した。蒸発乾固した後、残留物を、
溶出緩衝液として20mM TEABを使用してセファデックスG
25カラムにかけた。オリゴヌクレオチドを含む画分を混
合して、蒸発乾固し、次いで水（1ml）に溶解して下記
ハイブリッド形成実験に使用するのに適した原料溶液を
得た。
ｖ）末端ビオチン−標識化オリゴマープローブの調製 この研究の為に調製した未修飾オリゴマーを、ヌクレ
オチドのオリゴマーに対する比が5:1〜50:1に変化する
濃度で、0.2Mカコジル酸カリウム緩衝液pH7.2、1mM CoC
l2、末端転移酵素（オリゴマー20ユニット／μｇ）、オ
リゴマー（20μg/mlにて）及びビオチン−11−dUPTを含
む反応物において、末端デオキシヌクレオチド転移酵素
を使用して末端標識化した。幾つかの場合において、3H
−TTPを添加してビオチン−11−dUPTの組み込みを監視
した、キングスバリ,D.T.及びファルコウ,S.（編集）に
おけるブラッケル等、「感染性因子の検出と同定」アカ
デミック プレス社出版、ニューヨーク、第235−243頁
（1985）。たの場合において、末端添加におけるビオチ
ン−11−dUPTを分離し、又は交互にする為に反応物にTT
Pを添加した。反応を37℃で90分間継続させ、次いで25m
Mの濃度までEDTAを添加することにより停止させた。末
端標識化オリゴマーを、更に精製すること無く、下記報
告のハイブリッド形成／検出実験に使用した。
ハイブリッド形成／検出の検定方法 イムロン（登録商標名）２マイクロタイタープレート
に標的核酸の固定を、永田等、エフイービーエス レタ
ーズ（FEBS Letters）、第183巻、第379−382頁（198
5）に記載の方法の改良により達成した。使用した方法
は次の通りである。プレートを先ず1M酢酸アンモニウム
で洗浄し、次いで標的DNAを1M酢酸アンモニウム50μｌ
量に適当濃度でウエルに添加した。１本鎖標的DNAを1M
酢酸アンモニウムに希釈する以外は予備処理すること無
くウエルに負荷した。負荷されたウエルをプレートに標
的DNAを固定する為に37℃で1.5−２時間温置させた。プ
レートを調製後直ぐに使用するか、又はハイブリッド形
成実験に使用する前に４℃で保持した。ハイブリッド形
成直前に、プレートを２回2X SSCで洗浄し、次いで１回
１％（v/v）トリトンＸ−100を含む2X SSCで洗浄した。
ハイブリッド形成を、30％（v/v）ホルムアミド、2X
又は4X SSPE、１％（v/v）トリトンＸ−100、５％（W/
v）硫酸デキストラン、及びプローブDNAを含む溶液100
μｌを使用して室温で実施した。オリゴヌクレオチドプ
ローブを、最終濃度100ng/mlで使用した。ハイブリッド
形成を30〜90分間継続させた。
ハイブリッド形成の温置の後、プレートを逆さにし、
かつ普通は0.1％トリトンＸ−100を含む0.2X SSCで洗浄
することにより空にした。洗浄はプレートのウエルを20
0μｌの溶液で満たし、次いで５−10秒間（若し数個の
プレートを一度に行うならば、１〜２分間までのより長
い時間）静かに振とうすることから成った。幾つかの場
合において、洗浄は、37−42℃まで加熱された緩衝液で
実施して、ハイブリッド融解実験を実施する為に充分な
緊縮の条件を付与した。４〜５回の洗浄に続いて、ハイ
ブリッド形成したプローブ中のビオチンを次のようにし
て検出した。
ハイブリッド形成し、かつビオチン化したプローブDN
Aを、ストレプタビンのデテック（Detek登録商標名）−
hrp複合体とビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼを
使用することにより、次のようにして検出した。複合体
を、1X PBS,0.5M NaCl,0.1％BSA,0.1％トリトンＸ−10
0,5mM EDTA（複合体希釈緩衝液）中に希釈し、次いでプ
レートのウエルに添加した（ウエル当たり50μｌ）。複
合体を、別に記載しない限り、室温で30分間ウエル中で
温置した。次いでプレートを、複合体希釈緩衝液で２
回、次いで5mM EDTAを含む1X PBSで３回洗浄した。結合
した検出複合体中の西洋ワサビペルオキシダーゼを、ク
エン酸／リン酸塩緩衝液,pH6.0中のH2O2（0.0125％）と
OPD（1.6mg/ml）を含む反応混合物（ウエル当たり150μ
ｌ）と暗所にて反応させた（実温で20−30分間）。発色
を4N H2SO4（ウエル当たり50μｌ）添加することにより
停止させた。光学密度測定（490nmにて）を、インター
ラブ マイクロプレート リーダー モデルNJ2000を使
用して反応停止５〜10分間の内にした。DNA固定方法の
間にただ1Mの酢酸アンモニウムしか受け入れなかった
が、しかしプローブ、検出複合体、及びペルオキシダー
ゼ反応混合物にさらされたウエルを、吸光度読みの為の
ゼロ（空）対照として使用した。総てのハイブリッド形
成を、各種測定の為に二重〜四重にて実施した。非相補
的標的DNA（野生型バクテリオファージDNA）を含むウエ
ル中のハイブリッド形成からの吸光度読みは、0.010〜
0.050に亙り、かつ相補的標的DNAの為のハイブリッド形
成に対し報告される吸光度読みから差し引かれた。これ
らの方法の変動における変化は、適用出来る限りの下記
報告される個々の実験に記載されている。
実施例１ バクテリオファージM13mp系列DNAの塩基6204〜6220
（大腸菌ラック遺伝子の部分）に相補的なヘプタデカヌ
クレオチド（17塩基）配列を、修飾の為に選択した。こ
の配列とハイブリッド形成／検出実験の結果により、こ
れに沿って合成された各種ビオチン−標識したオリゴヌ
クレオチドを次の第１表に示す。
前記オリゴヌクレオチド合成方法により、単一ビオチ
ン置換が内部の部位（オリゴマー６と７）、及び３′−
末端（オリゴマー８）近くに導入された。５′−末端に
単一ビオチン化ヌクレオチドの付加を有する塩基配列を
含むオクタデカmerも合成された（オリゴマー９）。こ
のオリゴマーの５′−末端塩基は、非相補性の為に標的
M13DNAへ対合させることが出来ず、従って小さな尾とし
て作用する。配列当たり２つのビオチンを含む10のよう
なオリゴマーもまた合成され、これは内部部位に２つの
ビオチンを含有し、及び11のようなオリゴマーも合成さ
れ、これは末端近くの一つのビオチンと内部部位の一つ
のビオチンを含むものである。オリゴマー12は分子の末
端近くのビオチンを有し、オリゴマー13は、塩基配列が
３′−末端に３つのヌクレオチド（２つのビオチン化残
基と一つの末端チミジン残基）の付加により引き伸ばさ
れたドデカmerである。合成のポリマー−担持方法は、
固体担体に既に結合している望みの配列の３′−末端塩
基を必要とする為に、かつ固体担体に結合する修飾され
たトリフルオロアセチルアミノプロペニルヌクレオチド
が利用出来ない為に、３′−末端位置のチミジン残基が
使用された。３つのビオチン基を含む一つのオリゴマー
（オリゴマー14）も合成された。最後に、未修飾オリゴ
マーを合成し、かつ末端デオキシヌクレオチド転移酵素
を使用してビオチン−11−dUTPの末端付加により標識化
してオリゴマー15を得、これは分子当たり３〜４ビオチ
ン−dUMP残基を含んでいた（オリゴマー当たり3.3ヌク
レオチドの計算標識）。
この研究に使用された検定方法は膜結合標的DNAに対
して標識化オリゴマーのハイブリッド形成に使用された
ものと実質的に異なった為に、ハイブリッド形成−検出
曲線の傾斜における相違の幾つかは、ハイブリッドの安
定性における相違に基づいたに違いなく、かつ検出に対
するビオチン標識のアクセシビリティーの相違に基づく
ものでないだろう。この可能性を削除する為に、ワラス
等、ヌクレイック アシド リサーチズ（Nucleic Acid
s Res.）第６巻、第3543−3557頁（1979）に示されるよ
うな標準膜結合標的DNA技術を、ポリヌクレオチドキナ
ーゼと32P−ATPで32P標識化の後、幾つかのオリゴマー
のハイブリッド形成感度を評価する為に、本発明者等は
最初使用した。オリゴマー6,7,10，12，及び14（第１
表）を標識化し、次いでハイブリッド形成してニトロセ
ルロースフィルターに固定したM13mp18（１本鎖）DNAの
量を削減した。適度の緊縮合の条件下に、放射標識化オ
リゴマーを、膜結合標的DNAに対し等しい感度でハイブ
リッド化された。これらの結果は、検出が放射能に基づ
く場合、ビオチン標識はオリゴマーのハイブリッド形成
感度に作用しないことを示した。
マイクロタイタープレートハイブリッド形成方法をビ
オチン化DNAプローブと使用することが出来る。オリゴ
マープローブと使用する方法は上述の通りであった。得
られたハイブリッド形成／検出の結果を各種オリゴマー
プローブと比較する為に、標準ハイブリッド形成感度の
実験を実施し、この実験において、異なる量のDNA標的
を各々のウエルに付与した。各々のオリゴマープローブ
の試料をハイブリッド形成させて標的DNAの量を削減し
た。ストレプタビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキ
シダーゼでハイブリッド形成ビオチン標識したオリゴマ
ーの検出に続いて、標的DNAのngに対する490nmにおける
吸光度の曲線の傾斜を直線回帰によって計算した。オリ
ゴマー８，９，10及び12によるこのような標準ハイブリ
ッド形成感度の実験の結果を第２図に示す。
この研究の為に調製した総てのオリゴマーは、標的DN
Aの量に直接的に比例するシグナルを発生した。曲線の
相関係数は0.995〜0.999の範囲にあった。各種オリゴマ
ーによるハイブリッド形成／検出の結果は、直線回帰に
より決定した曲線の傾斜においてのみ相互に異なった。
化学的合成オリゴマー類と一つの酵素的標識化オリゴ
マーに対するハイブリッド形成／検出感度の実験の結果
を前記第１表に総括した。ハイブリッド形成検出曲線の
傾斜をオリゴマー９で得られた曲線の傾斜に対して標準
化した（オリゴマー９に対する実際の傾斜は、各種決定
において0.005−0.010A490ユニット／標的バクテリオフ
ァージDNAのngの範囲にあった）。示される値は、各々
のオリゴマーに対する少なくとも３つの決定において得
られた値の平均である。単一ビオチン−修飾ヌクレオチ
ド（6,7,８及び９）を含むオリゴマーの比較は、ビオチ
ン−標識したヌクレオチドがオリゴマープローブのハイ
ブリッド形成領域の中心から分子の末端近くへ移動され
るに従って、シグナル強度（標的DNAのA490/ng）が増加
することを示した。オリゴマー６（分子の中心のビオチ
ン）とオリゴマー８（ハイブリッド形成配列の次席ヌク
レオチドに位置するビオチン）の間で６倍の差異があっ
た。
この傾向は２つのビオチン−修飾ヌクレオチド（10,1
1,12及び13）を含むオリゴマー類に対しても観察され
た。最も弱いシグナルは２つの内部ビオチン（オリゴマ
ー10を含むオリゴマーにより発生され、かつ最も強いシ
グナルは３′−と５′−次席ヌクレオチド（オリゴマー
12）上のビオチンを含むオリゴマーにより発生さりた。
オリゴマー12中の２つのビオチン−dUMP分子からのシグ
ナルは、オリゴマー８中のシグナルビオチン−dUMPの約
２倍であり（各々、1.25と0.68の相対シグナル）、この
ことは、ハイブリッド形成領域の末端近くに位置するビ
オチン分子は追加シグナルを生成することを立証した。
第三の中心に位置するビオチン−dUMP（オリゴマー14）
の付加は、シグナル強さを増加しないばかりか、オリゴ
マーにより発生されるシグナルは、二重−標識したオリ
ゴマー１により発生されるシグナルと同じか又は平均し
て僅かに小さかった。
実施例２ ここに記載される実験は、ハイブリッド形成に続いく
洗浄の緊縮がハイブリッド形成／検出の結果に作用する
かどうか決定する為に実施された。ハイブリッド形成の
洗浄の緊縮の増加の効果は、オリゴマー９，12，及び14
に対する第３図に示され、ハイブリッド安定性実験の結
果を総ての化学的合成オリゴマーに対して第２表に総括
している。
これらの結果は、総てのプローブ：標的DNAハイブリ
ッドが37−42℃で0.1X SSCにおける洗浄に対して安定で
あった（90−100％の最大シグナル）が、しかし条件を
変えた時に、明らかに異なる安定性を有することを示し
ている。最も小さな安定性は、オリゴマーのハイブリッ
ド形成配列が内部でかつ比較的に近く隔たるビオチンを
含むものであった。最も小さなハイブリッドを形成する
オリゴマーは、オリゴマー14であり、一方、最も安定で
優れたハイブリッドは、オリゴマー８と９により形成さ
れた。従って、３′及び／又は５′末端のビオチン置換
ヌクレオチドを含むオリゴマーは、内部置換のものに比
較して優れた安定性を有することが見いだされた。
実施例３ ビオチン−11−dUPTの酵素的末端付加により調製され
たオリゴマー（オリゴマー15）は、最も強いシグナルを
発生する故に、尾の長さの効果、ビオチンの数、及び酵
素的−標識したオリゴマーの他の調製を使用するハイブ
リッド形成／検出上に対するビオチン間隔を検討するこ
とを決めた。その結果を第３表に示す。
末端延長部を有するオリゴマーを、化学的に又は末端
転移酵素でビオチン−11−dUTPの付加により調製した。
オリゴマーＡ−Ｅは、反応混合物中のビオチン−11−dU
TPのみで調製され、Ｆ−Ｉは、ビオチン−11−dUTPとTT
Pの異なる混合物で調製された。ビオチン−11−dUTPのT
TPに対する比は、角括弧中の値で示されている。末端付
加の長さは、3H−TPP組込みを測定することにより決定
し、付加当たりのビオチン−dUMP分子の数は計算され
た。オリゴマーをハイブリッド形成され、前記の通りに
検出複合体と30分間又は３時間の温置に続いて検出され
た。結果は計算され、かつ各々の検出複合体温置時間に
対してオリゴマー９に対する結果へ標準化された。
ビオチン−11−dUTPのみで（調製Ａ−Ｅ）、異なる程
度で標識したオリゴマーで標準検定（検出複合体と30分
間温置、第３表）にて得られた結果は、プローブのシグ
ナル強さは末端付加中のビオチン−11−dUTP残基の数に
直接に関係することを示した。シグナル強さは、この標
識方法により生成した末端付加の範囲に亙り増大し、し
かし各々の付加ビオチン−11−dUTP残基の効果は、ビオ
チン−dUMP残基の数が約４−８から12と17へ増大するに
従って減少した。ビオチン値当たりのシグナルは、９,1
3,A及びＢ（＝15）に対するユニットの近くから調製Ｄ
とＥに対する0.6と0.4の値まで、夫々減少した。末端転
移酵素反応（調製Ｆ−1,30分間温置、第３表）における
ビオチン−11−dUTPのTTPに対する異なる比で標識され
たオリゴマーを比較する場合に、ビオチン値当たりのシ
グナルにおける同じ傾向が観察された。ビオチン−dUMP
残基の数が増大するにつれ、シグナル強さは増大する
が、しかしビオチン値当たりのシグナルは減少した。本
発明者等は、末端標識調製のシグナル強さの増大は、一
部は検出複合体の結合の速度論の関数であると予期した
ので、発明者等は、これらの結果を検出複合体と延長さ
れた（３時間）温置の後に得られたものと比較した。検
出複合体が３時間結合された場合、調製ＥとＦは、８−
8.7倍大きいよりは、オリゴマー９のシグナルより3.6−
3.7倍の大きさに過ぎないシグナル（傾斜）しか発生せ
ず、このことは、平衡において、オリゴマー９の単一ビ
オチン−dUMP残基に結合するよりも、これらの末端標識
したオリゴマーに利用出来る17−18ビオチン−dUMP残基
に、３−４倍多くの検出複合体が結合することを暗示し
た。これらの速度論的研究の驚くべき結果は、TTPと共
標識した幾つかの調製（ＨとＩ）により発生されるシグ
ナルは、オリゴマー９に関して削減され、オリゴマー９
のシグナルの夫々３と3.4倍であるよりもむしろ、夫々
1.2と0.95倍に過ぎない。これらの結果は、ビオチン残
基の利用性は、第一ビオチンdUMPよりむしろ第一TMPを
含む末端延長部において時間がたつにつれ減少すること
を暗示している。
ビオチン標識の導入に対する最も有効な部位は、ハイ
ブリッド形成配列の外側、即ち、５′又は３′末端のい
ずれかから延在する「尾」である。化学的に合成したオ
リゴヌクレオチドプローブが、末端転移酵素で末端標識
により調製されたプローブ（2,3）と比較され、これら
の比較の結果は、外部ビオチンdUMP残基が最も検出可能
出ある結論を立証した。尾付加のオリゴマーの間の幾ら
かのシグナル相違が、検出複合体の結合の好ましい速度
論から結果することが示されたが、この相違は、検出複
合体の結合を平衡に近ずけることにより、全く除去され
た。検出複合体の結合が平衡に近ずくにつれ、末端延長
部のビオチン−dUMP残基は、内部ビオチン−dUMP残基以
上にシグナル発生した。それにもかかわらず、末端標識
したオリゴヌクレオチドは１〜３のビオチン−dUMPで内
部標識したものよりも更により敏感なプローブであっ
た。
TTPで共標識することにより末端ビオチン−dUMP残基
を分離する試みは、より好ましい標識配置を生成しない
ようであった。これらの末端延長部の構造を更に折り畳
んで、かつビオチン残基を単独に又は最初に含む末端延
長部においてより利用出来るようにすることは可能であ
る。この研究における酵素的に標識したオリゴマーは、
最も強いシグナルを生成したが、最近本発明者等は、前
記方法により３′−又は５′−末端の多重、合成的標識
は、酵素的標識を二重にすることが出来ることを見いだ
した。従って、オリゴヌクレオチドの３′と５′末端の
両方における多重標識は、３′と５′末端において単一
シグナルで標識したものよりより敏感な合成プローブを
生成する。
実施例４ デキストランのような重合性化合物を、先ずポリビオ
チン化し、次いで非干渉性連鎖群として使用した。この
ような化合物は、アビジン又はストレプタビジンを介し
てハイブリッド形成されたプローブへ結合される。次い
で、シグナル発生が、デテク（登録商標名）１−hrpシ
グナル発生システムの付加により齎らされる。このシス
テムは、ビオチン化プローブへ直接に適用したデテク１
−hrpシグナル発生システムによる直接検出に比較し
て、得られたシグナルを10〜100倍増幅する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ビオチン化ヌクレオチド合成の項に記載され
る５′−ジメトキシトリチル−５（３−トリフルオロア
セチルアミノプロペニル）−２′−デオキシウリジン−
３′−N,N−ジイソプロピルメトキシホスホールアミダ
イト（化合物５）の合成を説明するフローチャートであ
り、第２図は、ヌクレオチド配列中の各種位置における
ビオチンにより、標識したオリゴマーを有するマイクロ
タイタープレート中においてハイブリッド形成−検出し
た後に得られるシグナルオウトプットを示し、その結果
をオリゴマー12（●）、９（○）、８（■）、及び10
（□）で示され、第３図は、各種濃度のSSCで洗浄する
ことに対するビオチン化オリゴマー−標的DNAハイブリ
ッドの安定性を表し、その結果をオリゴマー９（●）、
12（○）、及び14（■）で示される。
フロントページの続き (72)発明者 アラン エフ クック アメリカ合衆国、ニュー ジャーシー州 07009、シーダー グローブ、ヒルク レスト ロード 19番 (72)発明者 エドモンド ブォコロ アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10473、ブロンクス、シュワード アベ ニュー 2249番 (56)参考文献 特開 昭63−8396（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヌクレオチドの５′および３′末端の各々
    に（ａ）直接的に又は（ｂ）間接的に結合した少なくと
    も１つのビオチンを有するオリゴ−又はポリ−ヌクレオ
    チドであって、（ｂ）の場合は結合は末端ヌクレオチド
    のリン酸基を介して行われ、結合基のいずれも単一のリ
    ジン残基又はポリリジンではない、オリゴ−又はポリ−
    ヌクレオチド。
  2. 【請求項２】少なくとも２つのビオチンがヌクレオチド
    の少なくとも１つの末端に結合したことを特徴とする請
    求項１記載のオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド。
  3. 【請求項３】少なくとも２つのビオチンがヌクレオチド
    の５′および３′末端に結合したことを特徴とする請求
    項２記載のオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド。
  4. 【請求項４】前記ビオチンの少なくとも１つが非干渉性
    連鎖群を介してヌクレオチド末端に結合したことを特徴
    とする請求項１記載のオリゴ−又はポリ−ヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】前記ビオチンの少なくとも１つがビオチン
    −11−dUMPから成ることを特徴とする請求項４記載のオ
    リゴ−又はポリ−ヌクレオチド。
  6. 【請求項６】前記ビオチンの少なくとも１つがポリビオ
    チン化ポリマーから成ることを特徴とする請求項１記載
    のオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド。
  7. 【請求項７】前記ポリビオチン化ポリマーがポリビオチ
    ン化デキストランである請求項６記載のオリゴ−又はポ
    リ−ヌクレオチド。
  8. 【請求項８】標的ハイブリッド形成領域及びヌクレオチ
    ドの５′および３′末端の各々に（ａ）直接的に又は
    （ｂ）間接的に結合した少なくとも１つのビオチン又は
    他の非放射性検出部分を有するオリゴ−又はポリ−ヌク
    レオチドであって、（ｂ）の場合は結合は末端ヌクレオ
    チドのリン酸基を介して行われ、結合基のいずれも単一
    のリジン残基又はポリリジンではない、オリゴ−又はポ
    リ−ヌクレオチド。
  9. 【請求項９】請求項１ないし７のいずれか１項に記載の
    オリゴ−又はポリ−ヌクレオチドと、前形成アビジン又
    はストレプトアビジン検出可能な分子複合体とから成
    る、核酸ハイブリッド形成検定組成物。
  10. 【請求項１０】前記の検出可能な分子が蛍光体、色素原
    又は酵素である請求項９記載の組成物。
  11. 【請求項１１】酵素がペルオキシダーゼ、アルカリ性ホ
    スファターゼ、酸性ホスファターゼ及びβ−ガラクトシ
    ダーゼから選択される請求項10記載の組成物。
JP01044981A 1988-02-26 1989-02-25 末端標識したヌクレオチドプローブ Expired - Lifetime JP3083297B2 (ja)

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