JPH025900A - 末端標識したヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特定結合検定の為のシグナル発生システムに
関するものである。更に特別には、本発明は、ビオチン
と他の公知標識化部分のような非放射性部分による核酸
ハイブリッド形成プローブの標識札における改良に関す
るものである。

（従来の技術と発明が解決しようとする課題）オリゴデ
オキシヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチド（オ
リゴマー）は、特定遺伝子及び核酸配列の検出の為のプ
ローブとして現在広く使用されている。オリゴヌクレオ
チドの標識化の為の最も普通の方法は、同位元素ｓａｐ
の組込みである。このアプローチは実験目的には適して
いるけれども、安全予防措置が必要とすることと相俟っ
て、ｓａｐの比較的に短い半減期は、効果的でかつ非放
射性標識化方法の検索が刺激されている。

今まで報告されている各種の非放射性標識の内、ビタミ
ンビオチン（及びイミノビオチンのようなビオチン類似
体）が、使用される検出システムの感度に加えて、アビ
ジンとストレブタビジンと結合する高い親和力、融通性
、及び取扱い容易によって可なりの注目を引いてきた。

ビオチン化プローブは、レアリ等、プロシーデインゲス
　ナショナルアカデミ−サイエンス（ＰＮＡＳ）、夏ｌ
ｌｂ第４０４５頁（１９８３）に示される゛ように、ニ
トロセルロースフィルター上の標的核酸配列の感光比色
的検出に対して、更に、ランゲルーサファー等、ＰＮＡ
Ｓ、［、第４３８１頁（１９８２）に示されるように標
的ＤＮＡの生体内原位置における検出に対して使用され
ている。

ＤＮＡ中にビオチンの酵素的組込みは一１相当に文献が
提出されており、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸の組
込みは、ラン゛ゲル等、ＰＮＡｓ’、ＬＬＩ血、第６６
３３頁（１９８１）に検討されているように、ニックト
ランスレーション法により、又は、キンゲスバリ等（編
集者）におけるブラケル等、「感染性因子の迅速検出と
同定」、アカデミツク　プレス、ニューヨーク、第２３
５〜２４３頁（１９８５）及びリレイ等、ディーエヌエ
−（ＤＮＡ）、星１塁、第３３３頁（１９８６）に記載
されるように末端デオキシヌクレオチド転移酵素によ′
る末端付加により達成出来る。ビオチン標識はまた、光
化学方法を使用してＤＮＡ中に導入されている。例えば
、ホルステル等、ヌクレイツクアシッド　リサーチ（ｌ
ｌｕｃ、ＡＣｏＲｅ　ｓ　、　）　％　１」皇、第７４
５頁（１９８５）参照。

幾つかの研究グループが、コレット等、ヌクレイツクア
シッド　リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、）、１
旦豆、第１５２９頁（１９８５）及びバクチル等、ヌク
レイツクアシッド　リサーチ（ＮＬＩ（！、　Ａｃ、　
Ｒｅｓ、）、第１４巻、第７９８５頁（１９８６）にお
けるようにリン酸アミド化を経るか、又はリン酸ジエス
テル結合を経るかのいずれかにより、オリゴヌクレオチ
ドの５′−末端に単一ビオチンの結合方法の改゛良に集
中している。後者に関して、ケンペ等、ヌクレイツクア
シッド　リサーチ、ｆｉ　、第４５頁（１９８５）、ア
グラバル等、ヌクレイックアシッドリサーチ−：　１」
１、第６２２７頁（１９８Ｂ）、及びチュー等、□ディ
ーエヌエー（ＤＮＡ）　、星１畳、第３２７頁（１９８
５）参照のこと。これらの方法はオリゴヌクレオチドプ
ローブを付与するのに使用出来るが、オリゴマー当たり
たった一つのビオチンしかこれらの方法により導入され
るに過ぎない。

ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブの感度を増大す
る為に、オリゴマーのハイブリッド形成が損なわれない
方法で幾つかのビオチンを導入する努力がなされて来た
。このことは、リレイ等、上記文献、のように末端転移
酵素を使用する、又は村杉等、ディーエヌエー（ＤＮＡ
）、ＬＬＩ、第２６９頁（１９８４）におけるようにフ
レノウ断片を使用する酵素的方法により達成されている
。また、プローブの内部ヌクレオチドに結合するサイド
アームに多くのビオチンを導入する化学的方法も、ブリ
アン等、ディーエヌエ−（ＤＮＡ）、ＬＬ、第１２４頁
（１９８４）による予告報告に記載されている。

（課題を解決するための手段） 本発明は、末端標識化、特に末端ビオチン化ヌクレオチ
ドを提供するもので、このヌクレオチドは、核酸ハイブ
リッド形成検定の成分として有用である。特に、記載さ
れる新規化合物新規化合物、及び核酸ハイブリッド形成
検定システム、並びにこの新規化合物を含みかつ使用す
る方法を提供するものである。

一つの見解において、ビオチンの少なくとも一つが、ハ
イブリッド形成を妨げない連鎖群を介して結合する。も
う一つの見解において、末端ヌクレオチドの少なくとも
一つが、ポリビオチン化ポリマーに結合する。本発明の
更にもう一つの見解において、新規オリゴ−が、ピリミ
ジン環の５−位置に結合する官能基を有するヌクレオチ
ドリン酸アミド化物から合成される。本し、それにより
このようなプローブを利用する検定がより敏感とされる
。

従って、本発明の主とする見解は、５°と３°の末端ヌ
クレオチド又は末端ヌクレオチド領域の各々に直接的に
又は間接的に結合する少なくとも一つのビオチン又は他
の非放射性検出部分を宵するオリゴ−又はポリヌクレオ
チドから成る酸ハイブリッド形成検定組成物は、更に追
加的試薬を含むことが出来る。

試験が実施される試料液体は、生物学的、生理学的、工
業的、環境的、及び他のタイプの液体を含む。特に関心
のある液体は、血清、血漿、尿、脳を髄液、唾液、乳、
スープ及び他の培養液、及び上澄み並びにこれらどれか
の画分のような生物学的液体である。関心のある生理学
的液体は、浸出液溶液、緩衝液、防腐・溶液又は抗菌溶
液などを含む。工業的液体は、例えば、薬品、乳製品及
び麦芽飲料の製造において使用される。発酵液及び他の
加工液を含む。従来の方法により試験される試料液の他
の源は、使用されるような試料液という用語で意図され
ており、かつ本発明により検定されることが出来る。

「アナライト」という用語は、その存在が試料液中に定
量的又は定性的に決定されるべきどの物質に、又は関連
する物質のクラスに関するものである。本発明の検定は
、特定結合相手があるアナライトの検出に、かつ逆にア
ナライトを結合する為のアナライト液の能力の検出に適
用出来る（普通、試料中のアナライトに対する結合゛相
手の存在に起因する）。′アナライトは普通、特定結合
相手が存在するか、又は付与され得るオリゴ−又はポリ
ヌクレオチドである。アナライトは、機能的用語におい
て、相補的核酸配列が存在するか、又は調製可能なＲＮ
Ａ又はＤ・Ｎ＾から普通選択される。

「アナライト−特定疲」という用語は、分子の特別な空
間と極性構成、即ち、エピトープ的部位、又はたの配列
に優先する核酸配列のような特別な情報配列を認識出来
るどの化合物又は複合物にも関係する。大部分の実施態
様にお゛いて、アナライト−特定液は、核酸ハイブリッ
ド形成検定プローブのような特定結合検定試薬であろう
。特に関心のあるアナライト−特定液は、疾患起因生物
体、例えば、Ｎ、淋菌文はヒト乳頭腫ウィルスに特異な
りＮＡハイブリッド形成検定オリゴヌクレオチドプロー
ブ、又は遺伝的障害、例えばディーサックス病又は網膜
芽腫を示すポリヌクレオチド遺伝子配列を含む。

アナライト−特定部分は、直接的に゛又はビオチン又は
ビオチン類似体のような他の部分を伴う非干渉性連鎖群
を介して結合され得る。直接的に結合される場合、この
ような結合は、共有又は非共有のいずれかで有り得る。

結合が非干渉性連鎖群を介して結合される場合、この非
干渉性連鎖群は、このアナライト−特定部分があるアナ
ライトと結合する特徴的能力を実質的に阻害しない一つ
である。更に、このような連鎖群は、これらがエネルギ
ー放出又はこれらが結合されるある部分の他の特性を実
質的に阻害しないことを特徴とする。連鎖群は、非荷電
であり得、又は一つ又はそれ以上の荷電官能性を含み得
る。アナライト−特性部分の他の部分との結合はまた、
重合性化合物を介して達成され得る。このような化合物
は、上述の連鎖群の非干渉性特徴を、普通発揮するであ
ろう。アナライト特定部分がアナライトに結合する場合
の検出は、検出可能な分子を使用する各種の手段により
達成可能である。検出可能な分子は、酵素、蛍光色素、
色素原又は直接的にまた間接的にアナライト特定部分に
結合され得るような物などが挙げられる。例えば、アナ
ライト特定部分に結合するビオチンは、アビジン又はス
トレブタビジン及びビオチン化酵素からなる、前形成の
検出可能な分子により検出され得る。検出可能な分子と
アナライト特定部分との間に形成された反応生成物の複
合体は、検定組成物のシグナル報告部分として上述の理
由で役立つことが出来る。

（実施例） 以下の実施例により本発明を説明するが、これらは本発
明を制限する為のものでは無い。

残留ビオチンの位置と数の関数としてビオチン標識付は
オリゴマープローブの有効性を研究する為に、各種の位
置のビオチン−１１−ｄＵＭＰを含む一連のオリゴマー
を合成し、かつこれらと、ビオチン−１１−ｄＵＴＰと
末端デオキシヌクレオチド転移酵素で酵素的に末端標識
化することにより調製したオリゴマーとの比較が、ハイ
ブリッド化／検出研究においてなされた。保護アリルア
ミノのサイドアームを含むデオキシウリジンリン酸アミ
ド化物を合成し、かつ１７−塩基オリゴヌクレオチド配
列内の各種の位置で残留アリルアミノを有するオリゴヌ
クレオチドを調製するのに使用した。続いて、ビオチン
置換物を、トビオチンニルー６−アミノカブロン酸−ト
ヒドロキシコハク酸イミドエステルと反応させること１
μよりアリルアミノ　サイドアームに結合させた。

これらのオリゴマーは、ミクロタイ５ターウエル（エリ
ザプレート）上に固定された標的ＤＮＡに対合させ、か
つ基質として過酸化水素を、色素原として０−フェニレ
ンジアミンを使用するストレプタビジンービオチン化西
洋ワサビペルオキシダーゼ複合体により検出された。こ
の定量的の比色的なハイブリッド形成／検出方法を使用
して、ハイブリッド形成配列の近く又は末端におけるオ
リゴヌクレオチド含有ビオチン標、識が、オリゴマー含
有内部的ビオチン標識よりもより効果的なプローブであ
ることを見いだした。ビオチン−ｄＵＭＰ残留の数を増
加する追加的効果が、幾つかの標識付は配置において見
いだされた。

下記実施例は、実験を詳しく説明すると共に、その結果
を報告している。

別に述べない限り、化学的試薬はアルドリッヒ社から購
入され、更に精製することな（使用した。薄層クロマト
グラフィーは、シリカゲル６０Ｆ２５４プレート（メル
ク）を使用して実施され、かつシリカフラッシュカラム
クロマトグラフィーは、シリカゲル品質６０（メルク）
を使用して実施された。塩化メチレンは、無水炭酸カリ
ウム添加して蒸留することにより乾燥し、Ｎ、　トジイ
ソプロビシレエチルアミンは蒸留により精製した。トビ
オチニルー６−アミノカプロン酸−トヒドロキシコハク
酸エステル（エンゾチン、登録商標名）は、工ンゾ　ピ
オケム社により供給された。’！Ｉｎｍｒスペクトルは
、ニコレットＱＥ３００装ｆｉで実施され、かつ３１ｐ
スペクトルは、ＪＥＯＬ　ＧＸ−４００分光計で実施さ
れた。

デテク（登録商標名）１−ｈｒｐ、末端デオキシヌクレ
オチド転移酵素、及びビオチン−１１−ｄＵＴＰは、エ
ンゾ　ピオケム社から入手された。０−フェニレンジア
ミン　ジヒドロクロライド（ＯＰＤ）　、ウシ血清アル
ブミン（３０％無菌溶液）、Ｈ３Ｏ１、トリトンｘ−ｔ
ｏｏは、シグマ社から購入された。イムロン（登録商標
名）２マイクロタイター［エリザ（ＥＬＩＳＡ）］プレ
ートは、ダイナチク社から購入された。硫酸デキストラ
ンは、ファルマシア社から、及びホルムアミドはフル力
社から購入された。１本鎖バクテリオファージ標的ＤＮ
Ａは、Ｍ１３ｍｐ１ｇバクテリオファージの組換え体（
大腸菌Ｒ１部位の無関係２．５キロ塩基挿入断片を含む
組換えＤＮＡ）により感染された大腸菌ＪＭ１０３上澄
みから標準的方法により調製されミこの方法は、マニア
チス等、「分子クローニング、実験室便覧」（１９８２
）、及びカドンガ等、ヌクレオイックアシッド　リサー
チ（Ｎｕｃ、＾ｃ、　Ｒｅｓ、）、第１３巻、第１７３
３〜１７４５貞（１９８５）を参照のこと。対照の１本
鎖標的ＤＮＡは、野生型（無ラック配列又はポリリンカ
ー配列）Ｍ２Ｓ−感染細胞上澄みから調製された。

下記ハイブリッド形成／検出検定の各種段階で使用した
緩衝液は、１）　ＳＳＣ：　２０Ｘ　ＳＳＣは３ＭＮａ
Ｃ１，０，３Ｍクエン酸ナトリウムであり；２）ＳＳＰ
Ｅ：　２０Ｘ　５ＳＰＥは３．６Ｍ　ＮａＣ１，０，２
Ｍ　　リン酸ナトリウムｐ１１７．４、及び０．０２Ｍ
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり；３）クエ
ン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ６、ｏ：　０．０５Ｍ　ｐ
Ｈ６，０に調節されたクエン酸と０．ＩＭ　ＮａｔＨＰ
Ｏ４：及び４）、　ＰＢＳ：　ｌ０ＸＰＢＳは１．５Ｍ
　ＮａＣ１，０，ＩＭ　リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
，２±０．２である。

ビオチン　ヌクレオチドの＾ ｉ）保護アリルアミノ−デオキシウリジン　リン酸アミ
ド化物 トリフルオロアセチルアリルアミド２゜トリフルオロ無
水酢酸（５６＋ａｌ、　３９７ｍモル）を１．５時間を
要して０℃のアリルアミン溶液（４０，５ｇ。

６０ｍ１．８００ｍモル）中に撹拌しながら滴下する。

生成赤色溶液を一晩室温で保存し、次いで酢酸エチルと
炭酸水素ナトリウム水溶液（各☆５０Ｇｍｌ）の間に分
配させる。酢酸エチル層を炭酸水素ナトリウム溶液（２
ｘ５０（）ｍｌ）と水（２ｘ５００＋ａｌ）で洗浄し、
次いで無水硫酸ナトリウム上で一晩乾燥する。濾過後、
溶液を蒸発乾固し、真空で痛留する。再蒸留により無色
油としての化合物？（第１図）を得る＝収量：　４５．
２ｇ（３７％）、沸点１１９℃／ｌｏｃｍ、　ｎｍｒ（
ＣＤＣ１３）ｄ　　６．５８．　　ｂｒ　　ｓ、ＩＮＨ
。

５、　Ｈｚ　ｍ＊　Ｌ　ＣＩＬ　５．　Ｌ　ＩＳ、　Ｌ
　ＣＨＩ、　４．０ｒ　Ｌ　Ｌ　ＣＨｔＮａＣ，Ｉｌ、
Ｐ３Ｎｏに文・　る元 計算値：　Ｃ３９，２２，ＩＩ’３．９５．　Ｆ　３７
．２３．　Ｎ・９．１５測定値：　Ｃ３９，００，Ｈ４
，１Ｂ、　Ｆ　３７．５０．　Ｎ　８．９１５−塩化水
銀−２′−デオキシウリジン（１）’（１２，６ｇ。

２７、２ｍモル）の酢酸ナトリウム緩衝液（０，ＩＮ、
　ＰＨ５）中の分散物ヲ、トリフルオロアセチルアリル
アミド（２）（２６ｇ、、　１７５ｍモル）と処理し、
次いでカリウムテトラクロロパラデート（８，９８ｇ、
　２７．５ｒモル）の水（１００ｇ＋１）溶液により処
理する。混合液を１８時間室温で撹拌し、次いでセライ
トを介して濾過して水銀とパラジウムめ黒色沈澱を除去
する。濾液を撹拌下に水素化ホウ素ナトリウム（３ｘｌ
Ｏｈｇ’）で処理し、次いで再びセライトを介して濾過
する。縞液を約３００１まで蒸発させ、次いで酢酸エチ
ル（６ｘ２００ｍｌ）で抽出する。−緒にした酢酸エチ
ル届を蒸発乾固し、これを２つの部分に分ける。各々の
部分を溶剤として酢酸エチルを使用してシリカゲル（ｚ
ｓｏｇ）上フラッシュカラムクロマトグラフィーにより
精製し、各々のカラムからの画分９５〜１８’Ｏ（２０
”−１画分）を組み合わせ、これを蒸発乾固して白色結
晶塊としての化合物（３）を得る。　３．８ｇ（３７％
）。試料を酢酸エチルｌヘキサンから再結晶化して白色
結晶としての分析的に純粋な化合物品を得る。

融点１８４〜１８５℃、　ｎｍｒ（Ｍｅ＊５Ｏ−ｄ６）
ｄ　１１．５＋　ｓ、　１．旧Ｉ；９、７．　ｔ、　ｔ
、　ＮＨ：８．１．ｓ、　１．Ｃａ１ｌ；６．４．ｒａ
、　１．ＣＩ＝Ｈ６，２，ｍ、　ＬＣｌ・ｌｌ、−ＣＨ
＝；５’、　３．　ｄ、　１．　ｃｓ・０１１；５．　
ｔ、　ｔ、　ｔ、　ｃｓ・０１１；４．３゜ｆｆｉ、　
１．　Ｃ１ｌ：３．８４３．　ｇ、　ｍ、　３．　ＣＩ
ｌ、　ＣＩＩｔＮ；３．　ｓ、　ｌ、　２．　ｃｏｔ　
：２．１１ｍ＋　Ｌ　Ｃｔ・ＨＳｕｖ（ＩＩｔＯ）＋ａ
ｘ２４１ｎｍ、　ｅ７９８０：２９４ｎｍ。

ｅ６８３０゜ ΩΩ 無水ピリジン（５ｍｌ）中の化合物品の溶液（５７０Ｂ
。

１、５２ｍモル）を室温で一晩４，４゛−ジメトキシト
リチルクロライド（６１７ｍｇ、　　１．８２ｍモル）
で処理した。

薄ＴＡクロマトグラフィー（ＴＬＣ；　シリカ、塩化メ
チレン：メタノール、　１０：１）は、出発原料がまだ
存在することを示したので、ジメトキシトリチルクロラ
イド（２５４ｍｇ）を追加して添加し、次いで溶液を３
時間室温で保持した。メタノール（１量ｌ）を添加し、
次いで溶液を一蒸発乾固し、真空中で一晩保持した。黄
色泡が塩化メチレンと水（各々７０１）の間に分配され
、塩化メチレン層を水（２ｘ７０ａ＋１）で洗浄し、次
いで硫酸ナトリウム上で一晩乾燥した。溶液を濾過し、
濾液を蒸発乾固し、溶剤として塩化メチレン：メタノー
ル（２５：１）を使用して′シリカ（１５０ｇ）上でフ
ラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。

チューブ３４３４−５０（２０画分）は、ＴＬＣ純粋原
料を含み、かつ組み合わされ、かつ蒸発乾固された。

残留物を乾燥、ベンゼン（２ｘ５ｍｌ）、で共蒸発させ
、−晩真空中で乾燥して白色非晶質固体としての化合物
±（第１図）を５９ｊＢ（５７％）得た。ｎｍｒ（ＣＤ
ＣＬｓ）ｄ　７．９０．８１１．　Ｃ６１１；７．３−
７．５．　ｔａ、　９．芳香族：６．８９．　ｄ、　４
゜芳香族；６．４４．　ｒａ、　２．　ＣＩ−Ｈ，Ｃ１
１＝’；　５．３２．　ｄ、　２．’ＣＨ＝；４．６５
゜ｓ、　ｌ、　Ｃ１ｌ：４．１４．　ｓ、　２．　ＣＩ
ＩｔＮ；３．８３．　ｓ、　６．０ＣＨｓ　；３．　Ｌ
　ＩＩ、　ＬＣｌｌ；３．　ｓ４．　Ｉｆ、　ｚ、　Ｃ
ｓ−１ｆ；２．４Ｌ　Ｉｌｌ　ｚ、　ＣＨ＊。

隔膜密封フラスコ中の乾燥塩化メチレン（４量ｌ）の化
合物まの溶液（３４ｈｇ、　０．５ｎ＋モル）を、Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０，２８６ｍ１゜■
、５ｓモル）で処理し１９次いでクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミノメトキシフォスフイン（０，１
４５ｍ１．０．７５ｎ＋モル）により処理し、両方の試
薬は注射器を介して添加した。溶液を２０分間室温で保
持し、次いで水と酢酸エチル（各々２５ｍ１）の間で分
配した。酢酸エチル層を炭酸水素ナトリウム水溶液（１
ｘ２５ａ＋１）、水（ＩＸ２５ｍｌ）で洗浄し、次いで
一晩無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。固体を濾別し
、濾液を蒸発乾固し、乾燥ベンゼン（２Ｘ５＋ａｌ）で
共蒸発させ、次いで一晩真空で乾燥した。残留物を乾燥
ベンゼン（２，５＋ｓｌ）に溶解し、溶液を激しく撹拌
されるＯ”Ｃの乾燥へ牛サンの溶液、へ添加することに
より沈澱させた。沈澱物を濾過により集め、冷へ牛サン
（６ｘ、２０１ｍ１）で洗浄し、−晩真空中で乾燥して
白色非晶質固体としての化合物型を３１１ｍｇ（７４％
）得た。

３１Ｐｎｍｒ（ＣＤＣ１３）ｄ　１４９．４４．１４８
．９１．不純物ｄ８．３７．　ｔｉｅ（ＣＨ２ＣＪ２／
ＭｅＱ１１．．２０：１）ＲｆＯ，４，不純物ＲｆＯ９
２゜ ｉｉ、）オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドを、メチルホスホールアミダイトと
製造会社により供給される試薬を使用してアプライドバ
イオシステム社の装置、モデル３８０Ｂに基づくホスホ
ールアミダイト添加により合成した。０．２μモルと１
μモルの両方の合成サイクルを使用した。修飾ホスホー
ルアミダイト（化合物互）を乾燥アセトニトリルに溶解
し、次いでガラス綿プラーグを介して濾過して直ぐ後で
前記装置に負荷した。ホスホールアミダイト添加をトリ
チル陽イオンの放出により監視し、かつ修飾化合物Ｓｉ
ｔ未修飾ホスホールアミダイトと同じ程度に混合された
。ここに報告されるように合成されたオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は、下記実施例１．第１１表に説
明される。合成の完成後、オリゴマーを一晩５５℃でア
ンモニアで処理することにより脱保護化し、これは尚ト
リフルオロアセチル基を開裂して、選択される位置にア
リルアミノ　サイドアームを有するオリゴヌクレオチド
を生成するのに役立ったｄ ｉｉｉ　）オリゴヌクレオチドのビオチン化上述のよう
にして調製した粗製オリゴヌクレオチドを、溶出緩衝液
として２Ｇ＋ａＭ炭酸水素トリエチルアンモニウムｐＨ
７（ＴＥＡＢ）を使用してセファデックス０２５カラム
（１ｘｔ６ｃｍ）を介して通すことにより最初に精製し
た。画分４−ｆｉ（１ｍｊ画分）を集め、蒸発乾固し、
水に溶解し、次いでｕ、ｖ分光学により検定した。精製
オリゴヌクレオチドの各々の水（１００μｌ）中のアリ
コート（２００Ｄｒｓ。ユニット）を、０．、．１ｍホ
ウ酸ナトリウムと組み合わさせ、次いでジメチルスルホ
キサイドを添加した。得られた溶液を、ジメチルスルホ
キサイド（１２５μｍ）中のトビオチニルートアミノカ
ブロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（５ｍｇ）
の新たに調製した溶液と組み合わせ、次いで得られた反
応混合物を一晩室温で装置した。次いで、得られた反応
混合物を２部分に分け、各々を２０ｍＭＴＥＡＢで平衡
されたセファデック不０２５カラム（１ｘｉ６．ｃｍ）
を通して精製した。各々のオリゴヌクレオチドに関して
、平行して通した２つのカラムの、各々からの画分４−
６　（１ｍ、１両分）を混合し、次いで蒸発して粗製ビ
オチン化オリゴマーを得、次いでこれを下記のゲル電気
泳動により精製した。

ｉｖ　）ゲル電気泳動によるビオチン化オリゴマーの精
製 上述のようにして調製したビオチン化オリゴマーを、更
に０．４ｍｍ厚さのゲル上で２０％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（アクリルアミド：ビスアクリルアミド、
、４０：ｌ及び７Ｍ尿素を含有）により精製した。次い
で、各々のビオチン化オリゴヌクレオチドの２００Ｄ＊
ｓ。ユニットを、０．０９Ｍ１−リスベース、０．０９
１つ酸、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ＩＸ　Ｔ、ＢＡ）、４
０％ホルムアミド及び０．２５％ブロムフェノールブル
ーを含む溶液ｌＯＯμｌに溶解した。各々のオリゴヌク
レオチド溶液を２０個の８鳳−ウェルに塗布し、３−４
時間ＩＸ　ＴＢＥ緩衝液において３０ミリアンペアで電
気泳動した。バンドを、背景としてシリカゲルオ６ＧＦ
２５４（メルク）のシートを使用して短波ｕｖクランプ
可視化した。最もゆっくりと移動した生成物のバンドを
切り取り、次いで６０℃で１８時間１００ｍＭ　）リス
ベース、０．５Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ
８に浸漬した。この溶液をデカントし、セップープアッ
ク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）カートリッジ（ミリポール）を使
用して脱塩した。溶液をカートリッジに入れ、水（２０
ｍｌ）で洗浄して塩類を除去し、次いでオリゴマーをメ
タノール／水１：１（３ｍｌ）で溶出した。蒸発乾固し
た後、残留物を、溶出緩衝液として２０＋＋＋Ｍ　ＴＥ
ＡＢを使用してセファデック不０２５カラムにかけた。

オリゴヌクレオチドを含む画分を混合して、蒸発乾固し
、次いで水（１１）に溶解して下記ハイブリッド形成実
験に使用するのに適した原料溶液を得た。

Ｖ）末端ビオチン−標識化、オリゴマープローブの調製 この研究の為に調製した未修飾オリゴマーを、ヌクレオ
チドのオリゴマーに対する比が５＝１〜５０：１に変化
する濃度で、０．２Ｍカコジル酸カリウム緩衝液ｐＨ７
，２，１ｍＭ　ＣｏＣＬ、末端転移酵素（オリゴマー２
０ユニツト／μｇ）、オリゴマー（２０Ｍｇ／＋ｓｌに
て）及びビオチン−１１−ｄＵＰＴを含む反応物におい
て、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して末端
標識化した。幾つかの場合において、３Ｈ−ＴＴＰを添
加してビオチン−１１−ｄＵＰＴの組み込みを監視した
、キンゲスバリ、　Ｄ、　Ｔ、及びファルコウ、Ｓ、（
編集）におけるブラッケル等、「感染性因子の検出と同
定」アカデミツク　プレス社出版、ニューヨーク、第２
３５−２４３頁（１９８５）。たの場合において、末端
添加におけるビオチン−１１−ｄＵＰＴを分離し、又は
交互にする為に一反応物にＴＴＰを添加した。反応を３
７℃で９０分間継続させ、次いで２５ｍＭの濃度までＥ
ＤＴＡを添加することにより停止させた。′末端標識化
オリゴマーを、更に精製すること無（、下記報告のハイ
ブリッド形成／検出実験に使用した。

ハイブリッド　　　　の イム口・ン（登録商標名）２マイクロタイタープレート
に標的核酸の固定を、水田等、エフイーピーニス　レタ
ーズ（ＰＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、ｌ旦１、第３７９
−３８２頁（１９１１１５）に記載の方法の改良により
達成した。使用した方法は次の通りである。プレートを
先ｆ１Ｍ酢酸アンモニウムで洗浄し、次いで標的ＤＮＡ
を゛ＩＭ酢酸アンモニウム５０μｍ世に適当濃度でウェ
ルに添加した。１本領標、的ＤＮＡを１Ｍ酢酸アンモニ
ウムに希釈する以外は予備処理すること無くウェルに負
荷した。負荷されたウェルをプレートに標的ＤＮＡを固
定する為に３７℃で１、５−２時間装置させた。プレー
トを調製後直ぐに使用するか、又はハイブリッド形成実
験に使用する前に４℃で保持した。、ハイブリッド形成
直前１こ、プレートを２回２Ｘ　ＳＳＣで洗浄し、次い
で１回１％（ｖ／ｖ）　トリトンＸ−１００を含む２Ｘ
　ＳＳＣで洗浄した。

ハイブリッド形成を、３０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、
２ｘ又は４Ｘ　ＳＳＩ’Ｅ、　　１％（ｖ／ｖ）　）リ
ドンＸ−１００，５％（Ｙ／ｖ）硫酸デキストラン、及
びプローブＤＮＡを含む溶液１’００μｌを使用して室
・温で実施した。オリゴヌクレオチドプローブを、最終
濃度１１００ｎ／ｍｌで使用した。ハイブリッド形成を
３０〜９０分間継続させた。

ハイブリッド形成の装置の後、プレートを逆さにし、か
つ普通は０．１％トリトンｘ−ｉｏｏを含む０．２Ｘ　
ＳＳＣで洗浄することにより空にした。洗浄はプレート
のウェルを２００μｌの溶液で満たし、次いで５−１０
秒間（若し数個のプレートを一度に行うなら□ば、１〜
２分間までのより長い時間）静かに振とうすることから
成った。幾つかの場合において、洗浄は、３７−４２℃
まで加熱された緩衝液で実施して、ハイブリッド融解実
験を実施する為に゛充分な緊縮の条件″を付与した。４
−５回の洗浄に続いて、ハイブリッド形成したプローブ
中のビオチンを次のようにして検出した。

ハイブリ、ド形成し、かｐビオチン化したプローブＤＮ
Ａを、ストレブタピンのブチツク（Ｄａｔｅｋ登録商標
名）−ｂｒｐ複合体とビオチン化西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを使用することにより、次のようにして検出した
。複合体を、ＩＸＰＢＳ、　　０．５Ｍ　ＮａＣ１，０
，１％ＢＳＡ、　　０．１％トリトンＸ−１００゜５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ（複合体希釈緩衝液）中に希釈し、次いで
プレートのウェルに添加した（ウェル当たり５０μｌ）
。複合体を、別に記載しない限り、室温で３０分間ウェ
ル中で装置した。次いでプレートを、複合体希釈緩衝液
で２回、次いで５ＩＩＩＭＥＤＴＡを含むＩＸ　ＰＢＳ
で３回洗浄した。結合した検出複合体中の西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを、クエン酸／リン酸塩緩衝液、　ｐＨ
６，０中のＩＩ　ｆｆｉ　Ｏ。

（０，０１２５％）と０ＰＤ（１，６ｍｇ／ｍｌ）を含
む反応混合物（ウェル当たり１５０μｌ）と暗所にて反
応させた（室温で２０−３０分間）。発色を４Ｎ　ｎ＊
５ｏ４（ウェル当たり５０μｌ）添加するこ゛とにより
停止させた。光学密度測定（４９０ｎｍにて）を、イン
ターラブマイクロプレート　リーダー　モデルＮＪ２０
００を使用して反応停止５〜１０分間の内にした。ＤＮ
Ａ固定方法の間にただＩＭの酢酸アンモニウムしか受は
入れなかったが、しかしプローブ・、検出複合体、及び
ペルオキシダーゼ反応混合”物にさらされたウェルを、
吸光度読みの為のゼロ（空）対照として使用した。総て
のハイブリッド形成を、各種測定の為に二重〜四重にて
実施した。非相補的標的ＤＩＩＡ（野生型バクテリオフ
ァージＤＮＡ）を含むウェル中のハイブリッド形成から
の吸光度読みは、０．０１０〜０．０５０に亙り、かつ
相補的標的ＤＮＡの為のハイブリッド形成に対し報告さ
れる吸光度読みから差し引かれた。これらの方法の変動
における変化は、適用出来る限りの下記報告される個々
の実験に記載されている。

１Ｌ バクテリオファージＭ１３ｍｐ系列ＤＮＡの塩基６２０
４〜６２２Ｇ（大腸菌ラック遺伝子の部分）に相補的な
ヘプタデカヌクレオチド（１？塩基）配列を、修飾の為
に選択した。この配列とハイブリッド形成／検出実験の
結果により、これに沿って合成された各種ピオチン−標
識したオリゴヌクレオチドを次の第１表に示す。

！’ Ｕ＝ビオナン化ｄＵＭＰ 前記オリゴヌクレオチド合成方法により、単一ビオチン
置換が内部の部位（オリゴマー旦とヱ）、及び３°−末
端（オリゴマー８）近（に導入された。

５゛−末端に単一ビオチン化ヌクレオチドの付加を有す
る塩基配列を含むオクタデカｍａｒも合成されたくオリ
ゴマーり。このオリゴマーの５°−末端塩基は、非相補
性の為に標的Ｍｉ３　ＤＮＡへ対合させることが出来ず
、従って小さな尾として作用する。配列光たり２つのビ
オチンを含むｌＯのようなオリゴマーもまた合成され、
これは内部部位に２つのビオチンを含有し、及び貝のよ
うなオリゴマーも合成され、これは末端近くの一つのビ
オチンと内部部位の一つのビオチンを含むものである。

オリゴマー■は分子の末端近（のビオチンを有し、オリ
ゴマー脛は、塩基配列が３°−末端に３つのヌクレオチ
ド（２つのビオチン化残基と一つの末端チミジン残基）
の付加により引き伸ばされたドデカｍａｒである。合成
のポリマー−担持方法は、固体担体に既に結合している
望みの配列の３゛−末端塩基を必要とする為に、かつ固
体担体に結合する修飾されたトリフルオロアセチルアミ
ノプロペニルヌクレオチドが利用出来ない為に、３°−
末端位置のチミジン残基が使用された。３つのビオチン
基を含む一つのオリゴマー（オリゴマー１４）も合成さ
れた。

最後に、未修飾オリゴマーを合成し、かつ末端デオキシ
ヌクレオチド転移酵素を使用してビオチン−１１−ｄυ
丁Ｐの末端付加により標識化してオリゴマー脛を得、こ
れは分子当たり３〜４ビオチン−ｄＵＭＰ残基を含んで
いた（オリゴマー当たり３．３ヌクレオチドの計算標識
）。

この研究に使用された検定方法は膜結合標的ＤＮＡに対
して標識化オリゴマーのハイブリッド形成に使用された
ものと実質的に異なった為に、ハイブリッド形成−検出
曲線の傾斜における相違の幾つかは、ハイブリッドの安
定性における相違に基づいたに違いなく、かつ検出に対
するビオチン標識のアクセシビリティ−の相違に基づく
ものでないだろう。この可能性を削除する為に、ワラス
等、ヌクレイツク　アシド　リサーチズ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）［、第３５４３−３５５７
頁（１９７９）に示されるような標準膜結合標的ＤＮＡ
技術を２、ポリヌクレオチドキナーゼとＳ″Ｐ−ＡＴＰ
でｓａｐ標識化の後、幾つかのオリゴマーのハイブリッ
ド形成感度を評価する為に、本発明者等は最初使用した
。オリゴマー６、　Ｚ、　１０．１２．及びＵ（第１表
）を標識化し、次いでハイブリッド形成してニトロセル
ロースフィルターに固定したＭ１３ｍｐ１８（１本鎖）
ＤＮＡの量を削減した。適度の緊縮台の条件下に、放射
標識化オリゴマーを、膜結合標的ＤＮＡに対し等しい感
度で・ハイブリッド化された。これらの結果は、検出が
放射能に基づ（場合、ビオチン標識はオリゴマーのハイ
ブリッド形成感度に作用しないことを示した。

マイクロタイタープレートハイブリッド形成方法をビオ
チン化ＤＮＡプローブと使用することが出来る。オリゴ
マープローブと使用する方法は上述の通りであった。得
られたハイブリッド形成／検出の結果を各種オリゴマー
プローブと比較する為に、標準ハイブリッド形成感度の
実験を実施し、この実験において、異なる量のＤＮＡ標
的を各々のウェルに付与した。各々のオリゴマープロー
ブの試料をハイブリッド形成させて標的ＤＮＡの量を削
減した。ストレブタビジンービオチン化西洋ワサビペル
オキシダーゼでハイブリッド形成ビオチン標識したオリ
ゴマーの検出に続いて、標的ＤＮＡのｎｇに対する４９
０ｎｍｌこおける吸光度の曲線の傾斜を直線回帰によっ
て計算した。オリゴマーｆｉ、９．１０及び口によるこ
のような標準ハイブリッド形成感度の実験の結果を第２
図に示す。

この研究の為に調製した総てのオリゴマーは、標的ＤＮ
Ａの量に直接的に比例するシグナルを発生した。曲線の
相関係数は０．９９５〜０．９９９の範囲にあった。各
種オリゴマーによるハイブリッド形成／検出の結果は、
直線回帰により決定した曲線の傾斜においてのみ相互に
異なった。

化学的合成オリゴマー類と一つの酵素的標識化オリゴマ
ーに対するハイブリッド形成／検出感度の実験の結果を
前記第１表に総括した。ハイブリッド形成検出曲線の傾
斜をオリゴマー９で得られた曲線の傾斜に対して標準化
した（オリゴマー９に対する実際の傾斜は、各種決定に
おいて゛０．００５−０．０１０Ａ４９０ユニット／標
的バクテリオファージＤＮＡのｎｇの範囲にあった）。

示される値は、各々のオリゴマーに対する少なくとも３
つの決定において得られた値の平均である。単一ピオチ
ンー修飾ヌクレオチド（６，Ｚ、　ｆｉ及び旦）を含む
オリゴマーの比較は、ビオチン−標識したヌクレ・オチ
ドがオリゴマープローブのハイブリッド形成領域の中心
から分子の末端近くへ移動されるに従って、シグナル強
度（標的ＤＮＡのＡ４９０／ｎｇ）が増加することを示
した。オリゴマー６（分子の中心のビオチン）とオリゴ
マー罫ハイブリッド形成配列の次席ヌクレオチドに位置
するビオチン）の間で６倍の差異があった。

この傾向は２つのビオチン−修飾ヌクレオチド（１０，
１１，１２及び１３）を含むオリゴマー類に対しても観
察された。最も弱いシグナルは２つの内部ビオチン（オ
リゴマーｌＯ）を含むオリゴマーにより発生され、かつ
最も強いシグナルは３′−と５°−次席ヌクレオチド（
オリゴマーＵ）上のビオチンを含むオリゴマーにより発
生さりた。オリゴマー１２中の２つのビオチン−ｄＵＭ
Ｐ分子からのシグナルは、オリゴマー旦中のシグナルビ
オチン・−ＪＵＭＰの約２倍であり（各々、１．２５と
０．６８の相対シグナル）、このことは、ハイブリッド
形成領域の末端近くに位置するビオチン分子は追加シグ
ナルを生成することを立証した。第三の中心に位置する
ビオチン−ｄＵＭＰ（オリゴマー１４）の付加は、シグ
ナル強さを増加しないばかりか、オリゴマーにより発生
されるシグナルは、二重−標識したオリゴマー１により
発生されるシグナルと同じか又は平均して僅かに小さか
った。

１劃■ ここに記載される実験は、ハイブリッド形成に続い（洗
浄の緊縮がハイブリッド形成／検出の結果に作用するか
どうか決定する為に実施された。ハイブリッド形成の洗
浄、の緊縮の増加の効果は、オリゴマー類水 に示され、ハイブリッド安定性実験の結果を総て切化学
的合成オリゴマーに対して第２表に総括している。

１堕 これらの結果は、総てのプローブ：標的ＤＮＡハイブリ
ッドが３７−４２℃で０．１ＸＳＳＣにおける洗浄；こ
対して安定であった（９０−１００％の最大シグナル）
が、しかし条件を変えた時に、明らかに異なる安定性を
有することを示している。最も小さな安定性は、オリゴ
マーのハイブリッド形成配列が内部でかつ比較的に近く
隔たるビオチンを含むものであった。最も小さなハイブ
リッドを形成するオリゴマーは、オリゴマーＵであす、
−方、最も安定で優れたハイブリ、ドは、オリゴマー塁
と旦により形成された。従って、３゛及び／又は５′末
端のビオチン置換ヌクレオチ・ドを含むオリゴマーは、
−内部置換のものに比較して優れた安定性を有すること
が見いだされた。

１１■ ビオチン−１１−ｄＵＰＴの酵素的末端付加により調製
されたオリゴマー（オリゴマー長）は、最も強いシグナ
ルを発生する故に、尾の長さの効果、ビオチンの数、及
び酵素的−標識したオリ・ゴマ−の他の調製を使用する
ハイブリッド形成／検出上に対するビオチン間隔を検討
することを決めた。その結−果を・第３表に示す。。

第１表 末端延長部を有するオリゴマーを、化学的に又は末端転
移酵素でビオチン−１１−ｄＵＴＰの付加により調製し
た。オリゴマーＡ−Ｅは、反応混合物中のビオチン−１
１−ｄＵＴＰのみで調製され、Ｐ−■は、ビオチン−１
１−ｄｔｌＴＩ’とＴＴＰの異なる混合物で調製された
。ビオチン−１１−ｄＵＴＰのＴＴＰに対する比は、角
括弧中の値で示されている。末端付加の長さは、３１１
−ＴＰＰ組込みを測定することにより決定し、付加当た
りのビオチン−ｄＵＭＰ分子の数は計算された。オリゴ
マーをハイブリッド形成され、前記の通りに検出複合体
と３０分間又は３時間の直置に続いて検出された。結果
は計算さ、れ、かつ各々の検出複合体温置時間に対して
オリコマ−９に対する結果へ標準化された。

ビオチン−１１−ｄＵＴＰのみで（調製Ａ−Ｅ）、異な
る程度で標識したオリゴマーで標準検定（検出複合体と
３０分間温直重第３表）にて得られた結果は、プローブ
のシグナル強さは末端付加中のビオチン−１１−ｄＵＴ
Ｐ残基の数に直接に関係することを示した。シグナル強
さは、この標識方法により生成した末端付加の範囲に亙
り増大し、しかし各々の付加ビオチン−１１−ｄＵＴＰ
残基の効果は、ビオチン−ｄＵＭＰ残基の数が約４−８
から１２と１７へ増大するに従って減少した。ビオチン
値崩たりのシグナルは、旦、１３．Ａ及びＢ（＝１５）
に対するユニットの近（から調製りとＥに対する０、６
と０．４の値まで、夫々減少した。末端転移酵素反応（
調製Ｆ−１゜３０分間温直重第３表）におけるビオチン
−１１−ｄＵＴＰのＴＴＰに対する異なる比で標識され
たオリゴマーを比較する場合に、ビオチン値崩たりのシ
グナルにおける同じ傾向が観察された。ビオチン−ｄＵ
ＭＰ残基の数が増大するにつれ、シグナル強さは増大す
るが、しかしビオチン値崩たりのシグナルは減少した。

本発明者等は、末端標識調製のシグナル強さの増大は、
一部は検出複合体の結合の速度論の関数であると予期し
たので、発明者等は、これらの結果を検出複合体と延長
された（３時間）直置の後に得られたものと比較した。

検出複合体が３時間結合された場合、調製ＥとＦは、８
−８．７倍大きいよりは、オリゴマー９のシグナルより
３．６−３．７倍の大きさに過ぎないシグナル（傾斜）
しか発生せず、このことは、平衡において、オリゴマー
９の単一ビオチンーｄｔ１ＭＰ残基に結合するよりも、
これらの末端標識したオリゴマーに利用出来る１７−１
８ピオチン−ｄＵＭＰ残基に、３−４倍多くの検出複合
体が結合することを暗示した。これらの速度論的研究の
驚くべき結果は、ＴＴＰと共標識した幾つかの調製（■
とＩ）により発生されるシグナルは、オリゴマー９に関
して削減され、オリゴマー旦のシグナルの夫々３と３．
４倍であるよりもむしろ、夫々１．２と０．９５倍に過
ぎない。これらの結果は、ビオチン残基の利用性は、第
一ビオチンｄｌＪＭＰよりむしろ第−ＴＭＰを含む末端
延長部において時間がたつにつれ減少することを暗示し
ている。

ビオチン標識の導入に対する最も有効な部位は、ハイブ
リッド形成配列の外側、即ち、５°又は３°末端のいず
れかから延在する「尾」である。

化学的に合成したオリゴヌクレオチドプローブが、末端
転移酵素で末端標識により調製されたプローブ（２，３
）と比較され、これらの比較の結果は、外部ビオチンｄ
ＵＭＰ残基が最も検出可能量ある結論を立証した。尾付
加のオリゴマーの間の幾らかのシグナル相違が、検出複
合体の結合の好ましい速度論から結果することが示され
たが、この相違は、検出複合体の結合を平衡に近ずける
ことにより、全く除去された。検出複合体の結合が平衡
に近ずくにつれ、末端延長部のビオチン−ｄＵＭＰ残基
は、内部ビオチン−ｄＵＭＰ残基以上にシグナル発生し
た。それにもかかわらず、末端標識したオリゴヌクレオ
チドはｌ−３のビオチン−ｄＵＭＰで内部標識したもの
よりも更により敏感なプローブであった。

ＴＴＰで共標識することにより末端ビオチン−ｄＵＭＰ
残基番分離する試みは、より好ましい標識配置を生成し
ないようであった。これらの末端延長部の構造を更に折
り畳んで、かつビオチン残基を単独に又は最初に含む末
端延長部においてより利用出来るようにすることは可能
である。この研究における酵素的に標識したオリゴマー
は、最も強いシグナルを生成したが、最近本発明者等は
、前記方法により３°−又は５゛−末端の多重、合成的
標識は、酵素的標識を二重にすることが出来ることを見
いだした。従って、オリゴヌクレオチドの３°と５°末
端の両方における多重標識は、３′と５°末端において
単一シグナルで標識したものよりより敏感な合成プロー
ブを生成する。

夾１」巳 デキストランのような重合性化合物を、先ずポリピオチ
ン化し、次いで非干渉性連鎖群として使用した。このよ
うな化合物は、アビジン又はストレプタビジンを介して
ハイブリッド形成されたプローブへ結合される。次いで
、シグナル発生が、デテク（登録商標名）ｌ−ｈｒｐシ
グナル発生システムの付加により党らされる。このシス
テムは、ビオチン化プローブへ直接に適用したデテク１
−ｈｒｐシグナル発生システムによる直接検出に比較し
て、得られたシグナルをｌＯ〜ｌＯＯ倍増幅する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ビオチン化ヌクレオチド合成の項に記載され
る５°−ジメトキシトリチル−５（３−トリフルオロア
セチルアミノプロペニル）−２’−デオキシウリジン−
３°−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルメトキシホスホールア
ミダイト（化合物５）の合成を説明するフローチャート
であり、第′２図は、ヌクレオチド配列中の各種位置に
おけるビオチンにより、標識したオ゛リゴマーを有する
マイクロタイタープレート中においてハイブリッド形成
−検出した後に得られるシグナルオウトプツトを示し、
その結果をオリゴマーＵ（・）、！（○）、塁（■）、
及びＬ！！（ロ）で示され、第３図は、各種濃度のＳＳ
Ｃで洗浄することに対するビオチン化オリゴマー−標的
ＤＮＡハイブリッドの安定性を表し、その結果をオリゴ
マー！（・）、１２（０）、及び１４（■）で示される
。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ 特許出願人　　エンシー　バイオケム　インコーポレイ
テッドｎり標的ＤＮＡ ５ＳＣ緊縮洗浄の濃度

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）５’と３’末端ヌクレオチドの各々に直接的に又
   は間接的に結合した少なくとも一つのビオチンを有する
   オリゴ−又はポリヌクレオチド。
2. （２）少なくとも一つの末端に結合した少なくとも２−
   ５ビオチンから成る請求項１記載のオリゴ−又はポリヌ
   クレオチド。
3. （３）各々の末端における２−５ビオチンから成る請求
   項２記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
4. （４）前記ビオチンの少なくとも一つが非干渉性連鎖群
   を介して末端ヌクレオチドに結合する請求項１記載のオ
   リゴ−又はポリヌクレオチド。
5. （５）前記ビオチン結合物はビオチン−１１−ｄＵＭＰ
   から成る請求項４記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド
   。
6. （６）前記末端ヌクレオチドの少なくとも一つがポリビ
   オチン化ポリマーに結合するオリゴ−又はポリヌクレオ
   チド。
7. （７）前記ポリビオチン化ポリマーがポリビオチン化デ
   キストランである請求項６記載のオリゴ−又はポリヌク
   レオチド。
8. （８）前記オリゴ−又はポリヌクレオチドの標的ハイブ
   リッド形成領域の外の５’と３’末端ヌクレオチドの各
   々に結合した少なくとも一つのビオチン又は修飾可能基
   を有するオリゴ−又はポリヌクレオチド。
9. （９）請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴ−又はポ
   リヌクレオチド及び前形成アビジン又はストレプタビジ
   ン検出可能な分子複合体から成る核酸ハイブリッド形成
   検定組成物。
10. （１０）検出可能な分子が蛍光体、色素原又は酵素であ
    る請求項９記載の組成物。
11. （１１）酵素がペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ
    ターゼ、酸性ホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ
    から選択される請求項１０記載の組成物。