JPH05123198A - １本鎖核酸プローブ、並びにそれを用いる２本鎖核酸の検出及び単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 試料核酸中の２本鎖核酸と特異的にハイブリ
ダイズ可能な配列を含む１本鎖核酸断片に、ハイブリダ
イズ時又はハイブリダイズ後に該２本鎖核酸と共有結合
し得る物質と標識物質とを導入してなる１本鎖核酸プロ
ーブ、並びにそれを用いる２本鎖核酸の検出及び単離方
法。 【効果】 合成容易でいかなる核酸にも適用可能な１本
鎖核酸プローブを用い、試料核酸の変性操作を行うこと
なく、目的核酸を２本鎖のまま、検出及び単離できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、１本鎖核酸プローブ、
並びにそれを用いる２本鎖核酸の検出及び単離方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】分子生
物学や遺伝子工学の急速な発展に伴い、特定の遺伝子を
検出することは現在極めて重要なこととなっている。例
えば、細菌・ウイルスなどの病原体の検出、癌の分子レ
ベルでの診断、遺伝病の出生前診断、ＨＬＡのタイピン
グ、あるいは親子鑑定などに遺伝子検出法を適用するこ
とは医学上重大な意義がある。また、これら医学分野の
みならず、農業、水産業、食品製造業分野への応用も非
常に期待されている。この様な遺伝子検出を行うには、
主に核酸ハイブリダイゼーション技術が使われる。この
技術は、相補的な核酸が互いに水素結合により結合して
２本鎖になるという性質に基づくものである。この技術
によれば、図１−Ａに示すように通常２本鎖の試料核酸
（１）を加熱又はアルカリ処理して変性（ｄｅｎａｔｕ
ｒｅ）（２）させ、１本鎖に解離させたものに、検出し
ようとする配列と相補的な塩基配列を持ち、しかも放射
性又は非放射性の標識物質で標識したポリヌクレオチド
鎖すなわち核酸プローブ（３）を結合（ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ）（４）させ、目的とする核酸を検出す
る。この場合、一般的には試料核酸を担体に固定するド
ット・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハ
イブリダイゼーション法などが行われる（Ｓ．Ｊ．Ｈｉ
ｇｇｉｎｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５年））。

【０００３】しかしながら、これらの方法は煩雑で手間
がかかる上にハイブリダイゼーションの速度が遅かった
り、担体に固定された試料核酸の一部しかハイブリダイ
ゼーションに利用されないなどの問題がある。これらの
問題を解決するためにサンドイッチ型の溶液ハイブリダ
イゼーションが工夫されている（Ｄ．Ｖ．Ｍｏｒｒｉｓ
ｓｃｙら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ３巻，１８９〜２０７頁（１９８９
年））。この方法では、ハイブリダイゼーションの時間
を大幅に短縮できることや、粗精製の検体でも適用でき
るなどの特徴がある。しかしながら、試料核酸が２本鎖
の場合、目的のハイブリダイゼーションとは逆反応であ
る相補鎖置換反応（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍ
ｅｎｔ）（５）〜（６）が起こり、ハイブリダイゼーシ
ョンの効率が低下するという問題が生じる。しかも、そ
の際の操作はいまだ煩雑なものである。

【０００４】これらの問題の一つの解決策としてＨ．
Ｂ．Ｇａｍｐｅｒらはリバースハイブリダイゼーション
法を考案している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １４巻，９９４３〜９９５４頁（１９８
６年））。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブに、
光反応によって標識遺伝子との間で架橋を形成するよう
な化学物質とそのプローブを検出するための標識を導入
する。そして、ハイブリダイゼーションと架橋反応とを
溶液中で同時に行い、得られた架橋物質をニトロセルロ
ース膜に固定して検出する方法である。つまり、サザン
ハイブリダイゼーションにおいて標識物質をニトロセル
ロース膜に固定する前にハイブリダイゼーションを行う
という点でリバースサザンハイブリダイゼーションと呼
んでいる。しかしながら、上記方法においては上記機能
を備えたプローブの調製が実際的ではないこと、及び標
的遺伝子を変性してハイブリダイゼーションを行うこと
から標的遺伝子の変性した状態の情報しか得られない等
の問題がある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情に鑑み鋭意検討した結果、後述する特定の１本鎖核酸
プローブを用いれば、試料核酸中の２本鎖核酸を簡便・
迅速、かつ高感度で検出し、又は該２本鎖核酸を変性す
ることなく単離できることを見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００６】すなわち、本発明は、試料核酸中の２本鎖
核酸と特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む１本鎖
核酸断片に、ハイブリダイズ時又はハイブリダイズ後に
該２本鎖核酸と共有結合し得る物質と標識物質とを導入
してなることを特徴とする１本鎖核酸プローブを提供す
るものである。

【０００７】本発明は、また、上記１本鎖核酸プローブ
と試料核酸中の２本鎖核酸とのハイブリダイゼーション
を行った後、標識物質を検出することを特徴とする２本
鎖核酸の検出方法を提供するものである。

【０００８】本発明は、さらに、上記１本鎖核酸プロー
ブ中の標識物質と特異的に結合可能な物質を予め固相担
体に固定し、該１本鎖核酸プローブと試料核酸中の２本
鎖核酸とのハイブリダイゼーションを行った後、生成す
る複合体を該固相担体に捕獲することを特徴とする２本
鎖核酸の単離方法を提供するものである。

【０００９】本発明において、試料核酸とは、検出すべ
き２本鎖核酸（以下、目的核酸という）又はその配列を
含む核酸であって、２本鎖のＤＮＡ又は高次構造を形成
したままのＤＮＡ若しくはＲＮＡでもよい。この様な核
酸は細菌、ウイルス及び高等動植物などあらゆる生命体
から調製することができる。なお、上記核酸を試料核酸
として用いる場合、核酸は必らずしも精製されていなく
てもよい。

【００１０】本発明において１本鎖核酸プローブとは、
上記目的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズして
２本鎖又は３本鎖を形成し、ハイブリダイズ時又はハイ
ブリダイズ後、目的核酸と共有結合し得る物質と目的核
酸を検出するための標識物質との２種類の物質が導入さ
れたものである（以下、単にプローブということがあ
る）。このプローブは、目的核酸と特異的にハイブリダ
イズするのに充分な長さのものであれば、合成オリゴデ
オキシリボヌクレオチドでも天然から得られるＤＮＡフ
ラグメントでもよいが、上記２種類の物質を導入するた
めには化学合成オリゴヌクレオチドが好ましい。

【００１１】上記目的核酸とプローブとの共有結合は、
化学反応や光化学反応などによるものがあるが、反応条
件が温和な光化学反応を利用する方法が好ましい。光化
学反応によって共有結合し得る物質としては、ソラレン
及びその誘導体（Ｊ．Ｈｅａｒｓｔら Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．１７巻，１〜４４頁（１９８４年））、
クマリン、アントラセン、ピレン、カロチン、トロポ
ン、クロモン、キノン、無水マレイン酸、アルキルマレ
イミド、オレフィン、ケトン、アジド及びそれらの誘導
体等からなる光反応性官能基群から選ばれるが、反応効
率や安定性等の点からソラレン又はその誘導体が最も好
ましい。

【００１２】これらの官能基を導入する部分はプローブ
を構成する核酸の５′側が好ましく、具体的な導入箇所
としては５′末端リン酸基、糖又は塩基部分などが考え
られる。リン酸基又は糖に上記官能基を導入する方法と
しては、例えば、アミノ基を導入した官能基とオリゴヌ
クレオチドの５′末端リン酸基又は糖の水酸基とを縮合
剤を用いて結合する方法（Ｂ．Ｌ．Ｌｅｅら Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７巻，３１９７〜３２０３頁（１
９８８年））や、該官能基を核酸の自動合成機で反応で
きるように修飾し、自動合成機を用いて導入する方法が
ある（Ｕ．Ｐｉｅｌｅｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻，２８５〜２９９頁（１
９８９年））。また、塩基部分に導入する方法として
は、例えば、塩基部分のアミノ基又はイミノ基に上記官
能基を導入し、さらにその核酸を自動合成機で反応でき
るように修飾してオリゴヌクレオチドに導入する方法が
ある（Ｕ．Ｐｉｅｌｅｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻，８９６７〜８９７８頁
（１９８９年））。その他、一級アミノ基又はチオール
基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、それら一級
アミノ基又はチオール基と選択的に反応する活性基（例
えばスクシニミジル基やマレイミド基）を導入した官能
基と反応させることによっても得られる。いずれにして
も、官能基とプローブを構成する核酸との間の構造が、
目的核酸との共有結合反応を妨げないものであるように
しなければならない。

【００１３】標識を導入する方法については種々の方法
があるが、容易さから考えて自動合成機を用いる方法が
好ましい。その場合も、標識物質を直接自動合成機で導
入する方法（Ａ．Ｊ．Ｃｏｃｕｚｚａら Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ３０巻，６２８７〜６２９
０頁（１９８９年））と、一級アミノ基（Ｎ．Ｄ．Ｓｉ
ｎｈａら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ １６巻，２６５９〜２６６９頁（１９８８年））
又はチオール基（Ｂ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙら Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３巻，４
４８４〜４５０２頁（１９８５年））を予め導入したオ
リゴヌクレオチドを合成し、その後これらの官能基と特
異的に反応する活性基（例えばスクシニミジル基やマレ
イミド基）を導入した標識物質とを反応させる方法があ
る。前者は、合成が容易であるが使用できる標識物質に
制約がある。一方、後者は、オリゴヌクレオチド合成後
に標識物質を導入しなければならないが、標識物の選択
の幅が広いなどの利点がある。後者の代表的な調製方法
としては、オリゴヌクレオチドの５′側にリン酸ジエス
テル結合を介して一級アミノ基を導入した後、又は３′
側にリン酸ジエステル結合を介して一級アミノ基を導入
した後に標識物質を導入する方法がある（特開昭５９−
９３１００号公報、特開昭６０−１６６６９５号公
報）。

【００１４】標識物質としては、非放射性、放射性物質
のいずれを用いてもよいが、非放射性物質が好ましい。
非放射性の標識物質としては、直接測定可能なものとし
て蛍光物質〔例えば、フルオレッセイン及びその誘導体
（フルオレッセインイソチオシアネート等）、ローダミ
ン及びその誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート、テキラスレッド等）〕や遅延蛍光を発する物
質（「ＤＴＴＡ」，ファルマシア社製）等が挙げられ
る。

【００１５】また、上記標識物質と特異的に結合する物
質を利用すれば、間接的に標識物質を検出することもで
きる。こうした場合の標識物質としては、ビオチン又は
ハプテン等が挙げられ、ビオチンの場合は、これに特異
的に結合するアビジン若しくはストレプトアビジンが、
ハプテンの場合は、これに特異的に結合する抗体が利用
できる。

【００１６】上記試料核酸及び上記プローブを適当な緩
衝液存在下で混合し、混合時又はその前後に目的核酸と
共有結合し得る物質とが共有結合をひき起こす条件を付
加することにより、ハイブリダイズ時又はハイブリダイ
ズ後、目的核酸との共有結合形成を行うことができる。
例えば、目的核酸と共有結合し得る物質としてソラレン
又はその誘導体を用いた場合、約３００〜３８０nmの光
を照射することにより、プローブと目的核酸とのハイブ
リダイズ時又はその後に共有結合形成を行うことができ
る。

【００１７】前記従来のハイブリダイゼーション法と
は、プローブ長により加える塩濃度や温度を調節する必
要があった。しかし、本発明の上記方法では、図１−Ｂ
に示すように、試料核酸（１）をpH調節のため緩衝液中
に浸すのみでよく、また室温で充分である。例えば、ソ
ラレン又はその誘導体を光化学的に共有結合し得る基
（７′）として用い、標識物質（７″）を有する１本鎖
核酸プローブ（７）は、３００〜３８０nmの光照射
（８）により試料核酸（１）と共有結合し３本鎖を形成
する（９）。ここでは、共有結合しているため、相補鎖
置換反応は起こらない。光源としては、Ｈｅ−Ｃｄレー
ザー、窒素レーザー、水銀アーク灯、及び適当なフィル
ターを備えた他の光源などが挙げられる。

【００１８】本発明の２本鎖核酸検出方法は、例えば、
後記実施例で示すようにゲル電気泳動、限外濾過、又は
クロマトグラフィー等の手法により、プローブと目的核
酸とのバイブリダイゼーションにより生成した複合体を
未反応プローブや未反応試料核酸から分離し、該複合体
に存在する標識物質を検出することにより、プローブと
目的核酸との複合体を特異的に検出することをいう。特
に、電気泳動と膜へのＤＮＡ転写を連続して行えるダイ
レクトブロッティング法（Ｆ．Ｍ．ＰｏｈｌＴｈｅ Ｅ
ＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３巻，２９０５〜２９０９頁
（１９８４年））は、本発明を実施するのに最も有効な
方法の一つである。

【００１９】標識物質の検出は、使用する標識物質に応
じ、一般的手法を用いて行うことができる。例えば、標
識物質が放射性同位元素の場合、そのまま活性を測定す
ればよいし、蛍光標識物質の場合、蛍光光度計を用いて
そのまま強度を測定することができる。また、ビオチン
の場合には、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体を、ハプテンの場合には、これに特異
的に結合する抗体−酵素複合体等を用いて基質と反応さ
せ、色的又は蛍光的手段により検出可能な成分を得るこ
とができる。

【００２０】本発明の２本鎖核酸単離方法は、例えば、
予め、プローブ中の標識物質と特異的に結合可能な物質
を固相担体に固定しておくことにより、ハイブリダイゼ
ーションにより生成する上記プローブと目的核酸との複
合体を該固相担体に捕獲することができる。その後、洗
浄操作により該複合体以外の物質を除き、目的核酸を単
離することができる。この場合、プローブと目的核酸と
の複合体は共有結合により結ばれており、一般的なＤＮ
Ａハイブリダイゼーション後の洗浄操作より過酷な条件
下で行うことができ、非特異的に固相担体に付着した他
の核酸等をより効果的に除くことができる。

【００２１】また、目的核酸と共有結合し得る物質とし
てソラレン又はその誘導体を用いた場合、固相担体に捕
獲された複合体に紫外線（およそ２５４nm）を照射する
ことによって、ソラレンと目的核酸との結合を開裂させ
（Ｂ．Ｌ．Ｌｅｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７
巻，３１９７〜３２０３頁（１９８８年））、目的核酸
を元の状態のまま溶液中に遊離させ、回収することがで
きる。

【００２２】さらに、導入された標識物質中に適当な試
薬で開裂できる官能基が導入されている場合（Ｄ．Ｒ．
Ｇｒｅｔｃｈら Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ １６３巻，２７０〜２７７頁（１９８７
年））、標識物質とプローブとの間の結合を開裂するこ
とにより目的核酸を固相担体から遊離させることもでき
る。

【００２３】プローブ中の標識物質と特異的に結合可能
な物質としては、該標識物質と選択的に結合可能なもの
であれば、特に制限はされない。一般に、上記結合に
は、リガンドとそのレセプター又は抗原と抗体などの特
異性の高いものを利用することが好ましい。例えば、標
識物質がビオチンの場合、アビジン又はストレプトアビ
ジンが、また、フルオレッセイン等の蛍光物質、２，４
−ジニトロフェニル基を有する化合物、ジコキシゲニン
等のハプテンなどの場合、これらの抗体が、上記標識物
質と特異的に結合可能な物質として挙げられる。

【００２４】固相担体は、反応に使用する溶媒及びすべ
ての試薬に対し不活性で、かつ何らかの方法で該試薬溶
液と分離でき、なおかつ上記標識物質と選択的に結合可
能なものが好ましい。このようなものとしては、セルロ
ース、アガロース又はポリマー性樹脂等一般にアフィニ
ティークロマトグラフィーに使用される固相材料等が挙
げられる。これらの固相担体に上記標識物質と特異的に
結合可能な物質を吸着又は適当な架橋剤を用いて固定す
ることにより、プローブと目的核酸との複合体を捕獲可
能な固相担体を調製することができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明１本鎖核酸プローブを用いること
により、従来のハイブリダイゼーション法では必須であ
った試料核酸の変性操作を必要とすることなく、目的と
する核酸を２本鎖のままで検出又は単離することができ
る。さらに、検出すべき２本鎖核酸との間で３本鎖を形
成させ当該２本鎖核酸の特異的塩基配列を検出又は単離
することもできる。なお、本発明１本鎖核酸プローブは
化学合成が容易で、しかも、いかなる核酸にも適用で
き、応用範囲の広いものである。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００２７】〔１〕ソラレン−ホスホロアミダイトの合
成 Ｐｉｅｌｅｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻，２８５〜２９９頁（１９８
９年））に従って、４，５′，８−トリメチルソラレン
を出発原料とし、下記３段階を経てソラレンホスホロア
ミダイトを合成した。

【００２８】（ｉ）４′−クロロメチル−４，５′，８
−トリメチルソラレン（化合物１）の合成 トリオキサレン（４，５′，８−トリメチルソラレン；
１．８２ｇ，８mmol）を酢酸（１５０ml）に懸濁させ
る。徐々に加温し、完全に溶解したら室温に戻す。クロ
ロメチルメチルエーテル（１５ml）を加え時々攪拌し、
室温で２４時間放置した。クロロメチルメチルエーテル
（１５ml）を追加しさらに４８時間反応した。溶媒の酢
酸が氷結しない程度に冷却して再結晶を行った（収量：
１．５１ｇ，６８％）。

【００２９】（ii）リンカーを付加したソラレン誘導体
（化合物２）の合成 化合物１（１．４５ｇ；５．２mM）をエチレングリコー
ル（３２ml）に懸濁し、１００℃まで加熱しながら完全
に溶解する。溶解後さらに１０分間加熱を続け、その後
徐々に室温に戻す。水（４０ml）を加えメチレンクロリ
ドで抽出した（１５ml×３）。有機層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、濃縮後シリカゲルカラムで精製し、目的
のフラクションを集めてアセトニトリルから再結晶を行
った（収量：１．０２ｇ，６５％）。

【００３０】（iii）ソラレン−ホスホロアミダイト
（化合物３）の合成 化合物３（２００mg；０．７７mM）をメチレンクロリド
（１０ml）に溶解し、アルゴン気流中ジイソプロピルエ
チルアミン（３６０μｌ；１．８４mmol）、次いでクロ
ロ［（β−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピ
ルアミノ］ホスフィン（２００mg；０．８５mmol）を加
え室温で３０分間攪拌する。飽和重曹水（５ml）を加え
て反応を停止し、さらに重曹水（１０ml×２）で洗浄す
る。無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、カラムクロマ
トグラフィー（溶出液；メチレンクロリド：ｎ−ヘキサ
ン：トリエチルアミン＝２：８：１）で精製した。目的
物のフラクションを集めて減圧乾固した（オイル状、収
量：２４０mg，６２％）。

【００３１】〔２〕３′−アミノ化ＣＰＧの合成 Ｎｅｌｓｏｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻，７１８７〜７１９４頁（１
９８９年））に従い、３′末端に一級のアミノ基を導入
するための固相合成用樹脂を合成した。

【００３２】（ｉ）（±）Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−アミノ−
１，２−プロパンジオール（化合物４）の合成 （±）３−アミノ−１，２−プロパンジオール（０．７
２５ｇ；８mmol）をＤＭＦ（２０ml）に溶解し、Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルエチルアミン（１．６７５ml；９．５
mmol）、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（クロロ蟻酸９−フルオレニル
メチル、２．５ｇ；９．５mmol）を加え室温で３０分間
攪拌する。反応液を氷冷した飽和重曹水（２００ml）に
注ぎ込む。析出した沈澱を濾取し水で３回洗浄した。沈
澱を乾燥後少量の酢酸エチルに溶解し、ｎ−ヘキサンを
加えて再結晶した（収量：２．０５ｇ，８２％）。

【００３３】（ii）Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ＤＭＴ−３−ア
ミノ−１，２−プロパンジオール（化合物５）の合成 化合物４（２．０３ｇ，６．５mmol）をピリジン（２５
ml）に溶解し、ＤＭＴＣｌ（ジメトキシトリメチルクロ
リド、２．６４ｇ，７．８mmol）を加え、室温で１８時
間攪拌した。メタノール（２ml）を加えて室温で１０分
間攪拌した後溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム
で精製した。目的のフラクションを集めて乾固した（収
量：２．５ｇ，６２％）。

【００３４】（iii）３′−アミノ化ＣＰＧ（化合物
７）の合成 化合物５（１．１ｇ；１．７５mmol）をピリジン（１０
ml）に溶解し、ジメチルアミノピリジン（１００mg；
０．４５mmol）を加え、さらに無水コハク酸（１５０m
g；１．５mmol）を加え、室温で２０時間攪拌した。反
応液に酢酸エチル（３０ml）を加えて溶解し、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（３０ml）、飽和ＮａＣｌ（３０ml）でそれ
ぞれ洗浄した。溶媒を減圧乾固した（化合物６、収量：
１．２ｇ）。化合物６（０．３５ｇ；０．５mmol）をジ
オキサン（５ml）に溶かし、ピリジン（１００μｌ）及
びｐ−ニトロフェノール（７０mg；０．５mmol）を加え
ＤＣＣ（０．２ｇ；０．９６mmol）を加えた。室温で３
時間攪拌し、析出した沈澱を濾別し、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ
（ＣＰＧ，Ｉｎｃ．「Ｌｏｎｇ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎ
ｏ−ａｌｋｙｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＰｏｒｅＧｌ
ａｓｓ」，１ｇ）及びトリメチルアミン（２００μｌ）
を加え終夜攪拌した。少量を採取し、ジメトキシトリ基
の定量より固相化容量を求めた（３０μmol/ｇ）。さら
に、トリメチルアミン（２０μｌ）を加え室温で終夜攪
拌した。反応液中のＣＰＧをＤＭＦ及びピリジンで洗浄
し、無水酢酸：ピリジン：ジメチルアミノピリジン＝１
０：９０：１（体積：体積：重量）で室温で１時間処理
した。さらに、ＣＰＧをそれぞれピリジン、メタノー
ル、エーテルで洗浄し、減圧下乾燥した（収量：８５０
mg，固相化容量：３３μmol/ｇ）。

【００３５】〔３〕１本鎖核酸プローブの合成 本発明で使用する１本鎖核酸プローブを得るために、ま
ず、上記（２）で合成した３′アミノ化ＣＰＧ（化合物
７）及びソラレン−ホスホロアミダイト誘導体（化合物
３）及びＡＢＩ社から供給された試薬及びホスホロアミ
ダイトを用いて５′−ソラレン−３′−アミノオリゴヌ
クレオチドをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社、「３８１Ａ」）
により製造した。粗製ＤＮＡは高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）装置（島津社）のシステムコントロー
ラＳＣＬ−６Ｂ、相液ユニットＬＣ−６Ａ、ＵＶスペク
トロメトリックディテクターＳＰＤ−６Ａ及びクロマト
パックＣ−Ｒ６Ａを用いて、逆相カラム（東ソー社、
「ＴＳＫ−８０ＴＭ」）で行った。上記合成機から得ら
れ、水（１００μｌ）に溶解した粗製のＤＮＡを上記の
カラムにかけて、５０mM酢酸トリエチルアンモニウム及
び５０mM酢酸トリエチルアンモニウム−アセトニトリル
（１：１）の２０〜６０％、２０分の濃度勾配を利用し
て流速１ml／分で溶出することにより精製した。適当な
画分をプールし、ヤマト遠心凍結乾燥装置（ヤマト社
製）を用いて共沸、凍結乾燥した。

【００３６】ヒト・β−グロビン遺伝子の一部の１９−
ｍｅｒ配列が目的核酸として選ばれ、それの配列に相補
的な配列を持ち、５′−ソラレン標識３′−アミノ化プ
ローブをＰｓｏ−βとし、化学的に合成した。また、
５′末端未標識３′−アミノ化プローブのＮｏｎ Ｐｓ
ｏ−βも合成した。それらの配列を下に示す。 Pso-β ５′ Pso-TATCAAGGTTACAAGACAG-NH₂ ３′ Non Pso-β ５′ TATCAAGGTTACAAGACAG-NH₂ ３′

【００３７】続いて上記２種のプローブの３′アミノ末
端は以下の様にビオチン標識を行った。５０Ｏ．Ｄ．単
位のプローブを水（４４μｌ）に溶解し、１Ｍ炭酸水素
ナトリウム溶液（pH８．３，１１μｌ）、ビオチン活性
エステルのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２０
μｇ／μｌ，５５μｌ）を加え、室温で一晩反応させ
た。その後、ゲル濾過及びＨＰＬＣで精製した。その結
果、約３５μｇのＰｓｏ−β−Ｂｉｏ及び約５５μｇの
Ｎｏｎ Ｐｓｏ−β−Ｂｉｏを得た。収率はＰｓｏ−β
−Ｂｉｏが約２０％、Ｎｏｎ Ｐｓｏ−β−Ｂｉｏが約
３４％であった。

【００３８】〔４〕試料核酸からの目的核酸の検出 試料核酸として目的核酸であるヒトβ−グロビン遺伝子
を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＧＳ（ｐＵＣ１１８（宝
酒造）にヒト−β−グロビン遺伝子のＢａｍＨＩ切断断
片を挿入したもの）をＢａｍＨＩで完全消化したもの
（試料Ａ）、目的核酸を含まないヒト・パピローマ・ウ
イルス（ＨＰＶ）１６型のＥ７遺伝子を含むプラスミド
ｐＳＫ−１５６−１をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで完
全消化したもの（試料Ｂ）を用意した。これらの試料を
１％アガロース・ゲル電気泳動に供した結果を図２
（Ａ）に示す。目的核酸は試料（Ａ）１．９ｋｂｐｓ中
に存在する（レーン２）。また、試料（Ａ）を加熱変性
（５分間煮沸）すると変性して１本鎖となり、３．２ｋ
ｂｐｓ及び１．９ｋｂｐｓのバンドはそれぞれ１．６ｋ
ｂｐｓ及び１．３ｋｂｐｓの位置にシフトする（レーン
４）。これらの試料を用いて目的核酸の検出を以下の操
作によって行った。

【００３９】上記のプラスミド試料１０ｆｍｏｌと上記
の核酸プローブ１０ｐｍｏｌを１０mM Ｔｒｉｓ−Ｃ
ｌ，０．１mM ＥＤＴＡ（pH７．５，１０μｌ）中で混
合し、その溶液をボロシリカ製ガラスチューブ（ＣＯＲ
ＮＩＮＧ社、「ＰＹＲＥＸ」１０×７５mm）に入れ、暗
室中で長波長紫外線ランプ（ＵＶＰ社、「ＵＶＳＬ−５
８」）を用いて３６５nmの光を０．８３Ｊ／cm^-2 min
^-1の強度で９０分間照射した。このボロシリカ製ガラス
チューブは３００nm以下の光を通さないものである。

【００４０】この反応液に水（１０μｌ）及びゲル・ロ
ーディング液〔０．２５％ブロモフェノールブルー（Ｂ
ＰＢ）、０．２５％キシレンシアノール（ＸＣ）、１５
％フィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、「ＴＹＰＥ４０
０」）５μｌ〕を加え、１％アガロースゲル電気泳動
（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ／第２版，６頁（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に供与し、７０Ｖで２時間
３０分泳動した。

【００４１】泳動後、ゲルの必要部分を切り出し、変性
溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸
し３０分ゆっくりと振とうした。そして、中和溶液〔１
Ｍ Ｔｒｉｓ（pH８．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ〕に１
５分間、２回浸して中和後、２０ＸＳＳＣ〔３．０Ｍ
ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム（pH７．０）〕
でニトロセルロース・メンブレン・フィルターに一晩ト
ランスファーした。トランスファーしたフィルターを濾
紙にはさみ、室温で１５分間乾燥後、そのままアルミホ
イルに包んで８０℃のバキュームオーブンで１時間乾燥
した。

【００４２】フィルターを２ＸＳＳＣに５分間浸し、そ
の後、ブロッキング溶液〔０．５％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ
ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ社）、１００mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１５０mM
ＮａＣｌ〕に浸して３０分間ゆっくり振とうした。フ
ィルターの水分をぬぐってハイブリ・バックに入れ、ス
トレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ・コンジ
ュゲート（Ｅｎｚｙｍａｔｉｘ社）をＳｏｌｎＩ〔０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２
mM ＭｇＣｌ ₂ 、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００〕
で１／２，０００に希釈した溶液を注入してシールを
し、１０分間放置した。

【００４３】ハイブリ・バックからフィルターを取り出
し、ＳｏｌｎＩで１０分間３回洗浄、続いてＳｏｌｎ I
II〔０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH９．５）、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、５０mM ＭｇＣｌ₂ 〕で５分間２回洗浄した。そ
して、フィルターをハイブリ・バックに入れ、ニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−ク
ロロ−インドリルリン酸 ｐ−トルイジン（ＢＣＩＰ）
を含むＳｏｌｎ III〔Ｓｏｌｎ III １０mlに対し、Ｎ
ＢＴ溶液（７．５mg ＮＢＴ／１００μｌ ７０％ＤＭ
Ｆ）４４μｌ、ＢＣＩＰ溶液（５mgＢＣＩＰ／１００μ
ｌＤＭＦ）３３μｌ加えた溶液〕を注入してシールを
し、室温で数時間、暗所に放置して青紫色のバンドが検
出されるかどうかをみた。

【００４４】その結果、図２（Ｂ）に示す様に、プロー
ブＰｓｏ−β−Ｂｉｏを試料Ａに反応させたフィルター
では目的核酸としたヒト・β−グロビン遺伝子の一部の
１９−ｍｅｒ配列を含む１．９ｋｂｐｓの青紫色を呈し
たバンドが検出された。これに対し、試料Ｂに反応させ
たフィルターではその様なバンドは検出されなかった。
また、５′末端をソラレン標識していないプローブＮｏ
ｎ Ｐｓｏ−β−Ｂｉｏを同様に試料Ａ及び試料Ｂに反
応させたが、図２（Ｃ）に示す様にバンドは全く検出さ
れなかった。以上の結果から明らかな様に、本発明のプ
ローブ１０pmolを用いて１０fmol程度の試料核酸から特
異的に目的遺伝子の検出が行えることが確認された。

【００４５】次に、目的核酸とプローブとが標識物質を
介して不可逆的に結合してしていることを確認するた
め、試料ＡとプローブＰｓｏ−β−Ｂｉｏとを上記のよ
うに光を当てて反応させた後、従来ハイブリダイゼーシ
ョンしたものが解離するはずの加熱変性操作（５分間煮
沸）を行ってバンドが検出されなくなるかどうかを調べ
た。その結果図２（Ｄ）に示す様に、目的核酸は加熱変
性して１本鎖となるため泳動度が大きくなり、１．９ｋ
ｂｐｓのバンドは１．３ｋｂｐｓの位置にシフトする
が、加熱変性を行わないときと同等の感度でバンドが検
出された。従って、本実施例の方法においては、１本鎖
核酸プローブと目的核酸とが光化学的に共有結合する能
力のある物質ソラレンを介して結合した不可逆的ハイブ
リダイゼーションが起こっていることが示唆された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明と従来法とによるハイブリダイゼーショ
ンの概要を示す図である。

【図２】本発明実施例における目的核酸の検出結果を示
す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料核酸中の２本鎖核酸と特異的にハイ
   ブリダイズ可能な配列を含む１本鎖核酸断片に、ハイブ
   リダイズ時又はハイブリダイズ後に該２本鎖核酸と共有
   結合し得る物質と標識物質とを導入してなることを特徴
   とする１本鎖核酸プローブ。
2. 【請求項２】 共有結合し得る物質が１本鎖核酸断片の
   ５′末端に導入されている請求項１記載の１本鎖核酸プ
   ローブ。
3. 【請求項３】 共有結合し得る物質が、光化学反応によ
   り共有結合するものである請求項１又は２記載の１本鎖
   核酸プローブ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の１本鎖
   核酸プローブと試料核酸中の２本鎖核酸とのハイブリダ
   イゼーションを行った後、標識物質を検出することを特
   徴とする２本鎖核酸の検出方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の１本鎖
   核酸プローブ中の標識物質と特異的に結合可能な物質を
   予め固相担体に固定し、該１本鎖核酸プローブと試料核
   酸中の２本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを行った
   後、生成する複合体を該固相担体に捕獲することを特徴
   とする２本鎖核酸の単離方法。