JP2007043937A - 遺伝子検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】特定の配列を有する検出すべき遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出方法を提供する。
【解決手段】検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルに対して、電気化学的に活性であり、且つ前記遺伝子サンプルに特異的に結合され、光照射により共有結合される標識剤を添加する標識剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された標識剤とを共有結合させる光照射工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に、前記標識剤が共有結合された遺伝子サンプルを添加し、該電極に固定化された核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸に共有結合した標識剤を電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を高感度に検出する遺伝子検出方法に関し、特に、標識剤により電気化学的に遺伝子を検出する遺伝子検出方法に関する。

従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定により前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。

ここで、前記標識剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。

さらに、前述した標識剤には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があり、このような電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす挿入剤を用いれば、電気化学的変化の測定によって、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化の出力信号としては、酸化還元時に発生する電流や発光が挙げられる。

従って、このような従来の遺伝子検出方法においては、前記標識剤を二本鎖核酸にのみ特異的に結合させ、該二本鎖核酸に結合した挿入剤の量を正確に検出することが重要となる。

しかし、前記標識剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した標識剤は、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の量の検出時にバックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。

これを解消するため、従来の遺伝子検出方法においては、前記拡散プローブと遺伝子サンプルとの反応系に前記標識剤を添加した後に、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている標識剤を除去する洗浄処理が必要となっている。
特許第２５７３４４３号公報 特許第３２３３８５１号公報

しかしながら、前述したように、前記標識剤と二本鎖核酸間の結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によるものであってその結合力が弱いため、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した標識剤を除去する洗浄工程の際に、物理的洗浄効果がある、揺動洗浄や流水によるすすぎのような強い除去操作を行なうと、前記二本鎖核酸に結合させた標識剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまうという課題がある。

一方、前記洗浄工程の際に、前記二本鎖核酸に結合した標識剤が解離しないように考慮した、物理的な洗浄効果のほとんどない、ピペッティングや洗浄液にやさしく浸漬する程度の除去操作では、該非特異的に吸着した標識剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズが増加してしまい、検出感度の低下につながる、という課題がある。

さらに、従来の検出方法における、標識剤と二本鎖核酸間の結合反応は平衡反応であるため、該標識剤が二本鎖核酸の塩基対間へ挿入される割合が低く、もともと検出感度が低いという課題もある。

本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、遺伝子サンプルと強固に且つ不可逆的に結合する標識剤を用いることで、目的遺伝子サンプルを高感度に検出可能な遺伝子検出方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法において、前記検体試料中の検出すべき遺伝子の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記検出すべき遺伝子を、一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記遺伝子サンプルに、電気化学的に活性であり、且つ該遺伝子サンプルに、特異的に結合され、光照射により共有結合される標識剤を添加する標識剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された標識剤とを共有結合させる光照射工程と、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に、前記光照射工程で得た前記標識剤を共有結合させた遺伝子サンプルを添加し、前記電極に固定化された核酸プローブと前記標識剤が共有結合された遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸に結合された標識剤を電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。

これにより、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記遺伝子サンプルに共有結合させた標識剤による電気化学発光量を測定するものである。

これにより、前記検出対象である遺伝子サンプルの存在を的確に確認できる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記標識剤が、前記遺伝子サンプルに、特異的に結合し且つ光照射により共有結合する遺伝子サンプル結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記遺伝子サンプル結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなるものである。

これにより、前記二本鎖核酸と前記標識剤とを、不可逆的に、且つ強固に結合させることができ、この結果、前記二本鎖核酸に挿入される標識剤の割合を増すことができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記遺伝子サンプル結合部位が、感光性を持つ化合物であるものである。

これにより、前記二本鎖核酸と前記標識剤とを、光照射することによって、不可逆的に、且つ強固に結合させることができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記感光性を持つ化合物が、フロクマリン誘導体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学活性部位が、酸化還元性を有する化合物であるものである。

これにより、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、検出対象である遺伝子サンプルを検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物であるものである。

これにより、前記電極に電圧を印加すると、該電極に固定化された二酸化核酸に結合した標識剤が酸化還元反応すると共に発光し、該電気化学発光量を測定することで、検出対象である遺伝子サンプルを検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかであるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかであるものである。

これにより、前記電極に電圧を印加した際、より良好な電気化学発光量を得ることができ、検出対象である遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。

本発明の遺伝子検出方法によれば、検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して作製した遺伝子サンプルに、電気化学的に活性であり、且つ該遺伝子サンプルに特異的に結合し、光照射により共有結合する標識剤を添加して光照射を行うことで、前記遺伝子サンプルと前記添加された標識剤とを共有結合させた後、前記検出すべき遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に、前記標識剤が共有結合された遺伝子サンプルを添加して二本鎖核酸を形成させ、該二本鎖核酸に結合した標識剤を電気化学的な測定により検出するようにしたので、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる。

また、本発明の遺伝子検出方法によれば、光照射により、検出対象となる遺伝子サンプルと標識剤とを共有結合させ、該遺伝子サンプルと前記標識剤とを、不可逆的に、且つ強固に結合させるようにしたので、結合していない標識剤及び遺伝子サンプルを強い除去操作で除去することができることに加え、前記電極上に固定化された核酸プローブと前記標識剤と共有結合させた遺伝子サンプルとをハイブリダイジェーションさせた後、前記核酸プローブと二本鎖を形成していない未結合の遺伝子サンプルを除去する際にも、強い除去操作が行えるため、前記標識剤の非特異吸着によるバックグランドノイズの影響をなくすることが可能となり、高感度な検出を実現できる。

以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。
なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。

（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。
まず、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成する。
この核酸プローブは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸あるいは化学合成で得られた一本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。

そしてこの後、前述のようにして得られた核酸プローブを電極に固定する。
本発明で用いる電極は、電極として使用可能であればどのようなものであってもよく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極や、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても良く、このように被覆することによって、より安定なプローブ固定化電極を調製することができる。

なお、前記核酸プローブを前記電極に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。一例をあげると、例えば前記電極が金である場合、固定する核酸プローブの５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、金とイオウとの共有結合を介して、前記核酸プローブが該金電極に固定される。この核酸プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，１８０５〜１８０８及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８５，ｖｏｌ．１３，４４８４）に記載されているものが挙げられる。

即ち、前記方法によって得られたチオール基を有する核酸プローブを、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することにより、該核酸プローブが電極に固定され、核酸プローブが作製される。

また別の例をあげると、例えば前記電極がグラシーカーボンである場合、まずグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入し、これにより、核酸プローブが、アミド結合によりグラシーカーボン電極表面に固定される。このグラシーカーボン電極に核酸プローブを固定する、実際の固定化方法については、文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，ｖｏｌ．６５，２３１７〜２３２３）に詳細が記載されている。

次に、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。

このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。

その後、一本鎖に編成された前記遺伝子サンプルに標識剤を添加して、該標識剤を該遺伝子サンプルに特異的に結合させる。そして、前記標識剤を前記遺伝子サンプルに結合させた後に光照射を行い、該遺伝子サンプルと標識剤間を共有結合させる。

以下、前記遺伝子サンプルに標識する標識剤について説明する。
本発明の標識剤は、前記遺伝子サンプルと特異的に結合し、且つ光照射により共有結合する特徴をもつ物質を用いる。これにより、前記標識剤は、前記遺伝子サンプルと、強固且つ不可逆的に結合するため、この後の工程である未反応標識剤の除去工程の際に、前記遺伝子サンプルに結合した標識剤が解離することがない。さらに、本発明の標識剤は、電気化学的に活性である特徴を持つ物質を用いる。これにより、前記前記遺伝子サンプルに結合した標識剤由来の電気化学的な信号により、該前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出できる。

前述した２つの特性を満たす標識剤は、光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する遺伝子サンプル結合部位（Ｉ）と、電気化学活性を有する電気化学活性部位（Ｆ）と、前記前記遺伝子サンプル結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位（Ｌ）と、を有する化合物である。

例えば、このような標識剤は、下記一般式（１）で表すことができる。
一般式
Ｆ − Ｌ − Ｉ ・・（１）

なお、式中のＦは電気化学的に活性な電気化学活性基、Ｉは光照射により遺伝子サンプルと架橋する部位を有する遺伝子サンプル標識基、Ｌは前記Ｆと前記Ｉとを連結する連結基である。

ここで、前記一般式（１）に示す、遺伝子サンプル標識基Ｉとして用いることができる物質としては、光照射により遺伝子サンプルに共有結合する、感光性を持つ標識剤が挙げられる。

そして、このような標識剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。このソラレン誘導体は、遺伝子サンプルに標識すると、遺伝子サンプルと非共有的相互作用を起こし、さらにこれに長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を照射すると、安定な共有結合を形成する。

そしてこの後、界面活性剤溶液中で、揺動洗浄及び流水によるすすぎを行い、未反応の標識剤及び遺伝子サンプルを除去する。このように、強い除去操作を行なったとしても、遺伝子サンプルに結合した本標識剤は、そのソラレン誘導体部分が強固に且つ不可逆的に遺伝子サンプルと共有結合しているため、標識剤が抜け落ちることはない。

このようなソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。

次に、前記一般式（１）に示す、電気化学活性基Ｆとして用いることができる物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば、特に制限されずに用いられ、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物を挙げることができる。

そして、このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。

さらに、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、その発光を測定することで検出を行うこともできる。

そして、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体があり、特にピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等がある。

さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体において、中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。

そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。

さらに、前記一般式（１）において、連結基Ｌとして用いることができるものとしては、前記電気化学活性基Ｆと前記遺伝子サンプル標識基Ｉとを連結するものであれば、そのリンカー配列は特に制限されるものではなく、例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。

そして、以上のようにして得られた、核酸プローブが結合した電極と、標識剤が結合された遺伝子サンプルを含む溶液とを接触させることにより、核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。この核酸プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。

そして、このように二本鎖核酸を形成した後、二本鎖を形成しなかった未反応な遺伝子サンプルを、洗浄液で除去する洗浄処理を行う。

この結果、洗浄処理後の電極表面には、標識剤が共有結合された二本鎖核酸のみが残るようになり、この後、標識剤由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在、すなわち遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。

前記標識剤由来の電気化学的な信号は、添加する標識剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる標識剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。

以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）金電極表面への核酸プローブの固定化
ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で１分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。

核酸プローブには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する５’−末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該核酸プローブを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１００μＭに調整した。

この調整した核酸プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で４時間放置することで、チオール基と金とを結合させて、核酸プローブを金電極に固定した。

（２）遺伝子サンプルへの標識剤の結合
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’−末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。

また、標識剤には、下記の化１に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。

ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下の手順により得ることができる。
まず、公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．６，１９７７）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で撹拌しながら１，４−ジアミノブタン（０．３２ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を滴下し１２時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ａを得た（収率４０％）。

次に、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１．３５×１０^-2ｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２．７０×１０^-2ｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，２−ジブロモエタン７．６１ｇ（４．０５×１０^-2ｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。

この１，２−ジブロモエタンとＴＨＦとが標識された容器に、先程の、ＴＨＦに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン溶液とリチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液とを反応させた反応液をゆっくり滴下させ、２．５時間反応させた。そして、この反応溶液を、２Ｎの塩酸で中和して、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出し、さらに、前記溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｂを得た（収率４７％）。

そして、前記生成物Ａ（０．５０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｂ（０．４９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とを、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で１８時間撹拌させた。そして、この撹拌した溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ｃを得た（収率３８％）。

さらに、塩化ルテニウム（III）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール:水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は、吸引ろ過で採取し、生成物Ｄを得た（収率６８．２％）。

そして、前記生成物Ｃ（０．３０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｄ（０．３２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）とを、ジメチルホルムアミドに溶かして６時間還流し、反応後、溶媒を留去させて得た黒紫色の物質に蒸留水を加えて溶解させ、未反応錯体をろ過により除去した後、溶媒を留去した。

得られた粗生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、ソラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率６８％）。表１は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体のプロトンＮＭＲの結果（¹Ｈ‐ＮＭＲ結果）である。

（表１）
¹Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ−６）
σ：
１．４〜１．８ （６Ｈ，ｍ）
２．４〜２．６ （１２Ｈ，ｍ）
２．７４ （２Ｈ，ｔ）
３．８〜３．１ （６Ｈ，ｍ）
４．３１ （２Ｈ，ｓ）
６．３２ （１Ｈ，ｓ）
７．３８ （２Ｈ，ｄ）
７．５４ （７Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１６ （４Ｈ，ｔ）
８．７０ （２Ｈ，ｄ）
８．８８ （４Ｈ，ｄ）

このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を、１０ｍＭのＰＢＳで２μＭに調整した。

この調整した標識剤の溶液を、遺伝子サンプルに添加し、ＵＶクロスリンカー（フナコシ製ＵＶＰＣＬ１０００Ｌ型）を用いて、波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、標識剤のソラレン部位と遺伝子サンプルとを共有結合させた。共有結合後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、未反応の遺伝子サンプル及びルテニウム錯体を除去した。ＨＰＬＣで精製後、前記標識剤が結合された遺伝子サンプルを濃縮した。

（３）ハイブリダイゼーション
前記標識剤が共有結合された遺伝子サンプルは、１０ｍＭのＰＢＳ、及び２ＸＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。

この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に滴下し、４０℃の恒温槽内で４時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。その後、二本鎖を形成しなかった未反応の遺伝子サンプルを、界面活性剤溶液中での揺動洗浄及び流水によるすすぎを行い除去した。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｘを得た。

さらに、本実施例１においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｙを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｙは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｘを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。

（５）電気化学測定
以上の工程の後、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を滴下した。さらに、本実施例１では、さらなる比較対象として、核酸のない金電極（以下、「ブランク電極」と称す。）ｚも用意する。このブランク電極ｚは、前述した工程（１）において、金電極に核酸プローブを固定化せず、そのほかの工程は、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｘを得る時と同様の処理をして得る。そして、このようにして得たブランク電極ｚに対しても、０．１ＭのＰＢＳ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を滴下した。

その後、それぞれの金電極ｘ，ｙ，ｚに電圧を印加し、この時に生じた標識剤由来の電気化学発光の測定を行った。

なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、１秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。

図１は、本実施例１の電気化学測定にて得られた最大電気化学発光量の結果を示すものである。図１から明らかなように、二本鎖核酸が形成された金電極ｘでの発光量は、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｙでの発光量と比較して著しく高い値となっており、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。また、核酸のない電極ｚではほとんど発光が見られないことから、標識剤の非特異吸着に由来するノイズ成分となるバックグラウンド発光もほとんど生じていないことが分かる。

本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。

本発明の実施例１における、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、二本鎖核酸が形成されていない電極ｙ、及び核酸のない電極ｚのぞれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示すものである。

Claims (12)

1. 検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法において、
   前記検体試料中の検出すべき遺伝子の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
   前記検出すべき遺伝子を、一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
   前記遺伝子サンプルに、電気化学的に活性であり、且つ該遺伝子サンプルに、特異的に結合され、光照射により共有結合される標識剤を添加する標識剤添加工程と、
   光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された標識剤とを共有結合させる光照射工程と、
   前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に、前記光照射工程で得た前記標識剤を共有結合させた遺伝子サンプルを添加し、前記電極に固定化された核酸プローブと前記標識剤が共有結合された遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
   前記二本鎖核酸に結合された標識剤を電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
2. 請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
   前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記遺伝子サンプルに共有結合させた標識剤による電気化学発光量を測定する、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
3. 請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
   前記標識剤は、前記遺伝子サンプルに、特異的に結合し、且つ光照射により共有結合する遺伝子サンプル結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記遺伝子サンプル結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
4. 請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
   前記遺伝子サンプル結合部位は、感光性を持つ化合物である、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
5. 請求項４に記載の遺伝子検出方法において、
   前記感光性を持つ化合物は、フロクマリン誘導体である、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
6. 請求項５に記載の遺伝子検出方法において、
   前記フロクマリン誘導体は、ソラレン誘導体である、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
7. 請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
   前記電気化学活性部位は、酸化還元性を有する化合物である、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
8. 請求項７に記載の遺伝子検出方法において、
   前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
9. 請求項８に記載の遺伝子検出方法において、
   前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかである、
   ことを特徴とする遺伝子検出方法。
10. 請求項９に記載の遺伝子検出方法において、
    前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
    ことを特徴とする遺伝子検出方法。
11. 請求項１０に記載の遺伝子検出方法において、
    前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
    ことを特徴とする遺伝子検出方法。
12. 請求項９に記載の遺伝子検出方法において、
    前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである、
    ことを特徴とする遺伝子検出方法。

Images