CN109312339B - 用于治疗肌萎缩侧索硬化症和/或额颞叶变性的材料和方法 - Google Patents

用于治疗肌萎缩侧索硬化症和/或额颞叶变性的材料和方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了用于在体外和在体内对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)和/或额颞叶变性(FTLD)的患者进行治疗的材料和方法。此外，本申请提供了用于通过基因组编辑进行编辑以调节细胞中C9ORF72基因的表达、功能或活性的材料和方法。

Description

用于治疗肌萎缩侧索硬化症和/或额颞叶变性的材料和方法
相关申请
本申请要求于2015年12月23日提交的美国临时申请号62/387,424；以及于2016年4月18日提交的美国临时申请号62/324,281的权益，这些美国临时申请中的每个临时申请的内容通过引用全部结合在本文中。
技术领域
本申请提供了用于在体外和在体内对患有肌萎缩侧索硬化症(AmyotrophicLateral Sclerosis，ALS)和/或额颞叶变性(Frontaltemporal Lobular Degeneration，FTLD)的患者进行治疗的材料和方法。此外，本申请提供了用于通过基因组编辑进行编辑以调节细胞中C9ORF72基因的表达、功能或活性的材料和方法。
通过引用对序列表的结合
本申请含有呈计算机可读形式的序列表(文件名：50316A_SeqListing.txt；14,785,573字节——ASCII文本文件；创建于2016年12月21日)，所述序列表通过引用全部结合在本文中并且形成本公开的一部分。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种致命性神经变性病，其临床特征为通常在症状发作的两到三年内由于呼吸衰竭导致死亡的进行性麻痹(Rowland和Shneider，《新英格兰医学期刊(N.Engl.J.Med.)》，2001年，第344期，第1688到1700页)。在西方世界中，ALS是第三最常见的神经变性病(Hirtz等人，《神经病学(Neurology)》，2007年，第68期，第326到337页)。大概10％的病例在性质上是家族性的，而被诊断为患有所述疾病的大多数患者被分类为散发的，因为他们在整个人口中似乎随机发生(Chio等人，《神经病学(Neurology)》，2008年，第70期，第533到537页)。基于临床数据、遗传学数据以及流行病学数据，人们越来越多地认识到ALS和额颞叶痴呆(Frontotemporal Lobular Dementia)代表重叠的疾病连续统，其病理学特征为在整个中枢神经系统中存在TDP-43阳性包涵体(Lillo和Hodges，《临床神经科学杂志(J.Clin.Neurosci)》，2009年，第16期，第1131到1135页；Neumann等人，《Science(科学)》，2006年，第314期，第130到133页)。
迄今，已经发现大量基因是典型的家族性ALS的起因，例如，SOD1、TARDBP、FUS、OPTN以及VCP(Johnson等人，《Neuron(神经元)》，2010年，第68期，第857到864页)；Kwiatkowski等人，《科学(Science)》，2009年，第323期，第1205到1208页；Maruyama等人，《Nature(自然)》，2010年，第465期，第223到226页；Rosen等人，《自然(Nature)》，1993年，第362期，第59到62页；Sreedharan等人，《科学(Science)》，2008年，第319期，第1668到1672页；Vance等人，《大脑(Brain)》，2009年，第129期，第868到876页)。过去10年中，对涉及多种ALS、FTD和ALS-FTD病例的家族进行的连锁分析在9号染色体的短臂上识别到所述疾病的重要座位，所述座位现在被称为C9orf72(Boxer等人，《神经病学、神经外科及精神病学杂志(J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry)》，2011年，第82期，第196到203页；Morita等人，《神经病学(Neurology)》，2006年，第66期，第839到844页；Pearson等人，《神经病学杂志(J.Neurol.)》，2011年，第258期，第647到655页；Vance等人，《大脑(Brain)》，2006年，第129期，第868到876页)。
额颞叶变性(FTLD)是一种类型的神经变性病，涉及大脑的额叶和颞叶前部中的灰质的变性，其中顶叶和枕叶不受影响。继阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)之后，FTLD是痴呆的第二最常见形式，并且因此是老年人神经性问题的主要原因。FTLD的综合征涵盖了额颞痴呆(FTD)、FTD连同运动神经元病(MND)、语义性痴呆以及原发性进行性失语症的临床亚组，并且其特征为行为、个性和语言的变化，其中记忆和感觉相对保留。
病理上，有两种主要的组织学简况与FTLD相关。这些简况之一是tau蛋白病变，即过度磷酸化的tau在神经元中并且偶尔在神经胶质中累积。然而，很好地说明所有病例中超过一半病例的与FTLD相关的最常见神经病理是被称为FTLD-U的神经病理，在所述神经病理中，存在对泛素具有免疫应答(ub-ir)而不是对tau具有免疫应答的神经元细胞质包涵体和神经突。这种类型的FTLD病理最初发现于患有运动神经元病(MND)和痴呆的患者中，但是随后已经被视为未患有运动症状患者中的FTLD的常见神经病理学特征。这种ub-ir病理典型地发现于海马体的齿状筋膜的颗粒细胞中并且发现于额和颞新皮质的第2层的神经元中。
当前，市面上仅存在一种FDA批准药物用于治疗ALS，即力如太(Rilutek)(利鲁唑)。然而，对作用机制少有了解。人们认为所述药物通过降低大脑中的谷氨酸酯水平来减缓疾病在一些人中的进展。
C9orf72(9号染色体开放阅读框72)是在人类中通过基因C9ORF72编码的蛋白质。人类C9ORF72基因位于9号染色体开放阅读框72的短(p)臂上，从碱基对27,546,542到碱基对27,573,863。所述基因的细胞发生位置处于9p21.2处。所述蛋白质存在于大脑的许多区域中、在神经元的细胞质中、以及在突触前末梢中。在所述基因中引起突变的疾病最初由两个独立研究小组于2011年发现(DeJesus-Hernandez等人(2011年)，《神经元(Neuron)》，第72卷，第2期，第245到256页)；Renton等人(2011年)，《神经元(Neuron)》，第72卷，第2期，第257到268页)。因为C9ORF72中的突变是被识别为FTLD与ALS之间的遗传联系的第一发病机制，所以所述突变是值得注意的。自2012年起，所述突变是所识别到的与家族性FTLD和/或ALS相关的最常见突变。
C9ORF72的突变是六字母串的核苷酸GGGGCC的六核苷酸重复扩增。健康个体中，存在很少的这种六核苷酸重复，通常为30个，但是在患有疾病表型的人中，所述重复可能数以百计地发生(Fong等人(2012年)，《老年痴呆症研究与治疗(Alzheimers Res Ther)》，第4卷，第4期，第27页)。C9ORF72基因中的六核苷酸扩增事件存在于大约40％的家族性ALS和8％到10％的散发ALS患者中。六核苷酸扩增发生于C9ORF72基因的选择性剪接的第1内含子中，并且如此并不更改编码序列或所产生的蛋白质。通常产生C9ORF72的三种选择性剪接变体(V1、V2和V3)。已经显示，扩增核苷酸重复减少了对V1的转录，然而，所产生的蛋白质的总量不受影响(DeJesus-Hernandez等人(2011年)，《神经元(Neuron)》，第72卷，第2期，第245到256页)。总体而言，已经在来自ALS患者的大脑尸检样本中观察到C9ORF72的蛋白质水平降低(Waite(2014年)，《衰老神经生物学(Neurobiol Aging)，第35期，第1779 e1775到1779e1713页》)，从而暗示单倍体不足是ALS/FTD的起因。然而，对C9orf72蛋白质的生理功能鲜有了解，并且神经元特异性基因敲除小鼠并未患有如病理等疾病(Koppers(2015年)，《神经病学年报(Ann Neurol)》，第78期，第426到438页)，从而使得单倍体不足不可能显著地促进疾病机制。
除了单倍体不足之外，存在其它与C9ORF72六核苷酸扩增引起FTD和/或ALS的方式有关的理论。另一种理论是，富GC的RNA在细胞核和细胞质中积累变得有毒，并且发生RNA结合蛋白质积聚。近几年已经得到越来越多关注的非编码重复扩增障碍的共同特征是由重复核苷酸组成的RNA片段作为RNA团簇(RNA focus)而在受影响细胞的细胞核和/或细胞质中积累(Todd和Paulson，2010年，《神经病学年报(Ann Neurol)》，第67期，第291到300页)。在若干障碍中，已经显示，RNA团簇使RNA结合蛋白质积聚，从而导致对选择性mRNA剪接的调控异常。这种RNA团簇的特点是整个中枢神经系统中存在TDP-43阳性包涵体(Lillo和Hodges，《临床神经科学杂志(J.Clin.Neurosci)》，2009年，第16期，第1131到1135页；Neumann等人，《Science(科学)》，2006年，第314期，第130到133页)。
额外的理论是：从含有扩增六核苷酸重复的C9ORF72基因转录而来的RNA通过非ATG引发机制进行转译。这驱动与多个核糖体阅读框相对应的二肽重复蛋白质在突变上形成和积累。所述重复被转译成引起重复诱导毒性的二肽重复(DPR)蛋白质。DPR抑制蛋白酶体并且使其它蛋白质积聚。C9ORF72中的GGGGCC重复扩增可能通过若干可能的机制破坏核质运输(Edbauer，《神经生物学新见(Current Opinion in Neurobiology)》，2016年，第36期，第99到106页)。
传统地，家族性和散发性ALS病例在临床上一直都是不可区分的，这已经使诊断变得困难。因此，对此基因的识别将有助于未来对家族性ALS的诊断。缓慢诊断对于FTD来说也是常见的，对于许多被初始地误诊断为患有另一病情的患者而言，这通常可能耗费长达一年。对已知引起这些疾病的特异性基因的测试将有助于较快速的诊断。最重要的是，这种六核苷酸重复扩增是用于开发用于治疗家族性FTD和家族性ALS两者的疗法的极有前景的未来目标。
基因组工程是指用于对活生物体的遗传信息(基因组)进行靶向特异性修饰的策略和技术。由于宽范围的可能应用，特别是在人类健康领域中，基因组工程是非常活跃的研究领域；例如，对携带有害突变的基因的修正，或者以探索基因的功能。被开发用于将转基因插入到活细胞中的早期技术经常受到将新序列插入到基因组中的随机性质的限制。随机插入到基因组中可能导致扰乱对相邻基因的正常调控，从而导致严重的不利作用。此外，随机整合技术提供了很小的再现性，因为没有保证序列将被插入在两个不同细胞中的相同位置处。最近的基因组工程策略如ZFNs、TALENs、HEs和MegaTAL使得能够对DNA的特异性区域进行修饰，由此相比于早期技术提高了修正和插入精度。这些较新平台提供了大得多的再现性程度。
尽管一直试图解决ALS和FTLD的全球研究人员和医疗专业人员做出了努力并且尽管基因组工程方式很有前途，但是仍然迫切地需要开发出安全且有效的ALS和FTLD治疗方案。
目前，所有用于解决ALS和FTLD的疗法都旨在减缓疾病进展而不是治愈疾病。相比而言，本发明呈现了一种用于修正疾病的遗传基础的方式。通过使用基因组工程工具来对基因组产生可以利用单次治疗恢复C9ORF72六核苷酸重复扩增的永久变化，所产生的疗法应当完全停止疾病进展。
发明内容
本文提供了用于通过对C9ORF72基因或者对C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复进行缺失、插入或修正或者通过基因组编辑将C9ORF72 cDNA或迷你基因敲入到安全港座位中并且恢复C9orf72蛋白质活性来对基因组产生永久改变、可以用于治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的细胞方法、体外方法和体内方法，以及用于执行这种方法的组分、试剂盒和组合物、以及通过所述组分、试剂盒和组合物产生的细胞。
本文提供了一种用于通过基因组编辑对人类细胞中的C9ORF72基因进行编辑的方法，所述方法包括以下步骤：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述人类细胞中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中的至少一项，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或一个或多个DSB，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
本文还提供了一种用于通过基因组编辑将C9ORF72基因插入人类细胞中的方法，所述方法包括以下步骤：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述人类细胞中，以在安全港座位内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因或迷你基因的永久插入并且引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
一方面，本文提供了一种用于通过基因组编辑对人类细胞中的C9ORF72基因进行编辑的方法，所述方法包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个DSB，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因或迷你基因的永久插入以及C9orf72蛋白质活性的恢复。
另一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：产生患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；在所述iPSC的C9ORF72基因或者对所述iPSC的所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述iPSC的安全港座位内或附近进行编辑；使基因组编辑后iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞；以及将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
在一些实施例中，所述产生患者特异性诱导性多能干细胞的步骤包括：从所述患者体内分离体细胞；以及将一组多能性相关基因引入到所述体细胞中以诱导所述细胞变成多能干细胞。在一些实施例中，所述体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，所述一组多能性相关基因是选自由以下组成的群组的基因中的一个或多个基因：OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG、以及cMYC。
所述在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑或者在安全港座位附近或内进行编辑或者在所述C9ORF72基因的第一外显子的座位处或附近进行编辑的步骤可以包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述iPSC中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述对所述iPSC的所述C9ORF72基因进行编辑的步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述iPSC中，以在所述C9ORF72基因内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正。
在一些实施例中，所述使所述基因组编辑后iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞的步骤包括以下操作中的一项或多项：使用小分子的组合进行治疗或者递送关键转录因子。
在一些实施例中，所述将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内的步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
另一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：从所述患者体内分离白血细胞；对所述白血细胞的C9ORF72基因进行编辑；以及将编辑后白血细胞植入到所述患者体内。
在一些实施例中，分离白血细胞的步骤包括：细胞差速离心和细胞培养。
所述在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑或者在安全港座位附近或内进行编辑或者在所述C9ORF72基因的第一外显子的座位处或附近进行编辑的步骤可以包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述白血细胞中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述对所述神经细胞的所述C9ORF72基因进行编辑的步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述神经细胞中，以在所述C9ORF72基因内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正。
在一些实施例中，所述将所述白血细胞植入到所述患者体内的步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述白血细胞植入到所述患者体内。
一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：任选地，对所述患者的骨髓执行活检；分离间充质干细胞；在所述干细胞的C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述C9ORF72基因的安全港座位内或附近进行编辑；使所述干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞；以及将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
在一些实施例中，所述分离间充质干细胞的步骤包括：抽吸骨髓以及使用PercollTM通过密度离心分离间充质细胞。
所述在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑或者在安全港座位附近或内进行编辑或者在所述C9ORF72基因的第一外显子的座位处或附近进行编辑的步骤可以包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述间充质干细胞中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述对所述干细胞的所述C9ORF72基因进行编辑的步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述干细胞中，以在所述C9ORF72基因内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正。
在一些实施例中，所述使所述干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞的步骤包括以下操作中的一项或多项以使基因组编辑后干细胞分化成神经细胞：使用小分子的组合进行治疗或者递送关键转录因子。
在一些实施例中，将所述细胞植入到所述患者体内的步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述细胞植入到所述患者体内。
另一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：任选地，使用粒细胞集落刺激因子(GCSF)对所述患者进行治疗；从所述患者体内分离造血祖细胞；在所述造血祖细胞的C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述造血祖细胞的所述C9ORF72基因的安全港座位内或附近进行编辑；以及将所述细胞植入到所述患者体内。
在一些实施例中，所述使用粒细胞集落刺激因子(GCSF)对所述患者进行治疗组合Plerixaflor而执行的。
在一些实施例中，所述从所述患者体内分离造血祖细胞的步骤包括：分离CD34+细胞。
所述在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑或者在安全港座位附近或内进行编辑或者在所述C9ORF72基因的第一外显子的座位处或附近进行编辑的步骤可以包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述造血祖细胞中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述对所述造血祖细胞的所述C9ORF72基因进行编辑的步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述干细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列或者所述C9ORF72基因的安全港座位内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正以及C9orf72蛋白质活性的恢复。
在一些实施例中，将所述细胞植入到所述患者体内的所述步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述神经细胞植入到所述患者体内。
另一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：对所述患者的细胞中的C9ORF72基因进行编辑。
所述在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑或者在安全港座位附近或内进行编辑或者在所述C9ORF72基因的第一外显子的座位处或附近进行编辑的步骤可以包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述细胞中以在所述C9ORF72基因或对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近或影响所述C9ORF72基因的表达或功能的一个或多个突变或外显子的表达或功能的永久插入、修正或调节中，或者在安全港座位内或附近产生一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。所述安全港座位可以选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述对所述患者的细胞的所述C9ORF72基因进行编辑的步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述细胞中，以在所述C9ORF72基因内或附近实现一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正。
在一些体内实施例中，所述细胞是神经细胞、骨髓细胞、造血祖细胞或者CD34+细胞。
在一些实施例中，所述一个或多个DNA内切核酸酶是：Cas1内切核酸酶、Cas1B内切核酸酶、Cas2内切核酸酶、Cas3内切核酸酶、Cas4内切核酸酶、Cas5内切核酸酶、Cas6内切核酸酶、Cas7内切核酸酶、Cas8内切核酸酶、Cas9(也被称为Csn1和Csx12)内切核酸酶、Cas100内切核酸酶、Csy1内切核酸酶、Csy2内切核酸酶、Csy3内切核酸酶、Cse1内切核酸酶、Cse2内切核酸酶、Csc1内切核酸酶、Csc2内切核酸酶、Csa5内切核酸酶、Csn2内切核酸酶、Csm2内切核酸酶、Csm3内切核酸酶、Csm4内切核酸酶、Csm5内切核酸酶、Csm6内切核酸酶、Cmr1内切核酸酶、Cmr3内切核酸酶、Cmr4内切核酸酶、Cmr5内切核酸酶、Cmr6内切核酸酶、Csb1内切核酸酶、Csb2内切核酸酶、Csb3内切核酸酶、Csx17内切核酸酶、Csx14内切核酸酶、Csx10内切核酸酶、Csx16内切核酸酶、CsaX内切核酸酶、Csx3内切核酸酶、Csx1内切核酸酶、Csx15内切核酸酶、Csf1内切核酸酶、Csf2内切核酸酶、Csf3内切核酸酶、Csf4内切核酸酶、或Cpf1内切核酸酶；或者其同系物、密码子优化后或修饰后版本。
在一些实施例中，所述方法包括：将对所述一个或多个DNA内切核酸酶进行编码的一个或多个多核苷酸引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述方法包括：将对所述一个或多个DNA内切核酸酶进行编码的一个或多个核糖核酸(RNA)引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述一个或多个多核苷酸或所述一个或多个RNA是一个或多个修饰后多核苷酸或一个或多个修饰后RNA。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将一个或多个DNA内切核酸酶引入到所述细胞中，其中所述DNA内切核酸酶是蛋白质或多肽。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将一个或多个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述一个或多个gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，所述一个或多个gRNA或所述一个或多个sgRNA是一个或多个修饰后gRNA或一个或多个修饰后sgRNA。
在一些实施例中，所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或多个gRNA或一个或多个sgRNA预先复合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将包括野生型C9ORF72基因或cDNA的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述野生型C9ORF72基因或cDNA的所述一部分是整个C9ORF72基因或cDNA或者天然变体1、变体2或变体3的cDNA。在一些实施例中，所述供体模板是单链的或双链的。在一些实施例中，所述供体模板与9p21.2区域具有同源臂。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将一个向导核糖核酸(gRNA)以及至少包括所述野生型C9ORF72基因的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述方法进一步包括：将一个向导核糖核酸(gRNA)以及至少包括密码子优化后或修饰后C9ORF72基因的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中。在一些实施例中，所述一个或多个DNA内切核酸酶是一个或多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述一个或多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的座位处实现一个单链断裂(SSB)或一个双链断裂(DSB)，所述一个SSB或一个DSB引起所述C9ORF72基因的所述染色体DNA的接近所述座位或所述安全港座位的一部分的永久插入或修正以及C9orf72蛋白质活性的恢复，并且其中所述gRNA包括与所述座位的片段或所述安全港座位互补的间隔序列。在一些实施例中，接近意指所述DSB座位上游或下游两处的核苷酸。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将两个向导核糖核酸(gRNA)以及至少包括所述野生型C9ORF72基因的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中，并且其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近或者在安全港座位内或附近实现至少两个(例如，一对)单链断裂(SSB)或一对双链断裂(DSB)——第一个位于5′座位处并且第二个位于3′座位处，所述SSB或DSB促进将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入到所述5′座位与所述3′座位之间的染色体DNA中、引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列或者安全港座位内或附近的所述5′座位与所述3′座位之间的所述染色体DNA的永久插入或修正，并且其中所述第一向导RNA包括与所述5′座位的片段互补的间隔序列并且所述第二向导RNA包括与所述3′座位的片段互补的间隔序列。
在一些实施例中，所述一个或多个gRNA是一个或两个单分子向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，所述一个或两个gRNA或所述一个或两个sgRNA是一个或两个修饰后gRNA或一个或两个修饰后sgRNA。
在一些实施例中，所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或两个gRNA或一个或两个sgRNA预先复合。
在一些实施例中，所述野生型C9ORF72基因或cDNA的所述一部分是整个C9ORF72基因或cDNA；天然变体1、变体2、或变体3的cDNA；或约30个六核苷酸重复。
在一些实施例中，所述供体模板是单链的或双链的。在一些实施例中，所述供体模板与9p21.2区域具有同源臂。
在一些实施例中，所述DSB、或所述5′DSB以及所述3′DSB位于所述C9ORF72基因的第一内含子中。
所述供体模板可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。所述供体模板可以与安全港座位具有同源臂，所述安全港座位如例如：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在一些实施例中，所述插入或修正是通过同源定向修复(HDR)进行的。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将两个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述细胞中，并且其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因内或附近实现一对双链断裂(DSB)——第一个位于5′DSB座位处并且第二个位于3′DSB座位处，所述一对DSB造成所述5′DSB座位与所述3′DSB座位之间的所述染色体DNA的缺失、引起所述C9ORF72基因内或附近的所述5′DSB座位与所述3′DSB座位之间的所述染色体DNA的永久缺失，并且其中所述第一向导RNA包括与所述5′DSB座位的片段互补的间隔序列并且所述第二向导RNA包括与所述3′DSB座位的片段互补的间隔序列。
在一些实施例中，所述两个gRNA是两个单分子向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，所述两个gRNA或所述两个sgRNA是两个修饰后gRNA或两个修饰后sgRNA。
在一些实施例中，所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或两个gRNA或一个或两个sgRNA预先复合。
在一些实施例中，所述5′DSB和所述3′DSB位于所述C9ORF72基因的第一外显子、第一内含子或第二外显子中或附近。
在一些实施例中，所述缺失是所述扩增六核苷酸重复的缺失。
在一些实施例中，所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA、以及供体模板各自被单独配制成脂质纳米颗粒或全部被共同配制成脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA、以及供体模板被配制成单独的外来体或者被共同配制成外来体。
在一些实施例中，所述Cas9或Cpf1 mRNA被配制成脂质纳米颗粒，并且所述gRNA和所述供体模板均通过病毒载体递送到所述细胞中。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV6载体。
所述Cas9或Cpf1 mRNA可以被配制成脂质纳米颗粒；并且所述gRNA可以通过电穿孔递送到所述细胞中；并且所述供体模板可以通过病毒载体递送到所述细胞中。所述病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体。所述AAV载体可以是AAV6载体。
在一些实施例中，所述C9ORF72基因位于9号染色体上：27,546,542到27,573,863(基因组参照序列联盟(Genome Reference Consortium)-GRCh38/hg38)。
在一些实施例中，将C9orf72蛋白质活性的所述恢复与野生型或正常C9orf72蛋白质活性进行比较。
另一方面，本文提供了一种或多种向导核糖核酸(gRNA)，其包括选自由SEQ ID NO1到18807中的核酸序列组成的群组的间隔序列，所述一种或多种gRNA用于对来自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者的细胞中的C9ORF72基因进行编辑。在一些实施例中，所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，所述一种或多种gRNA或所述一种或多种sgRNA是一种或多种修饰后gRNA或一种或多种修饰后sgRNA。
本文还提供了一种或多种向导核糖核酸(gRNA)，其包括选自由SEQ ID NO 18810到73668中的核酸序列组成的群组的间隔序列，所述一种或多种gRNA用于对来自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者的细胞中的安全港座位进行编辑，并且其中所述安全港座位选自由以下组成的群组：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR在一些实施例中，所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，所述一种或多种gRNA或所述一种或多种sgRNA是一种或多种修饰后gRNA或一种或多种修饰后sgRNA。
本文还提供了已经通过前述方法修饰以永久修正C9ORF72基因内的一个或多个突变并且恢复C9orf72蛋白质活性的细胞。本文进一步提供了用于通过将已经通过前述方法修饰的细胞施用到肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)患者体内来改善ALS或FTLD的方法。
在一些实施例中，本公开的方法和组合物包括一个或多个修饰后向导核糖核酸(gRNA)。修饰的非限制性实例可以包括包括在糖的2′位置处修饰的一个或多个核苷酸，在一些实施例中，所述一个或多个核苷酸为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基、或2′-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNA修饰包括RNA的3′末端处的嘧啶、脱碱基残基、脱氧核苷酸或倒位碱基上的2′-氟、2′-氨基、或2′O-甲基修饰。
在一些实施例中，所述一个或多个修饰后向导核糖核酸(gRNA)包括使修饰后gRNA比原生寡核苷酸对核酸酶消化更具抵抗力的修饰。这种修饰的非限制性实例包含：包括修饰后主链的修饰，例如，硫代磷酸酯、phosphorothyo、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键、或者短链杂原子或杂环糖间键。
另一方面，本文提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的方法，所述方法包括：将骨髓从供体移植到所述患者体内。
本文中描述和例示了各个其它方面。
附图说明
图1是示出了经受通过分解(潮汐(TIDE))分析进行的插入/缺失(indel)跟踪的向导RNA的切割百分比的曲线图。
序列表详细说明
SEQ ID NO 1到6148是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 6149到6892是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 7760到8097是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 8098到8261是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 6893到7759是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 8262到18807是用于使用氨基酸球菌属(Acidominococcus)、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)Cpf1内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 18810到20841是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 20842到21012是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 21013到21030是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 21031到21039是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 21040到21114是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 21115到22290是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向AAVS1(PPP1R12C)基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22291到22458是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Alb基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22459到22486是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向Alb基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22487到22504是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Alb基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22505到22509是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向Alb基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22510到22533是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向Alb基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22534到22912是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向Alb基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 22913到23257是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Angptl3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 23258到23293是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向Angptl3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 23294到23316是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Angptl3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 23317到23329是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向Angptl3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 23330到23392是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向Angptl3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 23393到24240是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向Angptl3基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24241到24643是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向ApoC3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24644到24668是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向ApoC3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24669到24671是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向ApoC3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24672和24673是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向ApoC3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24674到24685是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向ApoC3基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24686到24917是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向ApoC3基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 24918到26685是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向ASGR2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 26686到26891是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向ASGR2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 26892到26915是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向ASGR2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 26916和26927是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向ASGR2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 26928到27010是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向ASGR2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 27011到28450是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向ASGR2基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28451到28653是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向CCR5基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28654到28685是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向CCR5基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28686到28699是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向CCR5基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28700和28701是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向CCR5基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28702到28729是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向CCR5基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 28730到29029是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向CCR5基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 29030到30495是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向F9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 30496到30658是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向F9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 30659到30719是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向F9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 30720到30744是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向F9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 30745到30897是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向F9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 30898到33038是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向F9基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 33039到34054是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向G6PC基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 34055到34171是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向G6PC基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 34172到34195是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向G6PC基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 34196到34204是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向G6PC基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 34205到34294是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向G6PC基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 34295到35389是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向G6PC基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 35390到40882是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Gys2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 40883到41558是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向Gys2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 41559到41836是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Gys2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 41837到41950是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向Gys2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 41951到42630是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向Gys2基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 42631到51062是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向Gys2基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 51063到52755是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向HGD基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 52756到52969是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向HGD基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 52970到53052是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向HGD基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 53053到53071是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向HGD基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 53072到53272是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向HGD基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 53273到55597是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向HGD基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 55598到59392是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Lp(a)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 59393到59802是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向Lp(a)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 59803到59938是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Lp(a)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 59939到59973是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向Lp(a)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 59974到60341是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向Lp(a)基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 60342到64962是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向Lp(a)基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 64963到66982是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向PCSK9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 66983到67169是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向PCSK9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 67170到67205是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向PCSK9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 67206到67219是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向PCSK9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 67220到67359是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向PCSK9基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 67360到69153是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向PCSK9基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 69154到70291是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Serpina1基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 70292到70384是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向Serpina1基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 70385到70396是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向Serpina1基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 70397到70399是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向Serpina1基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 70400到70450是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向Serpina1基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 70451到71254是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向Serpina1基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 71255到72086是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向TF基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72087到72172是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向TF基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72173到72184是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向TF基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72185到72191是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向TF基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72192到72235是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向TF基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72236到72871是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向TF基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 72872到73171是用于使用酿脓链球菌Cas9内切核酸酶来靶向TTR基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 73172到73212是用于使用金黄色葡萄球菌Cas9内切核酸酶来靶向TTR基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 73213到73229是用于使用嗜热链球菌Cas9内切核酸酶来靶向TTR基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 73230到73231是用于使用齿垢密螺旋体Cas9内切核酸酶来靶向TTR基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 73232到73266是用于使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9内切核酸酶来靶向TTR基因的第1和第2外显子的20个碱基对间隔序列。
SEQ ID NO 73267到73668是用于使用氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌Cpf1内切核酸酶来靶向TTR基因第1和第2外显子的22个碱基对间隔序列。
具体实施方式
C9ORF72
人类C9ORF72基因位于9号染色体开放阅读框72的短(p)臂上，从碱基对27,546,542到碱基对27,573,863。所述基因的细胞发生位置处于9p21.2处。C9ORF72的突变是六字母串的核苷酸GGGGCC的六核苷酸重复扩增。健康个体中，存在很少的这种六核苷酸重复，通常为30个或更少，但是在患有疾病表型的人中，所述重复可能数以百计地发生。C9ORF72基因中的六核苷酸扩增事件存在于大约40％的家族性ALS和8％到10％的散发ALS中。
六核苷酸扩增发生于C9ORF72基因的选择性剪接的第1内含子中，并且如此并不更改编码序列或所产生的蛋白质。通常产生C9ORF72的三种选择性剪接变体(V1、V2和V3)。已经显示，扩增核苷酸重复减少了对V1的转录，然而，所产生的蛋白质的总量不受影响。
术语“六核苷酸重复扩增”是指至少重复两次的一系列六个碱基(例如，GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC)。在某些实施例中，六核苷酸重复扩增可以位于C9ORF72核酸的第1内含子中。在某些实施例中，致病性六核苷酸重复扩增至少包含C9ORF72核酸中对GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC的30次重复并且与疾病相关。在其它实施例中，致病性六核苷酸重复扩增至少包含31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多次重复。在某些实施例中，重复是连续的。在某些实施例中，重复被1个或多个核碱基中断。在某些实施例中，野生型六核苷酸重复扩增包含C9ORF72核酸中对GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC的29次或更少次重复。在其它实施例中，野生型六核苷酸重复扩增包含28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次重复。在某些实施例中，使整个六核苷酸重复扩增缺失。在某些实施例中，重复是连续的。在某些实施例中，重复被1个或多个核碱基中断。
治疗方式
本文提供了用于使用基因组工程工具通过以下操作对基因组产生永久变化的细胞方法、体外方法和体内方法：1)使C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复完全缺失；2)修正C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复或使用野生型或类似数量的六核苷酸重复来将其置换；或者3)使六核苷酸重复区域缺失并将C9ORF72 cDNA敲入到基因座位或安全港座位中。这种方法使用如CRISPR相关(Cas9、Cpf1等)核酸酶等内切核酸酶来使扩增六核苷酸重复或其部分永久缺失或对其进行置换或者插入在C9ORF72基因的基因组座位中。以此方式，本发明使用单次治疗(而不是在患者的寿命内递送潜在疗法)来恢复野生型或类似的C9ORF72内含子序列或者使扩增六核苷酸重复缺失。
本文提供了用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)和/或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的方法。这种方法的实施例是基于体外细胞的疗法。例如，产生患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)。然后，使用本文所述的材料和方法来修正这些iPS细胞的染色体DNA。接下来，使修正后iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞。最后，将造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞植入到患者体内。
本文中提供了使用CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1连同用于将野生型C9ORF72 cDNA插入到C9ORF72座位或插入到选自由以下组成的群组的安全港座位中的供体模板来恢复C9ORF72基因的正确表达的方法：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。在一些实施例中，这种方法是对可以被敲入且含有受影响外显子的cDNA的使用。除了部分cDNA方式之外，可以将完整长度的cDNA敲入到转译起始位点中。在任一情况下，所插入cDNA的表达受C9ORF72启动子的控制，所述启动子实现对C9ORF72蛋白质水平的精确调控。
本文还提供了通过将C9ORF72 cDNA插入到选自由以下组成的群组的安全港座位中来恢复C9ORF72基因的正确表达的方法：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
这种方法的另一实施例是基于体外细胞的疗法。例如，从患者体内分离白血细胞。接下来，使用本文所述的材料和方法来修正这些白血细胞的染色体DNA。最后，将编辑后白血细胞植入到患者体内。
这种方法的又另一实施例是基于体外细胞的疗法。例如，任选地对患者的骨髓执行活检。然后，从活检材料中分离出间充质干细胞。接下来，使用本文所述的材料和方法来修正这些干细胞的染色体DNA。接下来，使所述干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞。最后，将这些造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞植入到患者体内。
这种方法的进一步实施例是基于体外细胞的疗法。例如，任选地使用粒细胞集落刺激因子对患者进行治疗。例如，从患者体内分离造血祖细胞。接下来，使用本文所述的材料和方法来修正这些细胞的染色体DNA。最后，将所述细胞植入到患者体内。
体外细胞治疗方式的一个优点在于能够在施用之前对治疗剂进行综合分析。所有基于核酸酶的治疗剂都具有某种程度的脱靶效应。在体外执行基因修正允许人们在植入之前完全表征修正后细胞群。本发明的方面包含对修正后细胞的整个基因组进行测序以确保脱靶切口(如果有的话)处于与最小患者风险相关的基因组位置中。此外，可以在植入之前分离特异性细胞群，包含克隆群。
相比于其它原代细胞源，体外细胞疗法的另一优点与iPSC中的基因修正相关。iPSC是丰富的，从而使得容易获得基于细胞的疗法将需要的大量细胞。此外，iPSC是用于执行克隆分离的理想细胞类型。这允许在不冒着降低生存力的风险的情况下筛选正确的基因组修正。相比而言，其它原代细胞只能存活几个道次并且难以对其进行克隆扩增。因此，操纵iPSC以治疗ALS或FTLD将容易得多，并且将缩短进行期望基因修正所需的时间量。
这种方法的另一实施例是基于体内的疗法。在这种方法中，使用本文所述的材料和方法来修正患者体内细胞的染色体DNA。优选地，所述细胞是神经细胞、骨髓细胞、造血祖细胞或者CD34+细胞。
体内基因疗法的优点是易于进行治疗剂产生和施用。相同的治疗方式和疗法将有可能被用于治疗多于一位患者，例如，共享相同或相似基因型或等位基因的多位患者。相比而言，体外细胞疗法通常需要使用患者自身的细胞，所述细胞被分离、操纵并且返回到同一患者体内。
本文还提供了一种用于通过基因组编辑来编辑细胞中的C9ORF72基因的细胞方法。例如，从患者或动物体内分离细胞。然后，使用本文所述的材料和方法来修正所述细胞的染色体DNA。
本发明的方法，无论是细胞方法还是体外方法还是体内方法都涉及以下操作之一或其组合：使C9ORF72基因中或附近的整个扩增六核苷酸重复或其一部分缺失；将C9ORF72基因中或附近的扩增六核苷酸重复修正为野生型水平或类似水平；或者将外源C9ORF72DNA或cDNA序列或其片段引入到基因的座位中或者在基因组中的异源位置处(如安全港位点，如选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR)。修正策略和敲入策略两者都在同源定向修复(HDR)中利用供体DNA模板。任一策略中的HDR都可以借助于通过使用内切核酸酶在基因组中的特异性位点处产生一个或多个双链断裂(DSB)来实现。对HDR介导的将cDNA敲入到第一外显子中的效率的评估可以利用将cDNA敲入到“安全港”位点中，如与例如以下区域中的一个区域具有同源臂的单链DNA或双链DNA：ApoC3(11号染色体：116,829,908到116,833,071)、Angptl3(1号染色体：2,597,487到62,606,305)、Serpina1(14号染色体：94,376,747到94,390,692)、Lp(a)(6号染色体：160,531,483到160,664,259)、Pcsk9(1号染色体：55,039,475到55,064,852)、FIX(X号染色体：139,530,736到139,563,458)、ALB(4号染色体：73,404,254到73,421,411)、TTR(18号染色体：31,591,766到31,599,023)、TF(3号染色体：133,661,997到133,779,005)、G6PC(17号染色体：42,900,796到42,914,432)、Gys2(12号染色体：21,536,188到21,604,857)、AAVS1(PPP1R12C)(19号染色体：55,090,912到55,117,599)、HGD(3号染色体：120,628,167到120,682,570)、CCR5(3号染色体：46,370,854到46,376,206)、ASGR2(17号染色体：7,101,322到7,114,310)。修正策略和敲入策略两者都在同源定向修复(HDR)中利用供体DNA模板。任一策略中的HDR都可以借助于通过使用内切核酸酶在基因组中的特异性位点处产生一个或多个双链断裂(DSB)来实现。
例如，修正策略涉及在存在外源地引入以将细胞DSB应答引导到同源定向修复的供体DNA模板的情况下通过使用一个或多个Cas9和sgRNA在兴趣基因中诱导一个双链断裂或者使用两个或更多个合适的sgRNA在兴趣基因中诱导两个或更多个双链断裂来修正C9ORF72基因中的扩增六核苷酸重复(所述供体DNA模板可以是短的单链寡核苷酸、短的双链寡核苷酸、长的单链或双链DNA分子)。这种方式需要针对C9ORF72基因的异源六核苷酸重复扩增而开发和优化gRNA和供体DNA分子。
例如，敲入策略涉及使用靶向C9ORF72基因的第一或其它外显子和/或内含子上游或中的一个sgRNA或一对sgRNA将C9ORF72 cDNA敲入到基因的座位中，或者敲入在安全港位点中(如例如，选自由以下组成的群组的安全港座位的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR)。供体DNA将是与9p21.2区域具有同源臂的单链DAN或双链DNA。供体DNA可以是与靶安全港座位具有同源臂的单链DNA或双链DNA。供体模板可以是与选自由以下组成的群组的安全港座位具有同源臂的单链DNA或双链DNA：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
例如，缺失策略涉及使用一个或多个内切核酸酶和两个或更多个gRNA或sgRNA来使C9ORF72基因中的一个或多个并且优选地所有六核苷酸重复缺失。
以上策略(修正和敲入以及缺失)的优点类似，原则上包含短期和长期有利临床和实验室效果两者。敲入方式相比于修正或缺失方式并不提供一个优点：能够治疗所有患者相对于仅患者的子集。以此方式进行的基因编辑的另一问题是需要用于HDR的DNA供体。
除了以上基因组编辑策略之外，另一策略涉及通过在基因中而不是扩增六核苷酸重复区域中进行编辑或者通过在调控序列中进行编辑来调节C9orf72的表达、功能和活性。
当PAM作为DNA寡核苷酸(PAMer)反式存在时，CRISPR/Cas9内切核酸酶可以用于靶向单链RNA靶(O′Connell，M.R.等人，《自然(Nature)》，第516期，第263到266页(2014年))。可以利用对此系统的操纵在转录后RNA中特异性地诱导断裂，同时使基因组座位完整。对于从细胞中的有害RNA中敲除表达而言，这是有用的策略。在治疗ALS的背景下，一种方式将是递送特异性地靶向C9ORF72前体RNA中的六核苷酸重复的gRNA连同用于诱导切割的DNAPAMer。这将引起有害C9ORF72 mRNA的表达减少。
本发明的另一种方法涉及对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗，所述方法：包括将骨髓从供体移植到患者体内。
除了编码和剪接序列中的突变之外，还存在多种类型的基因组靶位点。
对转录和转译的调控涉及与细胞蛋白质或核苷酸相互作用的多种不同类别的位点。通常可以靶向转录因子或其它蛋白质的DNA结合位点以进行突变或缺失从而研究位点的作用，但是还可以靶向所述位点以改变基因表达。可以通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源定向修复(HDR)进行的直接基因组编辑添加位点。对转录因子结合的基因组测序、RNA表达和全基因组研究的使用增加已经增加了我们识别位点如何导致发育或时间基因调控的能力。这些控制系统可以是直接的或者可以涉及可能需要集成来自多个增强子的活动的广泛协同调控。转录因子通常结合6到12个碱基对长度的退化DNA序列。由个别位点提供的低特异性水平暗示在结合和功能结果中涉及复杂的相互作用和规则。具有较少退化的结合位点可以提供更简单的调控方式。人工转录因子可以被设计成指定在基因组中具有较少类似序列且具有较低脱靶切割可能性的较长序列。可以使这些类型的结合位点中的任何结合位点突变、缺失或甚至产生以实现基因调控或表达的变化(Canver，M.C.等人，《自然(Nature)》(2015年))。
具有这些特征的另一类基因调控区域是微RNA(miRNA)结合位点。miRNA是在转录后基因调控时发挥关键作用的非编码RNA。miRNA可以调控所有哺乳动动物蛋白质编码基因中的30％的表达。发现了通过双链RNA(RNAi)进行的特异性和潜能基因沉默，外加额外的小型非编码RNA(Canver，M.C.等人，《自然(Nature)》(2015年))。对于基因沉默而言很重要的最大类非编码RNA为miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长RNA转录本，所述转录本可以是单独的转录单元、蛋白质内含子的一部分或者其它转录本。长转录本被称为包括不完美碱基配对发夹结构的初级miRNA(pri-miRNA)。这些pri-miRNA通过微处理器切割成一个或多个较短前体miRNA(pre-miRNA)，所述微处理器是细胞核中的蛋白质复合体，包括Drosha。
pre-miRNA是具有2核苷酸3′突出的长度为约70个核苷酸的短茎环，所述短茎环被导出为成熟的19到25个核苷酸miRNA：miRNA*双链体。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(向导链)被加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)上。随从向导链(标记为*)可以是功能性的，但是经常被降解。成熟miRNA将RISC栓系到主要存在于3′非翻译区域(UTR)内的靶向mRNA中的部分互补序列基序并且诱导转录后基因沉默(Bartel，D.P.，《细胞(Cell)》，第136期，第215到233页(2009年)；Saj，A.和Lai，E.C.，《遗传与发育新见(Curr Opin Genet Dev)》，第21期，第504到510页(2011年))。
在发育、分化、细胞周期以及生长控制方面并且在哺乳动物和其它多细胞生物中的几乎所有生物学途径中，miRNA很重要。miRNA还涉及细胞周期控制、凋亡和干细胞分化、造血作用、缺氧、肌肉发育、神经形成、胰岛素分泌、胆固醇代谢、老化、病毒复制、以及免疫应答。
单个miRNA可以靶向数百个不同的mRNA转录本，而单独的转录本可以由许多不同的mRNA靶向。在miRBase(v.21)的最新版本中已经注释了超过28645个微RNA。一些miRNA通过多个座位编码，所述多个座位中的一些根据串联共转录簇而表达。所述特征允许具有多个途径和反馈控制的复杂调控网络。miRNA是这些反馈和调控电路的完整部分并且可以通过使蛋白质产量保持在限度内以帮助调控基因表达(Herranz，H.和Cohen，S.M.，《基因与发育(Genes Dev)》，第24期，第1339到1344页(2010年)；Posadas，D.M.和Carthew，R.W.，《遗传与发育新见(Curr Opin Genet Dev)》，第27期，第1到6页(2014年))。
在与异常miRNA表达相关的大量人类疾病中，miRNA也很重要。这种相关强调了miRNA调控途径的重要性。最近的miRNA缺失研究已将miRNA与对免疫应答的调控联系起来(Stern-Ginossar，N.等人，《科学(Science)》，第317期，第376到381页(2007年))。
miRNA与癌症也具有很强的联系并且可能在不同类型的癌症中起到作用。已经发现miRNA在大量肿瘤中被向下调控。miRNA在如细胞周期控制和DNA损伤应答等对关键癌症相关途径的调控方面很重要并且因此用于进行诊断且在临床上被靶向。微RNA微妙地调控血管生成的平衡，使得耗尽所有微RNA的实验抑制肿瘤血管生成(Chen，S.等人，《基因与发育(Genes Dev)》，第28期，第1054到1067页(2014年))。
如针对蛋白质编码基因而已经示出的，miRNA基因还经历与癌症一起发生的表观遗传变化。许多miRNA座位与CpG岛相关，从而增大了通过DNA甲基化对其进行调控的机会(Weber，B.、Stresemann，C.、Brueckner，B.和Lyko，F.，《细胞周期(Cell Cycle)》，第6期，第1001到1005页(2007年))。大多数研究已经使用利用染色质重塑药物进行的治疗来揭示表观遗传沉默的miRNA。
除了miRNA在RAN沉默中的作用之外，miRNA还可以激活转译(Posadas，D.M.和Carthew，R.W.，《遗传与发育新见(Curr Opin Genet Dev)》，第27期，第1到6页(2014年))。敲除这些位点可能导致靶向基因的表达减少，同时引入这些位点可能增加表达。
可以通过使种子序列(微RNA的第2碱基到第8碱基)突变来最有效地敲除单独的miRNA，这对于结合特异性而言很重要。在通过NHEJ进行的错配修复之前在此区域中进行的切割可以通过阻断结合到靶位点而有效地消除miRNA功能。还可以通过特异性地靶向回文序列附近的特殊环区域来抑制miRNA。催化失活的Cas9还可以用于抑制shRNA表达(Zhao，Y.等人，《科学报告(Sci Rep)》，第4期，第3943页(2014年))。除了靶向miRNA之外，还可以靶向结合位点并使其突变以防止通过miRNA进行的沉默。
人类细胞
为了改善ALS或FTLD，如本文所描述和说明的，用于基因编辑的主要靶是人类细胞。例如，在体外方法中，人类细胞是体细胞，所述体细胞在使用如所描述的技术进行修饰之后可能产生神经细胞或祖细胞。例如，在体内方法中，人类细胞是神经细胞。
通过在源自于且因此已经与有需要的患者完全匹配的自体细胞中执行基因编辑，有可能生成这样的细胞：所述细胞可以被安全地重新引入到患者体内并且有效地产生一群细胞，所述一群细胞将有效地改善与患者疾病相关的一个或多个临床病状。
祖细胞(本文中也被称为干细胞)既能够进行增殖又能够产生更多的祖细胞，这些祖细胞进而有能力产生大量母细胞，所述母细胞进而可以产生分化后或可分化的子细胞。可以诱导子细胞自身增殖并产生子代，所述子代随后分化成一个或多个成熟细胞类型，而且同时保留具有亲代发育潜能的一个或多个细胞。术语“干细胞”则是指在特定情况下有能力或潜能分化成更特化或分化的表型并且在某些情况下保留增殖而基本上不分化的能力的细胞。在一个实施例中，术语祖细胞或干细胞是指广义的母细胞，其后代(子代)经常在不同方向上通过如在胚细胞和组织的逐渐多样化中发生的分化——例如，通过获取完全独立的特征——而特化。细胞分化是通常通过许多细胞分裂而发生的一个复杂过程。分化后细胞可以源自于本身源自于专能细胞等的专能细胞。虽然这些专能细胞中的每个专能细胞可以被视为干细胞，但是每个专能细胞可以产生的细胞类型的范围可以大大变化。一些分化后细胞还可能有能力产生具有更大发育潜能的细胞。这种能力可以是天然的或者可以在使用各种因子进行治疗时进行人工诱导。在许多生物学实例中，干细胞也是“专能的”，因为其可以产生多于一个不同细胞类型的子代，但是对于“干性”而言，这不是必需的。
自我更新是干细胞的另一重要方面。理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种机制发生。干细胞可以不对称地分裂，其中，一个子细胞保留干细胞状态，并且另一个子细胞表达其它某种不同的特异性功能和表型。可替代地，群体中的干细胞中的一些干细胞可以对称地分裂成两个干细胞，由此使群体中的一些干细胞保持完整，而群体中的其它细胞仅产生分化后子代。总体而言，“祖细胞”具有更原始的细胞表型(即，相比于完全分化后细胞，处于沿着发育途径或进展的较早步骤)。祖细胞还经常具有显著的或非常高的增殖潜能。祖细胞可以产生多个不同的分化后细胞类型或者单个分化后细胞类型，这取决于发育途径并且取决于细胞发育和分化的环境。
在细胞个体发育中，形容词“分化后的(differentiated)”或“分化中的(differentiating)”是相对术语。“分化后细胞”是相比于与其比较的细胞已经在发育途径上进一步向下进展的细胞。因此，干细胞可以分化成谱系限制的前体细胞(如肌细胞祖细胞)，所述前体细胞进而可以在所述途径上进一步向下分化成其它类型的前体细胞(如肌细胞前体)并且然后分化成如肌细胞等末期分化后细胞，所述末期分化后细胞在某一组织类型中起到关键作用并且可以或可以不保留进一步增殖的能力。
术语“造血祖细胞”是指干细胞谱系中产生所有血细胞类型的细胞，所述血细胞类型包括红系细胞(红血球或红细胞(RBC))、骨髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸细胞、巨核细胞/血小板、以及树突细胞)、以及淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。
“红系谱系中的细胞”表示被接触的细胞是经历红细胞生成的细胞，使得在最终分化时，所述细胞形成红血球或红细胞。这种细胞源自骨髓造血祖细胞。在暴露于特异性生长因子和造血微环境的其它成分时，造血祖细胞可以通过一系列中间分化细胞类型——即，红系谱系中的所有中间体——而成熟为RCN。因此，“红系谱系”中的细胞包括造血祖细胞、原红细胞、早幼红细胞、成红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞、以及红血球。
在一些实施例中，造血祖细胞可以表达造血祖细胞特有的以下细胞表面标志物中的至少一个细胞表面标志物：CD34+、CD59+、Thyl/CD90+、CD381o/-、以及C-kit/CDl 17+。在一些实施例中，造血祖细胞为CD34+。
在一些实施例中，造血祖细胞为在已经使用如粒细胞集落刺激因子等一个或多个因子(任选地组合普乐沙福(Plerixaflor))来治疗患者之后从所述患者体内获得的外周血干细胞。在说明性实施例中，使用
Figure BDA0001772177500000311
细胞选择系统(
Figure BDA0001772177500000312
Cell SelectionSystem)(Miltenyi Biotec)来富集CD34+细胞。在一些实施例中，在基因组编辑之前使用细胞因子(例如，SCF、rhTPO、rhFLT3)在无血清培养基(例如，CellGenix的CellGrow SCGM培养基)中刺激CD34+细胞。在一些实施例中，设想了添加SR1和dmPGE2和/或其它因子以改进长期移植。
在一些实施例中，红系谱系中的造血祖细胞具有红系谱系特有的细胞表面标志物：如CD71和Terl 19。
ALS和FTLD运动神经元即脊髓中发出神经纤维以控制肌肉的大细胞的两种疾病。而且，大脑的一部分中管理随意运动的运动神经元在ALS和FTLD中被破坏。这些所谓的上运动神经元从大脑向下发送神经纤维以控制脊髓中的下运动神经元。体内方法可以直接靶向运动神经元。体内方法还可以靶向神经胶质、星形胶质细胞以及其它支持细胞。
在未公开数据中，已经显示，携带纯合子C9ORF72突变的小鼠是活的。然而，这些小鼠的特征在于预期寿命降低、脾大、中性白细胞增多症、血小板减少、以及炎症性细胞因子水平升高，从而暗示可能存在对ALS病理的免疫组分。有趣的是，骨髓移植能够延迟在C9ORF72纯合子突变小鼠中观察到的致命性和细胞因子水平。以此工作为基础，假设使用CRISPR/Cas9/Cpf1技术来修正免疫系统的细胞中的C9orf72座位可能是用于治疗ALS的一种新方式。
诱导性多能干细胞
在一些实施例中，本文所述的基因工程化人类细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的优点在于：可以从将对其施用祖细胞的同一受试者体内得到所述细胞。也就是说，可以从受试者体内获得体细胞、将所述体细胞重新编程为诱导性多能干细胞、并且然后将所述体细胞重新分化成待向受试者施用的祖细胞(例如，自体细胞)。因为祖细胞基本上源自于自体来源，所以相比于使用来自另一受试者或受试者群组的细胞，移植排斥或过敏反应的风险降低。此外，使用iPSC消除了对从胚胎来源获得的细胞的需要。因此，在一个实施例中，在本公开方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。
尽管在生理背景下分化通常是不可逆的，但是最近已经开发出了用于将体细胞重新编程为iPSC的若干方法。示例性方法对于所属领域的技术人员而言是已知的并且以下将对其进行简要描述。
术语“重新编程”是指变更或反转分化后细胞(例如，体细胞)的分化状态的过程。换句话说，重新编程是指将细胞分化向后驱动为更加未分化或更原始类型的细胞的过程。应当注意的是，对许多原代细胞进行培养可能导致完全分化特性的一些损失。因此，简单地培养包括在术语分化后细胞中的这种细胞并不使这些细胞成为非分化细胞(例如，未分化细胞)或多能细胞。除了在培养中导致分化特性的部分损失的刺激物之外，分化后细胞到多能性的转变还需要重新编程刺激物。相对于原代细胞亲代，经重新编程细胞还具有在不损失生长潜能的情况下进行延伸传代的能力的特性，所述元代细胞亲代通常在培养中具有仅有限数量的分裂的能力。
在重新编程之前，待重新编程细胞可以部分分化或者终末分化。在一些实施例中，重新编程涵盖将分化后细胞(例如，体细胞)的分化状态完全反转为多能状态或专能状态。在一些实施例中，重新编程涵盖将分化后细胞(例如，体细胞)的分化状态完全或部分反转为未分化后细胞(例如，胚胎状细胞)。重新编程可能导致由细胞表达特定基因，所述基因的表达进一步促进重新编程。在本文所述的某些实施例中，对分化后细胞(例如，体细胞)的重新编程使分化后细胞采取未分化状态(例如，为未分化细胞)。所产生的细胞被称为“经重新编程细胞”或者“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。
重新编程可能涉及改变例如反转在细胞分化期间发生的以下各项中的至少一些：核酸修饰(例如，甲基化)的可遗传模式、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等。重新编程不同于简单地维持已经是多能的细胞的现有未分化状态或者维持已经是专能细胞(例如，肌源性干细胞)的细胞的现有不到完全分化后状态。在一些实施例中，虽然重新编程还不同于促进已经是多能或专能的细胞的自我更新或增殖，但是本文所述的组合物和方法还可以用于这种目的。
本领域中已知可以用于从体细胞产生多能干细胞的许多方法。将体细胞重新编程为多能表型的任何这种方法将适合在本文所述的方法中使用。
已经描述了用于使用转录因子的定义组合来产生多能细胞的重新编程方法。可以通过对Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的直接转导将小鼠体细胞转换为具有扩展发育潜能的ES细胞状细胞；见例如Takahashi和Yamanaka，《细胞(Cell)》，第126卷，第4期，第663到676页(2006年)。iPSC与ES细胞类似，因为iPSC恢复多能性相关转录电路以及许多表观遗传景观。此外，小鼠iPSC满足针对多能性的所有标准测定：具体地，体内分化为三个胚层的细胞类型、畸胎瘤形成、对嵌合体的贡献、种系传递[见例如，Maherali和Hochedlinger，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》，第3卷，第6期，第595到605页(2008年)]、以及四倍体互补。
人类iPSC可以使用类似的转导方法来获得，并且三重转录因子OCT4、SOX2和NANOG已经被建立为管理多能性的核心的一组转录因子；见例如，Budniatzky和Gepstein，《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med.)》，第3卷，第4期，第448到457页(2014年)；Barrett等人，《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med.)》，第3期，第1到6页，sctm.2014-0121(2014年)；Focosi等人，《血液癌症杂志(Blood Cancer Journal)》，第4期，第e211页(2014年)；以及其中引用的参考文献。iPSC的产生可以通过历史上使用病毒载体引入将干细胞相关基因编码为成年体细胞的核酸序列来实现。
iPSC可以产生自或源自终末分化后体细胞以及成年体细胞或体干细胞。也就是说，可以通过重新编程使非多能祖细胞为多能或专能的。在这种实例中，可能没必要包括与对终末分化后细胞进行编程所需的一样多的重新编程因子。进一步地，重新编程可以通过对重新编程因子的非病毒引入诱导，例如，通过引入蛋白质本身、或者通过引入对重新编码因子进行编码的核酸、或者通过引入在转译时产生重新编程因子的信使RNA(见例如，Warren等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》，第7卷，第5期，第618到630页(2010年))。重新编程可以通过引入对干细胞相关基因进行编码的核酸的组合来实现，所述基因包括例如Oct-4(也被称为Oct-3/4或Pouf51)、Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15、Sox 18、NANOG、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、以及LIN28。在一个实施例中，使用本文所述的方法和组合物进行的重新编程可以进一步包括将以下各项中的一项或多项引入到体细胞：Oct-3/4、Sox家族的成员、Klf家族的成员、Myc家族的成员。在一个实施例中，本文所述的方法和组合物进一步包括引入Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4中的每一个以进行重新编码。如上所述，用于重新编程的确切方法对于本文所述的方法和组合物而言不一定关键。然而，在从经重新编程细胞分化的细胞将在例如人类疗法中使用时，在一个实施例中，重新编程并不通过变更基因组的方法来实现。因此，在这种实施例中，重新编程是在例如不使用病毒载体或质粒载体的情况下实现的。
可以通过添加各种剂例如小分子来增强源自一群起始细胞的重新编程效率(即，经重新编程细胞的数量)，如以下文献所示：Shi等人，《细胞干细胞(Cell-Stem Cell)》，第2期，第525到528页(2008)；Huangfu等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，第26卷，第7期，第795到797页(2008年)；以及Marson等人，《细胞干细胞(Cell-Stem Cell)》，第3期，第132到135页(2008年)。因此，增强诱导性多能干细胞产生的效率或比率的剂或剂的组合可以用于产生患者特异性或疾病特异性iPSC。增强重新编程效率的剂的一些非限制性实例包括可溶Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901(MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5′-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维他命C、以及曲古抑菌素(TSA)等。
重新编程增强剂的其它非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1，3-二氧代-1H，3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸(例如，苯丁酸钠和丙戊酸(VPA)以及其它短链脂肪酸)、Scriptaid、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、Apicidin、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex、AN-9)、曲普欣B(Trapoxin B)、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林(N-acetyl dinaline))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(m-羧基肉桂酸双双羟肟酸)、JNJ16241199、Tubacin、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-Cl-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9、10-环氧癸酸)、CHAP31、以及CHAP 50。其它重新编程增强剂包括例如以下各项的线性阴性形式：HDAC(例如，催化失活形式)、HDAC的siRNA抑制剂、以及特异性地结合到HDAC的抗体。这种抑制剂例如可从BIOMOL International、Fukasawa、Merck Biosciences、Novartis、Gloucester Pharmaceuticals、Titan Pharmaceuticals、MethylGene以及Sigma Aldrich获得。
为了确认诱导出供与本文所述方法一起使用的多能干细胞，可以对所分离克隆体进行测试以找到干细胞标志物的表达。源自于体细胞的细胞中的这种表达将细胞标志物为诱导性多能干细胞。干细胞标志物选自包括以下的非限制性群组：SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl、以及Natl。在一个实施例中，表达Oct4或Nanog的细胞被认为是多能的。用于检测这种标记的表达的方法可以包括例如RT-PCR以及检测经编码多肽的存在的免疫学方法，如蛋白质印迹(Western blot)或流式细胞术分析。在一些实施例中，检测不仅涉及RT-PCR，而且包括对蛋白质标志物的检测。细胞内标志物可以经由RT-PCR或如免疫细胞化学等蛋白质检测方法进行最佳识别，而细胞表面标志物很容易例如通过免疫细胞化学进行识别。
所分离细胞的多能干细胞特性可以通过测试进行确认，所述测试对iPSC分化成三个胚层中的每个胚层的细胞的能力进行评估。作为一个实例，裸鼠体内的畸胎瘤形成可以用于对所分离克隆体的多能特性进行评估。细胞被引入到裸鼠体内，并且对由所述细胞产生的肿瘤执行组织学和/或免疫组织化学。包括来自所有三个胚层的肿瘤的生长例如进一步表明细胞是多能干细胞。
神经细胞
据估计，人类神经系统具有大约3600亿个非神经胶质细胞以及900亿个神经细胞。仅仅基于形态学就存在数百种不同类型的神经元。看起来类似的神经元常常具有明显不同的性质。例如，所述神经元利用且响应于不同神经递质。
神经干细胞(NSC)是自我更新的专能细胞，其生成神经系统的主要表型。干细胞的特征在于其能够经由来自其环境的外源刺激分化成多种细胞类型。所述干细胞经历非对称细胞分裂以分裂成两个子细胞，一个是非特化的并且一个是特化的。NSC主要分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
典型的神经元将电信号从一个细胞传输到另一个细胞。神经元含有细胞体、树突、轴丘、轴突、神经末梢、以及神经肌肉接合处。可以根据树突树的形状和性质对神经元进行命名。
中枢神经系统的最多细胞成分是占据神经元之间的空间的非神经元神经胶质(“神经胶水(nerve glue)”)细胞。据估计，大约存在3600亿个胶质细胞，所述胶质细胞包括CNS中的细胞的80％到90％。神经胶质在若干一般方式方面不同于神经元，因为神经胶质：不形成突触，基本上仅具有一种类型的过程，保留分裂能力，并且相比神经元较不可电兴奋。神经胶质基于其细胞核的大小和形状而分类，并且在光显微层面与神经元区分。神经质基于大小分成两个主要类别：大胶质和小胶质。大胶质来源于外胚层并且由星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞组成。小胶质细胞很可能来源于中胚层。
产生患者特异性iPSC
本发明的体外方法的一个步骤涉及产生患者特异性iPS细胞、多个患者特异性iPS细胞或者患者特异性iPS细胞系。本领域中存在用于产生患者特异性iPS细胞的许多既定方法，如Takahashi和Yamanaka 2006年；Takahashi、Tanabe等人2007年所述。例如，产生步骤包括：a)从患者体内分离体细胞，如皮肤细胞或成纤维细胞；以及b)将一组多能性相关基因引入到体细胞中，以便诱导细胞变成多能干细胞。在一些实施例中，所述一组多能性相关基因是选自由以下组成的群组的基因中的一个或多个基因：OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG、以及cMYC。
对患者骨髓执行活检
活体组织切片是从身体取得的组织或流体样本。存在许多不同种类的活检。几乎所有活检都涉及使用锋利工具移除少量组织。如果活检将在皮肤或其它敏感区域上进行，则首先应用麻痹药物。可以根据本领域中已知方法中的任何已知方法执行活检。例如，在骨髓活检时，大针用于进入骨盆以收集骨髓。
分离白血细胞
可以根据本领域中已知的任何方法分离白血细胞。例如，可以通过离心从液体样本中分离白血细胞。
分离间充质干细胞
可以根据本领域中已知的任何方法分离间充质干细胞。例如，骨髓抽吸物被收集到具有肝素的注射器中。在珀可(Percoll)上对细胞进行洗涤和离心。在含有10％胎牛血清(FBS)的杜伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(低糖)中对细胞进行培养(Pittinger MF、MackayAM、Beck SC等人，《科学(Science)》，1999年，第284期，第143到147页)
使用GCSF治疗患者
可以任选地根据本领域中已知的任何方法使用粒细胞集落刺激因子(GCSF)对患者进行治疗。在一些实施例中，组合Plerixaflor而施用GCSF。
从患者体内分离造血祖细胞
可以通过本领域中已知的任何方法从患者体内分离造血祖细胞。使用
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细胞选择系统(Miltenyi Biotec)来富集CD34+细胞。在一些实施例中，在基因组编辑之前使用细胞因子(例如，SCF、rhTPO、rhFLT3)在无血清培养基(例如，CellGenix的CellGrowSCGM培养基)中弱刺激CD34+细胞。
基因组编辑
基因组编辑通常是指优选地以精确或预定方式修饰基因组核苷酸序列的过程。本文所述的基因组编辑方法的实例包括在基因组的精确靶位置处使用定点核酸酶切割脱氧核糖核酸(DNA)的方法，由此在基因组内的特定位置处产生双链或单链DNA断裂。这种断裂可以并且经常是通过自然的内源细胞过程进行修复，所述过程如同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)，如最近在Cox等人，《自然医学(Nature Medicine)》，第21卷，第2期，第121到131页(2015年)中评述的。NHEJ直接连接由双链断裂产生的DNA末端，有时损失或添加核苷酸序列，这可能破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为用于在断点处插入所定义DNA序列的模板。同源序列可以处于内源性基因组，如姐妹染色单体。可替代地，供体可以是如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒等外源核酸，所述外源核酸具有与核酸酶切割座位有高同源性的区域，但是可能含有额外序列或序列变化，包含可以并入所切割靶座位中的缺失。第三修复机制是微同源性介导末端连接(MMEJ)，也被称为“替代性NHEJ”，其中，遗传结果类似于NHEJ，因为在切割位点处可能发生小的缺失和插入。MMEJ利用DNA断裂侧翼的几个碱基对的同源序列驱动更有利的DNA末端连接修复结果，并且最近的报告已经进一步阐明了此过程的分子机制；见例如，Cho和Greenberg，《自然(Nature)》，第518期，第174到176页(2015年)；Kent等人，《自然结构与分子生物学(NatureStructural and Molecular Biology)》，提前在线出版doi：10.1038/nsmb.2961(2015年)；Mateos-Gomez等人，《自然(Nature)》，第518期，第254到257页(2015年)；Ceccaldi等人，《自然(Nature)》，第528期，第258到262页(2015年)。在一些实例中，有可能基于对DNA断裂位点处的潜在微同源性的分析预测修复结果。
这些基因组编辑机制中的每一种基因组编辑机制可以用于产生期望的基因组改变。基因组编辑过程中的步骤是在尽可能靠近预期突变位点的靶座位中产生一个或两个DNA断裂，所述两个DNA断裂作为双链断裂或作为两个单链断裂。这可以通过使用定点多肽来实现，如本文所描述和说明的。
如DNA内切核酸酶定点多肽可以在核酸例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，同源依赖修复或非同源末端连接或替代性非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导末端连接)。NHEJ可以在不需要同源模板的情况下修复切割后的靶核酸。这有时可能在靶核酸中在切割位点处引起小的缺失和插入(插入/缺失)并且可能导致破坏或改变基因表达。可能在同源修复模板或供体可用时发生HDR。同源供体模板包括与靶核酸切割位点侧翼的序列同源的序列。姐妹染色单体通常由细胞用作修复模板。然而，为了基因组编辑的目的，修复模板经常被供应为外源核酸，如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、或病毒核酸。在外源供体模板的情况下，常见的是，在具有同源性的侧翼区域之间引入额外的核酸序列(如转基因)或修饰(如单或多碱基变化或缺失)，使得额外的或改变后的核酸序列还变得并入靶座位中。MMEJ导致与NHEJ类似的遗传结果，因为在切割位点处可能发生小的缺失和插入。MMEJ利用切割位点侧翼的几个碱基对的同源序列驱动良好的末端连接DNA修复结果。在一些实例中，有可能基于对核酸酶靶区域中的潜在微同源性的分析预测修复结果。
因此，在一些情况下，使用同源重组将外源多核苷酸序列插入到靶核酸切割位点中。外源多核苷酸序列在本文中被称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。在一些实施例中，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的副本或者供体多核苷酸的副本的一部分被插入到靶核酸切割位点中。在一些实施例中，供体多核苷酸是外源供体多核苷酸，即，不在靶核酸切割位点处自然发生的序列。
由于NHEJ和/或HDR而产生的对靶DNA的修饰可能导致例如突变、缺失、改变、整合、基因修正、基因置换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA和将非原生核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的实例。
CRISPR内切核酸酶系统
CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat)基因组座位可能存在于许多原核生物(例如，细菌和古菌)的基因组中。在原核生物中，CRISPR座位对充当某种类型的免疫系统的产物进行编码以防卫原核生物以免于如病毒和噬菌体等外来侵入物。CRISPR座位功能有三个阶段：将新序列集成到座位中、CRISPR RNA(crRNA)的生物发生、以及外来侵入物核酸的沉默。已经识别了五种类型的CRISPR系统(例如，I型、II型、III型、U型以及V型)。
CRISPR座位包括被称为“重复”的多个短的重复序列。所述重复可以形成发夹结构和/或包括未结构化的单链序列。所述重复通常成簇地发生并且频繁地在物种之间发散。所述重复规律地间隔有被称为“间隔”的唯一插入序列，从而产生重复-间隔-重复座位架构。间隔与已知的外来侵入物序列完全相同或者与其具有高同源性。间隔-重复单元对crisprRNA(crRNA)进行编码，所述crisprRNA被处理成间隔-重复单元的成熟形式。crRNA包括参与靶向靶核酸的“种子”或间隔序列(在原核生物的自然发生形式中，间隔序列靶向外来侵入物核酸)。间隔序列位于crRNA的5′末端或3′末端。
CRISPR座位还包括对CRISPR相关(Cas)基因进行编码的多核苷酸序列。Cas基因对参与生物发生以及原核生物中的crRNA功能的干扰阶段的内切核酸酶进行编码。一些Cas基因包括同源二级结构和/或三级结构。
II型CRISPR系统
II型CRISPR系统中的crRNA生物发生本质上需要反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA由内源RNaseIII进行修饰并且然后与前体crRNA阵列杂交。内源RNaseIII被募集以对前体crRNA进行切割。切割后的crRNA经受核糖核酸外切酶修剪以产生成熟的crRNA形式(例如，5′修剪)。tracrRNA保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如，Cas9)相关。crRNA-tracrRNA-Cas9复合体中的crRNA将复合体引导到crRNA可以与其杂交的靶核酸。crRNA与靶核酸的杂交活化Cas9以便进行靶核酸切割。II型CRISPR系统中的靶核酸被称为原型间隔相邻基序(PAM)。本质上，PAM对于促进定点多肽(例如，Cas9)与靶核酸的结合而言是必不可少的。II型系统(也被称为Nmeni或CASS4)进一步细分为II-A型(CASS4)和II-B型(CASS4a)。Jinek等人，《科学(Science)》，第337卷，第6096期，第816到821页(2012年)显示，CRISPR/Cas9系统对RNA可编程基因组编辑而言有用，并且国际专利申请公开号WO2013/176772提供了CRISPR/Cas内切核酸酶系统用于位点特异性基因编辑的许多实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统与II型系统具有若干重要差异。例如，Cpf1是相比于II型系统缺少tracrRNA的单个RNA引导的内切核酸酶。事实上，Cpf1相关的CRISPR阵列在不需要额外的反式激活tracrRNA的情况下被处理成成熟的crRNA。V型CRISPR阵列被处理成长度为42到44个核苷酸的短的成熟crRNA，其中，每个成熟crRNA以同向重复的19个核苷酸开始，随后是间隔序列的23到25个核苷酸。相比而言，II型系统中的成熟crRNA以间隔序列的20到24个核苷酸开始，随后是同向重复的约22个核苷酸。而且，Cpf1利用富含T的原型间隔相邻基序，使得Cpf1-crRNA复合体有效地切割短的富含T的PAM之后的靶DNA，所述短的富含T的PAM与II型系统的靶DNA之后的富含G的PAM形成对比。因此，V型系统在远离PAM的点处进行切割，而II型系统在邻近PAM的点处进行切割。此外，相比于II型系统，Cpf1经由具有4或5核苷酸5′突出的交错DNA双链断裂对DNA进行切割。II型系统经由平端双链断裂进行切割。类似于II型系统，Cpf1含有预测的RuvC状内切核酸酶域，但是缺少第二HNH内切核酸酶域，这与II型系统形成对比。
Cas基因/多肽和原型间隔相邻基序
示例性CRISPR/Cas多肽包括Fonfara等人，《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》，第42期，第2577到2590页(2014)年的图1中的Cas9多肽。自Cas基因被发现以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经经历了广泛的重写。以上Fonfara的图5提供了来自各物种的Cas9多肽的PAM序列。
定点多肽
定点多肽是在基因组编辑中用于对DNA进行切割的核酸酶。定点多肽可以作为以下各项中的任一项而施用给细胞或患者：一个或多个多肽或者对多肽进行编码的一个或多个mRNA。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定点多肽可以结合到向导RNA，所述向导RNA进而指定靶DNA中多肽针对的位点。在本文中的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的实施例中，定点多肽是如DNA内切核酸酶等内切核酸酶。
在一些实施例中，定点多肽包括多个核酸切割(即，核酸酶)域。两个或更多个核酸切割域可以经由接头链接在一起。在一些实施例中，接头包括柔性接头。接头的长度可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸。
自然发生的野生型Cas9酶包括两个核酸酶域：HNH核酸酶域和RuvC域。本文中，“Cas9”是指自然发生的Cas9和重组Cas9两者。本文中设想的Cas9酶包括HNH或HNH状核酸酶域和/或RuvC或RuvC状核酸酶域。
HNH或HNH状域包括McrA状折叠。HNH或HNH状域包括两个反向平行β链和d螺旋。HNH或HNH状域包括金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。HNH或HNH状域可以对靶核酸的一个链(例如，crRNA靶向链的互补链)进行切割。
RuvC或RuvC状域包括RNaseH或RNaseH状折叠。RuvC/RNaseH域参与多样的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA两者。RNaseH域包括被多个α螺旋围绕的5个β链。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH状域包括金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH状域可以对靶核酸的一个链(例如，双链靶DNA的非互补链)进行切割。
定点多肽可以在核酸例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，同源依赖修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)或替代性非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导末端连接(MMEJ))。NHEJ可以在不需要同源模板的情况下修复切割后的靶核酸。这有时可能在靶核酸中在切割位点处引起小的缺失和插入(插入/缺失)并且可能导致破坏或改变基因表达。可能在同源修复模板或供体可用时发生HDR。同源供体模板包括与靶核酸切割位点侧翼的序列同源的序列。姐妹染色单体通常由细胞用作修复模板。然而，为了基因组编辑的目的，修复模板经常被供应为外源核酸，如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、或病毒核酸。在外源供体模板的情况下，常见的是，在具有同源性的侧翼区域之间引入额外的核酸序列(如转基因)或修饰(如单或多碱基变化或缺失)，使得额外的或改变后的核酸序列还变得并入靶座位中。MMEJ导致与NHEJ类似的遗传结果，因为在切割位点处可能发生小的缺失和插入。MMEJ利用切割位点侧翼的几个碱基对的同源序列驱动良好的末端连接DNA修复结果。在一些实例中，有可能基于对核酸酶靶区域中的潜在微同源性的分析预测修复结果。
因此，在一些情况下，使用同源重组将外源多核苷酸序列插入到靶核酸切割位点中。外源多核苷酸序列在本文中被称为供体多核苷酸(或供体或供体序列)。在一些实施例中，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的副本或者供体多核苷酸的副本的一部分被插入到靶核酸切割位点中。在一些实施例中，供体多核苷酸是外源供体多核苷酸，即，不在靶核酸切割位点处自然发生的序列。
由于NHEJ和/或HDR而产生的对靶DNA的修饰可能导致例如突变、缺失、改变、整合、基因修正、基因置换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA和将非原生核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的实例。
在一些实施例中，定点多肽包括与野生型示例性定点多肽[例如，来自酿脓链球菌的Cas9，US2014/0068797 Sequence ID No.8或者Sapranauskas等人，《核酸研究(NucleicAcids Res)》，第39卷，第21期，第9275到9282页(2011年)]和各种其它定点多肽具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或者100％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，定点多肽包括与野生型示例性定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的核酸酶域具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或者100％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，在10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。在一些实施例中，在10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。在一些实施例中，在定点多肽的HNH核酸酶域中的10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。在一些实施例中，在定点多肽的HNH核酸酶域中的10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。在一些实施例中，在定点多肽的RuvC核酸酶域中的10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。在一些实施例中，在定点多肽的RuvC核酸酶域中的10个连续氨基酸内，定点多肽包括与野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％一致性。
在一些实施例中，定点多肽包括野生型示例性定点多肽的修饰后形式。野生型示例性定点多肽的修饰后形式包括降低定点多肽的核酸切割活性的突变。在一些实施例中，野生型示例性定点多肽的修饰后形式具有野生型示例性定点多肽的(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的核酸切割活性的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％，、或小于1％。定点多肽的修饰后形式可能基本上不具有核酸切割活性。当定点多肽是基本上不具有核酸切割活性的修饰后形式时，其在本文中被称为是“酶失活的”。
在一些实施例中，定点多肽的修饰后形式包括突变，使得所述突变可以在靶核酸上诱导单链断裂(SSB)(例如，通过仅对双链靶核酸的糖-磷酸主链中的一个进行切割)。在一些实施例中，突变导致野生型定点多肽(例如，以上来自酿脓链球菌的Cas9)的所述多个核酸切割域中的一个或多个中的核酸切割活性的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、或小于1％。在一些实施例中，突变导致所述多个核酸切割域保留对靶核酸的互补链进行切割的能力，但是降低其对靶核酸的非互补链进行切割的能力。在一些实施例中，突变导致所述多个核酸切割域保留对靶核酸的非互补链进行切割的能力，但是降低其对靶核酸的互补链进行切割的能力。例如，使野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽中的残基，如Asp10、His840、Asn854和Asn856突变以使所述多个核酸切割域(例如，核酸酶域)中的一个或多个失活。在一些实施例中，待突变的残基对应于野生型示例性酿脓链球菌Cas9中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构对齐所确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。所属领域的技术人员将认识到，除了丙氨酸取代之外的突变是适当的。
在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A或N856A突变中的一种或多种突变组合以产生基本上缺少DNA切割活性的定点多肽。在一些实施例中，H840A突变与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种突变组合以产生基本上缺少DNA切割活性的定点多肽。在一些实施例中，N854A突变与H840A、D10A或N856A突变中的一种或多种突变组合以产生基本上缺少DNA切割活性的定点多肽。在一些实施例中，N856A突变与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种突变组合以产生基本上缺少DNA切割活性的定点多肽。包括一个基本上失活的核酸酶域的定点多肽被称为“切口酶”。
可以使用RNA引导的内切核酸酶例如Cas9的切口酶变体来增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由被设计成与靶序列中的指定的～20核苷酸序列(如内源基因组座位)杂交的单个向导RNA引导。然而，在向导RNA与靶座位之间可以耐受若干错配，从而有效地将靶位点中的所需同源性的长度减小为例如小到13nt的同源性，并且由此引起通过CRISPR/Cas9复合体在靶基因组中其它地方进行结合和双链核酸切割——也被称为脱靶切割——的潜能上升。因为Cas9的切口酶变体各自仅对一个链进行切割，所以为了产生双链断裂，有必要使一对切口酶在靶核酸的相反链上紧密结合，由此产生相当于双链断裂的一对切口。这要求两个单独的向导RNA——每个切口酶一个——必须在靶核酸的相反链上紧密结合。此要求基本上使发生双链断裂所需的同源性的最小长度加倍，由此降低将在基因组中的其它地方发生双链切割的可能性，其中，这两个向导RNA位点——如果它们存在的话——不可能足够靠近彼此以使双链断裂能够形成。如本领域中所述，切口酶还可以用于促进HDR对NHEJ。HDR可以用于通过使用有效地介导期望改变的特异性供体序列来将所选改变引入到基因组的靶位点中。可以在例如国际专利申请公开号WO2013/176772中并且在《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，第32期，第347到355页(2014年)以及本文应用的参考文献中找到对用于基因编辑的各种CRISPR/Cas系统的描述。
所设想突变包括取代、添加和缺失或其任何组合。在一些实施例中，突变将突变后氨基酸转换为丙氨酸。在一些实施例中，突变将突变后氨基酸转换成另一种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、或精氨酸)。在一些实施例中，突变将突变后氨基酸转换成非天然氨基酸(例如，硒代蛋氨酸)。在一些实施例中，突变将突变后氨基酸转换成氨基酸模拟物(例如，磷酸模拟物)。在一些实施例中，突变是保守突变。例如，突变可以将突变后氨基酸转换成与突变后氨基酸的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体类似的氨基酸(例如，半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)。在一些实施例中，突变引起阅读框移位和/或产生提前终止密码子。在一些实施例中，突变引起基因的调控区域或影响一个或多个基因的表达的座位的变化。
在一些实施例中，定点多肽(例如，变体、突变后、酶失活和/或条件酶失活的定点多肽)靶向核酸。在一些实施例中，定点多肽(例如，变体、突变后、酶失活和/或条件酶失活的内切核糖核酸酶)靶向RNA。在一些实施例中，定点多肽(例如，变体、突变后、酶失活和/或条件酶失活的内切核糖核酸酶)靶向DNA。
在一些实施例中，定点多肽包括一个或多个非原生序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列、一个核酸结合域、以及两个核酸切割域(即，HNH域和RuvC域)。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列以及两个核酸切割域(即，HNH域和RuvC域)。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列以及两个核酸切割域，其中所述核酸切割域中的一者或两者包括与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9的核酸酶域至少50％的氨基酸一致性。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列、两个核酸切割域(即，HNH域和RuvC域)、以及非原生序列(例如，核定位信号)或者将定点多肽链接到非原生序列的接头。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列、两个核酸切割域(即，HNH域和RuvC域)，其中定点多肽包括核酸切割域中的一者或两者中的突变，所述突变使核酸酶域的切割活性降低至少50％。
在一些实施例中，定点多肽包括包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9至少15％的氨基酸一致性的氨基酸序列以及两个核酸切割域(即，HNH域和RuvC域)，其中核酸酶域之一包括天冬氨酸10的突变，和/或其中核酸酶域之一包括组氨酸840的突变，并且其中所述突变使一个或多个核酸酶域的切割活性降低至少50％。
在本发明的一些实施例中，所述一个或多个定点多肽例如DNA内切核酸酶包括在一起在基因组中的特异性座位处实现一个双链断裂的两个切口酶，或者在一起在基因组中的特异性座位处实现两个双链断裂的四个切口酶。可替代地，一个定点多肽例如DNA内切核酸酶在基因组中的特异性座位处实现一个双链断裂。
基因组靶向核酸
本公开提供了一种基因组靶向核酸，所述基因组靶向核酸可以将相关多肽(例如，定点多肽)的活性引导到靶核酸内的特异性靶序列。在一些实施例中，基因组靶向核酸是RNA。基因组靶向RNA在本文中被称为“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA至少包括与兴趣靶核酸序列杂交的间隔序列以及CRISPR重复序列。在II型系统中，gRNA还包括tracrRNA序列。在II型向导RNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型向导RNA中，crRNA形成双链体。在两种系统中，双链体结合定点多肽，使得向导RNA和定点多肽形成复合体。基因组靶向核酸借助于其与定点多肽的相关而提供对复合体的靶特异性。基因组靶向核酸因此引导定点多肽的活性。
示例性向导RNA包括SEQ ID NO 1到18807中的间隔序列，被示出为具有其靶序列的基因组位置以及相关的Cas9切割位置，其中所述基因组位置基于GRCh38/hg38人类基因组组装。如所属领域的普通技术人员所理解的，每个向导RNA被设计成包括与其基因组靶序列互补的间隔序列。例如，SEQ ID NO 1到18807中的间隔序列中的每个间隔序列可以放入单个RNA嵌合体或crRNA中(与相应tracrRNA一起)。见Jinek等人，《科学(Science)》，第337期，第816到821页(2012年)以及Deltcheva等人，《自然(Nature)》，第471期，第602到607页(2011年)。
在一些实施例中，基因组靶向核酸是双分子向导RNA。在一些实施例中，基因组靶向核酸是单分子向导RNA。
双分子向导RNA包括两个RNA链。第一链在5′到3′方向上包括任选的间隔扩展序列、间隔序列和最小CRISPR重复序列。第二链包括最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3′tracrRNA序列和任选的tracrRNA扩展序列。
II型系统中的单分子向导RNA在5′到3′方向上包括任选的间隔扩展序列、间隔序列、最小CRISPR重复序列、单分子向导接头、最小tracrRNA序列、3′tracrRNA序列以及任选地tracrRNA扩展序列。任选地tracrRNA扩展可以包括对向导RNA共享额外功能(例如，稳定性)的元素。单分子向导接头将最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列链接以形成发夹结构。任选地tracrRNA扩展包括一个或多个发夹。
V型系统中的单分子向导RNA在5′到3′方向上包括最小CRISPR重复序列和间隔序列。
通过说明的方式，在CRISPR/Cas系统中使用的向导RNA或其它较小RNA可以容易地通过化学手段合成，如以下所说明且在本领域中所述的。虽然化学合成程序不断扩展，但是通过如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用如PAGE等凝胶)等程序纯化这种RNA往往变得更具挑战性，因为多肽长度显著增大超过一百个核苷酸左右。用于生成更大长度的RNA的一种方式是产生连接在一起的两个或更多个分子。如对Cas9内切核酸酶进行编码的RNA等长得多的RNA更容易通过酶生成。可以在化学合成和/或酶生成RNA期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天性免疫应答的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如本领域所述的。
间隔扩展序列
在基因组靶向核酸的一些实施例中，间隔扩展序列可以提供稳定性和/或提供用于修饰基因组靶向核酸的位置。间隔扩展序列可以修饰中靶或脱靶活性或特异性。在一些实施例中，提供了间隔扩展序列。间隔扩展序列可以具有大于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔扩展序列可以具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，间隔扩展序列的长度为小于10个核苷酸。在一些实施例中，间隔扩展序列的长度为10个核苷酸到30个核苷酸之间。在一些实施例中，间隔扩展序列的长度为30个核苷酸到70个核苷酸之间。
在一些实施例中，间隔扩展序列包括另一部分(例如，稳定性控制序列、内切核糖核酸酶结合序列、核酶)。在一些实施例中，所述部分增加了核酸靶向核酸的稳定性。在一些实施例中，所述部分是转录终止子片段(即，转录终止序列)。在一些实施例中，所述部分在真核细胞中起作用。在一些实施例中，所述部分在原核细胞中起作用。在一些实施例中，所述部分在真核细胞和原核细胞两者中起作用。适当部分的非限制性实例包括：5′端帽(例如，7-甲基鸟苷酸端帽(m7G))、核糖开关序列(例如，用于允许通过蛋白质和蛋白质复合体调控稳定性和/或调控可接近性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合到荧光分子、缀合到促进荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等)、和/或为蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录阻抑蛋白、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)提供结合位点的修饰或序列。
间隔序列
间隔序列与兴趣靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的间隔以序列特异性方式经由杂交(即，碱基配对)与靶核酸相互作用。间隔的核苷酸序列因此根据兴趣靶核酸的序列而变化。
在本文中的CRISPR/Cas系统中，间隔序列被设计成与位于所述系统中使用的Cas9酶的PAM的5′处的靶核酸杂交。间隔可以与靶序列完美匹配或者可能具有错配。每个Cas9酶具有其在靶DNA中识别的特定PAM序列。例如，酿脓链球菌在靶核酸中识别包括序列5′-NRG-3′的PAM，其中R包括A或G，其中N是任何核苷酸，并且N紧挨着由间隔序列靶向的靶核酸序列的3′。
在一些实施例中，靶核酸序列包括20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包括大于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包括小于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸序列包括至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸序列包括至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸序列包括紧挨着PAM的第一核苷酸的5′的20个碱基。例如，在包括5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3′的序列(SEQ ID NO：18808)中，靶核酸包括与Ns相对应的序列，其中N是任何核苷酸，并且下划线NRG序列是酿脓链球菌PAM。
在一些实施例中，与靶核酸杂交的间隔序列具有至少6个核苷酸(nt)的长度。间隔序列可以为至少约6nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt、或至少约40nt、从约6nt到约80nt、从约6nt到约50nt、从约6nt到约45nt、从约6nt到约40nt、从约6nt到约35nt、从约6nt到约30nt、从约6nt到约25nt、从约6nt到约20nt、从约6nt到约19nt、从约10nt到约50nt、从约10nt到约45nt、从约10nt到约40nt、从约10nt到约35nt、从约10nt到约30nt、从约10nt到约25nt、从约10nt到约20nt、从约10nt到约19nt、从约19nt到约25nt、从约19nt到约30nt、从约19nt到约35nt、从约19nt到约40nt、从约19nt到约45nt、从约19nt到约50nt、从约19nt到约60nt、从约20nt到约25nt、从约20nt到约30nt、从约20nt到约35nt、从约20nt到约40nt、从约20nt到约45nt、从约20nt到约50nt、或从约20nt到约60nt。在一些实施例中，间隔序列包括20个核苷酸。在一些实施例中，间隔序列包括19个核苷酸。
在一些实施例中，间隔序列与靶核酸之间的百分比互补性为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％。在一些实施例中，间隔序列与靶核酸之间的百分比互补性为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％、或100％.在一些实施例中，在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最靠近5′的核苷酸内，间隔序列与靶核酸之间的百分比互补性为100％。在一些实施例中，在约20个连续核苷酸内，间隔序列与靶核酸之间的百分比互补性为至少60％。间隔序列和靶核酸的长度可以相差1个核苷酸到6个核苷酸，所述核苷酸可以被认为是一个或多个凸起。
在一些实施例中，间隔序列是使用计算机程序来设计或选择的。计算机程序可以使用如以下等变量：预测熔化温度、二级结构形成、预测退火温度、序列一致性、基因组上下文、染色质可接近性、％GC、基因组发生频率(例如，由于错配、插入或缺失而完全相同或类似但在一个或多个斑点上有所不同的序列的基因组发生频率)、甲基化状态、SNP的存在、等等。
最小CRISPR重复序列
在一些实施例中，最小CRISPR重复序列是与参考CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％序列一致性的序列。
最小CRISPR重复序列包括可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列形成双链体，即，碱基配对双链结构。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列一起结合到定点多肽。最小CRISPR重复序列的至少一部分与最小tracrRNA序列杂交。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的至少一部分包括与最小tracrRNA序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％互补。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的至少一部分与最小tracrRNA序列包括至多约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％互补。
最小CRISPR重复序列可以具有从约7个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，最小CRISPR重复序列的长度为从约7个核苷酸(nt)到约50nt、从约7nt到约40nt、从约7nt到约30nt、从约7nt到约25nt、从约7nt到约20nt、从约7nt到约15nt、从约8nt到约40nt、从约8nt到约30nt、从约8nt到约25nt、从约8nt到约20nt、从约8nt到约15nt、从约15nt到约100nt、从约15nt到约80nt、从约15nt到约50nt、从约15nt到约40nt、从约15nt到约30nt、或从约15nt到约25nt。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的长度为约9个核苷酸。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的长度为约12个核苷酸。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小CRISPR重复序列与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型crRNA)至少约60％完全相同。例如，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小CRISPR重复序列与参考最小CRISPR重复序列至少约65％完全相同、至少约70％完全相同、至少约75％完全相同、至少约80％完全相同、至少约85％完全相同、至少约90％完全相同、至少约95％完全相同、至少约98％完全相同、至少约99％完全相同、或100％完全相同。
最小tracrRNA序列
在一些实施例中，最小tracrRNA重复序列是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％序列一致性的序列。
最小tracrRNA序列包括与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即，碱基配对双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复一起结合到定点多肽。最小tracrRNA序列的至少一部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。在一些实施例中，最小tracrRNA序列与最小CRISPR重复序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％互补。
最小tracrRNA序列可以具有从约7个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，最小tracrRNA序列的长度可以为从约7个核苷酸(nt)到约50nt、从约7nt到约40nt、从约7nt到约30nt、从约7nt到约25nt、从约7nt到约20nt、从约7nt到约15nt、从约8nt到约40nt、从约8nt到约30nt、从约8nt到约25nt、从约8nt到约20nt、从约8nt到约15nt、从约15nt到约100nt、从约15nt到约80nt、从约15nt到约50nt、从约15nt到约40nt、从约15nt到约30nt、或从约15nt到约25nt。在一些实施例中，最小tracrRNA序列的长度为约9个核苷酸。在一些实施例中，最小tracrRNA序列的长度为约12个核苷酸。在一些实施例中，最小tracrRNA由tracrRNA nt23到48组成，如以上Jinek等人所述。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小tracrRNA序列与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型crRNA)序列至少60％完全相同。例如，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小tracrRNA序列与参考最小tracrRNA序列至少约65％完全相同、至少约70％完全相同、约75％完全相同、约80％完全相同、约85％完全相同、约90％完全相同、约95％完全相同、约98％完全相同、约99％完全相同、或100％完全相同。
在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体包括双螺旋。在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体包括至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体包括至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸。
在一些实施例中，所述双链体包括错配(即，双链体的两个链并不100％互补)。在一些实施例中，所述双链体包括至少约1、2、3、4或5个或错配。在一些实施例中，所述双链体包括至多约1、2、3、4或5个或错配。在一些实施例中，所述双链体包括不超过2个错配。
凸起
在一些实施例中，在最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体中存在“凸起”。凸起是双链体内核苷酸的未配对区域。在一些实施例中，凸起有助于将双链体结合到定点多肽。凸起在双链体的一侧包括未配对的5′-XXXY-3′，其中X是任何嘌呤，并且Y包括可以与相对链上的核苷酸形成摇摆对的核苷酸；并且在双链体的另一侧包括未配对核苷酸区域。双链体的所述两侧上的未配对核苷酸的数量可以是不同的。
在一个实例中，凸起在凸起的最小CRISPR重复链上包括未配对嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施例中，凸起包括凸起的最小tracrRNA序列链的未配对5′-AAGY-3′，其中Y包括可以与最小CRISPR重复链上的核苷酸形成摇摆对的核苷酸。
在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起包括至少1、2、3、4、或5个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起包括至多1、2、3、4、或5个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起包括1个未配对核苷酸。
在一些实施例中，双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起包括4个未配对核苷酸。
在一些实施例中，凸起包括至少一个摇摆对。在一些实施例中，凸起包括至多一个摇摆对。在一些实施例中，凸起包括至少一个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起包括至少3个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列包括至少5个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列包括至少一个鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列包括至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在各个实施例中，一个或多个发夹位于3′tracrRNA序列的3′到最小tracrRNA处。
在一些实施例中，发夹从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3′起约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20个或更多个核苷酸处开始。在一些实施例中，发夹可以从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的3′起至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸处开始。
在一些实施例中，发夹包括至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20个或更多个连续核苷酸。在一些实施例中，发夹包括至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个连续核苷酸。
在一些实施例中，发夹包括CC二核苷酸(即，两个连续的胞嘧啶核苷酸)。
在一些实施例中，发夹包括双链体核苷酸(例如，发夹中杂交在一起的核苷酸)。例如，发夹包括与3′tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
发夹中的一个或多个可以与定点多肽的向导RNA相互作用区域相互作用。
在一些实施例中，存在两个或更多个发夹，并且在一些实施例中，存在三个或更多个发夹。
3′tracrRNA序列
在一些实施例中，3′tracrRNA重复序列包括与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或100％序列一致性的序列。
在一些实施例中，3′tracrRNA序列具有从约6个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，3′tracrRNA序列可以具有从约6个核苷酸(nt)到约50nt、从约6nt到约40nt、从约6nt到约30nt、从约6nt到约25nt、从约6nt到约20nt、从约6nt到约15nt、从约8nt到约40nt、从约8nt到约30nt、从约8nt到约25nt、从约8nt到约20nt、从约8nt到约15nt、从约15nt到约100nt、从约15nt到约80nt、从约15nt到约50nt、从约15nt到约40nt、从约15nt到约30nt、或从约15nt到约25nt的长度。在一些实施例中，3′tracrRNA序列具有约14个核苷酸的长度。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，3′tracrRNA序列与参考3′tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3′tracrRNA序列)至少约60％完全相同。例如，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，3′tracrRNA序列与参考3′tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3′tracrRNA序列)至少约60％完全相同、约65％完全相同、约70％完全相同、约75％完全相同、约80％完全相同、约85％完全相同、约90％完全相同、约95％完全相同、约98％完全相同、约99％完全相同、或100％完全相同。
在一些实施例中，3′tracrRNA序列包括多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。在一些实施例中，3′tracrRNA序列包括两个双链体区域。
在一些实施例中，3′tracrRNA序列包括茎环结构。在一些实施例中，3′tracrRNA中的茎环结构包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，3′tracrRNA中的茎环结构包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，茎环结构包括功能部分。例如，茎环结构可以包括适配子、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子、或外显子。在一些实施例中，茎环结构包括至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实施例中，茎环结构包括至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
在一些实施例中，3′tracrRNA序列中的发夹包括P域。在一些实施例中，P域包括发夹中的双链区域。
tracrRNA扩展序列
无论tracrRNA是处于单分子向导还是双分子向导的背景下，都可以提供tracrRNA扩展序列。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有从约1个核苷酸到约400个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有大于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、或400个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有从约20个核苷酸到约5000个或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有大于1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列可以具有小于1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列的长度包括小于10个核苷酸。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列的长度为10个核苷酸到30个核苷酸。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列的长度为30个核苷酸到70个核苷酸。
在一些实施例中，tracrRNA扩展序列包括功能部分(例如，稳定性控制序列、核酶、内切核糖核酸酶结合序列)。在一些实施例中，功能部分包括转录终止子片段(即，转录终止序列)。在一些实施例中，功能部分具有从约10个核苷酸(nt)到约100个核苷酸、从约10nt到约20nt、从约20nt到约30nt、从约30nt到约40nt、从约40nt到约50nt、从约50nt到约60nt、从约60nt到约70nt、从约70nt到约80nt、从约80nt到约90nt、或从约90nt到约100nt、从约15nt到约80nt、从约15nt到约50nt、从约15nt到约40nt、从约15nt到约30nt、或从约15nt到约25nt的总长度。在一些实施例中，功能部分在真核细胞中起作用。在一些实施例中，功能部分在原核细胞中起作用。在一些实施例中，功能部分在真核细胞和原核细胞两者中起作用。
适当的tracrRNA扩展功能部分的非限制性实例包括：3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列(例如，用于允许通过蛋白质和蛋白质复合体调控稳定性和/或调控可接近性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，直接缀合到荧光分子、缀合到促进荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等)、和/或为蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录阻抑蛋白、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)提供结合位点的修饰或序列。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列包括引物结合位点或分子指数(例如，条码序列)。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列包括一个或多个亲和力标签。
单分子向导接头序列
在一些实施例中，单分子向导核酸的接头序列具有从约3个核苷酸到约100个核苷酸的长度。在例如以上Jinek等人中，使用了简单的4核苷酸“四环”(-GAAA-)(《科学(Science)》，第337卷，第6096期，第816到821页(2012年))。说明性接头具有从约3个核苷酸(nt)到约90nt、从约3nt到约80nt、从约3nt到约70nt、从约3nt到约60nt、从约3nt到约50nt、从约3nt到约40nt、从约3nt到约30nt、从约3nt到约20nt、从约3nt到约10nt的长度。例如，接头可以具有从约3nt到约5nt、从约5nt到约10nt、从约10nt到约15nt、从约15nt到约20nt、从约20nt到约25nt、从约25nt到约30nt、从约30nt到约35nt、从约35nt到约40nt、从约40nt到约50nt、从约50nt到约60nt、从约60nt到约70nt、从约70nt到约80nt、从约80nt到约90nt、或从约90nt到约100nt的长度。在一些实施例中，单分子向导核酸的接头在4个核苷酸与40个核苷酸之间。在一些实施例中，接头为至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、或7000个或更多个核苷酸。在一些实施例中，接头为至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、或7000个或更多个核苷酸。
接头可以包括各种序列中的任何序列，但是优选地接头将不包括这样的序列：所述序列的大量区域与向导RNA的其它部分具有同源性，这可能引起可能干扰向导的其它功能区域的分子内结合。在以上Jinek等人中，使用了简单的4核苷酸序列-GAAA-(《科学(Science)》，第337卷，第6096期，第816到821页(2012年))，但是同样可以使用众多其它序列，包括较长序列。
在一些实施例中，接头序列包括功能部分。例如，接头序列可以包括一个或多个特征，包括适配子、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子、或外显子。在一些实施例中，接头序列包括至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实施例中，接头序列包括至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
用于通过对C9ORF72基因中的扩增六核苷酸重复进行缺失或置换或者通过将C9ORF72 cDNA敲入到相应基因的座位或安全港位点中来修正细胞的基因组工程策略
本发明的体外方法的步骤涉及使用基因组工程来编辑/修正患者特异性iPS细胞。可替代地，本发明的体外方法的步骤涉及编辑/修正白血细胞、间充质干细胞、或造血祖细胞。同样，本发明的体内方法的步骤涉及使用基因组工程来编辑/修正ALS或FTLD患者体内的细胞。类似地，本发明的细胞方法中的步骤涉及通过基因组工程来编辑/修正人类细胞中的C9ORF72基因。
ALS和/或FTLD患者在C9ORF72基因中具有扩增六核苷酸重复。因此，不同的患者将通常需要类似的修正策略。可以在本发明的方法中使用任何CRISPR内切核酸酶，每个CRISPR内切核酸酶具有其自己的相关PAM，所述PAM可以或者可以不具有疾病特异性。例如，已经在SEQ ID NO 1到6148中标识了用于使用来自酿脓链球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。已经在SEQ ID NO 6149到6892中标识了用于使用来自金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。已经在SEQ ID NO 7760到8097中标识了用于使用来自嗜热链球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。已经在SEQ ID NO 8098到8261中标识了用于使用来自齿垢密螺旋体的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。己经在SEQ IDNO 6893到7759中标识了用于使用来自脑膜炎奈瑟氏球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。已经在SEQ ID NO 8262到18807中标识了用于使用来自氨基酸球菌属和毛螺菌科的CRISPR/Cas9内切核酸酶来靶向C9ORF72基因的gRNA间隔序列。已经分别在实例7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、以及91中标识了用于使用来自酿脓链球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。已经分别在实例8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、以及86中标识了用于使用来自金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。已经分别在实例9、15、21、27、33、39、45、51、57，63、69、75、81、以及87中标识了用于使用来自嗜热链球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。已经分别在实例10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、以及88中标识了用于使用来自齿垢密螺旋体的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。已经分别在实例11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、以及89中标识了用于使用来自脑膜炎奈瑟氏球菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。已经分别在实例12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、以及90中标识了用于使用来自氨基酸球菌属、毛螺菌科和新凶手弗朗西斯菌的CRISPR/Cas9内切核酸酶来进行靶向的gRNA间隔序列，例如靶向以下各项的第1和第2外显子：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR。
例如，可以通过由于不精确的NHEJ修复途径而产生的插入或缺失来修正突变。如果患者的C9ORF72基因具有插入或缺失的碱基，则靶向切割可能导致使框恢复的NHEJ介导的插入或缺失。还可以通过使用一个或多个向导RNA进行的NHEJ介导的修正来修正错义突变。可以基于局部序列或微同源性设计一个或多个切口修正突变的能力或可能性。NHEJ还可以用于直接地或者通过借助于靶向若干位置的一个gRNA或者若干gRNA进行切割来改变剪接供体或受体位点从而使基因的片段缺失。如果氨基酸、域或外显子含有突变并且可以被移除或倒位或者如果缺失以其它方式恢复蛋白质的功能，那么这可能是有用的。已经使用了多对向导链来进行缺失或倒位修正。
可替代地，用于HDR修正的供体含有具有用于允许退火的小或大侧翼同源性臂的修正后序列。HDR基本上是在DSB修复期间将所供应同源DNA序列用作模板的无错机制。同源定向修复(HDR)的比率是突变与切割位点之间的距离的函数，所以选择重叠或最近的靶位点很重要。模板可以包括同源区域侧翼的额外序列或者可以含有与基因组序列不同的序列，由此允许序列编辑。
除了通过NHEJ或HDR修正突变之外，一系列其它选项是可能的。如果存在小或大的缺失或多个突变，则可以将cDNA敲入含有受影响外显子的cDNA中。可以将完整长度的cDNA敲入到任何“安全港”中，但是必须使用所供应启动子或其它启动子。如果此构造被敲入到正确位置中，则其将具有类似于正常基因的生理控制。可以使用多对核酸酶来使突变后基因区域缺失，但是经常将必须提供供体以恢复功能。在这种情况下，将供应两个gRNA和一个供体序列。
一些基因组工程策略涉及使用C9ORF72基因中或附近的野生型或类似数量的六核苷酸重复来置换扩增六核苷酸重复，或者通过同源定向修复(HDR)——其也被称为同源重组(HR)——使扩增六核苷酸重复缺失并且将C9ORF72 cDNA敲入到相应基因的座位或者安全港座位中。同源定向修复是一种用于对在C9ORF72基因中具有扩增六核苷酸的患者进行治疗的策略。这些策略将恢复C9ORF72基因并且完全反转疾病状态。此策略将有可能基于患者的扩增六核苷酸重复的长度而需要更定制化的方式。用于修正突变的供体核苷酸很小(＜300bp)。这是有利的，因为HDR效率与供体分子的大小呈负相关。而且，预期的是，供体模板可以装配到大小受限的病毒载体分子中，例如，通过非限制性实例的方式包括大小受限的腺相关病毒(AAV)分子，已经显示所述大小受限的AAV分子是供体模板递送的有效手段。而且，预期的是，供体模板可以装配到其它大小受限的分子中，通过非限制性实例的方式，包括血小板和/或外来体或其它微囊泡。
同源定向修复是一种用于修复双链断裂(DSB)的细胞机制。最常见的形式是同源重组。存在额外的HDR途径，包括单链退火和替代性HDR。基因组工程工具允许研究者操纵细胞同源重组途径以对基因组产生位点特异性修饰。已经发现，细胞可以使用反式提供的合成供体分子修复双链断裂。因此，通过在特异性突变附近引入双链断裂和提供适当的供体，可以在基因组中进行靶向改变。在仅接收同源供体的106个细胞中，特异性切割使HDR的比率增大超过1,000倍，超过了比率1。特定核苷酸处进行的同源定向修复(HDR)的比率是到切割位点的距离的函数，所以选择重叠或最近的靶位点很重要。基因编辑相比基因添加提供了优点，因为原位修正留下了未扰动基因组的剩余部分。
用于通过HDR进行编辑的所供应供体显著变化但是通常含有用于允许对基因组DNA的退火的小或大的侧翼同源性臂的预期序列。所引入基因改变侧翼的同源性区域可以为30bp或更小，或者与可以含有启动子、cDNA等的多千碱基盒一样大。已经使用了单链寡核苷酸供体和双链寡核苷酸供体两者。这些寡核苷酸的大小范围为小于100nt到超过许多kb，但是还可以生成并使用较长的ssDNA。经常使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小环。总体而言，已经发现，AAV载体是一种非常有效的供体模板递送方式，但是单独供体的包装限制为＜5kb。供体的活跃转录使HDR增大了三倍，从而表明对启动子的包括可以提高转换。相反，供体的CpG甲基化降低了基因表达和HDR。
除了如Cas9等野生型内切核酸酶之外，存在使一个或另一个核酸酶域失活从而导致对仅一个DNA链进行切割的切口酶变体。HDR可以从单独的Cas切口酶或者使用靶区域侧翼的多对切口酶引导。供体可以是单链的、带切口的、或是dsDNA。
可以通过各种不同的方法将供体DNA与核酸酶一起供应或者独立供应，例如通过转染、纳米颗粒、微注射、或病毒转导。已经提出了一系列栓系选项以增大用于HDR的供体的可用性。实例包括将供体附接到核酸酶、附接到结合在附近结合的蛋白质的DNA、或者附接到参与DNA末端结合或修复的蛋白质。
可以通过如影响细胞循环的培养条件等多种培养条件或通过对DNA修复和相关蛋白质的靶向来引导修复途径选择。例如，为了增大HDR，可以抑制关键NHEJ分子，如KU70、KU80、或DNA连接酶IV。
在不存在供体的情况下，可以使用若干非同源修复途径接合来自DNA断裂的末端或者来自不同断裂的末端，在所述非同源修复途径中，在接合处具有很少或不具有碱基配对的情况下接合DNA末端。除了典型的NHEJ之外，存在类似的修复机制，如替代性NHEJ。如果存在两个断裂，则可以使插入片段缺失或倒位。NHEJ修复途径可能在接合处引起插入、缺失或突变。
在核酸酶切割之后使用了NHEJ来将15-kb可诱导基因表达盒插入到人类细胞系中的定义座位中。Maresca，M.、Lin，V.G.、Guo，N.和Yang，Y.，《基因组研究(Genome Res)》，第23期，第539到546页(2013年)。
除了通过NHEJ或HDR进行的基因组编辑之外，已经进行了使用NHEJ途径和HR两者的位点特异性基因插入。在某些环境下，组合方式可能适用，可能包括内含子/外显子边界。可以证明NHEJ对于在内含子中进行连接有效，而在编码区域中，无错HDR可能更适合。
如前所述，C9ORF72基因的突变是六字母串的核苷酸GGGGCC的六核苷酸重复扩增。在健康个体中，存在很少的这种六核苷酸重复，通常为约或少于30个。在患有疾病表型的人中，所述重复可能约数以百计地发生。可以使一个或多个六核苷酸重复缺失或修正以便使基因恢复到野生型或类似数量的六核苷酸重复。可替代地，可以使所有六核苷酸重复缺失。作为另外的替代方案，可以将C9ORF72 cDNA敲入到相应基因的座位中或者敲入到如选自由以下组成的群组的安全港座位等安全港座位中：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。在一些实施例中，所述方法提供可以用于促进并入来自多核苷酸供体模板的新序列以置换一个或多个突变或用于敲入到整个C9ORF72基因或cDNA中的一个gRNA或一对gRNA。
所述方法的一些实施例提供了通过对基因进行切割两次来进行缺失的gRNA对——一个gRNA在一个或多个六核苷酸重复的5′末端处进行切割，并且另一个gRNA在一个或多个六核苷酸重复的3′末端处进行切割，所述缺失促进插入来自多核苷酸供体模板的新序列以置换所述一个或多个六核苷酸重复。可以通过各自在基因组中进行DSB的一对DNA内切核酸酶或者通过在基因组中一起进行DSB的多个切口酶实现所述切割。
可替代地，所述方法的一些实施例提供了用于在一个或多个六核苷酸重复周围形成一个双链切口的一个gRNA，所述一个双链切口促进插入来自多核苷酸供体模板的新序列以置换所述一个或多个六核苷酸重复。可以通过单个DNA内切核酸酶或在基因组中一起进行DSB的多个切口酶形成双链切口。
C9ORF72基因内进行的说明性修饰包括以上提及的突变内或近侧进行的置换，如特异性突变上游或下游小于3kb、小于2kb、小于1kb、或小于0.5kb的区域内。考虑到C9ORF72基因中存在相对广泛的六核苷酸重复变体，应当理解的是，将预期以上提及的置换的众多变体(包括但不限于较大以及较小缺失)导致C9ORF72基因的恢复。
这种变体包括相比所讨论的特异性突变在5′和/或3′方向上较大或者在任一方向上较小的置换。因此，相对于特异性置换而言的“近侧”意味着与期望置换边界(本文中也被称为端点)相关的DSB座位可以处于距离所指出参考座位小于约3kb的区域内。在一些实施例中，DSB座位处于更近侧并且处于2kb内、处于1kb内、处于0.5kb内、或者处于0.1kb内。在小置换的情况下，期望端点处于或者“邻近”参考座位，这意味着端点距离参考座位100bp内、50bp内、25bp内、或者小于约10bp到5bp。
预期包括较大或较小置换的实施例提供相同的益处，只要扩增六核苷酸重复减小到野生型水平。因此期望的是，本文所描述和说明的置换的许多变体将有效改善ALS和/或FTLD。
另一基因组工程策略涉及外显子缺失。特异性外显子的靶向缺失是一种有吸引力的用于使用单个治疗混合物(cocktail)来治疗患者中的很大子集的策略。缺失可以是单六核苷酸重复缺失或多六核苷酸重复缺失。虽然多重复缺失——包括扩增六核苷酸重复的完全缺失——可以触及大量患者，但是对于较大缺失，缺失的效率随着大小增大而大大降低。因此，优选缺失的大小范围为40个碱基对(bp)到10,000个bp。例如，缺失的大小范围可以为：40个碱基对到100个碱基对；100个碱基对到300个碱基对；300个碱基对到500个碱基对；500个碱基对到1,000个碱基对；1,000个碱基对到2,000个碱基对；2,000个碱基对到3,000个碱基对；3,000个碱基对到5,000个碱基对；或者5,000个碱基对到10,000个碱基对。
为了确保前体mRNA在缺失之后得以适当处理，重要的是还使周围剪接信号缺失。剪接供体和受体通常处于相邻内含子的100个碱基对内。因此，在一些实施例中，方法提供了相对于每个兴趣外显子/内含子接合处切割大约+/-100bp到3100bp的所有gRNA。
对于基因组编辑策略中的任何基因组编辑策略，基因编辑可以通过测序或PCR分析确认基因编辑。
靶序列选择
优先地，5′边界和/或3′边界的位置相对于特定参考座位的移位用于促进或增强基因编辑的特定应用，所述特定应用部分地取决于选择用于编辑的内切核酸酶系统，如本文中进一步描述和说明的。
在靶序列选择的第一方面，许多内切核酸酶系统具有指导初始选择用于切割的潜在靶位点的规则或标准，如在CRISPR II型或v型内切核酸酶的情况下，邻近DNA切割位点的特定位置中的PAM序列基序的要求。
在靶序列选择或优化的另一方面，相对于中靶活性的频率而评估靶序列和已经遍及内切核酸酶的特定组合的“脱靶”活性的频率(即，在除了所选靶序列之外的位点处发生DSB的频率)。在一些情况下，相对于其它细胞，已经在期望座位处被正确编辑的细胞可以具有选择性优势。选择性优势的说明性但非限制性实例包括获取如以下各项等属性：提高的复制率、持久性、抵抗某些条件、提高的成功移植率或者在引入到患者体内之后的体内持久性、以及与维持这种细胞或增大这种细胞的数量或生存力相关的其它属性。在其它情况下，可以通过一种或多种用于识别、分类或以其它方式选择已经被正确编辑的细胞的筛选方法来肯定地选择已经在期望座位处被正确编辑的细胞。选择性优势和定向选择方法两者可以利用与修正相关的表型。在一些实施例中，可以对细胞进行编辑两次或更多次以产生第二修饰，所述第二修饰产生用于选择或纯化预期细胞群体的新表型。可以通过为可选择或可筛选标记物添加第二gRNA来产生这种第二修饰。在一些实施例中，可以使用含有cDNA以及还有可选择标记物的DNA片段在期望座位处对细胞进行正确编辑。
无论是任何选择性优势适用还是将在特定情况下应用任何定向选择，还通过考虑脱靶频率来引导靶序列选择，以便提高应用的效率和/或降低在除了期望靶之外的位点处发生不期望改变的可能性。如本文中和本领域中进一步描述和说明的，脱靶活性的发生受大量因素的影响，所述因素包括靶位点与各种脱靶位点之间的相同点和不通电以及所使用的特定内切核酸酶。在许多情况下，可获得辅助预测脱靶活性的生物信息学工具，并且这种工具还频繁用于识别最可能的脱靶活性位点，然后可以在实验环境中对所述位点进行评估以评价脱靶活性与中靶活性的相对频率，从而允许选择具有较高相对中靶活性的序列。本文中提供了这种技术的说明性示例，并且本领域中已知其它技术。
靶序列选择的另一方面涉及同源重组事件。众所周知的是，共享同源性区域的序列可以充当导致插入序列缺失的同源重组事件的焦点。这种重组事件在正常的染色体和其它DNA序列复制过程期间发生，并且还在合成DNA序列的其它时间发生，如在正常细胞复制周期期间有规律地发生但还可以通过各种事件(如UV光和其它DNA断裂诱导物)的发生或某些剂(如各种化学诱导物)的存在来增强的双链断裂(DSB)修复的情况下。许多这种诱导物使DSB在基因组中任意发生，并且DSB在正常细胞中有规律地诱导和修复。在修复期间，可以完全保真地重构原始序列，然而，在一些情况下，在DSB位点处引入小的插入或缺失(被称为“插入/缺失”)。
还可以在特定位置处特异性地诱导DSB，如本文所述的可以用于在所选染色体位置处引起定向或优先基因修饰事件的内切核酸酶系统的情况一样。可以在大量情况下利用同原序列在DNA修复(以及复制)的背景下经历重组的趋势，并且所述趋势是如CRISPR等基因编辑系统的一个应用的基础，在所述应用中同源定向修复用于将通过使用“供体”多核苷酸提供的兴趣序列插入到期望染色体位置中。
还可以使用特定序列之间的可以是可能包括少到十个碱基对或更少的小型“微同源性”区域的同源性区域来引起期望缺失。例如，在与附近序列具有微同源性的位点处引入单个DSB。在对这种DSB的正常修复过程期间，高频率发生的结果是由于DSB和伴随的细胞修复过程促进的重组而产生的插入序列缺失。
然而，在一些情况下，选择同源性区域内的靶序列还可能引起大得多的缺失，包括基因融合(当在编码区域中发生缺失时)，考虑到特定情况，所述缺失可能是期望的或者可能是不期望的。
本文提供的实例进一步说明了选择各种靶区域以产生被设计成诱发导致恢复野生型或类似程度的六核苷酸重复的置换的DSB，以及选择这种区域内被设计成使脱靶事件相对于中靶事件最小化的特异性靶区域。
核酸修饰
在一些实施例中，引入到细胞中的多核苷酸包括可以用于例如提高活性、稳定性或特异性、改变递送、降低宿主细胞中的先天性免疫引导、或用于其它增强的一种或多种修饰，如本文进一步描述且本领域中已知的。
在一些实施例中，在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用修饰后多核苷酸，在这种情况下，可以对向导RNA(单链向导或双链向导)和/或对引入到细胞中的Cas或Cpf1内切核酸酶进行编码的RNA进行修饰，如下所描述和说明的。可以在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用这种修饰后多核苷酸来编辑任何一个或多个基因组座位。
将CRISPR/Cas9/Cpf1系统用于非限制性地说明这种用途的目的，可以使用对向导RNA的修饰来增强包括向导RNA和Cas或Cpf1内切核酸酶的CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合体的形成和稳定性，所述向导RNA可以是单分子向导或双分子。对向导RNA的修饰还可以或者可替代地用于增强基因组编辑复合体与基因组中的靶序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以例如用于提高中靶活性。对向导RNA的修饰还可以或可替代地用于提高特异性，例如，中靶位点处的基因组编辑相较于其它(脱靶)位点处的效应的相对比率。
修饰还可以或可替代地用于例如通过增加向导RNA对细胞中存在的核糖核酸酶(RNA酶)进行的降解的抵抗力来提高向导RAN的稳定性，由此使向导RNA在细胞中的半衰期增加。在Cas或Cpf1内切核酸酶被引入到待通过需要转译以生成内切核酸酶的RNA进行编辑细胞中的实施例中，提高向导RNA半衰期的修饰特别有用，这是因为使在RNA对内切核酸酶进行编码的同时引入的向导RNA的半衰期增加可以用于增加向导RNA和编码后Cas或Cpf1内切核酸酶共存于细胞中的时间。
修饰还可以或可替代地用于降低引入到细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度。已经在包括如下文和本领域中所描述的小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰的背景下良好表征的这种应答往往与RNA的半衰期降低和/或引起与免疫应答相关的细胞因子或其它因子相关。
还可以对被引入到细胞中的对内切核酸酶进行编码的RNA进行一种或多种类型的修饰，包括但不限于提高RNA的稳定性的修饰(如通过提高存在于细胞中的RNA酶对其进行的降解)、增强对所产生产物(即，内切核酸酶)的转译的修饰、和/或降低引入到细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度。
同样可以使用如前述和其它修饰等修饰的组合。在例如CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，可以对向导RNA进行一种或多种类型的修饰(包括以上例示的修饰)和/或可以对编码Cas或Cpf1内切核酸酶的RNA进行一种或多种类型的修饰(包括以上例示的修饰)。
通过说明的方式，在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用的向导RNA或其它较小RNA可以容易地通过化学手段合成，从而使得能够容易地并入大量修饰，如以下所说明且在本领域中所述的。虽然化学合成程序不断扩展，但是通过如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用如PAGE等凝胶)等程序纯化这种RNA往往变得更具挑战性，因为多肽长度显著增大超过一百个核苷酸左右。用于生成更大长度的化学修饰RNA的一种方式是产生连接在一起的两个或更多个分子。如对Cas9内切核酸酶进行编码的RNA等长得多的RNA更容易通过酶生成。虽然一般情况下较少类型的修饰可用于酶促产生的RNA中，但是仍然存在可以用于例如提高稳定性、降低先天性免疫应答可能性或程度和/或提高其它属性的修饰，如下文和本领域中进一步描述的；并且正定期开发新类型的修饰。
通过说明各种类型的修饰的方式，特别是频繁地与较小化学合成RNA一起使用的修饰，修饰可以包括在糖的2′位置处修饰的一个或多个核苷酸，在一些实施例中，所述一个或多个核苷酸为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基、或2′-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNA修饰包括RNA的3′末端处的嘧啶、脱碱基残基或倒位碱基上的2′-氟、2′-氨基、或2′O-甲基修饰。这种修饰通常结合到寡核苷酸中，并且已经显示，针对给定靶，这些寡核苷酸相比2′-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。
已经显示，大量核苷酸和核苷修饰使其被结合到其中的寡核苷酸相比于原生寡核苷酸对核酸酶消化更具抵抗力；这些修饰后寡核苷酸相比未修饰寡核苷酸在更长的时间内完整生存。修饰后寡核苷酸的特定实例包含包括修饰后主链的寡核苷酸，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键、或者短链杂原子或杂环糖间键。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，所述主链具体地为：CH2-NH-O-CH2、CH，～N(CH3)～O～CH2(被称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中，原生磷酸二酯主链被表示为O-P--O-CH，)；酰胺主链[见De Mesmaeker等人，《化学研究述评(Acc.Chem.Res.)》，第28期，第366到374页(1995年)]；吗啉代主链结构(见Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中，寡核苷酸的磷酸二酯主链被替换为聚酰胺主链，核苷酸直接或间接结合到聚酰胺主链的氮杂氮原子，见Nielsen等人，《科学(Science)》，1991年，第254期，第1497页)。含磷键包含但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3′-5′键、这些键的2′-5′连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的反向极性的那些硼烷磷酸酯；见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050。
在以下文献中描述了基于吗啉代的寡聚化合物：Braasch和David Corey，《生物化学(Biochemistry)》，第41卷，第14期，第4503到4510页(2002年)；《创世纪(Genesis)》，第30卷，第3期(2001年)；Heasman，《发育生物学(Dev.Biol.)》，第243期，第209到214页(2002年)；Nasevicius等人，《自然遗传学(Nat.Genet.)》，第26期，第216到220页(2000年)；Lacerra等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》，第97期，第9591到9596页(2000年)；以及于1991年7月23日发布的美国专利号5,034,506。
在Wang等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》，第122期，第8595到8602页(2000年)中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包含磷原子的修饰后寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的主链。所述主链包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；含烯主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的主链；见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述美国专利中的每个美国专利在本文中通过引用结合。
还可以包含一个或多个取代的糖部分，例如处于2′位置处的以下各项之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n Nh2、或O(CH2)n CH3，其中n为1到约10；C1到C10低级烷基、烷氧基-烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨烷基氨基；聚烷氨；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施例中，修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-0-CH2CH2OCH3，也被称为2′-O-(2-甲氧乙基))(Martin等人，《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》，1995年，第78期，第486页)。其它修饰包括2′-甲氧基(2′-0-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2 CH2CH3)、以及2′-氟(2′-F)。还可以在寡核苷酸上的其它位置处进行类似修饰，特别是3′末端核苷酸上的糖的3′位置以及5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，如替代呋喃戊基团的环丁基。
在一些实施例中，核苷酸单元的糖和核苷间键即主链被置换为新颖基团。保持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这种寡聚化合物即已经显示具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被置换为含酰胺主链，例如氨基乙基甘氨酸主链。核碱基得以保留并且直接或间接地结合到所述主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262。可以在Nielsen等人，《科学(Science)》，第254期，第1497到1500页(1991年)中找到PNA化合物的另外教导。
另外地或可替代地，向导RNA还可以包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如本文所使用的，“未修饰”或“天然”核碱基包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰后核碱基包括仅很少或瞬时发现于天然核酸中的核碱基，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶(也被称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中通常被称为5-Me-C))、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC；以及合成核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(吲唑基甲基)腺嘌呤、2-(氨基甲基氨基)腺嘌呤或其它杂取代甲基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基脲嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、以及2，6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，《DNA复制(DNA Replication)》，W.H.Freeman&Co.，旧金山，第75到77页(1980年)；Gebeyehu等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，第15期，第4513页(1997年)。还可以包括本领域中已知的“普适(universal)”碱基，例如，肌苷。已经显示，5-Me-C取代物使核酸双链体稳定性增加0.6℃到1.2℃。(编者Sanghvi，Y.S.、Crooke，S.T.以及Lebleu，B.，《反义研究(Antisense Research)》，CRC出版社，Boca Raton，1993年，第276到278页)，并且是碱基取代物的实施例。
修饰后核碱基包括其它合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤基；8-氨基；8-氢硫基；8-硫烷基；8-羟基和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤基尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的核碱基；在‘The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering(聚合物科学与工程简明百科全书)’，第858到859页，编者Kroschwitz，J.I.，John Wiley&Sons，1990年中公开的核碱基；在Englisch等人，《应用化学(Angewandle Chemie)国际版》，1991年，第30期，第613页中公开的核碱基；以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，《反义研究与应用(Antisense Research andApplications)》，第289到302页，编者Crooke，S.T.和Lebleu，B.，CRC出版社，1993年中公开的核碱基。这些核碱基中的某些核碱基对提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些核碱基包含5-取代嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经显示，5-甲基胞嘧啶取代物使核酸双链体稳定性提高了0.6℃到1.2℃(编者Sanghvi，Y.S.、Crooke，S.T.以及Lebleu，B.，‘《反义研究与应用(Antisense Research and Applications)》’，CRC出版社，Boca Raton，1993年，第276到278页)，并且是碱基取代物的实施例，甚至更具体地当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰物组合时。修饰后核碱基在以下美国专利号中进行了描述：3,687,808；以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096；以及美国专利申请公开2003/0158403。
因此，术语“修饰后”是指结合到向导RNA、内切核酸酶、或向导RNA与内切核酸酶两者中的非天然糖、磷酸盐或碱基。不需要使给定寡核苷酸中的所有位置被均匀地修饰，并且事实上可以将上述修饰物中的多于一种修饰物并入单个寡核苷酸中或甚至寡核苷酸内的单个核苷中。
在一些实施例中，对内切核酸酶进行编码的向导RNA和/或mRNA(或DNA)化学连接到提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物。一些部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分[Letsinger等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第86期，第6553到6556页(1989年)]；胆酸[Manoharan等人，《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Let.)》，第4期，第1053到1060页(1994)年]；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基醇[Manoharan等人，《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》，第660期，第306到309页(1992年)，以及Manoharan等人，《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Let.)》，第3期，第2765到2770页(1993年)]；巯基胆固醇[Oberhauser等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，第20期，第533到538页(1992年)]；脂族链，例如，十二烷基二醇或十一烷基残基[Kabanov等人，《FEBS快报(FEBSLett.)》，第259期，第327到330页(1990年)，以及Svinarchuk等人，《生物化学(Biochimie)》，第75期，第49到54页(1993年)]；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-rac--丙三基3-H-磷酸酯[Manoharan等人，《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》，第36期，第3651到3654页(1995年)，以及Shea等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，第18期，第3777到3783页(1990年)]；聚胺或聚乙二醇链[Mancharan等人，《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》，第14期，第969到973页(1995年)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人，《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》，第36期，第3651到3654页(1995年)]；棕榈基部分[Mishra等人，《生物化学生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)》，第1264期，第229到237页(1995年)]；或者十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分[Crooke等人，《药理学和实验治疗学期刊(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》，第277期，第923到937页(1996年)]。还参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941。
可以使用糖或其它部分来将如阳离子聚合物和脂质体等包括核苷酸的蛋白质和复合体靶向到特定位点。例如，可以经由脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导肝细胞引导的转移；见例如，Hu等人，《蛋白质和肽快报(Protein Pept Lett.)》，第21卷，第10期，第1025到1030页(2014年)。可以使用本领域中已知且定期开发的其它系统来将在本案中使用的生物分子和/或其复合体靶向到特定兴趣靶细胞。
这些靶向分子或缀合物可以包含共价结合到功能基团的缀合物基团，所述功能基团如伯羟基基团或仲羟基基团。本发明的缀合物基团包含嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚物的药效性质的基团、以及提高寡聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包含胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、以及染料。在本发明的背景下，提高药效性质的基团包含改善摄取、提高对降解的抵抗力、和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景下，提高药代动力学性质的基团包含改善对本发明的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。在于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196以及美国专利号6,287,860中公开了带百姓缀合物基团，这些专利通过引用并入本文中。缀合物部分包含但不限于如胆固醇部分等脂质部分、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醚)、巯基胆固醇、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一基残基)、磷脂(例如，二-十六基-rac-甘油或1，2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵)、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。参见例如美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
还可以通过各种手段对较不易于化学合成且通常通过酶合成产生的较长多核苷酸进行修饰。这种修饰可以包括例如引入某些核苷酸类似物、在分子的5′或3′末端处并入特定序列或其它部分、以及其它修饰。通过说明的方式，对Cas9进行编码的mRNA的长度为约4kb并且可以通过体外转录合成。可以应用对mRNA的修饰以例如提高其转译或稳定性(如通过提高其对随着细胞降解的抵抗力)，或者以降低RNA引起通常在引入外源RNA特别是如对Cas9进行编码的RNA等较长RNA之后在细胞中观察到的先天性免疫应答的趋势。
在现有技术中已经描述了许多这种修饰物，如聚A尾、5′端帽类似物(例如，抗反向端帽类似物(Anti Reverse Cap Analog，ARCA)或m7G(5′)ppp(5′)G(mCAP))、修饰后5′或3′非翻译区域(UTR)、使用修饰后碱基(如，假UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞苷-5′-三磷酸脂(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)、或使用磷酸酶移除5′末端磷酸酯以进行治疗。这些修饰物和其它修饰物在本领域中是已知的，并且对RNA的新修饰物正被定期开发。
存在众多修饰后RNA商业供应商，包含例如TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon等。如例如TriLink所描述的，可以使用5-甲基-CTP来给予期望特性，如核酸酶稳定性提高、转译提高、或先天性免疫受体与体外转录后RNA相互作用减少。已经显示，5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP、以及假UTP和2-硫代-UTP在培养时且在体内减少先天性免疫刺激，同时增强转译，如在以下参照的Kormann等人和Warren等人的出版物中所说明的。
已经显示，可以使用体内递送的化学修饰mRNA来实现改善的治疗效果；见例如，Kormann等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，第29期，第154到157页(2011年)。这种修饰物可以例如用于提高RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。通过使用如假U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C等化学修饰物，已经发现，分别使用2-硫代-U和5-甲基-C来取代尿苷和胞苷的仅四分之一导致在小鼠中对mRNA进行的toll样受体(TLR)介导识别显著减少。通过减少激活先天性免疫系统，这些修饰物可以用于在体内有效地提高mRNA的稳定性和寿命；见例如，以上Kormann等人。
已经显示，重复施用结合了被设计成绕过先天性抗病毒应答的修饰物的合成信使RNA可以将分化后人类细胞重新编程为具有多能性。见例如，Warren等人，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》，第7卷，第5期，第618到630页(2010年)。充当原代重新编程蛋白质的这种修饰后mRNA可能是一种对多种人类细胞类型进行重新编程的高效手段。这种细胞被称为诱导性多能干细胞(iPSC)，并且已经发现，可以使用结合5-甲基-CTP、假UTP和抗反向端帽类似物(ARCA)的酶合成RNA来有效地规避细胞的抗病毒应答；见例如，以上Warren等人。
本领域中描述的其它多核苷酸修饰包含例如使用聚A尾、添加5′端帽类似物(如m7G(5′)ppp(5′)G(mCAP))、修饰5′或3′非翻译区域(UTR)、或者使用磷酸酶移除5′末端磷酸酯以进行治疗、以及正被定期开发的新方式。
已经关于对RNA干扰(RNAi)包括小干扰RNA(siRNA)的修饰开发了适用于生成供本文中使用的修饰后RNA的大量组合物和技术。siRNA在体内存在特定挑战，这是因为其对经由mRNA干扰进行的基因沉默的作用通常是瞬时的，这可能需要重复施用。此外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，并且哺乳动物细胞具有已经演化成检测和中和dsRNA的免疫应答，这通常是病毒性感染的副产物。因此，存在如PKR(dsRNA应答性激酶)等哺乳动物酶、和可能地可以介导对dsRNA的细胞应答的视黄酸诱导基因I(RIG-I)、以及可以响应于这种分子而触发诱导细胞因子的Toll样受体(如TLR3、TLR7和TLR8)；见例如，Angart等人的评述，《药物(Pharmaceuticals)》(巴塞尔)，第6卷，第4期，第440到468页(2013年)；Kanasty等人，《分子疗法(Molecular Therapy)》，第20卷，第3期，第513到524页(2012年)；Burnett等人，《生物技术杂志(Biotechnol J.)》，第6卷，第9期，第1130到1146页(2011年)；Judge和MacLachlan，《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》，第19卷，第2期，第111到124页(2008年)；以及其中引用的参考文献。
大量修饰已经被开发并且应用于提高RNA稳定性、减少先天性免疫应答、和/或结合将多核苷酸引入到人类细胞中实现可能有用的其它益处，如本文所述；见例如，Whitehead KA等人的评述，《化学与生物分子工程年评(Annual Review of Chemical andBiomolecular Engineering)》，第2期，第77到96页(2011年)；Gaglione和Messere，《药物化学短评(Mini Rev Med Chem)》，第10卷，第7期，第578到595页(2010年)；Chernolovskaya等人，《分子疗法新见(Curr Opin Mol Ther.)》，第12卷，第2期，第158到167页(2010年)；Deleavey等人，《核酸化学现行协议(Curr Protoc Nucleic Acid Chem)》，第16章，第16.3单元(2009年)；Behlke，《寡核苷酸(Oligonucleotides)》，第18卷，第4期，第305到319页(2008年)；Fucini等人，《核酸疗法(Nucleic Acid Ther)》，第22卷，第3期，第205到210页(2012年)；Bremsen等人，《遗传学前沿(Front Genet)》，第3期，第154页(2012年)。
如上所述，存在大量修饰后RNA商业供应商，所述供应商中的许多供应商专门研究被设计成提高siRNA的有效性的修饰物。基于在所述文献中报告的各种发现提供了各种方式。例如，Dharmacon指出，使用硫(硫代磷酸酯，PS)来置换非桥氧已经被广泛用于提高siRNA的核酸酶抵抗力，如由Kole，《(自然评论药物发现Nature Reviews DrugDiscovery)》，第11期，第125到140页(2012年)中所报告的。据报告，对核糖的2′位置的修饰提高了核苷酸间磷酸键的核酸酶抵抗力，同时提高了双链体稳定性(Tm)，还已经显示所述修饰提供针对免疫激活的保护。已经使具有小的耐受性良好的2′-取代物(2′-O-甲基、2′-氟、2′-水)的中度PS主链修饰的组合与供体内应用的高度稳定siRNA相关，如由Soutschek等人，《自然(Nature)》，第432期，第173到178页(2004年)所报告的；并且已经报告，2′-O-甲基修饰物有效地提高了稳定性，如由Volkov，《寡核苷酸(Oligonucleotides)》，第19期，第191到202页(2009年)所报告的。关于降低对先天性免疫应答的诱导，已经报告，使用2′-O-甲基、2′-氟、2′-水来修饰特异性序列减少了TLR7/TLR8相互作用，同时总体上保存了沉默活性；见例如，Judge等人，《分子疗法(Mol.Ther.)》，第13期，第494到505页(2006年)；以及Cekaite等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，第365期，第90到108页(2007年)。还已经显示，如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷使通过TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫作用最小化；见例如，Kariko，K.等人，《免疫(Immunity)》，第23期，第165到175页(2005年)。
还如本领域中已知且商业可获得的，可以将大量缀合物应用于如RNA等供本文中使用的可以增强由细胞对其进行的递送和/或摄取的多核苷酸，包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头、以及适配子；见例如，由Winkler，《治疗剂递送(Ther.Deliv.)》，第4期，第791到809页(2013年)进行的评述，以及其中应用的参考文献。
密码子优化
在一些实施例中，根据针对含有兴趣靶DNA的细胞中的表达的本领域方法标准对编码定点多肽的多核苷酸进行密码子优化。例如，如果预期靶核酸处于人类细胞中，则设想编码Cas9的人类密码子优化多核苷酸用于产生Cas9多肽。
基因组靶向核酸和定点多肽的复合体
基因组靶向核酸与定点多肽(例如，如Cas9等核酸引导的核酸酶)相互作用，从而形成复合体。基因组靶向核酸将定点多肽引导到靶核酸。
RNP
如上所述，定点多肽和基因组靶向核酸各自可以单独使用给细胞或患者。另一方面，可以将定点多肽与一个或多个向导RNA或一个或多个crRNA连同tracrRNA预先复合。然后可以将预先复合的材料使用给细胞或患者。这种预先复合的材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
核酸编码系统组分
另一方面，本公开提供了一种核酸，所述核酸包括对本公开的基因组靶向核酸进行编码的核苷酸序列、本公开的定点多肽和/或实施本公开的方法的实施例所需的任何核酸或蛋白质分子。
在一些实施例中，对本公开的基因组靶向核酸进行编码的核酸、本公开的定点多肽和/或实施本公开的方法的实施例所需的任何核酸或蛋白质分子包括载体(例如，重组表达载体)。
术语“载体”是指能够转运其已经被连接到的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将额外核酸片段连接到其中的圆形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的核酸片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到所述宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。
在一些实施例中，载体能够引导其被可操作连接到的核酸的表达。这种载体被称为“重组表达载体”或更简单地被称为“表达载体”，它们起到同等作用。
术语“可操作地连接”意味着兴趣核苷酸序列以允许核苷酸序列的表达的方式链接到一个或多个调控序列。术语“调控序列”旨在包含例如启动子、增强子以及其它表达控制元素(例如，多腺苷酸化信号)。这种调控序列在本领域中是已知的并且描述于例如Goeddel，《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods inEnzymology)》第185期，学术出版社(Academic Press)，加利福尼亚州圣地亚哥(1990年)。调控序列包括引导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成性表达的序列以及引导核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的序列(例如，组织特异性调控序列)。所属领域的技术人员应当理解的是，表达载体的设计可以取决于如靶细胞的选择、期望的表达水平等因素。
所设想的表达载体包含但不限于基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯性疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，白血病病毒、脾坏死病毒、以及源自于如劳斯肉瘤病毒、哈威肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓及外骨髓增殖的肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒等逆转录病毒的载体)的病毒载体以及其它组合载体。设想用于真核靶细胞的其它载体包含但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG以及pSVLSV40(Pharmacia)。只要其它载体与宿主细胞相容，就可以使用其它载体。
在一些实施例中，载体包括一个或多个转录和/或转译控制元素。根据所利用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用大量适当转录和/转译控制元素中的任何元素，包含组成型和诱导型启动子、转录增强子元素、转录终止子等。在一些实施例中，载体是自我失活载体，其使病毒序列或者CRISPR机械或其它元素的组分失活。
适当的真核启动子(即，在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包含：来自巨细胞病毒(CMV)立即早期的启动子、单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)、人延伸因子-1启动子(EF1)、包括与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的混合构建体、小鼠干细胞启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1座位启动子(PGK)、以及小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小型RNA，包括结合Cas或Cpf1内切核酸酶使用的向导RNA，如RNA聚合酶III启动子等各种启动子——包括例如U6和H1——可能是有利的。对这种启动子的描述以及用于增强这种启动子的用途的参数在本领域中是已知的，并且额外的信息和方式正被定期地进行描述；见例如，Ma，H.等人，《分子疗法-核酸(Molecular Therapy-NucleicAcids)》，第3期，第e161页(2014年)，doi：10.1038/mtna.2014.12。
表达载体还可以含有用于转译启动的核糖体结合位点以及转录终止子。表达载体还可以包含用于放大表达的适当序列。表达载体还可以包含对非原生标签(例如，组氨酸标签、血球凝聚素标签、绿色荧光蛋白等)进行编码的与定点多肽融合从而产生融合蛋白的核苷酸序列。
在一些实施例中，启动子是诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、雌激素受体调控的启动子等)。在一些实施例中，启动子是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施例中，启动子是受空间限制和/或时间限制的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。
在一些实施例中，本公开的对基因组靶向核酸进行编码的核酸和/或定点多肽被包装到递送媒剂的表面中或上以便递送到细胞。所设想的递送媒剂包含但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶、以及胶束。如本领域中所述的，可以使用各种靶向部分来增强这种媒剂与期望细胞类型或位置的优先相互作用。
将本公开的复合体、多核苷酸和核酸引入到细胞中可以通过以下方式发生：病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导转染、DEAE右旋糖酐介导转染、脂质体介导转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导核酸递送等。
递送
可以通过本领域中已知的病毒递送媒剂或非病毒递送媒剂递送向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或一个或多个内切核酸酶多核苷酸(RNA或DNA)。可替代地，可以通过本领域中已知的非病毒递送媒剂如电穿孔或脂质纳米颗粒来递送一个或多个内切核酸酶多肽。在另外的可替代实施例中，DNA内切核酸酶作为一个或多个多肽(或者单独地或与一个或多个向导RNA或一个或多个crRNA连同tracrRNA预先复合)而被递送。
可以通过非病毒递送媒剂递送多核苷酸，所述非病毒递送媒剂包含但不限于纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电的肽、小分子RNA缀合物、适配子RNA嵌合体、以及RNA融合蛋白复合物。在Peer和Lieberman，《基因疗法(Gene Therapy)》，第18期，第1127到1133页(2011年)(其集中于用于siRNA的而且对递送其它多核苷酸有用的非病毒递送媒剂)中描述了一些示例性非病毒递送媒剂。
可以通过脂质纳米颗粒(LNP)将如向导RNA、sgRNA和mRNA等对内切核酸酶进行编码的多核苷酸递送到细胞或患者。
LNP是指具有小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、或25nm的直径的任何颗粒。可替代地，纳米颗粒的大小范围可以为1nm到1000nm、1nm到500nm、1nm到250nm、25nm到200nm、25nm到100nm、35nm到75nm、或25nm到60nm。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质制成。如融合性磷脂DOPE或膜组分胆固醇等中性脂质可以包括在LNP中作为“辅助脂质”以提高转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的限制包括由于稳定性差和快速清除以及炎症应答或抗炎应答生成产生的低疗效。
LNP还可以由疏水脂质、亲水脂质、或疏水脂质和亲水脂质两者组成。
可以使用本领域中已知的脂质或脂质组合来产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例为：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、以及GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例为：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、以及7C1。中性脂质的实例为：DPSC、DPPC、POPC、DOPE、以及SM。PEG修饰的脂质的实例为：PEG-DMG、PEG-CerC14、以及PEG-CerC20。
脂质可以以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。此外，可以以宽范围的摩尔比将一个或多个多核苷酸与一个或多个脂质组合以产生LNP。
如上所述，定点多肽和基因组靶向核酸各自可以单独使用给细胞或患者。另一方面，可以将定点多肽与一个或多个向导RNA或一个或多个crRNA连同tracrRNA预先复合。然后可以将预先复合的材料使用给细胞或患者。这种预先复合的材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。虽然在许多生物过程中利用了此性质，但是在核酸富集的细胞环境中这还伴随有各种相互作用的风险。此问题的一种解决方案是形成RNA在其中与内切核酸酶预先复合的核糖核蛋白颗粒(RNP)。RNP的另一益处是保护RNA免于降解。
RNP中的内切核酸酶可以是修饰后的或未修饰的。同样，gRNA、crRNA、tracrRNA、或sgRNA可以是修饰后的或未修饰的。本领域中已知众多修饰物，并且可以使用所述修饰物。
通常可以以1∶1的摩尔比将内切核酸酶与sgRNA组合。可替代地，通常可以以1∶1∶1的摩尔比将内切核酸酶、crRNA与tracrRNA组合。然而，可以使用宽范围的摩尔比来产生RNP。
可以将病毒载体用于进行递送，如腺病毒、HPV、HSV、慢病毒、或其它病毒载体。
可以将组合腺相关病毒(AAV)用于进行递送。用于产生rAAV颗粒的技术在本领域中是标准的，在所述rAAV颗粒中，包括待递送多核苷酸、rep和cap基因、以及辅助病毒功能的待包装AAV基因组被提供到细胞。产生rAAV要求在单个细胞(本文中被表示为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即，不在其中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自于可以导出重组病毒的任何AAV血清型并且可以来自于与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包含但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、以及AAVrh.74。在例如国际专利申请公开号WO 01/83692中公开了对假病毒rAAV的产生。见表1。
表1
AAV血清型 基因库(Genbank)登录号
AAV-1 NC_002077.1
AAV-2 NC_001401.2
AAV-3 NC_001729.1
AAV-3B AF028705.1
AAV-4 NC_001829.1
AAV-5 NC_006152.1
AAV-6 AF028704.1
AAV-7 NC_006260.1
AAV-8 NC_006261.1
AAV-9 AX753250.1
AAV-10 AY631965.1
AAV-11 AY631966.1
AAV-12 DQ813647.1
AAV-13 EU285562.1
一种生成包装细胞的方法涉及产生稳定表达AAV颗粒产生的所有必要组分的细胞系。例如，可以将包括缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因、以及如新霉素抗性基因等可选标记物的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。已经通过如GC拖尾(Samulski等人，1982年，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第79期，第2077到2081页)、添加含有限制内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人，1983年，《基因(Gene)》，第23期，第65到73页)或者通过直接平端连接(Senapathy和Carter，1984年，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，第259期，第4661到4666页)等程序将AAV基因组引入到细菌质粒中。包装细胞系然后感染如腺病毒等辅助病毒。这种方法的优点在于细胞是可选地的并且适用于大规模产生rAAV。适当方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒，而不是质粒以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入到包装细胞中。
在例如Carter，1992年，《生物技术新见(Current Opinions inBiotechnology)》，第1533到1539页；以及Muzyczka，1992年，《微生物学与免疫学当前话题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》，第158期，第97到129页)。在以下文献中描述了各种方式：Ratschin等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，第4期，第2072页(1984年)；Hermonat等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第81期，第6466页(1984年)；Tratschin等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，第5期，第3251页(1985年)；McLaughlin等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》，第62期，第1963页(1988年)；以及Lebkowski等人，1988年，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，第7期，第349页(1988年)。Samulski等人(1989年，《病毒学杂志(J.Virol.)》，第63期，第3822到3828页)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995年)，《疫苗(Vaccine)》，第13期，第1244到1250页；Paul等人(1993年)，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》，第4期，第609到615页；Clark等人(1996年)，《基因疗法(GeneTherapy)》，第3期，第1124到1132页；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595。
AAV载体表型可以与靶细胞类型匹配。例如，以下示例性细胞类型可以通过所指示AAV表型等转导。见表2。
表2
组织/细胞类型 血清型
肝 AAV3、AAV5、AAV8、AAV9
骨骼肌 AAV1、AAV7、AAV6、AAV8、AAV9
中枢神经系统 AAV5、AAV1、AAV4
RPE AAV5、AAV4
感光细胞 AAV5
肺 AAV9
心脏 AAV8
胰腺 AAV8
肾 AAV2、AAV8
除了腺相关病毒载体之外，在实践本发明时可以使用其它病毒载体。这种病毒载体包含但不限于慢病毒、甲病毒、肠道病毒、瘟疫病毒、杆状病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒、乳多空病毒、痘病毒、牛痘病毒、以及单纯性疱疹病毒。
在一些实施例中，Cas9 mRNA、靶向C9ORF72基因中的一个或两个座位的sgRNA、以及供体DNA各自单独配制成脂质纳米颗粒或者全部共同配制成一个脂质纳米颗粒或者共同配制成两个或更多个脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，Cas9 mRNA被配制成脂质纳米颗粒，而sgRNA和供体DNA在AAV载体中递送。在一些实施例中，Cas9mRNA和sgRNA被共同配制成脂质纳米颗粒，而供体DNA在AAV载体中递送。
可获得用于将Cas9核酸酶作为DNA质粒、作为mRNA或作为蛋白进行递送的选项。向导RNA可以根据同一DNA表达或者还可以作为RNA进行递送。可以对RNA进行化学修饰以改变或提高其半衰期或者降低免疫应答的可能性或程度。可以在递送之前将内切核酸酶蛋白与gRNA复合。病毒载体允许高效递送；可以将Cas9的分裂版本和Cas9的较小直向同源物包装在AAV中，如供体可以那样，以供进行HDR。还存在可以递送这些组分中的每个组分的一系列非病毒递送方法，或者可以串联地采用非病毒方法和病毒方法。例如，可以使用纳米颗粒递送蛋白和向导RNA，而可以使用AAV来递送供体DNA。
基因修饰的细胞
术语“基因修饰的细胞”指包括通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统)引入的至少一种基因修饰的细胞。在本文中的一些体外实施例中，基因修饰的细胞是基因修饰的祖细胞。在本文中的一些体内实施例中，基因修饰的细胞是基因修饰的神经细胞。本文中设想了包括外源基因组靶向核酸和/或对基因组靶向核酸进行编码的外源核酸的基因修饰的细胞。
术语“控制治疗群体”描述了除了添加基因组编辑组分之外已经用相同培养基、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合度、烧瓶大小、pH等治疗的细胞群体。本领域中已知的任何方法可以用于测量C9ORF72基因中的碱基重复的长度，例如对C9ORF72 mRNA的Northern印迹分析或量化C9ORF72 mRNA。
术语“所分离细胞”指已经从其最初被发现的生物中移除的细胞或这种细胞的后代。任选地，例如，在限定条件下或在存在其它细胞的情况下，已经在体外培养细胞。任选地，细胞稍后被引入第二生物中或重新引入其(或遗传所述细胞的细胞)从中分离的生物中。
关于所分离细胞群体，术语“所分离群体”指已经从混合或非均质细胞群体中移除和分离的细胞群体。在一些实施例中，相比于细胞从中分离或富集的非均质群体，所分离群体是基本上纯细胞群体。在一些实施例中，相比于包括人类祖细胞以及得出人类祖细胞的细胞的非均质细胞群体，所分离群体是所分离人类祖细胞群体，例如，基本上纯人类祖细胞群体。
关于特定细胞群体，术语“大幅度增强”指某种细胞群体，在所述细胞群体中特定类型的细胞的出现相对于预先存在或参考水平增大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少400倍、至少1000倍、至少5000倍、至少20000倍、至少100000倍或更多倍，例如取决于这种细胞用于改善ALS和/或FTLD的期望水平。
关于特定细胞群体，术语“基本上富集的”指相对于构成总细胞群体的细胞的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或更多的细胞群体。
关于特定细胞群，术语“基本上富集的”或“基本上纯的”指相对于构成总细胞群体的细胞的至少约75％、至少约85％、至少约90％或至少约95％纯度的细胞群体。也就是说，关于祖细胞群体，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”指含有少于如本文中的术语定义的非祖细胞的细胞的约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或小于1％的细胞群体。
将基因编辑的iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞
本发明的体外方法的另一个步骤涉及将基因编辑的iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞。分化步骤可以根据本领域中已知的任何方法进行。例如，使用小分子的组合或通过递送主要转录因子，如但不限于Brn2、ASCL1、MYT1L、Sox2和Foxa2、Hes1、Hes3、Klf4、Myc、Notch1、(NICD)、PLAGL1和Rfx4，将iPSC分化成神经元。可以将iPSC分化成神经元，表达β III-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMX1B和MAP2。存在儿茶酚胺相关的酶可以指示像hESC等iPSC可以分化成多巴胺能神经元。
将基因编辑的间充质干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞
本发明的体外方法的另一个步骤涉及将基因编辑的间充质干细胞分化成神经细胞。分化步骤可以根据本领域中已知的任何方法进行。例如，使用小分子的组合或通过递送主要转录因子，如但不限于Brn2、ASCL1、MYT1L、Sox2和Foxa2、Hes1、Hes3、Klf4、Myc、Notch1、(NICD)、PLAGL1和Rfx4，将间充质干细胞分化成神经元。可以将间充质干细胞分化成神经元，表达β III-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMX1B和MAP2。存在儿茶酚胺相关的酶可以指示像hESC等间充质干细胞可以分化成多巴胺能神经元。
将细胞植入患者中
本发明的体外方法的另一个步骤涉及将细胞植入患者中。可以使用本领域中已知的植入的任何方法完成此植入步骤。例如，基因修饰的细胞可以直接注入患者的中枢神经系统中或者以其它方式对患者施用。可以使用所选标记物在体外纯化基因修饰的细胞。
药学上可接受的载剂
向本文中设想的受试者施用祖细胞的体外方法涉及使用包括祖细胞的治疗组合物。
治疗组合物含有生理上可容忍的载剂连同细胞组合物，以及任选地如本文所描述的在其中溶解或分散为活性成分的至少一个额外生物活性剂。在一些实施例中，当出于治疗目的对哺乳动物或人类患者施用时，治疗组合物基本上无免疫原性，除非这样期望。
通常，本文所描述的祖细胞作为具有药学上可接受的载剂的悬浮液施用。所属领域技术人员将认识到待在细胞组合物中使用的药学上可接受的载剂将不包含基本上干扰待递送到受试者的细胞的生存力的量的缓冲液、化合物、低温贮藏剂、或其它药剂。包括细胞的配制品可以包含例如允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲液以及任选地用于在施用时维持细胞生存力或者增强移植的营养素。这种配制品和悬浮液对所属领域技术人员已知和/或可以适用于如本文所描述的使用常规实验与祖细胞一起使用。
细胞组合物还可以被乳化或呈现为脂质体组合物，条件是乳化过程不会不利地影响细胞生存力。细胞和任何其它活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容，并且采用适合于在本文所描述的治疗方法中使用的量。
包含在细胞组合物中的额外药剂可以包含其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，其可与无机酸形成，如例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理上可容忍的载剂是本领域中熟知的。示例性液体载剂是无菌水溶液，所述无菌水溶液除了活性成分和水之外不含有任何物质，或者含有如生理pH值处的磷酸钠等缓冲液、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲盐水。仍然进一步地，水性载剂可以含有多于一种缓冲盐，以及盐，如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。液体组合物还可以含有除了水之外并且排除水之外的液相。这种额外液相的实例是甘油、如棉花籽油等植物油以及水油乳剂。用于在特定障碍或病状的治疗中有效的细胞组合物中的活性化合物的量将取决于障碍或病状的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
施用和疗效
术语“施用”、“引入”和“移植”可在以下环境中互换地使用：将例如祖细胞等细胞通过某种方法或途径置于受试者中，所述方法或途径导致引入的细胞至少部分地局限于期望的部位(如损伤或修复部位)，使得产生一种或多种期望的效果。例如祖细胞等细胞或其分化后子代可以通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送到受试者中的期望的位置，在所述期望的位置处，植入的细胞或细胞组分的至少一部分保持有活力。在对受试者施用之后细胞的生存力周期可以短至几小时，例如，二十四小时，到几天，到若干年那么长或者甚至患者的生命周期，即，长期移植。例如，在本文所描述的一些实施例中，有效量的肌原性祖细胞通过如腹膜内途径或静脉内途径等全身施用途径而施用。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换的使用并且指期望诊断、处理或治疗的任何受试者。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。
当预防地提供时，可以在任何ALS和/或FTLD症状之前对受试者施用本文所描述的祖细胞，例如，在痴呆、行走困难、腿无力、手无力、动作笨拙、说话含糊、吞咽困难、肌肉痉挛、手臂或肩膀或舌头抽搐、抬头困难或保持良好姿势困难之前。因此，预防地施用神经祖细胞群体用于预防ALS和/或FTLD。
当在治疗上提供时，在ALS和/或FTLD的症状或指示发作时(或之后)，例如在疾病发作时，提供神经祖细胞。
在本文所描述的一些实施例中，根据本文所描述的方法施用的神经祖细胞群体包括从一个或多个供体处获得的同种异体神经祖细胞。“同种异体”指神经祖细胞或包括从相同物种的一个或多个不同供体处获得的神经祖细胞的生物样品，其中一个或多个基因座位处的基因不相同。例如，对受试者施用的神经祖细胞群体可以源自一个或多个不相关供体受试者或者源自一个或多个不相同兄弟姐妹。在一些实施例中，可以使用同基因神经祖细胞群体，如从基因相同的动物处或从同卵双胞胎处获得的同基因神经祖细胞群体。在其它实施例中，神经祖细胞是自体细胞；也就是说，神经祖细胞从受试者处获得或与受试者分离并且对相同受试者施用，即供体和接受者相同。
在一个实施例中，术语“有效量”指需要预防或减轻至少一个或多个ALS和/或FTLD迹象或症状的祖细胞群体或其子代的量，并且涉及足够量的组合物以提供期望的效果例如来治疗患有ALS和/或FTLD的受试者。因此，术语“治疗上有效量”指祖细胞或包括祖细胞的组合物的当对如患有ALS和/或FTLD或者有ALS和/或FTLD风险的典型受试者施用时足以促进特定效果的量。有效量还将包含足以预防或延迟疾病症状的产生、改变疾病症状的过程(例如但不限于，减慢疾病症状的进展)、或逆转疾病症状的量。应当理解的是，对于任意给定情况，使用常规实验，本领域的普通技术人员可以确定适当的“有效量”。
为了在本文所描述的各实施例中使用，祖细胞的有效量包括至少102个祖细胞、至少5X102个祖细胞、至少103个祖细胞、至少5X103个祖细胞、至少104个祖细胞、至少5X104个祖细胞、至少105个祖细胞、至少2X105个祖细胞、至少3X105个祖细胞、至少4X105个祖细胞、至少5X105个祖细胞、至少6X105个祖细胞、至少7X105个祖细胞、至少8X105个祖细胞、至少9X105个祖细胞、至少1X106个祖细胞、至少2X106个祖细胞、至少3X106个祖细胞、至少4X106个祖细胞、至少5X106个祖细胞、至少6X106个祖细胞、至少7X106个祖细胞、至少8X106个祖细胞、至少9X106个祖细胞或其倍数。祖细胞从一个或多个供体中得到或者从自体来源中获得。在本文所描述的一些实施例中，在对需要其的受试者施用之前，祖细胞在培养中扩增。
患有ALS和/或FTLD的患者的细胞中的C9ORF72基因中的扩增的碱基重复的减少可能有益于改善疾病的一个或多个症状、增加长期存活和/或减少与其它治疗相关的副作用。在向人类患者施用这种细胞时，存在具有野生型或类似水平的碱基重复的神经祖细胞是有益的。在一些实施例中，对受试者的有效治疗引起相对于受治疗的受试者中的总碱基重复的至少约3％、5％或7％的野生型或类似水平。在一些实施例中，野生型或类似水平将为总碱基重复的至少约10％。在一些实施例中，野生型或类似水平将为总碱基重复的至少约20％到30％。类似地，对具有野生型水平的碱基重复的细胞的甚至相对有限的亚群的引入可能在各个患者中有益，因为在一些情形下，标准化细胞相对于患病细胞将具有选择性优势。然而，即使适度水平的具有野生型或类似水平的碱基重复的神经祖细胞可能有益于改善患者中的ALS和/或FTLD的一个或多个方面。在一些实施例中，施用这种细胞的患者中的神经祖细胞的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多产生野生型或类似水平的碱基重复。
“被施用”指通过某种方法或途径将祖细胞组合物递送到受试者中，所述方法或途径导致细胞组合物至少部分地局限于期望的部位。可以通过导致受试者的有效治疗的任何适当的途径施用细胞组合物，即导致递送到受试者中的期望的位置的施用，在所述期望的位置处，递送的组合物的至少一部分，即至少1x104个细胞递送到期望的部位一段时间。施用的模式包含注射、输注、滴注或摄取。“注射”包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，途径是静脉内。对于递送细胞，通过注射或输注施用通常是优选的。
在一个实施例中，细胞被全身施用。如在此所使用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指将祖细胞群体并非直接施用到靶部位、组织或器官中，使得它进入、代替受试者的循环系统，并且因此经受新陈代谢和其它相似的过程。
包括用于治疗ALS和/或FTLD的组合物的治疗的疗效可以由有经验的临床医生确定。然而，举个例子，如果碱基重复水平的迹象或症状中的任何一个或所有以有益的方式改变(例如，增大至少10％)，或者其它临床上接受的症状或疾病标记物被改进或改善，则治疗被认为是“有效治疗”。疗效还可以通过如由住院治疗评估的个体恶化的失败或对医疗干预(例如，慢性阻塞性肺病或疾病的进展停止或至少减慢)的需要来测量。测量这些指标的方法对所属领域技术人员是已知的和/或在本文描述了。治疗包含对个体或动物(一些非限制性实例包含人类或哺乳动物)中的疾病的任何治疗并且包含：(1)抑制疾病，例如，阻止或减慢症状的进展；或者(2)缓解疾病，例如，使症状好转；以及(3)预防或减小症状发展的可能性。
根据本发明的治疗通过减少个体中的碱基重复的量来改善与ALS和/或FTLD相关的一个或多个症状。典型地与ALS和/或FTLD相关的早期迹象包含例如痴呆、行走困难、腿无力、手无力、动作笨拙、说话含糊、吞咽困难、肌肉痉挛、手臂或肩膀或舌头抽搐、抬头困难或保持良好姿势困难。
试剂盒
本公开提供了用于执行本发明的方法的试剂盒。试剂盒可以包含基因组靶向核酸、对基因组靶向核酸进行编码的多核苷酸、定点多肽、对定点多肽进行编码的多核苷酸和/或执行本发明的方法的实施例所必须的任何核酸或蛋白质分子、或其组合。
在一些实施例中，试剂盒包括：(1)包括对基因组靶向核酸进行编码的核苷酸序列的载体，以及(2)包括对定点多肽进行编码的核苷酸序列或定点多肽的载体，以及(3)用于重构和/或稀释一个或多个载体和/或多肽的试剂。
在一些实施例中，试剂盒包括：(1)包括(i)对基因组靶向核酸进行编码的核苷酸序列，以及(ii)对定点多肽进行编码的核苷酸序列的载体，以及(2)用于重构和/或稀释载体的试剂。
在以上试剂盒中的任何试剂盒的一些实施例中，试剂盒包括单分子指导基因组靶向核酸。在以上试剂盒中的任何试剂盒的一些实施例中，试剂盒包括双分子基因组靶向核酸。在以上试剂盒中的任何试剂盒的一些实施例中，试剂盒包括两个或多个双分子指导或单分子指导。在一些实施例中，试剂盒包括对核酸靶向核酸进行编码的载体。
在以上试剂盒中的任何试剂盒的一些实施例中，试剂盒可以进一步包括待插入以影响期望的基因修饰的多核苷酸。
试剂盒的组分可以在单独容器中或组合到单一容器中。
在一些实施例中，上述试剂盒进一步包括一种或多种额外试剂，其中这种额外试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲液、清洗缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于在体外从DNA产生多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲液可以是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。在一些实施例中，试剂盒还可以包含可以用于促进或增强中靶结合或通过内切核酸酶切割DNA或改进靶向特异性的一种或多种组分。
除了以上提及的组分之外，试剂盒可以进一步包含使用试剂盒的组分实践所述方法的说明。实践所述方法的说明通常记录在合适的记录介质上。例如，说明可以印刷在如纸或塑料等基板上。说明可以作为包装说明书存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或分包装相关)等说明可以作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如，CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等。在一些实例中，实际说明不存在于试剂盒中，而是可以提供用于从远程源处获得说明(例如，通过互联网)的装置。此实施例的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址查看说明和/或可以从所述网址下载所述说明。正如说明一样，用于获得所述说明的此装置可以记录在合适的基板上。
向导RNA配制品
本发明的向导RNA用如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等药学上可接受的赋形剂配制，取决于特定施用模式和剂量形式。向导RNA组合物通常被配制以实现生理上相容的pH，并且范围从约3的pH到约11的pH、约pH 3到约pH 7，取决于配制品和施用途径。在替代性实施例中，pH被调整为从约pH 5.0到约pH 8的范围。在一些实施例中，组合物包括治疗有效量的如本文所描述的至少一种化合物，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物包括本文所描述的化合物的组合，或者可以包含在治疗或预防细菌生长时有用的第二活性成分(例如但不限于抗菌剂或抗微生物剂)，或者可以包含本发明的试剂的组合。
合适的赋形剂包含例如载剂分子，所述载剂分子包含大型新陈代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒。其它示例性赋形剂包含抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
其它可能的治疗方式
可以使用被工程化成靶特异性序列的核酸酶进行基因编辑。迄今为止，存在四种主要类型的核酸酶：大范围核酸酶及其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9核酸酶系统。核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用模式方面不同，特别地如ZFN和TALEN的特异性贯穿整个蛋白-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要指导Cas9。Cas9切割还要求在不同CRISPR系统之间不同的邻近基序，即PAM。来自酿脓链球菌的Cas9使用NRG PAM切割，来自脑膜炎奈瑟菌的CRISPR可以在具有包含NNNNGATT、NNNNNGTTT和NNNNGCTT的PAM的位点处切割。多个其它Cas9直系同源物靶向与替代性PAM邻近的原型间隔子。
优选的是在本发明的方法中使用CRISPR内切核酸酶，如Cas9。然而，在本文所描述的教导中，如治疗靶位点可以应用于其它形式的内切核酸酶，如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或者使用核酸酶的组合物。然而，为了将本发明的教导应用于这种内切核酸酶，除了其它方面之外，需要将蛋白直接工程化到特定靶位点。
额外的结合域可以融合到Cas9蛋白以增加特异性。这些构建体的靶位点将映射到鉴定的gRNA指定位点，但是将要求额外的结合基序如用于锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，大范围核酸酶可以融合到TALE DNA-结合域。大范围核酸酶域可以增加特异性并提供切割。类似地，灭活的或死亡Cas9(dCas9)可以融合到切割域并且需要sgRNA/Cas9靶位点以及用于融合DNA-结合域的邻近结合位点。除了催化剂灭活之外，这很可能将需要工程化dCas9的一些蛋白以便在没有额外结合位点的情况下减少结合。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是包括工程化锌指DNA结合域的模块化蛋白质，所述工程化锌指DNA结合域链接到II型内切核酸酶FokI的催化域。因为FokI仅起到二聚体的作用，所以一对ZFN必须被工程化为结合相对DNA链上的同源靶“半位点”序列并且具有它们之间的精确间隔以使催化活性FokI二聚体形成。在二聚化本身不具有序列特异性的FokI域时，作为基因编辑的初始步骤，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂。
每个ZFN的DNA结合域通常包括丰富的Cys2-His2架构的3到6个锌指，其中每个锌指主要识别靶DNA序列的一条链上核甘酸三联体，尽管与第四个核苷酸的跨链相互作用可能也很重要。锌指的氨基酸在与DNA进行关键接触的位置中的改变使给定锌指的序列特异性改变。因此，四指锌指蛋白将选择性地识别12bp靶序列，其中靶序列是由每个锌指贡献的三联体偏好，尽管三联体偏好可以在不同程度上受相邻锌指的影响。ZFN的重要方面是它们可以仅通过修饰单独锌指容易地重新靶向几乎任何基因组地址，尽管做好这一点需要相当多的专业知识。在ZFN的大多数应用中，使用4到6个锌指的蛋白，分别识别12bp到18bp。因此，一对ZFN将通常识别24bp到36bp的组合靶序列，不包含半位点之间的5bp到7bp间隔。结合位点可以进一步以较大间隔分开，包含15bp到17bp。这种长度的靶序列可能在人类基因组中是唯一的，假设在设计过程期间不包含重复序列或基因同源物。然而，ZFN蛋白-DNA相互作用在其特异性上并非绝对，因此脱靶结合和切割事件作为两个ZFN之间的异质二聚体或者作为ZFN中的一个或另一个的同源二聚体而发生。已经通过工程化FokI域的二聚化界面以创建“加”和“减”变体，也被称为专性异质二聚体变体，来有效地消除后一种可能性，所述专性异质二聚体变体仅可以彼此二聚，而不与自身二聚。强加专性异质二聚体防止形成同源二聚体。这大大增强了ZFN以及采用这些FokI变体的任何其它核酸酶的特异性。
本领域中已经描述了各种基于ZFN的系统，定期报告其修改，并且许多参考描述了用于指导ZFN的设计的规则和参数；见例如，Segal等人，《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》，第96卷，第6期，第2758到2763页(1999年)；Dreier B等人，《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》，第303卷，第4期，第489到502页(2000年)；Liu Q等人，《生物化学杂志(JBiol Chem.)》，第277卷，第6期，第3850到3856页(2002年)；Dreier等人，《生物化学杂志(JBiol Chem.)》，第280卷，第42期，第35588到35597页(2005年)；以及；Dreier等人，《生物化学杂志(J Biol Chem.)》，第276卷，第31期，第29466到29478页(2001年)。
转录激活子样效应核酸酶(TALEN)
TALEN表示模块化核酸酶凭借的另一种格式，与ZFN一样，工程化的DNA结合域链接到FokI核酸酶域，并且一对TALEN依次操作以实现靶向DNA切割。与ZFN的主要区别是DNA结合域的性质以及相关联的靶DNA序列识别性能。TALEN DNA结合域源自于起初在植物细菌性病原体黄单胞菌物种中描述的TALE蛋白。TALE包括33到35个氨基酸重复的串联阵列，其中每个重复识别靶DNA序列中的单个碱基对，在给定总靶序列长度高达40bp的情况下，所述靶DNA序列长度通常高达20bp。每个重复的核苷酸特异性由重复可变双残基(RVD)确定，所述RVD在位置12和13处仅包含两个氨基酸。碱基鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶主要由以下四个RVD分别识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构建比针对锌指更简单的识别代码，并且因此表示针对核酸酶设计优于后者。然而，与ZFN一样，TALEN的蛋白-DNA相互作用在其特异性上并非绝对，并且TALEN还在使用FokI域的专性异质二聚体变体来减少脱靶活性方面有益。
已经产生了FokI域的在其催化功能中灭活的额外变体。如果TALEN对或ZFN对的一半含有失活FokI域，则仅单链DNA切割(切口)而非DSB将在靶位点处发生。结果与使用其中Cas9切割域之一已经被灭活的CRISPR/Cas9/Cpf1“切口酶”突变体相当。DNA切口可以用于由HDR驱动基因编辑，但是比使用DSB效率更低。主要益处是脱靶切口被快速且准确地修复，不像DSB，容易NHEJ介导的错误修复。
本领域中已经描述了各种基于TALEN的系统，并且定期报告其修改；见例如，Boch，《科学(Science)》，第326卷，第5959期，第1509到1512页(2009年)；Mak等人，《科学(Science)》，第335卷，第6069期，第716到719页(2012年)；以及Moscou等人，《科学(Science)》，第326卷，第5959期，第1501页(2009年)。已经通过多个群组描述了基于“Golden Gate”平台对TALEN的使用；见例如，Cermak等人，《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》，第39卷，第12期，第e82页(2011年)；Li等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，第39卷，第14期，第6315到6325页(2011年)；Weber等人，《公共科学图书馆综合(PLoS One.)》，第6卷，第2期，第e16765页(2011年)；Wang等人，《遗传学报(J Genet Genomics)》，第41卷，第6期，第339到347页，电子出版2014年5月17日(2014年)；以及Cermak T等人，《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》，第1239期，第133到159页(2015年)。
归巢内切核酸酶
归巢内切核酸酶(HE)是序列特异性内切核酸酶，所述序列特异性内切核酸酶具有长识别序列(14到44个碱基对)并且经常在基因组中独特位点处以高特异性切割DNA。存在至少六个如由其结构分类的已知HE族，包含LAGLIDADG(SEQ ID NO：18809)、GIY-YIG、His-Cis盒、H-N-H、PD-(D/E)xK以及源自于广泛宿主的Vsr类，所述宿主包含真核生物、原生生物、细菌、古生菌、蓝藻细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可以用于作为基因编辑中的初始步骤在靶座位处产生DSB。另外，一些天然和工程化的HE仅切断DNA的单链，由此充当位点特异性切口。HE的大靶序列以及其提供的特异性使其成为用于产生位点特异性DSB的有吸引力的候选物。
本领域中已经描述了各种基于HE的系统，并且定期报告其修改；见例如，Steentoft等人的评述，《糖生物学(Glycobiology)》，第24卷，第8期，第663到680页(2014年)；Belfort和Bonocora，《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》，第1123期，第1到26页(2014年)；Hafez和Hausner，《基因组(Genome)》，第55卷，第8期，第553到569页(2012年)；以及其中引用的参考文献。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
如杂合核酸酶的进一步实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用TALE DNA结合域与催化活性HE的融合物，利用可调DNA结合以及TALE的特异性，连同HE的切割序列特异性；见例如，Boissel等人，《NAR》，第42期，第2591到2601页(2014年)；Kleinstiver等人，《G3》，第4期，第1155到1165页(2014年)；以及Boissel和Scharenberg，《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》，第1239期，第171到196页(2015年)。
在进一步变体中，MegaTev架构是大范围核酸酶(Mega)与源自GIY-YIG归巢内切核酸酶I-TevI(Tev)的核酸酶域的融合物。两个活性位点被定位在DNA基质上相隔～30bp并且产生具有不相容的粘合末端的两个DSB；见例如，Wolfs等人，《NAR》，第42期，第8816到8829页(2014年)。预期现有基于核酸酶的方法的其它组合将进化并在实现本文所描述的靶向基因组修饰时有用。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1以及其它核酸酶
结合上述核酸酶平台的结构和功能特性向基因编辑提供可能潜在地克服固有缺陷中的一些缺陷的进一步方法。作为实例，CRISPR基因编辑系统通常使用单个Cas9内切核酸酶来产生DSB。靶向的特异性由经历与靶DNA的Watson-Crick碱基配对的向导RNA中的20或24核苷酸序列驱动(在来自酿脓链球菌的Cas9的情况下，在相邻NAG或NGG PAM序列中加上额外2个碱基)。这种序列足够长以在人类基因组中是唯一的，然而，RNA/DNA相互作用的特异性并非绝对，极大的混杂有时是可容忍的，特别在靶序列的一半处的5′末端中，有效地减少驱动特异性的碱基数量。对此的一种解决方案是对Cas9或Cpf1催化功能完全灭活——仅保留RAN指导的DNA结合功能——并且代替地将FokI域融合到灭活的Cas9；见例如，Tsai等人，《自然生物技术(Nature Biotech)》，第32期，第569到576页(2014年)；以及Guilinger等人，《自然生物技术(Nature Biotech)》，第32期，第577到582页(2014年)。因为FokI必须二聚以变成催化活性的，所以需要两个向导RNA拴系两个FokI融合物靠近以形成二聚体并切割DNA。这本质上使组合的靶位点中的碱基数量加倍，由此增大了由基于CRISPR的系统进行的靶向的严格度。
作为进一步实例，TALE DNA结合域与催化活性HE的融合物，如I-TevI，利用可调DNA结合和TALE的特异性两者以及I-TevI的切割序列特异性，期望可以进一步减少脱靶切割。
本发明的方法和组合物
因此，本公开具体而言涉及以下非限制性发明：在第一方法——方法1中，本公开提供了一种用于通过基因组编辑对人类细胞中的C9ORF72基因进行编辑的方法，所述方法包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正并且引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法2中，本公开提供了一种用于通过基因组编辑将C9ORF72基因插入人类细胞中的方法，所述方法包括以下步骤：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述人类细胞中，以在安全港座位内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因或迷你基因的永久插入并且引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法3中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：i)产生患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；ii)在所述iPSC的C9ORF72基因或者对所述iPSC的所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述iPSC的安全港座位内或附近进行编辑；iii)使基因组编辑后iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞；以及iv)将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法4中，本公开提供了根据方法3所述的方法，其中所述产生步骤包括：a)从所述患者体内分离体细胞；以及b)将一组多能性相关基因引入到所述体细胞中以诱导所述细胞变成多能干细胞。
在另一方法——方法5中，本公开提供了根据方法4所述的方法，其中体细胞是成纤维细胞。
在另一方法——方法6中，本公开提供了根据方法4所述的方法，其中所述一组多能性相关基因是选自由以下组成的群组的基因中的一个或多个基因：OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG、以及cMYC。
在另一方法——方法7中，本公开提供了根据方法3到6中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述iPSC中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个SSB或DSB，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因或迷你基因的永久插入以及C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法8中，本公开提供了根据方法7所述的方法，其中所述安全港座位是选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
在另一方法——方法9中，本公开提供了根据方法3到8中任一项所述的方法，其中所述分化步骤包括以下操作中的一项或多项以将所述基因组编辑后iPSC分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞：使用小分子的组合进行治疗或者递送关键转录因子。
在另一方法——方法10中，本公开提供了根据方法3到9中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法11中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：i)从所述患者体内分离白血细胞；ii)在所述白血细胞的C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述白血细胞的安全港座位内或附近进行编辑；以及iii)将编辑后白血细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法12中，本公开提供了根据方法11所述的方法，其中所述分离步骤包括：细胞差速离心、细胞培养或其组合。
在另一方法——方法13中，本公开提供了根据方法11到12中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述神经细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个SSB或一个或多个DSB，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法14中，本公开提供了根据方法13所述的方法，其中所述安全港座位是选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
在另一方法——方法15中，本公开提供了根据方法11到14中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述编辑后白血细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法16中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：i)任选地，对所述患者的骨髓执行活检；ii)分离间充质干细胞；ii)在所述干细胞的C9ORF72基因或者对所述干细胞的所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述干细胞的安全港座位内或附近进行编辑；Iv)使所述干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞；以及v)将所述造血祖细胞、所述神经祖细胞或所述神经细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法17中，本公开提供了根据方法16所述的方法，其中所述分离步骤包括：抽吸骨髓以及使用PercollTM通过密度离心分离间充质细胞。
在另一方法——方法18中，本公开提供了根据方法16到17中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述干细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个SSB或一个或多个DSB，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法19中，本公开提供了根据方法18所述的方法，其中所述安全港座位是选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
在另一方法——方法20中，本公开提供了根据方法16到19中任一项所述的方法，其中所述分化步骤包括以下操作中的一项或多项以将基因组编辑后干细胞分化成造血祖细胞、神经祖细胞或神经细胞：使用小分子的组合进行治疗或者递送关键转录因子。
在另一方法——方法21中，本公开提供了根据方法16到20中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法22中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：i)任选地，使用粒细胞集落刺激因子(GCSF)对所述患者进行治疗；ii)从所述患者体内分离造血祖细胞；ii)在所述造血祖细胞的C9ORF72基因或者对所述造血祖细胞的所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在所述造血祖细胞的安全港座位内或附近进行编辑；以及iv)将所述细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法23中，本公开提供了根据方法22所述的方法，其中所述治疗步骤是组合Plerixaflor而执行的。
在另一方法——方法24中，本公开提供了根据方法22到23中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括：分离CD34+细胞。
在另一方法——方法25中，本公开提供了根据方法22到24中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述干细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个SSB或一个或多个DSB，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法26中，本公开提供了根据方法25所述的方法，其中所述安全港座位是选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
在另一方法——方法27中，本公开提供了根据方法22到26中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过移植、局部注射、全身输注或其组合将所述神经细胞植入到所述患者体内。
在另一方法——方法28中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的体内方法，所述方法包括以下步骤：在所述患者的细胞中的C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近进行编辑，或者在安全港座位内或附近进行编辑。
在另一方法——方法29中，本公开提供了根据方法28所述的方法，其中所述编辑步骤包括：将一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶引入到所述细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或一个或多个双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正，或者在安全港座位内或附近实现一个或多个SSB或一个或多个DSB，所述一个或多个SSB或一个或多个DSB引起C9orf72蛋白质活性的恢复。
在另一方法——方法30中，本公开提供了根据方法29所述的方法，其中所述安全港座位是选自由以下组成的群组的安全港座位：AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF以及TTR。
在另一方法——方法31中，本公开提供了根据方法28到30中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经细胞、骨髓细胞、造血祖细胞或CD34+细胞。
在另一方法——方法32中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是：Cas1内切核酸酶、Cas1B内切核酸酶、Cas2内切核酸酶、Cas3内切核酸酶、Cas4内切核酸酶、Cas5内切核酸酶、Cas6内切核酸酶、Cas7内切核酸酶、Cas8内切核酸酶、Cas9(也被称为Csn1和Csx12)内切核酸酶、Cas100内切核酸酶、Csy1内切核酸酶、Csy2内切核酸酶、Csy3内切核酸酶、Cse1内切核酸酶、Cse2内切核酸酶、Csc1内切核酸酶、Csc2内切核酸酶、Csa5内切核酸酶、Csn2内切核酸酶、Csm2内切核酸酶、Csm3内切核酸酶、Csm4内切核酸酶、Csm5内切核酸酶、Csm6内切核酸酶、Cmr1内切核酸酶、Cmr3内切核酸酶、Cmr4内切核酸酶、Cmr5内切核酸酶、Cmr6内切核酸酶、Csb1内切核酸酶、Csb2内切核酸酶、Csb3内切核酸酶、Csx17内切核酸酶、Csx14内切核酸酶、Csx10内切核酸酶、Csx16内切核酸酶、CsaX内切核酸酶、Csx3内切核酸酶、Csx1内切核酸酶、Csx15内切核酸酶、Csf1内切核酸酶、Csf2内切核酸酶、Csf3内切核酸酶、Csf4内切核酸酶、或Cpf1内切核酸酶；或者其同系物、天然存在的分子的重组、其密码子优化后或修饰后版本、及其组合。
在另一方法——方法33中，本公开提供了根据方法32所述的方法，其中所述方法包括：将对所述一个或多个DNA内切核酸酶进行编码的一个或多个多核苷酸引入到所述细胞中。
在另一方法——方法34中，本公开提供了根据方法32所述的方法，其中所述方法包括：将对所述一个或多个DNA内切核酸酶进行编码的一个或多个核糖核酸(RNA)引入到所述细胞中。
在另一方法——方法35中，本公开提供了根据方法33或34中任一项所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸或所述一个或多个RNA是一个或多个修饰后多核苷酸或一个或多个修饰后RNA。
在另一方法——方法36中，本公开提供了根据方法32所述的方法，其中所述DNA内切核酸酶是蛋白质或多肽。
在另一方法——方法37中，本公开提供了根据前述方法中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：将一个或多个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述细胞中。
在另一方法——方法38中，本公开提供了根据方法37所述的方法，其中所述一个或多个gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一方法——方法39中，本公开提供了根据方法37到38中任一项所述的方法，其中所述一个或多个gRNA或所述一个或多个sgRNA是一个或多个修饰后gRNA或一个或多个修饰后sgRNA。
在另一方法——方法40中，本公开提供了根据方法37到39中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或多个gRNA或一个或多个sgRNA预先复合。
在另一方法——方法41中，本公开提供了根据前述方法中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：将包括野生型C9ORF72基因或迷你基因或cDNA的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中。
在另一方法——方法42中，本公开提供了根据方法41所述的方法，其中所述野生型C9ORF72基因或cDNA的所述一部分是整个C9ORF72基因或cDNA或者天然变体1、变体2或变体3的cDNA。
在另一方法——方法43中，本公开提供了根据方法41到42中任一项所述的方法，其中所述供体模板是单链的或双链的。
在另一方法——方法44中，本公开提供了根据方法41到43中任一项所述的方法，其中所述供体模板与9p21.2区域具有同源臂。
在另一方法——方法45中，本公开提供了根据方法41到43中任一项所述的方法，其中所述供体模板与选自由以下组成的群组的安全港座位具有同源臂：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在另一方法——方法46中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：将一个向导核糖核酸(gRNA)以及至少包括所述野生型C9ORF72基因的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中，并且其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是一个或多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述一个或多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近的DSB座位处或者在安全港座位内或附近实现一个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个SSB或DSB促进将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入到所述座位或所述安全港处的染色体DNA中、引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列的所述染色体DNA的接近所述座位或所述安全港座位的一部分的永久插入或修正或者C9orf72蛋白质活性的恢复，并且其中所述gRNA包括与所述座位的片段或所述座位互补的间隔序列。
在另一方法——方法47中，本公开提供了根据方法46所述的方法，其中接近意指所述座位或所述座位上游或下游两处的核苷酸。
在另一方法——方法48中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：将两个向导核糖核酸(gRNA)以及至少包括所述野生型C9ORF72基因的一部分的多核苷酸供体模板引入到所述细胞中，并且其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近或者在安全港座位内或附近实现一对单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)——第一个位于5′座位处并且第二个位于3′座位处，所述一对SSB或DSB促进将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入到所述5′座位与所述3′座位之间的染色体DNA中、引起所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列或者所述安全港座位内或附近的所述5′座位与所述3′座位之间的所述染色体DNA的永久插入或修正以及C9orf72蛋白质活性的恢复，并且其中所述第一向导RNA包括与所述5′座位的片段互补的间隔序列并且所述第二向导RNA包括与所述3′座位的片段互补的间隔序列。
在另一方法——方法49中，本公开提供了根据方法46到48中任一项所述的方法，其中所述一个或两个gRNA是一个或两个单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一方法——方法50中，本公开提供了根据方法46到49中任一项所述的方法，其中所述一个或两个gRNA或所述一个或两个sgRNA是一个或两个修饰后gRNA或一个或两个修饰后sgRNA。
在另一方法——方法51中，本公开提供了根据方法46到50中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或两个gRNA或一个或两个sgRNA预先复合。
在另一方法——方法52中，本公开提供了根据方法46到51中任一项所述的方法，其中所述野生型C9ORF72基因或cDNA的所述一部分是整个C9ORF72基因或cDNA；天然变体1、变体2、变体3的cDNA；或约30个六核苷酸重复。
在另一方法——方法53中，本公开提供了根据方法46到52中任一项所述的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
在另一方法——方法54中，本公开提供了根据方法46到53中任一项所述的方法，其中所述供体模板与9p21.2区域具有同源臂。
在另一方法——方法55中，本公开提供了根据方法46到44中任一项所述的方法，其中所述供体模板与选自由以下组成的群组的安全港座位具有同源臂：AAVS1(PPP1R12C)的第1和第2外显子、ALB的第1和第2外显子、Angptl3的第1和第2外显子、ApoC3的第1和第2外显子、ASGR2的第1和第2外显子、CCR5的第1和第2外显子、FIX(F9)的第1和第2外显子、G6PC的第1和第2外显子、Gys2的第1和第2外显子、HGD的第1和第2外显子、Lp(a)的第1和第2外显子、Pcsk9的第1和第2外显子、Serpina1的第1和第2外显子、TF的第1和第2外显子、以及TTR的第1和第2外显子。
在另一方法——方法56中，本公开提供了根据方法44所述的方法，其中所述DSB、或所述5′DSB以及所述3′DSB位于所述C9ORF72基因的第一内含子中。
在另一方法——方法57中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29到56中任一项所述的方法，其中所述插入或修正是通过同源定向修复(HDR)进行的。
在另一方法——方法58中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：将两个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述细胞中，并且其中所述一个或多个DNA内切核酸酶是两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶，所述两个或更多个Cas9或Cpf1内切核酸酶在所述C9ORF72基因内或附近实现一对双链断裂(DSB)——第一个位于5′DSB座位处并且第二个位于3′DSB座位处，所述一对DSB造成所述5′DSB座位与所述3′DSB座位之间的所述染色体DNA的缺失、引起所述C9ORF72基因内或附近的所述5′DSB座位与所述3′DSB座位之间的所述染色体DNA的永久缺失，并且其中所述第一向导RNA包括与所述5′DSB座位的片段互补的间隔序列并且所述第二向导RNA包括与所述3′DSB座位的片段互补的间隔序列。
在另一方法——方法59中，本公开提供了根据方法58所述的方法，其中所述两个gRNA是两个单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一方法——方法60中，本公开提供了根据方法58到59中任一项所述的方法，其中所述两个gRNA或所述两个sgRNA是两个修饰后gRNA或两个修饰后sgRNA。
在另一方法——方法61中，本公开提供了根据方法58到60中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA内切核酸酶与一个或两个gRNA或一个或两个sgRNA预先复合。
在另一方法——方法62中，本公开提供了根据方法58到61中任一项所述的方法，其中所述5′DSB和所述3′DSB位于所述C9ORF72基因的第一外显子、第一内含子或第二外显子中或附近。
在另一方法——方法63中，本公开提供了根据方法58到62中任一项所述的方法，其中所述缺失是所述扩增六核苷酸重复的缺失。
在另一方法——方法64中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29到63中任一项所述的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA、以及供体模板各自被单独配制成脂质纳米颗粒或全部被共同配制成脂质纳米颗粒。
在另一方法——方法65中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29到63中任一项所述的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA被配制成脂质纳米颗粒，并且所述gRNA和所述供体模板均通过病毒载体递送。
在另一方法——方法66中，本公开提供了根据方法65所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
在另一方法——方法67中，本公开提供了根据方法66所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
在另一方法——方法68中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29到63中任一项所述的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA、以及供体模板各自被配制成单独的外来体或全部被共同配制成外来体。
在另一方法——方法69中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29到63中任一项所述的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA被配制成脂质纳米颗粒，并且所述gRNA通过电穿孔递送到所述细胞中，并且所述供体模板通过病毒载体递送到所述细胞中。
在另一方法——方法70中，本公开提供了根据方法69所述的方法，其中所述gRNA通过电穿孔递送到所述细胞中，并且所述供体模板通过腺相关病毒(AAV)载体递送到所述细胞中。
在另一方法——方法71中，本公开提供了根据方法70所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
在另一方法——方法72中，本公开提供了根据前述方法中任一项所述的方法，其中所述C9ORF72基因位于9号染色体上：27,546,542到27,573,863(基因组参照序列联盟(Genome Reference Consortium)-GRCh38/hg38)。
在另一方法——方法73中，本公开提供了根据方法1、7、13、18、25或29中任一项所述的方法，其中将C9orf72蛋白质活性的所述恢复与野生型或正常C9orf72蛋白质活性进行比较。
在另一方法——方法74中，本公开提供了一种用于对患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者进行治疗的方法，所述方法包括：将骨髓从供体移植到所述患者体内。
本公开还通过了一种或多种向导核糖核酸(gRNA)的组合物——组合物1，其包括选自由SEQ ID NO 1到18807中的核酸序列组成的群组的间隔序列，所述一种或多种gRNA用于对来自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者的细胞中的C9ORF72基因进行编辑。
在另一组合物——组合物2中，本公开提供了根据组合物1所述的组合物，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一组合物——组合物3中，本公开提供了根据组合物1或组合物2所述的组合物，其中所述一种或多种gRNA或所述一种或多种sgRNA是一种或多种修饰后gRNA或一种或多种修饰后sgRNA。
本公开还通过了一种或多种向导核糖核酸(gRNA)的组合物——组合物4，其包括选自由SEQ ID NO 18810到73668中的核酸序列组成的群组的间隔序列，所述一种或多种gRNA用于对来自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者的细胞中的C9ORF72基因进行编辑。
在另一组合物——组合物5中，本公开提供了根据组合物4所述的组合物，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一组合物——组合物6中，本公开提供了根据组合物4或组合物5所述的组合物，其中所述一种或多种gRNA或所述一种或多种sgRNA是一种或多种修饰后gRNA或一种或多种修饰后sgRNA。
定义
术语“包括(comprising或comprises)”是参照对于本发明来说关键但可能包括未指定要素——无论是否关键——的组合物、反方及其一个或多个对应组分而使用的。
术语“基本上由…组成”是指给定实施例所需的那些要素。所述术语允许并不实质影响本发明的那个实施例的(多个)基本且新颖或功能特性的额外要素存在。
术语“由…组成”是指如本文所述的组合物、方法及其对应组分，所述组合物、方法及其对应组分不包括在对所述实施例的该描述中未叙述的任何要素。
除非上下文清楚地另外指明，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数指示物。
本文中呈现的某些数值以术语“约”为先导。术语“约”用于为术语“约”之后的数值以及近似于所述数值的数值提供字面支持，也就是说，近似的未叙述数值可以是在其被呈现的上下文中作为具体叙述的数值的实质性等同物的数字。术语“约”意指所叙述数值的+10％内的数值。
当本文中呈现了数值范围时，设想的是，所述范围的下限与上限之间的每个中间值、作为所述范围的上限和下限的值、以及所述范围内的所有所陈述值都涵盖于本公开内。本公开还设想了所述范围的下限和上限内的所有可能子范围。
实例
通过参考以下实例将更完整地理解本发明，所述实例提供了本发明的说明性非限制性实施例。
所述实例描述了将CRISPR系统作为说明性基因组编辑技术以在C9ORF72基因中产生在本文中被称为“基因组修饰”的所定义治疗性基因组置换或在异源座位处的表达，所述所定义治疗性基因组置换导致基因组座位中的扩增六核苷酸重复的永久修正并且恢复野生型或类似水平的六核苷酸重复。对所定义治疗性修饰的引入表示一种用于潜在地改善ALS和/或FTLD的新颖治疗策略，如本文所描述和说明的。
实例1-C9ORF72基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 1到6148中提供的。
实例2-C9ORF72基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 6149到6892中提供的。
实例3-C9ORF72基因的CRISPR/StCas9靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 24个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 7760到8097中提供的。
实例4-C9ORF72基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 24个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 8098到8261中提供的。
实例5-C9ORF72基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA24个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 6893到7759中提供的。
实例6-C9ORF72基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对C9ORF72基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 24个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 8262到18807中提供的。
实例7-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 18810到20841中所示。
实例8-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 20842到21012中所示。
实例9-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/StCas9靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 21013到21030中所示。
实例10-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 21031到21039中所示。
实例11-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 21040到21114中所示。
实例12-AAVS1(PPP1R12C)基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对AAVS1(PPP1R12C)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 21115到22290中所示。
实例13-ALB基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22291到22458中所示。
实例14-ALB基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22459到22486中所示。
实例15-ALB基因的CRISPR/StCas9靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22487到22504中所示。
实例16-ALB基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22505到22509中所示。
实例17-ALB基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22510到22533中所示。
实例18-ALB基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对ALB基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22534到22912中所示。
实例19-Angptl3基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 22913到23257中所示。
实例20-Angptl3基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 23258到23293中所示。
实例21-Angptl3基因的CRISPR/StCas9靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 23294到23316中所示。
实例22-Angptl3基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 23317到23329中所示。
实例23-Angptl3基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 23330到23392中所示。
实例24-Angptl3基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对Angptl3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 23393到24240中所示。
实例25-ApoC3基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24241到24643中所示。
实例26-ApoC3基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24644到24668中所示。
实例27-ApoC3基因的CRISPR/StCas9靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24669到24671中所示。
实例28-ApoC3基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24672和24673中所示。
实例29-ApoC3基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24674到24685中所示。
实例30-ApoC3基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对ApoC3基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24686到24917中所示。
实例31-ASGR2基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 24918到26685中所示。
实例32-ASGR2基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 26686到26891中所示。
实例33-ASGR2基因的CRISPR/StCas9靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 26892到26915中所示。
实例34-ASGR2基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 26916到26927中所示。
实例35-ASGR2基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 26928到27010中所示。
实例36-ASGR2基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对ASGR2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 27011到28450中所示。
实例37-CCR5基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28451到28653中所示。
实例38-CCR5基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28654到28685中所示。
实例39-CCR5基因的CRISPR/StCas9靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28686到28699中所示。
实例40-CCR5基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28700和28701中所示。
实例41-CCR5基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28702和28729中所示。
实例42-CCR5基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对CCR5基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 28730到29029中所示。
实例43-FIX(F9)基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 29030和30495中所示。
实例44-FIX(F9)基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 30496和30658中所示。
实例45-FIX(F9)基因的CRISPR/StCas9靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 30659和30719中所示。
实例46-FIX(F9)基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 30720和30744中所示。
实例47-FIX(F9)基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 30745和30897中所示。
实例48-FIX(F9)基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对FIX(F9)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 30898到33038中所示。
实例49-G6PC基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQID NO 33039和34054中所示。
实例50-G6PC基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 34055和34171中所示。
实例51-G6PC基因的CRISPR/StCas9靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 341 72和34195中所示。
实例52-G6PC基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 34196和34204中所示。
实例53-G6PC基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 34205和34294中所示。
实例54-G6PC基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对G6PC基因的区域进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQID NO 34295到35389中所示。
实例55-Gys2基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 35390和40882中所示。
实例56-Gvs2基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 40883和41558中所示。
实例57-Gys2基因的CRISPR/StCas9靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 41559到41836中所示。
实例58-Gys2基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 41837到41950中所示。
实例59-Gys2基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 41951到42630中所示。
实例60-Gys2基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对Gys2基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 42631到51062中所示。
实例61-HGD基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 51063到52755中所示。
实例62-HGD基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 52756到52969中所示。
实例63-HGD基因的CRISPR/StCas9靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 52970到53052中所示。
实例64-HGD基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 53053到53071中所示。
实例65-HGD基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 53072到53272中所示。
实例66-HGD基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对HGD基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 53273到55597中所示。
实例67-Lp(a)基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 55598到59392中所示。
实例68-Lp(a)基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 59393到59802中所示。
实例69-Lp(a)基因的CRISPR/StCas9靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 59803到59938中所示。
实例70-Lp(a)基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 59939到59973中所示。
实例71-Lp(a)基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 59974到60341中所示。
实例72-Lp(a)基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对Lp(a)基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 60342到64962中所示。
实例73-PCSK9基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 64963到66982中所示。
实例74-PCSK9基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 66983到67169中所示。
实例75-PCSK9基因的CRISPR/StCas9靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 67170到67205中所示。
实例76-PCSK9基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 67206到67219中所示。
实例77-PCSK9基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 67220到67359中所示。
实例78-PCSK9基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对PCSK9基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 67360到69153中所示。
实例79-Serpina1基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 69154到70291中所示。
实例80-Serpina1基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 70292到70384中所示。
实例81-Serpina1基因的CRISPR/StCas9靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 70385到70396中所示。
实例82-Serpina1基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 70397到70399中所示。
实例83-Serpina1基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 70400到70450中所示。
实例84-Serpina1基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对Serpina1基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 70451到71254中所示。
实例85-TF基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 71255到72086中所示。
实例86-TF基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72087到72172中所示。
实例87-TF基因的CRISPR/StCas9靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72173到72184中所示。
实例88-TF基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72185到72191中所示。
实例89-TF基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72192到72235中所示。
实例90-TF基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对TF基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72236到72871中所示。
实例91-TTR基因的CRISPR/SpCas9靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NRG的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 72872到73171中所示。
实例92-TTR基因的CRISPR/SaCas9靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNGRRT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 73172到73212中所示。
实例93-TTR基因的CRISPR/StCas9靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNAGAAW的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 73213到73229中所示。
实例94-TTR基因的CRISPR/TdCas9靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NAAAAC的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 73230和73231中所示。
实例95-TTR基因的CRISPR/NmCas9靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列NNNNGHTT的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA20个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 73232和73266中所示。
实例96-TTR基因的CRISPR/Cpf1靶位点
对TTR基因的第1和第2外显子进行扫描以找到靶位点。对每个区域进行扫描以找到具有序列YTN的原型间隔相邻基序(PAM)。识别与PAM相对应的gRNA 22个碱基对间隔序列，如在SEQ ID NO 73267到73668中所示。
实例97-对向导链的生物信息学分析
将在多步骤过程中对候选向导进行筛选和选择，所述多步骤过程涉及理论结合和实验评估活性。通过说明的方式，可以使用如以下更详细地描述和说明的可用于评估脱靶结合的各种生物信息学工具中的一种或多种工具对具有将如C9ORF72基因内的位点等特定中靶位点与相邻PAM匹配的序列的候选向导在具有类似序列的脱靶位点处进行切割的可能性进行评估，以便评估除了预期染色体位置之外的染色体位置处的效果的可能性。然后可以实验地对预测具有相对较低脱靶活性可能性的候选物进行评估以测量其中靶活性并且然后测量在各个位点处的脱靶活性。优选向导具有足够高的中靶活性以在所选座位处实现期望水平的基因编辑，并且具有相对较低的脱靶活性以降低在其它染色体座位处发生改变的可能性。中靶活性与脱靶活性之比则被称为向导的“特异性”。
针对预测脱靶活性的初始筛选，存在大量已知且公共可用的生物学信息工具，所述生物学信息工具可以用于预测最可能的脱靶位点；并且由于到CRISPR/Cas9/Cpf1核酸酶系统中的靶位点的接合由互补序列之间的Watson-Crick碱基配对驱动，所以相异程度(以及因此降低的脱靶结合可能性)基本上与主要序列差异相关：错配和凸起，即改变为非互补碱基的碱基，以及碱基相对于靶位点插入到潜在脱靶位点中或从中缺失。被称为COSMID(CRISPR Off-target Sites with Mismatches，Insertions and Deletions，具有错配、插入和缺失的CRISPR脱靶位点)(可在网页crispr.bme.gatech.edu上获得)的示例性生物信息学工具符合这种相似性。其它生物信息学工具包含但不限于GUIDO、autoCOSMID、以及CCtop。
生物信息学被用于使脱靶切割最小化以便减少突变和染色体重排的有害作用。对CRISPR/Cas9系统的研究表明了由于向导链与具有碱基对错配和/或凸起、特别是在远离PAM区域的位置处具有碱基对错配和/或凸起的DNA序列的非特异性杂交而产生的高脱靶活性的可能性。(见例如，Hsu，P.D.等人，《RNA引导Cas9核酸酶的DNA靶向特异性(DNAtargeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases)》(《自然生物技术(NatBiotechnol)》，第31期，第827到832页(2013年))；Fu，Y.等人，《CRISPR-Cas核酸酶在人类细胞中诱导的高频脱靶突变形成(High-frequency off-target mutagenesis induced byCRISPR-Cas nucleases in human cells)》(《(自然生物技术(Nat Biotechnol)》(2013年))；Cradick，T.J.、Fine，E.J.、Antico，C.J.和Bao，G.，《靶向β球蛋白和CCR5基因的CRISPR/Cas9系统具有实质性脱靶活性(CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin andCCR5 genes have substantial off-target activity)》(《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》，第41期，第9584到9592页(2013年))；Lin，Y.等人，《CRISPR/Cas9系统具有脱靶活性连同靶DNA与向导RNA序列之间的插入或缺失(CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNAsequences)》(《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，第42期，第7473到7485页(2014年)))。因此，重要的是具有这样的生物学信息工具，所述生物学信息工具可以识别除了碱基对错配之外在RNA向导链与基因组序列之间具有插入和/或缺失的潜在脱靶位点。基于生物学信息学的工具，即COSMID(具有错配、插入和缺失的CRISPR脱靶位点)因此用于在基因组中搜索潜在的CRISPR脱靶位点(可在网页at http_crispr_bme_gatech_edu上获得)。COSMID基于错配的数量和位置输出经排序的潜在脱靶位点列表，从而允许对靶位点的更知情选择并且避免使用具有更可能发生脱靶切割的位点。
采用了对区域中的gRNA靶向位点的估计中靶活性和/或脱靶活性进行考虑的额外生物信息学流水线。可以用于预测活性的其它特征包含与所讨论细胞类型有关的信息、DNA可接近性、染色质状态、转录因子结合位点、转录因子结合数据、以及其它CHIP-seq数据。考虑了预测编辑效率的额外因子，如gRNA对的相对位置和方向、局部序列特征、以及微同源性。(见例如，Naito，Y.、Hino，K.、Bono，H.和Ui-Tei，K.：《用于设计具有减少的脱靶位点的CRISPR/Cas向导RNA的软件(software for designing CRISPR/Cas guide RNA withreduced off-target sites)》(《生物信息学(Bioinformatics)》，第31期，第1120到1123页(2015年))；Cradick，T.J.、Qui，P.、Lee，C.M.、Fine，E.J.和Bao，G.，《COSMID：用于识别和验证CRISPR/Cas脱靶位点的基于web的工具(COSMID：A Web-based Tool for Identifyingand Validating CRISPR/Cas Off-target Sites)》(分子疗法-核酸《(MolecularTherapy-Nucleic Acids)》，第e214页(2014年))；Güell，M.、Yang，L.和Church，G.M.，《使用CRISPR基因组分析器(CRISPR-GA)的基因组编辑评估(Genome editing assessment usingCRISPR Genome Analyzer (CRISPR-GA))》(《生物信息学(Bioinformatics)》，第30期，第2968到2970页(2014年))；Prykhozhij，S.V.、Rajan，V.、Gaston，D.和Berman，J.N.，《CRISPR多靶向器：用于在一组类似序列中找到共同且唯一的CRISPR单向导RNA靶的web工具(CRISPR multitargeter：a web tool to find common and unique CRISPR singleguide RNA targets in a set of similar sequences)》(《公共科学图书馆·综合(PLoSOne)》，第10期，第e0119372页(2015年))；Montague，T.G.、Cruz，J.M.、Gagnon，J.A.、Church，G.M.和Valen，E.，《CHOPCHOP：用于基因组编辑的CRISPR/Cas9和TALEN web工具(CHOPCHOP：a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing)》(《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，第42期，第W401到W407页(2014年))；Bae，S.、Kweon，J.、Kim，H.S.和Kim，J.S.，《对Cas9核酸酶靶位点的基于微同源性的选择(Microhomology-based choiceof Cas9 nuclease target sites)》(《自然方法(Nat Methods)》，第11期，第705页和706页(2014年))；Bae，S.、Park，J.和Kim，J.S.，《Cas-OFFinder：搜索Cas9 RNA引导的内切核酸酶的潜在脱靶位点的快速且全能的算法(Cas-OFFinder：a fast and versatile algorithmthat searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases)》(《生物信息学(Bioinformatics)》，第30期，第1473到1475页(2014年))；Stemmer，M.、Thumberger，T.、Del Sol Keyer，M.、Wittbrodt，J.和Mateo，J.L.，《CCTop：直观、灵活且可靠的CRISPR/Cas9靶预测工具(CCTop：An Intuitive，Flexible and ReliableCRISPR/Cas9 Target Prediction Tool)》(《(公共科学图书馆·综合(PLoS One)》，第10期，第e0124633页(2015年)))。
实例98-在细胞中测试优选向导的中靶活性
然后，将在如HEK293T或K562等模型细胞系中对预测具有最低脱靶活性的gRNA的脱靶活性进行测试，并且使用TIDE或下一代测序评估其插入/缺失频率。TIDE是一种用于对由CRISPR-Cas9对向导RNA(sgRNA)确定的靶座位进行的基因组编辑进行快速评估的web工具。基于来自两个标准毛细管测序反应的定量序列跟踪数据，TIDE软件使编辑效果量化并且识别靶向细胞池中的DNA中的主要插入和缺失(indel)类型。详细解释和实例，见Brinkman等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》(2014年)。下一代测序(NGS)、也被称为高通量测序是用于描述大量不同的现代测序技术的笼统术语，所述现代测序技术包含：Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、Ion torrent：Proton/PGM测序、以及SOLiD测序。相比之前使用的Sanger测序，这些近代技术允许人们以快得多且成本低得多的方式对DNA和RNA进行测序，并且如此已经彻底改变了对基因组学和分子生物学的研究。
组织培养细胞的转染允许筛选不同构建体以及用于测试活性和特异性的鲁棒手段(Cradick，T.J.、Qui，P.、Lee，C.M.、Fine，E.J.和Bao，G.，《COSMID：用于识别和验证CRISPR/Cas脱靶位点的基于web的工具(COSMID：A Web-based Tool for Identifying andValidating CRISPR/Cas Off-target Sites)》(分子疗法-核酸《(Molecular Therapy-Nucleic Acids)》，第e214页(2014年))。如K-562或HEK293T等组织培养细胞系容易转染且产生高活性。将对这些或其它细胞系进行评估以确定与CD34+匹配的细胞系并且提供最佳代用物。然后，这些细胞将被用于许多早期测试。例如，将使用适合于在人类细胞中进行表达的质粒将用于酿脓链球菌Cas9的单独gRNA转染到细胞中。若干天后，收集基因组DNA并且通过PCR放大靶位点。可以按照通过对自由DNA末端的NHEJ修复引入的插入、缺失和突变率来测量切割活性。尽管此方法无法利用此方法将正确修复的序列与未切割DNA进行区分，但是可以通过错误修复量来计量切割水平。可以通过放大所识别的推定脱靶位点并且使用用于检测切割的类似方法来观察脱靶活性。还可以使用切割位点侧翼的引物来测定易位，以确定是否发生特异性切割和易位。已经开发了允许对脱靶切割的互补测试的非向导测定，包括guide-seq.(Kim，D.等人，《Digenome-seq：对人类细胞中的CRISPR-Cas9脱靶效应的全基因组剖析(Digenome-seq：genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-targeteffects in human cells)》(《自然方法(Nat Methods)》，第12期，第237页和243页、第231到243页(2015年))；Frock，R.L.等人，《对由工程化核酸酶诱导的DNA双链断裂的全基因组检测(Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced byengineered nucleases)》(《自然生物技术(Nat Biotechnol)》，第33期，第179到186页(2015年))；Wang，X等人，《对由CRISPR-Cas9和TALEN使用整合酶-有缺陷慢病毒载体进行的脱靶切割的无偏检测(Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors)》(《自然生物技术(NatBiotechnol)》，第33期，第175到178页(2015年))；Tsai，S.Q.等人，《GUIDE-seq实现对由CRISPR-Cas核酸酶进行的脱靶切割的全基因组剖析(GUIDE-seq enables genome-wideprofiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases)》(《(自然生物技术(NatBiotechnol)》(2014年))；Kuscu，C.、Arslan，S.、Singh，R.、Thorpe，J.和Adli，M.，《全基因组分析揭示Cas9内切核酸酶结合的脱靶位点的特性(Genome-wide analysis revealscharacteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease)》(《自然生物技术(Nat Biotechnol)》，第32期，第677到683页(2014年)))。然后可以在培养细胞中跟踪具有显著活性的gRNA或gRNA对以测量C9ORF72基因的表达水平。可以再次跟踪脱靶事件。类似的，可以转染CD34+细胞，并且可以测量基因修正水平和可能的脱靶事件。这些实验允许优化核酸酶和供体设计以及递送。
实例99-在细胞中测试优选向导的脱靶活性
然后，将使用全基因组测序对根据以上实例中的TIDE和下一代测序研究具有最佳中靶活性的gRNA的脱靶活性进行测试。将在CD34+细胞或iPSC中对候选gRNA进行完全评估。
实例100-测试用于HDR基因编辑的不同方式
在测试gRNA的中靶活性和脱靶活性两者之后，将针对HDR基因编辑而对脱变修正和敲入策略进行测试。
对于突变修正方式，供体DNA模板将被提供为短的单链寡核苷酸、短的双链寡核苷酸(完整PAM序列/突变的PAM序列)、长的单链DNA分子(完整PAM序列/突变的PAM序列)或长的双链DNA分子(完整PAM序列/突变的PAM序列)。此外，将通过AAV递送供体DNA模板。
对于cDNA敲入方式的一些实施例，与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子(第一编码外显子)的多于40nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少40nt。与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子的多于80nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少80nt。与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子的多于100nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少100nt。与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子的多于150nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少150nt。与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子的多于300nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少300nt。与安全港座位(例如，AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、以及TTR)具有同源臂的单链DNA或双链DNA、18q11.2区域、14q24.3区域、或者11p15.4区域可以包括C9ORF72基因的第一外显子的多于400nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少400nt。此外，将通过AAV递送DNA模板。
对于cDNA或迷你基因敲入方式，与9p21.2具有同源臂的单链DNA或双链DNA，其包括C9ORF72基因的第一外显子(第一编码外显子)的80nt、C9ORF72基因的完整CDS以及C9ORF72基因的3′UTR、以及随后内含子的至少80nt。此外，将通过AAV递送DNA模板。
实例101-对引导Crispr-Cas9/DNA供体组合的重新评估
在针对HDR基因编辑而测试不同策略之后，将在原代人类神经元中对引导CRISPR-Cas9/DNA供体组合的缺失效率、重组效率和脱靶特异性进行重新评估。将把Cas9 mRNA配制成脂质纳米以供递送；将把sgRNA配制成纳米颗粒或作为AAV递送；并且将把供体DNA配制成纳米颗粒或作为AAV递送。
实例102-相关小鼠模型中的体内测试
最近，生成了含有人类C9ORF72基因连同正常六核苷酸重复互补物或扩增六核苷酸重复的小鼠模型。Tg(C9orf72_3)系112小鼠(美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，库存编号：023099)具有人类C9orf72_3转基因的若干串联拷贝，其中每个拷贝具有100到1000个重复([GGGGCC]100-1000)。作为对照，Tg(C9orf72_2)系8小鼠(美国杰克逊实验室，库存编号：023088)具有C9orf72_2转基因连同15个六核苷酸重复([GGGGCC]15)。来自Tg(C9orf72_3)系112和Tg(C9orf72_2)系8的半合子小鼠是活的、能生育的、以孟德尔比率出生并且截止16月龄未患有运动或认知表型。
然而，截止三个月龄，半合子Tg(C9orf72_3)系112动物在大脑的大多数神经元群体中展现出RNA团簇(由含有六核苷酸重复扩增的人类C9ORF72 RNA形成)以及聚(Gp)二肽(poly(GP)dipeptide)(由重复扩增的非ATG引发的转译产生)。对于半合子Tg(C9orf72_2)系8，未观察到RNA团簇或聚(Gp)二肽表型。(O′Rourke(2015年)，《神经元(Neuron)》，第88卷，第5期，第892到901页，2015年12月2日，“《C9orf72 BAC转基因小鼠显示ALS/FTD的典型病理学特征(C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features ofALS/FTD)》”)。
将在动物体内对gRNA进行测试以评估其改变C9ORF72中的六核苷酸重复扩增并产生表型变化的能力，如抑制或改善RNA团簇和重复相关非ATG(RAN)转译的二肽、以及抑制或改善半合子Tg(C9orf72_3)系112动物中展现出的所产生的改变后核仁蛋白分布和核仁功能障碍。
实例103-体外转录
为了识别能够编辑C9ORF72 DNA靶区域的大范围的gRNA对，进行了体外转录(IVT)gRNA筛选。提交了C9ORF72基因组序列以供使用gRNA设计软件进行分析。基于序列的唯一性(仅筛选了在基因组中的其它地方不具有最佳匹配的gRNA)和最小预测脱靶将所产生的gRNA列表缩减为约200个gRNA的列表(见表3)。
表3。gRNA
Figure BDA0001772177500001231
Figure BDA0001772177500001241
Figure BDA0001772177500001251
Figure BDA0001772177500001261
Figure BDA0001772177500001271
表3中的gRNA在体外转录并且使用信使Max转染到组成性地表达Cas9的HEK293T细胞中。在转染后48小时收集细胞；分离基因组DNA；并且使用TIDE分析对切割效率进行评估。(图1)。发现大约25％的被测gRNA诱导超过80％的切割效率。
关于说明性实施例的注记
虽然本公开为了说明本发明的各个方面和/或本发明的潜在应用的目的而提供了对各个特定方面的描述，但是应当理解的是，所属领域的技术人员将想到变化形式和修改形式。因此，本文中描述的一项或多项发明应当被理解为至少与请求对其进行保护的那样宽泛，并且不像本文中提供的特定说明性方面所定义的那样窄。
除非另外指明，本文中标识的任何专利、公开或其它公开材料通过引用全部结合在本说明书中，但是程度仅仅为所结合材料与本说明书中明确阐述的现有描述、定义、陈述或其它公开材料不冲突。如此并且在必要的程度上，本说明书中阐述的明确公开内容取代通过引用结合的任何冲突材料。被陈述为通过引用结合在本说明书中但与本文中所阐述的现有定义、陈述或其它公开材料冲突的任何材料或其部分仅仅是在这样的程度下结合：在所述结合材料与现有公开材料之间不产生冲突。申请人保留修改本说明书以明确叙述通过引用结合在本文中个的任何主题或其部分的权利。

Claims (18)

1.一种用于通过基因组编辑对人类细胞中的C9ORF72基因进行编辑的离体方法，所述方法包括：将一个或多个Cas9内切核酸酶和一个或多个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述细胞中，以在所述C9ORF72基因或者对所述C9ORF72基因的调控元件进行编码的其它DNA序列内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因内或附近的扩增六核苷酸重复的永久缺失、插入或修正并且引起C9orf72蛋白质活性的恢复，其中所述一个或多个gRNA包含选自下组的间隔序列：SEQ ID NO 2669,2673,2681,2687,2689,2694,2697,2698,2701,2755,2758,2763,2785,2805,3341,3344,3403,3404,3405,3410,3421,3422,3430,3432,3435,3437,3464,3472,3475,3479,3485,3496,3503,3519,3523,3524,3531,3534,3542,3549,3556,3558和3592。
2.一种用于通过基因组编辑将C9ORF72基因插入人类细胞中的离体方法，所述方法包括以下步骤：将一个或多个Cas9内切核酸酶和一个或多个向导核糖核酸(gRNA)引入到所述人类细胞中，以在安全港座位内或附近实现一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，所述一个或多个SSB或DSB引起所述C9ORF72基因或迷你基因的永久插入并且引起C9orf72蛋白质活性的恢复，其中所述一个或多个gRNA包含选自下组的间隔序列：SEQ ID NOs2669,2673,2681,2687,2689,2694,2697,2698,2701,2755,2758,2763,2785,2805,3341,3344,3403,3404,3405,3410,3421,3422,3430,3432,3435,3437,3464,3472,3475,3479,3485,3496,3503,3519,3523,3524,3531,3534,3542,3549,3556,3558和3592。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个Cas9内切核酸酶在一个或多个多核苷酸上编码。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个Cas9内切核酸酶在一个或多个核糖核酸(RNA)上编码。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸或所述一个或多个RNA是一个或多个修饰后多核苷酸或一个或多个修饰后RNA。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个Cas9内切核酸酶是蛋白质或多肽。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个gRNA或所述一个或多个sgRNA是一个或多个修饰后gRNA或一个或多个修饰后sgRNA。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个Cas9内切核酸酶和一个或多个gRNA各自被单独配制成脂质纳米颗粒或全部被共同配制成脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个Cas9内切核酸酶被配制成脂质纳米颗粒，并且所述一个或多个gRNA通过病毒载体递送。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
13.一个或多个向导核糖核酸(gRNA)，其包含选自下组的间隔序列：SEQ ID NO:2669,2673,2681,2689,2697,2698,2755,2758,2763,2785,2805,3341,3344,3403,3404,3405,3410,3421,3422,3430,3432,3435,3437,3464,3472,3475,3479,3485,3496,3503,3519,3523,3524,3531,3534,3542,3549,3556,3558和3592。
14.根据权利要求13所述的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)。
15.根据权利要求13或14所述的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或一种或多种sgRNA是一种或多种修饰后gRNA或一种或多种修饰后sgRNA。
16.一种对来自患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆(FTLD)的患者的细胞中的C9ORF72基因进行编辑的离体方法，所述方法包括：使用根据权利要求13-15的一个或多个向导核糖核酸(gRNA)和一个或多个Cas9内切核酸酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个gRNA是一个或多个单分子向导RNA(sgRNA)。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述一个或多个gRNA或所述一个或多个sgRNA是一个或多个修饰后gRNA或一个或多个修饰后sgRNA。
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
DK3119797T3 (da) 2014-03-18 2021-03-15 Univ Massachusetts Raav-baserede sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af amyotrofisk lateralsklerose
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
JP6619822B2 (ja) 2015-05-29 2019-12-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
EP3478841A1 (en) * 2016-06-29 2019-05-08 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of apolipoprotein c3 (apociii)-related disorders
WO2018007871A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR102294755B1 (ko) 2016-09-30 2021-08-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C9orf72 유전자좌에서 헥사뉴클레오티드 반복 확장을 갖는 비인간 동물
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
GB201619876D0 (en) 2016-11-24 2017-01-11 Cambridge Entpr Ltd Controllable transcription
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
AU2018224387A1 (en) 2017-02-22 2019-09-05 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
KR20190130613A (ko) 2017-03-23 2019-11-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018208972A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN111448321A (zh) 2017-09-22 2020-07-24 马萨诸塞大学 Sod1双表达载体及其用途
MX2020007148A (es) * 2017-09-29 2020-10-08 Intellia Therapeutics Inc Formulaciones.
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
KR20200077529A (ko) * 2017-10-24 2020-06-30 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 희귀 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
US10905707B2 (en) * 2017-11-10 2021-02-02 University Of Massachusetts Compositions and methods for the treatment of expanded repeat-associated disorders
AU2019361203A1 (en) 2018-10-18 2021-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
MX2021007400A (es) * 2018-12-20 2021-07-15 Regeneron Pharma Expansion de repeticiones mediada por nucleasas.
CN109852587B (zh) * 2019-03-07 2021-04-27 中国科学院动物研究所 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法
KR20210143230A (ko) 2019-03-19 2021-11-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물
JP2022528487A (ja) * 2019-03-29 2022-06-13 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツ Ｃ９ｏｒｆ７２のオリゴヌクレオチドベースの調節
CN114502177A (zh) * 2019-05-09 2022-05-13 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其使用方法
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20230040053A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-09 Tsinghua University DEVELOPMENT OF DUAL-gRNA APPROACH WITH UNDETECTABLE OFF-TARGET EFFECT TO CORRECT C9ORF72 REPEAT EXPANSION AND C9ORF72 PATHOLOGY
WO2021159008A2 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Maze Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
CA3175071A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Bit Bio Limited Method of generating hepatic cells
AU2021237633A1 (en) * 2020-03-18 2022-10-06 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of C9orf72
WO2021216457A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Spinalcyte, Llc Treatment of frontotemporal dementia using fibroblasts and products thereof
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
WO2022058295A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing diseases induced by repeat expansion using optical mapping
US20230392134A1 (en) 2020-09-30 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP2024513237A (ja) 2021-04-06 2024-03-22 メイズ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３プロテイノパチーを処置するための組成物及び方法
GB202105455D0 (en) * 2021-04-16 2021-06-02 Ucl Business Ltd Composition
EP4130263A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-08 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Compound and method for a specific targeting of the hax1 gene
WO2023086389A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Prime Medicine, Inc. Genome editing compositions and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2023164482A2 (en) * 2022-02-23 2023-08-31 The Johns Hopkins University Treatment for nucleotide repeat expansion disease
WO2023220740A2 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 The Regents Of The University Of California Therapeutic crispr/cas9 gene editing approaches to the c9orf72 repeat expansion mutation in ipscs
WO2023235726A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2024077109A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Maze Therapeutics, Inc. Unc13a antisense oligonucleotides and uses thereof

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
DE3851889T2 (de) 1987-06-24 1995-04-13 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
ATE154246T1 (de) 1990-07-27 1997-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
WO1992002534A2 (en) 1990-08-03 1992-02-20 Sterling Drug, Inc. Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
EP0691977B1 (en) 1993-03-31 1997-11-26 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
PT733103E (pt) 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
WO1996001064A1 (fr) 1994-07-01 1996-01-18 Tornare Francois Canne multi-longueurs
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CA2302992C (en) 1997-09-05 2011-11-01 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
JP6343605B2 (ja) 2012-05-25 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ依存性標的ｄｎａ修飾およびｒｎａ依存性転写調節のための方法および組成物
ES2701749T3 (es) * 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
CN105916983A (zh) * 2013-10-25 2016-08-31 塞勒克提斯公司 用于高效且特异性靶向包含高度重复基序的dna序列的稀有切割核酸内切酶的设计
KR20160097338A (ko) * 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 반복 장애에서의 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템의 조성물 및 방법 및 용도
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2015153760A2 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
CA2954791A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
JP6619822B2 (ja) * 2015-05-29 2019-12-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物
WO2016210372A2 (en) * 2015-06-25 2016-12-29 University Of Southern California Methods to treat neurological diseases
KR102294755B1 (ko) * 2016-09-30 2021-08-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C9orf72 유전자좌에서 헥사뉴클레오티드 반복 확장을 갖는 비인간 동물

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