JP4701176B2 - 遺伝子検出方法、及び挿入剤 - Google Patents
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Description
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程とを含むものである。
該一般式(1)中のそれぞれの部位に、−Lb−Ib、−Lc−Fb[但し、Ibは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Fbは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Lb,Lcは連結部位である]で表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有するものである。
以下、本実施の形態1における遺伝子検出方法、及び本実施の形態で用いる挿入剤について説明する。
ids Res.,13,4484(1985))に記載されているものが挙げられる。
一般式
ガラス基板上にスパッタ装置(アルバック製SH−350)によりチタン10nmを下地に金200nmを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液(過酸化水素:濃硫酸=1:3)で1分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な5’−末端からATGATAGTGG GAAAATTATT GCATATCTGG ATCCAGGGGGの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド(タカラバイオ製)を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、10mMのPBS、及び2XSSCを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、20μMに調整した。
挿入剤には、下記の(化11)に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
1H−NMR(300MHz、DMSOd−6)
σ:
1.39 (4H,m)
1.5〜1.8(8H,m)
1.9〜2.2(8H,m)
2.3〜2.6(15H,m)
2.75 (4H,t)
3.04 (4H,t)
4.29 (4H,s)
7.35 (4H,d)
7.4〜7.6(13H,m)
7.7〜7.8(8H,m)
8.15 (8H,t)
8.74 (4H,d)
8.82 (8H,d)
30分後、金電極x,yそれぞれに、UVクロスリンカー(フナコシ製UVPCL1000L型)を用いて波長365nm、5mW/cm2の紫外線を10分間照射し、前記ソラレンと二本鎖核酸とを共有結合させた。共有結合後、金電極xを10mMのPBSで10分間揺動洗浄し、未反応のRu錯体を取り除いた。
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された電極x、及び二本鎖核酸が形成されていない電極yのそれぞれに、0.1MのPBSおよび0.1Mのトリエチルアミンを混合した電解液を滴下した。その後、それぞれの電極x,yに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、0Vから1.3Vまで走査し、1秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管(浜松ホトニクス製H7360−01)を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
Claims (23)
- 特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記検出すべき遺伝子サンプルの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記遺伝子サンプルを前記核酸プローブが固定化された電極に添加し、該核酸プローブと遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸が形成された電極に、下記一般式(1)のそれぞれの部位に、−Lb−Ib、−Lc−Fbで表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
Fa−La−Ia (1)
[但し、Fa,Fbは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ia,Ibは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、La,Lb,Lcは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である]
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記FaとFb、前記IaとIbは、それぞれ同一の化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤による電気化学発光量を測定する、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ia、Ibが、感光性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項4に記載の遺伝子検出方法において、
前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項5に記載の遺伝子検出方法において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記Fa、Fbが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項7に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項8に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項9に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項10に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項9に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 下記一般式(1)で表される挿入剤において、
Fa−La−Ia (1)
[但し、Faは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Iaは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Laは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である]、
該一般式(1)中のそれぞれの部位に、−Lb−Ib、−Lc−Fb[但し、Ibは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Fbは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Lb,Lcは連結部位である]で表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有する、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項13に記載の挿入剤において、
前記FaとFb、前記IaとIbは、それぞれ同一の化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項13に記載の挿入剤において、
前記Ia、Ibが、感光性を有する化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項15に記載の挿入剤において、
前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項16に記載の挿入剤において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項13に記載の挿入剤において、
前記Fa、Fbが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項18に記載の挿入剤において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項19に記載の挿入剤において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項20に記載の挿入剤において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項21に記載の挿入剤において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。 - 請求項20に記載の挿入剤において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。
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