TW202228786A - Il-2接合物的免疫腫瘤學療法 - Google Patents

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卡羅琳娜 卡法洛
喬瑟夫 理維科
馬寇斯 米拉
傑萊德 普塔辛
蘿拉 蕭維爾
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美商欣爍克斯公司
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Abstract

本文揭示與投與IL-2接合物有關之方法及用途，或適用於治療一或多種適應症，如：治療增生性疾病之方法。本文亦說明包含一或多種IL-2接合物之醫藥組成物與套組。

Description

IL-2接合物的免疫腫瘤學療法
相關申請案之交叉參考文獻
本申請案主張2020年10月9日申請之美國臨時申請案案號 63/090,005、2021年3月9日申請之美國臨時申請案案號63/158,672、及2021年4月9日申請之美國臨時申請案案號63/173,130之優先權，其等揭示內容已分別以全文引用方式併入本文中。
不同的T細胞族群調控免疫系統來維持免疫穩衡(immune homeostasis)及耐受性。例如：調節性T (Treg)細胞藉由阻止病變性自體反應性來防止免疫系統的不當反應，而細胞毒性T細胞則靶向及破壞感染的細胞及/或癌細胞。有些例子中，不同T細胞族群之調控作用提供治療疾病或適應症的選項。
細胞激素包含細胞訊號傳導蛋白質家族，如：趨化素、干擾素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、及其他在先天性及後天性免疫細胞穩衡中扮演角色之生長因子。細胞激素係由免疫細胞產生，如：巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞與肥大細胞、內皮細胞、纖維母細胞、及不同基質細胞。有些例子中，細胞激素調控體液免疫反應與基於細胞之免疫反應之間之平衡。
介白素為訊號傳導蛋白質，其調控T與B淋巴細胞、單核球細胞系之細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性白血球、嗜酸性白血球、巨核細胞、及造血細胞之發育及分化。介白素係由輔助CD4+ T及B淋巴細胞、單核球、巨噬細胞、內皮細胞、及其他組織常駐分子產生。
有些例子中，介白素2 (IL-2)訊號傳導係用於調控T細胞反應及接著治療癌症。因此，本文在一項態樣中提供治療受試者之癌症之方法，其包括投與IL-2接合物。
本文說明治療受試者之癌症之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與24 μg/kg、32 μg/kg、或40 μg/kg，或24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其在位置64具有本文說明之非天然胺基酸殘基，例如：胺基酸序列SEQ ID NO：2。
例舉之實施例包括下列。實施例1為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例2為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例3為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例4為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例5為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例6為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例7為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例8為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例9為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例10為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例11為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例12為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例13為如實施例1至12中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中PEG具有分子量約30 kDa。
實施例14為如實施例1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：2，其中[AzK_L1_PEG30kD]為具有式(XVI)或式(XVII)結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image039
式(XVI)；
Figure 02_image041
式(XVII)； 其中： m為2； n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約30 kDa之整數；及 波浪線代表SEQ ID NO：2中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
實施例15為如實施例1至14中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物。
實施例16為如實施例15之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中式(IA)結構式為具有式(XVI)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物及其中式(IA)結構式為具有式(XVII)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物。
實施例17為如實施例1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中式(IA)結構式具有式(IVA)或式(VA)結構式 ：
Figure 02_image043
式(IVA)；
Figure 02_image045
式(VA)； 其中： W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團；及 q為1、2、或3。
實施例18為如實施例17之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物，且該醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中式(IA)結構式為具有式(IVA)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物及其中式(IA)結構式為具有式(VA)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物。
實施例19為如實施例1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中胺基酸位置64具有式(XIIA)或(XIIIA)結構式：
Figure 02_image047
式(XIIA)；
Figure 02_image049
式(XIIIA)； 其中： n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約25 kDa - 35 kDa之整數； q為1、2、或3；及 波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
實施例20為如實施例19之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物，且該醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中SEQ ID NO：1 之胺基酸P64已被式(XIIA) 結構式置換之IL-2接合物及其中SEQ ID NO：1 之胺基酸P64已被式(XIIIA)結構式置換之IL-2接合物。
實施例21為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例22為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例23為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例24為一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例25為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例26為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例27為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例28為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例29為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例30為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例31為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例32為一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例33為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例34為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例35為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例36為一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
實施例37為如實施例1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為1。
實施例38為如實施例1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為2。
實施例39為如實施例1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為3。
實施例40為如實施例1至39中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少2次。
實施例41為如實施例1至40中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少3次。
實施例42為如實施例1至41中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少4次。
實施例43為如實施例1至42中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少5次。
實施例44為如實施例1至43中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每兩週投與一次。
實施例45為如實施例1至43中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每三週投與一次。
實施例46為如實施例1至45中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每14、15、16、17、18、19、20、或21天投與一次。
實施例47為如實施例1至46中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有實體腫瘤癌症。
實施例48為如實施例1至47中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有轉移性實體腫瘤。
實施例49為如實施例1至48中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有晚期實體腫瘤。
實施例50為如實施例1至46中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有液體腫瘤。
實施例51為如實施例1至50中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有難治性癌症。
實施例52為如實施例1至51中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有復發性癌症。
實施例53為如實施例1至52中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該癌症係選自：腎細胞癌瘤(RCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭與頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、典型何杰金氏淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma)(cHL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、泌尿上皮癌、微小衛星體不穩定癌、微小衛星體穩定癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌(CRC)、子宮頸癌、肝細胞癌瘤(HCC)、默克細胞(Merkel cell)癌瘤(MCC)、黑色素瘤、小細胞肺癌(SCLC)、食道癌、食道鱗狀細胞癌瘤 (ESCC)、膠質母細胞瘤、間皮瘤、乳癌、三陰性乳癌、攝護腺癌、去勢抗性攝護腺癌、轉移性去勢抗性攝護腺癌、或具有DNA損傷反應(DDR)缺陷之轉移性去勢抗性攝護腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突變負荷之腫瘤、皮膚鱗狀細胞癌瘤(CSCC)、鱗狀細胞皮膚癌(SCSC)、低表現至無表現PD-L1之腫瘤、全身擴散至肝臟與CNS超出其原發解剖部位原點之腫瘤、及瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
實施例54為如實施例1至53中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD8+細胞擴增至少約2倍。
實施例55為如實施例1至54中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中NK細胞擴增至少約2倍。
實施例56為如實施例1至55中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中嗜酸性白血球擴增不超過約3.2倍。
實施例57為如實施例1至55中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD4+細胞擴增不超過約3.2倍。
實施例58為如實施例1至57中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD8+細胞及/或NK細胞之擴增不超過CD4+細胞及/或嗜酸性白血球之擴增。
實施例59為如實施例1至58中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起劑量限制性毒性。
實施例60為如實施例1至59中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起嚴重之細胞激素釋放症候群。
實施例61為如實施例1至60中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起血管滲漏症候群。
實施例62為如實施例1至61中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係經由靜脈內投藥法投與受試者。
實施例63為如實施例1至62中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物為醫藥上可接受之鹽、溶劑合物、或水合物。
實施例64為如實施例1至63中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中不會對該受試者投與額外醫療劑。
實施例65為如實施例1至64中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會誘發抗藥物抗體。
實施例66為如實施例1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有鱗狀細胞癌瘤。
實施例67為如實施例1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有結腸直腸癌症。
實施例68為如實施例1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有黑色素瘤。
實施例69為如前述實施例中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該方法包括對受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至32 μg/kg之 IL-2。
實施例70為如前述實施例中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該方法包括對受試者以IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg至40 μg/kg之IL-2。
實施例71為如前述實施例中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物具有之活體內半衰期為約10小時。
定義
除非另有其他說明，否則本文所採用所有技術及科學術語之定義係與熟悉本主張主題所屬領域者咸了解之定義相同。咸了解，上述一般說明及下列詳細說明僅供範例及說明，並未限制所主張之任何主題。若本文引用任何材料之程度與本揭露之表現內容不符合時，將以該表現內容為準。本申請案中，單數的用法包括複數，除非另有特別說明。必需注意，本說明書及附錄之申請專利範圍中所採用單數型「一個」、「一種」及「該」包括複數型，除非內文中另有清楚說明。本申請案中，除非另有其他說明，否則「或」之用法意指「及/或」。此外，術語「包括(including)」及其他形式，如：「包括(include)」、「包括(includs)」及「包括(included)」沒有限制。
說明書中提及之「有些實施例」、「一實施例」、「一項實施例」或「其他實施例」意指實施例中說明之相關特別特色、結構、或特徵均包括在本發明之至少有些實施例中，但不一定在所有實施例中。
本文所採用範圍及量可依「約」特定數值或範圍表示。「約」亦包括準確量。因此「約5 µL」意指「約5 µL」及亦指「5 µL」。通常，術語「約」包括預期在實驗誤差內之量值，如，例如：在15%、10%、或5%內。
本文所採用段落標題僅供組織目的，並未構成所說明主題之限制。
本文所採用術語「受試者」與「患者」意指任何哺乳動物。有些實施例中，哺乳動物為人類。有些實施例中，哺乳動物為非人類。該等術語均不需要或不受限於被健康照護工作者(例如：醫師、註冊護理師、專科護理師、醫師助理、勤務員或安寧照護工作者)監督(例如：持續不斷或間歇)之特定狀況。
本文所採用術語「非天然胺基酸」係指20種天然發生之胺基酸以外之胺基酸。非天然胺基酸實例說明於Young等人之「Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon」， J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
本文所採用「抗體」係廣義用法，且涵括各種不同抗體結構，包括(但不限於)：單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如：雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其等具有所需抗原結合活性即可。「抗體片段」係指不同於完整抗體，但包含該完整抗體一部份會與該完整抗體所結合之抗原結合之分子。抗體片段實例包括(但不限於)：Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如：scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
本文所採用「核苷酸」係指包含核苷部份基團及磷酸酯部份基團之化合物。天然核苷酸實例包括(但不限於)：腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鳥苷三磷酸(GTP)、腺苷二磷酸(ADP)、尿苷二磷酸(UDP)、胞苷二磷酸(CDP)、鳥苷二磷酸(GDP)、腺苷單磷酸(AMP)、尿苷單磷酸(UMP)、胞苷單磷酸(CMP)、及鳥苷單磷酸(GMP)、去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)、去氧腺苷二磷酸(dADP)、胸苷二磷酸(dTDP)、去氧胞苷二磷酸(dCDP)、去氧鳥苷二磷酸(dGDP)、去氧腺苷單磷酸(dAMP)、去氧胸苷單磷酸(dTMP)、去氧胞苷單磷酸(dCMP)、及去氧鳥苷單磷酸(dGMP)。包含去氧核糖作為糖部份基團之天然去氧核糖核苷酸實例包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、及dGMP。包含核糖作為糖部份基團之天然核糖核苷酸實例包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、及GMP。
本文所採用「鹼基」或「核鹼基」係指核苷或核苷酸(核苷及核苷酸涵括核糖或去氧核糖變體)之至少核鹼基部份，其在有些例子中，可以進一步包含在核苷或核苷酸之糖部份之修飾。有些例子中，「鹼基」亦用於代表整個核苷或核苷酸(例如：「鹼基」可以藉由DNA聚合酶引入DNA中，或藉由RNA聚合酶引入RNA中)。然而，術語「鹼基」不應解釋為一定代表整個核苷或核苷酸，除非內文要求。本文所提供鹼基或核鹼基之化學結構式中，僅出示核苷或核苷酸之鹼基，及糖部份基團，及為了清楚說明可視需要省略任何磷酸酯殘基。本文所提供鹼基或核鹼基之化學結構式所採用之波浪線代表與核苷或核苷酸之連結，其中核苷或核苷酸之糖部份可進一步經修飾。有些實施例中，波浪線代表鹼基或核鹼基與核苷或核苷酸之糖部份(如：五碳糖)之附接。有些實施例中，五碳糖為核糖或去氧核糖。
有些實施例中，核鹼基通常為核苷之雜環鹼基部份。核鹼基可能為天然發生、可能經修飾、可能不會與天然鹼基有相似性、及/或可能為例如：利用有機合成法合成。某些實施例中，核鹼基包含核苷或核苷酸中之任何原子或原子之基團，其中原子或原子之基團可以與另一個核酸之鹼基在使用或不使用氫鍵下交互作用。某些實施例中，非天然核鹼基不會衍生自天然核鹼基。應注意，非天然核鹼基不一定具有鹼性性質，然而，其等仍被簡稱為核鹼基。有些實施例中，當提及核鹼基時，「(d)」指示該核鹼基可附接去氧核糖或核糖，而沒有括號之「d」則指示該核鹼基附接去氧核糖。
本文所採用「核苷」為包含核鹼基部份基團及糖部份基團之化合物。核苷包括(但不限於)：天然發生之核苷(出現在DNA及RNA中)、無鹼基核苷、經修飾核苷、及具有擬似鹼基及/或糖基之核苷。核苷包括包含任何不同取代基之核苷。核苷可為透過核酸鹼基與糖之還原基之間之糖苷鏈結形成之糖苷化合物。
本文所採用術語化學結構式之「類似物」係指保留與母結構式實質類似性之化學結構式，雖然可能不容易從母結構式合成衍生。有些實施例中，核苷酸類似物為非天然核苷酸。有些實施例中，核苷類似物為非天然核苷。容易從母化學結構式合成衍生之相關化學結構式稱為「衍生物」。
本文所採用「劑量限制性毒性」(DLT)之定義為在治療週期第1天至第29天(含第29天) ±1天內發生之不良事件，其不清楚或無疑地僅與外來因素有關，且符合實例2針對DLT所設之標準。
本文所採用「嚴重細胞激素釋放症候群」係指Teachey 等人， Cancer Discov .2016; 6(6); 664–79所說明第4或5級之細胞激素釋放症候群，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
雖然本發明之各種不同特徵可能在單一實施例內文中說明，但該等特徵亦可能分開提供或呈任何合適組合提供。反之，雖然本發明可在分開實施例之內文中清楚說明，但亦可能在單一實施例中執行本發明。 IL-2 接合物
介白素2 (IL-2)為多效性1型細胞激素，其結構式包含15.5 kDa四個α-螺旋束。IL-2之前體型為長度153個胺基酸殘基，第一段20個胺基酸形成訊號肽，及殘基21-153形成成熟型。IL-2主要由CD4+ T細胞受到抗原刺激後產生，且在較低程度上由CD8+細胞、天然殺手(NK)細胞與天然殺手T (NKT)細胞、活化之樹突細胞(DC)、及肥大細胞產生。IL-2訊號傳導係透過與IL-2受體(IL-2R)次單元、IL-2Rα (亦稱為CD25)、IL-2Rβ(亦稱為CD122)、及IL-2Rγ(亦稱為CD132)之特定組合之交互作用來進行。IL-2與IL-2Rα之交互作用會形成「低親和性」IL-2受體複合物，其K d為約10 -8M。IL-2與IL-2Rβ及IL-2Rγ之交互作用會形成「中親和性」IL-2受體複合物，其K d為約10 -9M。IL-2與所有三種次單元IL-2Rα、IL-2Rβ、及IL-2Rγ之交互作用會形成「高親和性」IL-2受體複合物，其K d為約 ＞10 -11M。
有些例子中，IL-2透過「高親和性」IL-2Rαβγ複合物之訊號傳導會調控調節性T細胞之活化與增生。調節性T細胞，或CD4 +CD25 +Foxp3 +調節性T (Treg)細胞，藉由抑制效應細胞(如：CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、B細胞、NK細胞、與NKT細胞)來介導維持免疫穩衡。有些例子中，Treg細胞係由胸腺(tTreg細胞)產生或由周邊(pTreg細胞)中之原始T細胞誘發。有些例子中，Treg細胞被視為周邊耐受性之媒介。事實上，在一項研究中，在裸小鼠中轉移已消除CD25之周邊CD4 +T細胞時，會產生多種不同自體免疫疾病，而同時轉移CD4 +CD25 +T細胞則壓制自體免疫性之發展(Sakaguchi等人，「Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25) 」, J. Immunol. 155(3): 1151-1164 (1995)，其內容已以引用方式併入本文中)。 加強Treg細胞族群會下調效應T細胞增生，及壓制自體免疫性與T細胞抗腫瘤反應。
IL-2透過「中親和性」IL-2Rβγ複合物之訊號傳導會調控CD8 +效應T (Teff)細胞、NK細胞、與NKT細胞之活化與增生。CD8 +Teff細胞(亦稱為細胞毒性T細胞、Tc細胞、細胞毒性T淋巴球、CTL、T-殺手細胞、溶胞性T細胞、Tcon、或殺手T細胞)為辨識及殺死受損細胞、癌細胞、及感染病原菌之細胞之T淋巴球。NK與NKT細胞為淋巴球類型，其類似CD8 +Teff細胞，會靶向癌細胞及感染病原菌之細胞。
有些例子中，利用IL-2訊號傳導來調控T細胞反應，即可治療癌症。例如：IL-2係呈高劑量型投藥，以誘發Teff細胞族群，供治療癌症。然而，高劑量IL-2進一步造成伴隨刺激Treg細胞，其會減弱抗腫瘤免疫反應。高劑量IL-2亦誘發由涉及血管中表現IL-2Rα鏈之細胞(包括第2型先天免疫細胞(ILC-2)、嗜酸性白血球與內皮細胞)所介導之毒性不良事件。此造成嗜酸性白血球增多症、毛血管滲漏、及血管滲漏症候群(vascular leak syndrome，VLS)。
本文說明通常與投與介白素2 (IL-2)接合物之投藥法相關之方法與用途。IL-2接合物之投藥量可為24 μg/kg、32 μg/kg、或40 μg/kg，或24 μg/kg至32 μg/kg、或24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2。此等用量下之IL-2質量不包括與IL-2接合之材料(包括連接子)。
IL-2接合物可以投與超過一次，例如：2次、3次、4次、5次、或更多次。有些實施例中，IL-2接合物係約每兩週投與一次。有些實施例中，IL-2接合物係約每三週投與一次。有些實施例中，IL-2接合物係約每14、15、16、17、18、19、20、或21天投與一次。
有些實施例中，該等方法為治療癌症。有些實施例中，該癌症為實體腫瘤癌症。有些實施例中，受試者患有轉移性實體腫瘤。有些實施例中，受試者患有晚期實體腫瘤。
有些實施例中，該等方法為刺激受試者之CD8+細胞。有些實施例中，該等方法係刺激受試者中之NK細胞。該刺激可包括例如：在投藥後約4、5、6、或7天，或在投藥後約1、2、3、或4週，提高受試者之CD8+細胞數。有些實施例中，CD8+細胞包括記憶 CD8+細胞。有些實施例中，CD8+細胞包括效應CD8+細胞。該刺激可包括例如：在投藥後約4、5、6、或7天，或在投藥後約1、2、3、或4週，提高受試者中呈Ki67陽性之CD8+細胞比例。該刺激可包括例如：在投藥後約4、5、6、或7天，或在投藥後約1、2、3、或4週，提高受試者中NK細胞數。
有些實施例中，CD8+細胞在受試者接受投藥後擴增至少2倍，如：至少5倍。有些實施例中，CD8+細胞在受試者接受投藥後擴增至少5倍。有些實施例中，NK細胞在受試者接受投藥後擴增至少2倍，如：至少7倍。有些實施例中，NK細胞在受試者接受投藥後擴增至少7倍，如：至少7.7倍。有些實施例中，嗜酸性白血球之擴增不超過約3.2倍，如：不超過約2.7倍。有些實施例中，CD4+細胞之擴增不超過約3.2倍，如：不超過約2倍或2.7倍。有些實施例中，CD8+細胞及/或NK細胞之擴增超過CD4+細胞及/或嗜酸性白血球之擴增。有些實施例中，CD8+細胞之擴增超過CD4+細胞之擴增。有些實施例中，NK細胞之擴增超過CD4+細胞之擴增。有些實施例中，CD8+細胞之擴增超過嗜酸性白血球之擴增。有些實施例中，NK細胞之擴增超過嗜酸性白血球之擴增。擴增倍數係相對於投與IL-2接合物之前所量測基線值來決定。有些實施例中，擴增倍數係在前述段落中所示投藥後之任何時間點測定。
有些實施例中，IL-2接合物不會引起劑量限制性毒性。有些實施例中，IL-2接合物不會引起嚴重之細胞激素釋放症候群。有些實施例中，IL-2接合物不會誘發抗藥物抗體(ADA)，亦即對抗IL-2接合物之抗體。有些實施例中，由用於對抗PEG之抗體之直接免疫分析法及/或用於對抗IL-2接合物之抗體之ELISA測定沒有誘發ADA。若量測之ADA含量在統計上與基線(治療前)含量或與未處理對照組之含量沒有顯著差異時，則該IL-2接合物被視為不會誘發ADA。 IL-2 接合物
有些實施例中，IL-2序列包含SEQ ID NO：1序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO：1) 其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
Figure 02_image001
(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image004
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image004
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image007
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image007
； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
本文所說明式(IA)之任何實施例或變化中，IL-2接合物為醫藥上可接受之鹽、溶劑合物、或水合物。有些實施例中，IL-2接合物為醫藥上可接受之鹽。有些實施例中，IL-2接合物為溶劑合物。有些實施例中，IL-2接合物為水合物。
有些式(IA)之實施例中，Z為CH 2及Y為
Figure 02_image072
。 有些式(IA)之實施例中，Y為CH 2及Z為
Figure 02_image074
。有些式(IA)之實施例中，Z為CH 2及Y為
Figure 02_image076
。有些式(IA)之實施例中，Y為CH 2及Z為
Figure 02_image078
。
有些式(IA)之實施例中，q為1。有些式(IA)之實施例中，q為2。有些式(IA)之實施例中，q為3。
有些式(IA)之實施例中，W為具有平均分子量約25 kDa 之PEG基團。有些式(IA)之實施例中，W為具有平均分子量約30 kDa 之PEG基團。有些式(IA)之實施例中，W為具有平均分子量約35 kDa之PEG基團。
有些實施例中，IL-2序列包含SEQ ID NO：1序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO：1) 其中胺基酸位置P64被式(I)結構式置換：
Figure 02_image001
式(I) 其中： Z為CH 2及Y為
Figure 02_image080
； Y為CH 2及Z為
Figure 02_image080
； Z為CH 2及Y為
Figure 02_image083
；或 Y為CH 2及Z為
Figure 02_image085
； W為具有平均分子量約25 kDa-35 kDa 之PEG基團； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。有些實施例中，PEG基團具有平均分子量約30 kDa。
有些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO：2序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK [AzK_L1_PEG30kD]LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO：2) 其中[AzK_L1_PEG30kD]為 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（6-((2-azidoethoxy)-carbonyl)-L-lysine）利用DBCO-介導之點擊化學(click chemistry)穩定接合至PEG，形成包含式(IVA)或式(VA)結構式(其中q為1) (如：式(IV)或式(V))、與具有平均分子量約25-35仟道耳吞(例如：約30 kDa)之PEG，及利用甲氧基封端之化合物。由點擊反應產生之位置異構物比例為約1：1或大於1：1。術語「DBCO」意指包含二苯并環辛炔基團之化學部份基團，如：例示於實例1之反應圖1之包含mPEG-DBCO化合物。
PEG通常包含許多(OCH 2CH 2)單體或(CH 2CH 2O)單體，依PEG之定義而定。
有些例子中，PEG為封端聚合物，亦即具有至少一個末端被相當惰性基團(如：低碳數C 1-6烷氧基、或羥基)封端之聚合物。當聚合物為PEG時，可使用例如：甲氧基-PEG (常稱為mPEG)，其係PEG之線性型，其中聚合物之一端為甲氧基(—OCH 3)，而另一端為羥基或其他可視需要經化學修飾之官能基。
有些實施例中，構成本文所說明IL-2接合物之PEG基團為線性或分支PEG基團。有些實施例中，PEG基團為線性PEG基團。有些實施例中，PEG基團為分支PEG基團。有些實施例中，PEG基團為甲氧基PEG基團。有些實施例中，PEG基團為線性或分支甲氧基PEG基團。有些實施例中，PEG基團為線性甲氧基PEG基團。有些實施例中，PEG基團為分支甲氧基PEG基團。例如：本發明範圍內包括之IL-2接合物包含具有分子量30,000 Da ± 3000 Da、或30,000 Da ± 4,500 Da、或30,000 Da ± 5,000 Da之PEG基團。
有些實施例中，IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸殘基P64被式(IVA)或式(VA)結構式、或式(IVA)與式(VA)之混合物置換：
Figure 02_image043
式(IVA)；
Figure 02_image045
式(VA)； 其中： W為具有平均分子量約25 kDa - 35kDa之PEG基團； q為1、2、或3；及 X具有如下結構式：
Figure 02_image009
； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，q為1。有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，q為2。有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，q為3。
有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，W為PEG具有平均分子量約25 kDa之基團。有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，W為具有平均分子量約30 kDa 之PEG基團。有些式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)之混合物之實施例中，W為具有平均分子量約35 kDa之PEG基團。
本文所說明任何實施例中，式(IA)結構式具有式(IVA)或式(VA)結構式，或為式(IVA)與式(VA)之混合物。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(IVA)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(VA)結構式。有些實施例中，式(IA) 結構式為式(IVA)與式(VA)之混合物。
有些實施例中，IL-2接合物包含胺基酸序列(例如：胺基酸序列SEQ ID NO：1)，其中胺基酸殘基P64被式(IV)或式(V)結構式、或式(IV)與式(V)之混合物置換：
Figure 02_image091
式(IV)；
Figure 02_image093
式(V)； 其中： W為具有平均分子量約25 kDa-35kDa，如：約30 kDa 之PEG基團；及 X具有如下結構式：
Figure 02_image095
其中X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。本文所說明任何實施例中，其中IL-2接合物包含式(IA)結構式，式(IA)可為式(IV)或(V)、或(IV)與(V)之混合物。
有些實施例中，IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸殘基P64 被式(XIIA)或式(XIIIA)結構式、或式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物置換：
Figure 02_image047
式(XIIA)；
Figure 02_image049
式(XIIIA)； 其中： n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約25 kDa - 35 kDa之整數； q為1、2、或3；及 波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
有些式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物之實施例中，q為1。有些式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物之實施例中，q為2。有些式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物之實施例中，q為3。
有些式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物之實施例中，n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約30 kDa之整數。
本文所說明任何實施例中，式(IA)結構式具有式(XIIA)或式(XIIIA)結構式、或為式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XIIA)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XIIIA)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式為式(XIIA)與式(XIIIA)之混合物。
有些實施例中，IL-2接合物中SEQ ID NO：1之胺基酸殘基P64被式(XII)或(XIII)結構式、或(XII)與(XIII)之混合物置換：
Figure 02_image099
式(XII)；
Figure 02_image101
式(XIII)； 其中： n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約25 kDa – 35 kDa (例如：約30 kDa)之整數；及 波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
有些式(XII)或式(XIII)、或式(XII)與式(XIII)之混合物之實施例中，n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約30 kDa之整數。
本文所說明任何實施例中，式(IA)結構式具有式(XII)或式(XIII)結構式，或為式(XII)與式(XIII)之混合物。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XII)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XIII)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式為式(XII)與式(XIII)之混合物。
有些實施例中，IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中IL-2接合物中胺基酸殘基P64被式(XIV)或(XV)結構式、或(XIV)與(XV)之混合物置換：
Figure 02_image103
式(XIV)；
Figure 02_image105
式(XV)；        其中：        m為整數0至20(例如：1至3，或2)；        p為整數0至20 (例如：1至3，或2)；        n為讓PEG基團具有平均分子量約25 kDa – 35 kDa(例如：約30 kDa)之整數；及        波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。本文所說明任何實施例中，其中IL-2接合物包含式(I)結構式，式(I)可為式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物。
有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，m為整數1至10。有些實施例中，m為1。有些實施例中，m為2。有些實施例中，m為3。有些實施例中，m為4。有些實施例中，m為5。有些實施例中，m為6。有些實施例中，m為7。有些實施例中，m為8。有些實施例中，m為9。有些實施例中，m為10。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，m為整數1至5。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，m為整數11至20。有些實施例中，m為整數11至15。有些實施例中，m為整數16至20。有些實施例中，m為0。
有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，n為讓PEG基團具有平均分子量約25 kDa之整數。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，n為讓PEG基團具有平均分子量約30 kDa之整數。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，n為讓PEG基團具有平均分子量約35 kDa之整數。
有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，p為整數1至10。有些實施例中，p為1。有些實施例中，p為2。有些實施例中，p為3。有些實施例中，p為4。有些實施例中，p為5。有些實施例中，p為6。有些實施例中，p為7。有些實施例中，p為8。有些實施例中，p為9。有些實施例中，p為10。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，p為整數1至5。有些式(XIV)或(XV)、或(XIV)與(XV)之混合物之實施例中，p為整數11至20。有些實施例中，p為整數11至15。有些實施例中，p為整數16至20。有些實施例中，p為0。
有些實施例中，IL-2接合物包含胺基酸序列(例如：SEQ ID NO：1)，其中IL-2接合物中至少一個胺基酸殘基被式(XVI)或(XVII)結構式、或(XVI)與(XVII)之混合物置換：
Figure 02_image039
式(XVI)；
Figure 02_image041
式(XVII)；        其中：        m為整數0至20 (例如：1至3，或2)；        n為讓PEG基團具有平均分子量約25 kDa – 35 kDa (例如：約30 kDa)之整數；及       波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
有些式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)與式(XVII)之混合物之實施例中，n為讓PEG基團具有平均分子量約25 kDa之整數。有些式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)與式(XVII)之混合物之實施例中 ，n為讓PEG基團具有平均分子量約30 kDa之整數。有些式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)與式(XVII)之混合物之實施例中，n為讓PEG基團具有平均分子量約35 kDa之整數
有些式(XVI)或(XVII)、或(XVI)與(XVII)之混合物之實施例中 ，m為整數1至10。有些實施例中，m為1。有些實施例中，m為2。有些實施例中，m為3。有些實施例中，m為4。有些實施例中，m為5。有些實施例中，m為6。有些實施例中，m為7。有些實施例中，m為8。有些實施例中，m為9。有些實施例中，m為10。有些式(XVI)或(XVII)、或(XVI)與(XVII)之混合物之實施例中，m為整數1至5。有些式(XVI)或(XVII)、或 (XVI)與(XVII)之混合物之實施例中，m為整數11至20。有些實施例中，m為整數11至15。有些實施例中，m為整數16至20。有些實施例中，m為0。
本文所說明任何實施例中，式(IA)結構式具有式(XVI)或式(XVII)結構式，或為式(XVI)與式(XVII)之混合物。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XVI)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式具有式(XVII)結構式。有些實施例中，式(IA)結構式為式(XVI)與式(XVII)之混合物。
有些式(IA)或其任何變化之實施例中，IL-2接合物具有約10小時之活體內半衰期。 接合化學
本文所說明有些實施例中，本文所說明接合反應包括反應圖I所示之反應。 反應圖 I.
Figure 02_image109
其中X為SEQ ID NO：1之非天然胺基酸位置P64。此時及其他內容中，「位置X-1」與「位置X+1」係指緊接(i)該材料所接合或已接合之胺基酸殘基及/或(ii)為非天然胺基酸殘基之胺基酸殘基之N-末端與C-末端之胺基酸殘基。接合部份基團包含本文所說明PEG。
有些實施例中，反應性基團包含炔或疊氮。有些本文所說明實施例中，本文所說明接合反應包含反應圖II所示之反應。 反應圖 II .
Figure 02_image111
其中X係如上述。
有些本文所說明實施例中，本文所說明接合反應包含反應圖III所示之反應。 反應圖 III .
Figure 02_image113
其中X係如上述。
有些本文所說明實施例中，本文所說明接合反應包含反應圖IV所示之反應。 反應圖 IV .
Figure 02_image115
， 其中X係如上述。
有些本文所說明實施例中，本文所說明接合反應包含疊氮部份基團(如：包含在含有衍生自 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸(AzK)之胺基酸殘基之蛋白質中)與有張力的環炔(如：衍生自 DBCO，其係包含二苯并環辛炔基團之化學部份基團)之間之環加成反應。包含DBCO部份基團之PEG基團可自商品取得或可採用習此相關技藝習知之方法製備。有些實施例中，本文所說明接合反應包括反應圖V與VI所示之反應。 反應圖 V .
Figure 02_image117
反應圖 V.I.
Figure 02_image119
本文說明之接合反應，如：點擊反應可產生單一位置異構物或位置異構物之混合物。有些例子中，位置異構物之比值為約1：1。有些例子中，位置異構物之比值為約2：1。有些例子中，位置異構物之比值為約1.5：1。有些例子中，位置異構物之比值為約1.2：1。有些例子中，位置異構物之比值為約1.1：1。有些例子中，位置異構物之比值大於1：1。 細胞激素多肽 製備
有些例子中，本文所說明包含天然胺基酸突變或非天然胺基酸突變之IL-2接合物係重組產生或化學合成產生。有些例子中，本文所說明IL-2接合物係例如：由宿主細胞系統，或於無細胞系統重組產生。
有些例子中，IL-2接合物係透過宿主細胞系統重組產生。有些例子中，宿主細胞為真核生物細胞(例如：哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞)或原核生物細胞(例如：格蘭陽性細菌或格蘭陰性細菌)。有些例子中，真核生物宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。有些例子中，哺乳動物宿主細胞為穩定細胞株，或已在其自身基因體中引進所需遺傳材料之細胞株，其在經過幾代細胞分裂後，有能力表現該遺傳材料之產物。其他例子中，哺乳動物宿主細胞為過渡細胞株，或未在其自身基因體中引進所需遺傳材料之細胞株，其沒有能力在經過幾代細胞分裂後表現該遺傳材料之產物。
哺乳動物宿主細胞實例包括293T細胞株、293A細胞株、293FT細胞株、293F細胞 、293 H細胞、A549細胞、MDCK細胞、CHO DG44細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、Expi293F™細胞、Flp-In™ T-REx™ 293細胞株、Flp-In™-293細胞株、Flp-In™-3T3細胞株、Flp-In™-BHK細胞株、Flp-In™-CHO細胞株、Flp-In™-CV-1細胞株、Flp-In™-Jurkat細胞株、FreeStyle™ 293-F細胞、FreeStyle™ CHO-S細胞、GripTite™ 293 MSR細胞株、GS-CHO細胞株、HepaRG™細胞、T-REx™ Jurkat細胞株、Per.C6細胞、T-REx™-293細胞株、T-REx™-CHO細胞株、與T-REx™-HeLa細胞株。
有些實施例中，真核生物宿主細胞為昆蟲宿主細胞。昆蟲宿主細胞實例包括果蠅( Drosophila)S2細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、High Five™細胞、及表現SF+®細胞。
有些實施例中，真核生物宿主細胞為酵母宿主細胞。酵母宿主細胞實例包括畢赤酵母( Pichia pastoris)酵母菌株，如：GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H、及X-33、及釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株，如：INVSc1。
有些實施例中，真核生物宿主細胞為植物宿主細胞。有些例子中，植物細胞包含來自藻類之細胞。植物細胞株實例包括來自萊茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii) 137c、或細長聚球藍細菌( Synechococcus elongatus) PPC 7942 之菌株。
有些實施例中，宿主細胞為原核生物宿主細胞。原核生物宿主細胞實例包括BL21、Mach1™、DH10B™、TOP10、DH5α、DH10Bac™、OmniMax™、MegaX™、DH12S™、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2™、Stbl3™、或Stbl4™。
有些例子中，供產生本文所說明IL-2多肽之合適聚核酸分子或載體包括衍生自真核生物或原核生物來源之任何合適載體。聚核酸分子或載體實例包括來自細菌(例如：大腸桿菌( E. coli))、昆蟲、酵母(例如：巴斯德畢赤酵母( Pichia pastoris))、藻類、或哺乳動物來源之載體。細菌載體包括例如：例如：pACYC177、pASK75、pBAD載體系列、pBADM載體系列、pET載體系列、pETM載體系列、pGEX載體系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE載體系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC、或pTAC-MAT-2。
昆蟲載體包括例如：pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12，FLAG載體如：pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2，或MAT載體如：pPolh-MAT1、或pPolh-MAT2。
酵母載體包括例如：Gateway ®pDEST ™14載體、Gateway ®pDEST ™15載體、Gateway ®pDEST ™17載體、Gateway ®pDEST ™24載體、Gateway ®pYES-DEST52載體、pBAD-DEST49 Gateway ®目的載體、pAO815畢赤載體( Pichiavector)、pFLD1巴斯德畢赤酵母( Pichi pastoris)載體、pGAPZA、B、& C巴斯德畢赤酵母( Pichi pastoris)載體、pPIC3.5K畢赤載體、pPIC6 A、B、& C畢赤載體、pPIC9K畢赤載體、pTEF1/Zeo、pYES2酵母載體、pYES2/CT酵母載體、pYES2/NT A、B、& C酵母載體、或pYES3/CT酵母載體。
藻類載體包括例如：pChlamy-4載體或MCS載體。
哺乳動物載體包括例如：過渡表現載體或穩定表現載體。哺乳動物過渡表現載體實例包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3、或pBICEP-CMV 4。哺乳動物穩定表現載體實例包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1、或pBICEP-CMV 2。
有些例子中，使用無細胞系統來製造本文所說明細胞激素(例如：IL-2)多肽。有些例子中，無細胞系統包含來自細胞且適合活體外合成核酸之細胞質與/或核組份之混合物。有些例子中，無細胞系統利用原核生物細胞組份。其他例子中，無細胞系統利用真核生物細胞組份。核酸合成係得自依據例如：果蠅( Drosophila)細胞、爪蟾(Xenopus)卵、古菌(Archaea)、或HeLa細胞之無細胞系統。無細胞系統實例包括大腸桿菌( E. coli)S30萃取系統、大腸桿菌( E. coli)T7 S30系統、或PURExpress®、XpressCF、與XpressCF+。
各種不同無細胞轉譯系統包含諸如：質體、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、釋放因子、核糖體、伴護蛋白質、轉譯起始與延長因子、天然與/或非天然胺基酸之組份，及/或其他用於蛋白質表現之組份。此等組份可視需要經修飾，以改良產量、提高合成率、提高蛋白質產物正確性、或引進非天然胺基酸。有些實施例中，本文所說明細胞激素係採用說明於US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或 US 8,778,631之無細胞轉譯系統合成，此等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。有些實施例中，無細胞轉譯系統包含經修飾釋放因子，或甚至從系統中排除一或多個釋放因子。有些實施例中，無細胞轉譯系統包含降低之蛋白酶含量。有些實施例中，無細胞轉譯系統包含經修飾tRNA，其具有重新指定之密碼子，用於編碼非天然胺基酸。有些實施例中，在無細胞轉譯系統中採用本文所說明合成酶，來引進非天然胺基酸。有些實施例中，tRNA係預先利用酵素或化學方法加載非天然胺基酸後，才加至無細胞轉譯系統中。有些實施例中，用於無細胞轉譯系統之組份係得自經修飾生物體，如：經修飾細菌、酵母、或其他生物體。
有些實施例中，細胞激素(例如：IL-2)多肽係經由表現宿主系統或透過無細胞系統，呈環形排列形式產生 。 包含非天然胺基酸之 細胞激素多肽 之製備
本發明可使用正交或擴增之遺傳密碼子，其中存在於細胞激素(例如：IL-2)多肽之核酸序列中之一或多個特異性密碼子之位置可以編碼非天然胺基酸，使其可以利用正交 tRNA合成酶/tRNA配對，依遺傳方式引入細胞激素(例如：IL-2)中。正交 tRNA合成酶/tRNA配對可以使tRNA帶有非天然胺基酸，並可以讓非天然胺基酸因應密碼子而引入多肽鏈中。
有些例子中，密碼子為密碼子琥珀(amber)、赭石(ochre)、蛋白石(opal)、或四聯組(quadruplet)密碼子。有些例子中，密碼子相當於正交 tRNA，其將用於攜帶非天然胺基酸。有些例子中，密碼子為琥珀。其他例子中，密碼子為正交密碼子。
有些例子中，密碼子為四聯組密碼子，其可被正交核糖體ribo-Q1解碼。有些例子中，四聯組密碼子例示於Neumann等人之「Encoding multiple  unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome」， Nature, 464(7287): 441-444 (2010)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
有些例子中，本發明使用之密碼子為轉碼密碼子，例如：被替代之密碼子置換之同義密碼子或稀有密碼子。有些例子中，轉碼密碼子說明於Napolitano等人之「Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli」， PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。有些例子中，轉碼密碼子說明於Ostrov等人之「Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome」， Science 353(6301): 819-822 (2016)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
有些例子中，利用非天然核酸將一或多個非天然胺基酸引入細胞激素(例如：IL-2)中。非天然核酸實例包括(但不限於)：尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)、2-胺基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤與鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤與鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基，特定言之，5-溴、5-三氟甲基及其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。某些非天然核酸，如：5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2 經取代之嘌呤、N-6 經取代之嘌呤、O-6 經取代之嘌呤、2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、彼等提高形成雙螺旋之安定性者、通用核酸、疏水性核酸、無特異性核酸、擴大分子核酸、氟化核酸、5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6 經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-me-C)、5- 羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、5-鹵代胞嘧啶、5-丙炔基 (-C≡C-CH 3) 尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸之其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶 (假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵代，特定言之，5-溴、5-三氟甲基、其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、3-去氮雜鳥嘌呤、3-去氮雜腺嘌呤、三環嘧啶、吩㗁嗪胞苷( [5,4-b][l,4]苯并㗁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H- 嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夾(G-clamps)、吩㗁嗪胞苷(例如：9- (2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并㗁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5- b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、彼等其中嘌呤或嘧啶鹼基被其他雜環置換者、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥苷、2-胺基吡啶、2-吡啶酮、氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環胞嘧啶、阿糖胞苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、及5-碘尿嘧啶、2-胺基-腺嘌呤、6-硫-鳥嘌呤、2-硫-胸腺嘧啶、4-硫-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、5-羥基胞嘧啶、2’-去氧尿苷、2-胺基-2’-去氧腺苷、及彼等說明於美國專利案案號3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653與6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人，(2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，Kroschwitz, J.I.編輯，John Wiley & Sons, 1990, 858- 859；Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991, 30, 613；及Sanghvi之Antisense Research and Applications，第15章，Crooke與Lebleu編輯，CRC Press, 1993, 273-288。其他鹼基修飾可參見例如：美國專利案案號3,687,808；Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991, 30, 613；及Sanghvi之Antisense Research and Applications，第15章，第289-302頁，Crooke與Lebleu編輯，CRC Press, 1993。其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
相關技藝上可取得包含各種不同雜環鹼基及各種不同糖部份基團(及糖類似物)之非天然核酸，及在有些例子中，核酸係包括一個或數個不同於原則上天然核酸之五種鹼基組份之雜環鹼基。例如：該雜環鹼基在有些例子中包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4- 胺基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基基團，其中嘌呤係經由9-位置附接核酸之糖部份基團，嘧啶則經由1-位置，吡咯并嘧啶則經由7-位置，及吡唑并嘧啶則經由1-位置。
有些實施例中，核苷酸類似物亦在磷酸酯部份基團經修飾。經修飾磷酸酯部份基團包括(但不限於)：彼等在兩個核苷酸之間鏈結具有修飾者，且包含例如：硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3’-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯)、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(包括3’-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、及硼烷(borano)磷酸酯。咸了解，此等在兩個核苷酸之間之磷酸酯或經修飾磷酸酯鏈結係透過3’-5’鏈結或2’-5’鏈結，及包含相反極性之鏈結，如：3’-5’對5’-3’或2’-5’對5’-2’。亦包括各種不同鹽類、混合鹽類、及游離酸型。有許多美國專利案教示如何製造及使用包含經修飾磷酸酯之核苷酸且包括(但不限於)：3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；及 5,625,050；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些實施例中，非天然核酸包括2’,3’-二去氧-2’,3’-二去氫-核苷(PCT/US2002/006460)、5’-經取代之DNA及RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人，J. Org Chem., 1995, 60, 788-789；Wang等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890；Mikhailov等人，Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343；Leonid等人，1995, 14(3-5), 901-905；及Eppacher等人，Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)、或5’-經取代之單體係製成具有經修飾鹼基之單磷酸酯(Wang等人，Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)，其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些實施例中，非天然核酸包括在糖環之5’-位置及2’-位置之修飾(PCT/US94/02993)，如：5’-CH 2-取代之2’-O-受保護之核苷(Wu等人，Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143及Wu等人，Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924)。有些例子中，非天然核酸包括醯胺連接之核苷二聚體，其係準備引至寡核苷酸中，其中二聚體中之 3’連接之核苷(5’至3’)包含2’-OCH 3及5’-(S)-CH 3(Mesmaeker等人，Synlett, 1997, 1287-1290)。非天然核酸可包括2’-經取代之5’-CH 2(或O)修飾核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸包括5’-亞甲基膦酸酯 DNA及RNA單體、及二聚體(Bohringer等人，Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726；Collingwood等人，Synlett, 1995, 7, 703-705；及Hutter等人，Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806)。非天然核酸可包括具有2’-取代之5’-膦酸酯單體(US2006/0074035)及其他經修飾之5’-膦酸酯單體(WO1997/35869)。非天然核酸可包括5’-經修飾亞甲基膦酸酯單體(EP614907及EP629633)。非天然核酸可包括5’或6’-膦酸酯核糖核苷之類似物，其在5’ 及/或6’-位置包含羥基(Chen等人，Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786；Jung等人，Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509；Gallier等人，Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933；及Hampton等人，J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033)。非天然核酸可包括5’-膦酸酯去氧核糖核苷單體及具有5’-磷酸酯基團之二聚體(Nawrot等人，Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82)。非天然核酸可包括具有6’-膦酸酯基團之核苷，其中5’與/或6’-位置為未取代或經硫-第三丁基(SC(CH 3) 3) (及其類似物)取代；經亞甲基胺基(CH 2NH 2) (及其類似物)或氰基(CN) (及其類似物)取代(Fairhurst等人，Synlett, 2001, 4, 467-472；Kappler等人，J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038；Kappler等人，J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184；Vrudhula等人，J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894；Hampton等人，J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377；Geze等人，J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640；及Hampton等人，J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414)。其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些實施例中，非天然核酸亦包括糖部份基團之修飾。有些例子中，核酸包含一或多個其中糖基已經過修飾之核苷。此等經糖修飾之核苷可賦與加強之核酸酶安定性、提高之結合親和性、或有些其他有利生物性質。某些實施例中，核酸包含經化學修飾之核糖呋喃酮環部份基團。經化學修飾之核糖呋喃酮環實例包括(但不限於)：添加取代基(包括5’ 及/或2’ 取代基；橋接兩個環原子形成雙環狀核酸(BNA)；以S、N(R)、或C(R 1)(R 2) (R = H、C 1-C 12烷基或保護基)置換核糖基環氧原子；及其組合。經化學修飾之糖之實例可參見WO2008/101157、US2005/0130923、與WO2007/134181，其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些例子中，經修飾核酸包括經修飾糖或糖類似物。因此，除了核糖與去氧核糖以外，糖部份基團亦可為五碳糖、去氧五碳糖、六碳糖、去氧六碳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、或 糖「類似物」環戊基。糖可呈哌喃糖基或呋喃糖基型。糖部份基團可為核糖、去氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖之呋喃糖苷，及糖可附接各雜環鹼基，呈[α]或[β]變旋異構組態。糖修飾包括(但不限於)：2’-烷氧基-RNA類似物、2’-胺基-RNA類似物、2’-氟-DNA、及2’-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合物。例如：糖修飾可包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修飾包括2’-O-烷基-取代之去氧核糖核苷及2’-O-乙二醇樣核糖核苷。此等糖或糖類似物及各「核苷」(其中此等糖或類似物係附接雜環鹼基(核酸鹼基))之製法係已知。糖修飾亦可採用及組合其他修飾。
糖部份基團之修飾包括核糖及去氧核糖之天然修飾，及非天然修飾。糖修飾包括(但不限於)：2’位置上之下列修飾：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基及炔基。2’ 糖修飾亦包括(但不限於)：-O[(CH 2) nO] mCH 3、-O(CH 2) nOCH 3、-O(CH 2) nNH 2、-O(CH 2) nCH 3、-O(CH 2) nONH 2、及-O(CH 2) nON[(CH 2)n CH 3)] 2，其中n與m為1至約10。
2’位置之其他修飾包括(但不限於)：C 1至C 10低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基、報導子基團、嵌入體、改善寡核苷酸藥物動力學性質之基團、或改善寡核苷酸藥效學性質之基團、及具有類似性質之其他取代基。亦可在糖的其他位置進行類似修飾，特定言之，3’末端核苷酸或2’-5’連接之寡核苷酸中之糖的3’位置及5’末端核苷酸之5’位置。經修飾糖亦包括彼等在橋接環氧上包含修飾者，如：CH 2及S。核苷酸糖類似物亦可具有糖擬似物（mimetics），如：以環丁基部份基團替代呋喃戊糖基糖。有許多美國專利案教示此等經修飾糖結構之製法，並詳細說明一系列鹼基修飾，如：美國專利案案號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121, 5,596,091；5,614,617；5,681,941；及 5,700,920，其等揭示內容已分別以全文引用方式併入本文中。
具有經修飾糖部份基團之核酸實例包括(但不限於)：包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH 3、及2’-O(CH 2) 2OCH 3取代基之核酸。2’位置上之取代基可選自：烯丙基、胺基、疊氮基、硫、O-烯丙基、O-(C 1-C 1 0烷基)、OCF 3、O(CH 2) 2SCH 3、O(CH 2) 2-O-N(R m)(R n)、及O-CH 2-C(=O)-N(R m)(R n)，其中各R m及R n分別獨立為H或經取代或未經取代之C 1-C 10烷基。
某些實施例中，本文說明之核酸包括一或多個雙環核酸。某些此等實施例中，雙環核酸包含4’及2’核糖基環原子之間之橋連基。某些實施例中，本文提供之核酸包括一或多個雙環核酸，其中橋連基包含4’至2’之雙環核酸。此等4’至2’雙環核酸實例包括(但不限於)：以下一種化學式：4’-(CH 2)-O-2’ (LNA)；4’-(CH 2)-S-2’；4’-(CH 2) 2-O-2’ (ENA)；4’-CH(CH 3)-O-2’及4’-CH(CH 2OCH 3)-O-2’，及其類似物(參見美國專利案案號7,399,845)；4’-C(CH 3)(CH 3)-O-2’，及其類似物(參見WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美國專利案案號7,427,672、Chattopadhyaya等人，J. Org. Chem., 209, 74, 118-134、及WO2008/154401)。亦參見例如：Singh等人，Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人，Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人，Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh等人，J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava等人，J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379；Elayadi等人，Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人，Chem. Biol, 2001, 8, 1-7；Oram等人，Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；美國專利案案號4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；及 7,399,845；國際公告案案號WO2004/106356、WO1994/14226、WO2005/021570、WO2007/090071、與WO2007/134181；美國專利公告案案號US2004/0171570、US2007/0287831、與US2008/0039618；美國臨時申請案案號60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787,與61/099,844；及 國際申請案案號PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922、與PCT/DK98/00393。本章節所列各參考文獻之揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
某些實施例中，核酸包含連接之核酸。核酸可利用任何核酸之間鏈結連接在一起。可由磷原子之存在或不存在來定義兩大類核酸之間之連接基。代表性含磷之核酸間鏈結包括(但不限於)：磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、及硫代磷酸酯(P=S)。代表性非含磷之核酸間連接基包括(但不限於)：亞甲基甲基亞胺基(-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-)、硫二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰基胺基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H) 2-O-)；及N,N*-二甲基肼(-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3))。某些實施例中，具有對掌性原子之核酸間鏈結可製成消旋性混合物、分開之對映異構物，例如：烷基膦酸酯及硫代磷酸酯。非天然核酸可包含單一修飾。非天然核酸可在其中一個部份基團內或在不同部份基團之間包含多重修飾。
核酸之主幹磷酸酯修飾包括(但不限於)：甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、二硫代磷酸酯(phosphodithioate)、及硼烷(borano)磷酸酯，且可組合使用。亦可使用其他非磷酸酯鏈結。
有些實施例中，主幹修飾(例如：甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及二硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結)可對經修飾核酸賦與免疫調控活性及/或加強其活體內安定性 。
有些例子中，磷衍生物(或經修飾磷酸酯基團)係附接糖或糖類似物部份基團，且可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯或類似物。包含經修飾磷酸酯鏈結或非磷酸酯鏈結之聚核苷酸實例可參見Peyrottes等人，1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848；Chaturvedi等人，1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323；及Schultz等人(1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973；Matteucci, 1997, 「Oligonucleotide Analogs: an Overview」，述於Oligonucleotides as Therapeutic Agents (Chadwick及Cardew編輯)，John Wiley and Sons, New York, NY；Zon, 1993, 「Oligonucleoside Phosphorothioates」述於Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190；Miller等人，1971, JACS 93:6657-6665；Jager等人，1988, Biochem. 27:7247-7246；Nelson等人，1997, JOC 62:7278-7287；美國專利案案號5,453,496；及Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些例子中，骨幹修飾包括以替代之部份基團(如：陰離子性、中性或陽離性基團)置換磷酸二酯鏈結。此等修飾實例包括：陰離子性核苷間鏈結；N3’至P5’之胺基磷酸酯修飾；硼烷磷酸酯 DNA；改質寡核苷酸(prooligonucleotides)；中性核苷間鏈結，如：甲基膦酸酯；醯胺連接之DNA；亞甲基(甲基亞胺基)鏈結；甲縮醛及硫代甲縮醛鏈結；包含磺醯基之骨幹；嗎啉基寡聚物；肽核酸(PNA)；及帶正電荷之去氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179，其揭示內容已以引用方式併入本文中)。經修飾核酸可包括包含一或多個修飾之嵌合或混合骨幹，例如：磷酸酯鏈結之組合，如：磷酸二酯與硫代磷酸酯鏈結之組合。
磷酸酯之取代基包括例如：短鏈烷基或環烷基核苷間鏈結、混合雜原子與烷基或環烷基核苷間鏈結、或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鏈結。此等包括彼等具有嗎啉基鏈結(一部份由核苷之糖部份形成)；矽氧烷骨幹；硫醚、亞碸及碸骨幹；甲醯基(formacetyl)及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；含烯烴骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼骨幹；磺酸酯與磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；及其他具有混合N、O、S與CH 2組份者。許多美國專利案揭示如何製造及使用此等型態之磷酸酯置換法，且包括(但不限於)：美國專利案案號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；及 5,677,439。咸了解，核苷酸取代中，核苷酸之糖與磷酸酯兩個部份基團均可被例如：醯胺型鏈結(胺基乙基甘胺酸)(PNA)置換。美國專利案案號5,539,082；5,714,331；及5,719,262教示如何製造及使用PNA分子，其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。亦參見Nielsen等人，Science, 1991, 254, 1497-1500。亦可與核苷酸或核苷酸類似物連接其他型態之分子(接合物)，以加強例如：細胞吸收性。接合物可依化學方式連接核苷酸或核苷酸類似物。此等接合物包括(但不限於)：脂質部份基團如：膽固醇部份基團(Letsinger等人， Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86：6553-6556)、膽酸(Manoharan等人， Biorg . Med. Chem. Let., 1994, 4：1053-1060)、硫醚，例如：己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人， Ann . N.Y. Acad. Sci., 1992, 660：306-309；Manoharan等人， Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3：2765-2770)、硫膽固醇(Oberhauser等人， Nucl . Acids Res., 1992, 20：533-538)、脂系鏈，例如：十二烷二醇或十一烷基(Saison-Behmoaras等人， EMBO J, 1991, 10：1111-1118；Kabanov等人， FEBS Lett., 1990, 259：327-330；Svinarchuk等人， Biochimie, 1993, 75：49-54)、磷脂，例如：二-十六烷基-消旋性-甘油或1-二-O-十六烷基-消旋性-甘油基-S-H-膦酸三乙基銨鹽(Manoharan等人， Tetrahedron Lett., 1995, 36：3651-3654；Shea等人， Nucl. Acids Res., 1990, 18：3777-3783)、多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人， Nuclosides & Nuclotides, 1995, 14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人， Tetrahedron Lett., 1995, 36：3651-3654)、棕櫚基部份基團(Mishra等人， Biochim . Biophys. Acta, 1995, 1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基氧膽固醇部份基團(Crooke等人，J. Pharmacol . Exp. Ther., 1996, 277：923-937)。許多美國專利案教示此等接合物之製法，且包括 (但不限於)：美國專利案案號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928與5,688,941。本章節所列各參考文獻之揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些例子中，非天然核酸進一步形成非天然鹼基對。可以在活體內條件下形成非天然DNA或RNA 鹼基對(UBP)之非天然核苷酸實例包括(但不限於)：TPT3、dTPT3、5SICS、d5SICS、NaM、dNaM、CNMO、dCNMO、與其組合。可形成用於製備本文所揭示IL-2接合物之非天然UBP之其他非天然核苷酸實例可參見Dien等人，J Am Chem Soc., 2018, 140:16115–16123；Feldman 等人., J Am Chem Soc, 2017, 139:11427–11433；Ledbetter 等人., J Am Chem Soc., 2018, 140:758-765；Dhami 等人., Nucleic Acids Res. 2014, 42:10235-10244；Malyshev 等人., Nature, 2014, 509:385-388；Betz 等人., J Am Chem Soc., 2013, 135:18637-18643；Lavergne 等人., J Am Chem Soc. 2013, 135:5408-5419；及 Malyshev 等人. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:12005-12010；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。有些實施例中，非天然核苷酸包括：
Figure 02_image121
Figure 02_image123
。
有些實施例中，可用於製備本文所揭示IL-2接合物之非天然核苷酸可衍生自下式化合物
Figure 02_image125
其中R 2係選自下列各物所組成群中：氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲硒基、鹵素、氰基、及疊氮基；及 波浪線代表與核糖基或2’-去氧核糖基之鍵結，其中核糖基或2’-去氧核糖基部份基團之5’-羥基係呈游離型，或可視需要鍵結單磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯基團。
有些實施例中，可用於製備本文所揭示IL-2接合物之非天然核苷酸可衍生自
Figure 02_image127
,
Figure 02_image129
,
Figure 02_image131
,
Figure 02_image133
,
Figure 02_image135
與
Figure 02_image137
。有些實施例中，可用於製備本文所揭示IL-2接合物之非天然核苷酸包括
Figure 02_image139
，
Figure 02_image141
，
Figure 02_image143
，
Figure 02_image145
，
Figure 02_image147
與
Figure 02_image149
，或其鹽類。
有些實施例中，產生非天然胺基酸之非天然鹼基對說明於Dumas等人之「Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology」， Chemical Science, 6: 50-69 (2015)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
有些實施例中，非天然胺基酸係利用包含非天然核酸之合成性密碼子引入細胞激素(例如：IL多肽)中。有些例子中，非天然胺基酸利用正交之經修飾合成酶/tRNA配對引入細胞激素中。此等正交配對包含非天然合成酶，可以在非天然tRNA上加載非天然胺基酸，同時讓加載a)其他內因性胺基酸至非天然tRNA上及b)加載非天然胺基酸至其他內因性tRNA上達最小化。此等正交配對包含之tRNA可以利用非天然合成酶加載，同時避免被內因性合成酶加載a)其他內因性胺基酸。有些實施例中，此等配對可從各種不同生物體中判別，如：細菌、酵母、古菌(Archaea)、或人類來源。有些實施例中，正交合成酶/tRNA配對包含來自單一生物體之組份。有些實施例中，正交合成酶/tRNA配對包含來自兩種不同生物體之組份。有些實施例中，正交合成酶/tRNA配對包含之組份在修飾之前，會促進兩種不同胺基酸之轉譯。有些實施例中，正交合成酶為經修飾丙胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾精胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾天冬醯胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾天冬胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾半胱胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾麩醯胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾麩胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾丙胺酸甘胺酸。有些實施例中，正交合成酶為經修飾組胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾白胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾異白胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾離胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾甲硫胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾苯基丙胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾脯胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾絲胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾蘇胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾色胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾酪胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾纈胺酸合成酶。有些實施例中，正交合成酶為經修飾磷酸絲胺酸合成酶。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾丙胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾精胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾天冬醯胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾天冬胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾半胱胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾麩醯胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾麩胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾丙胺酸甘胺酸。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾組胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾白胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾異白胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾離胺酸tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾甲硫胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾苯基丙胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾脯胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾絲胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾蘇胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾色胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾酪胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾纈胺酸 tRNA。有些實施例中，正交 tRNA為經修飾磷酸絲胺酸 tRNA。
有些實施例中，非天然胺基酸係利用胺基醯基(aaRS或RS)-tRNA合成酶-tRNA配對引入細胞激素(例如：IL多肽)中。aaRS-tRNA配對實例包括(但不限於)：詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii) ( Mj -Tyr) aaRS/tRNA配對、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus) tRNA CUA配對、大腸桿菌( E. coli)LeuRS ( Ec -Leu)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus) tRNA CUA配對、及吡咯烷基(pyrrolysyl)-tRNA配對。有些例子中，非天然胺基酸係利用 Mj-TyrRS/tRNA配對引入細胞激素(例如：IL多肽)中。可藉由 Mj-TyrRS/tRNA配對引進之UAA實例包括(但不限於)：對位-經取代之苯基丙胺酸衍生物，如：對-胺基苯基丙胺酸及對-甲氧基苯基丙胺酸；間位-經取代之酪胺酸衍生物，如：3-胺基酪胺酸、3-硝基酪胺酸、3,4-二羥基苯基丙胺酸、及3-碘酪胺酸；苯基硒基半胱胺酸；對-二羥基硼代苯基丙胺酸；及鄰-硝基苯甲基酪胺酸。
有些例子中，非天然胺基酸係利用 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA配對引入細胞激素(例如：IL多肽)中。可利用 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA配對引進之UAA實例包括(但不限於)：包含二苯甲酮、酮、碘化物、或疊氮取代基之苯基丙胺酸衍生物； O-炔丙基酪胺酸；α-胺基辛酸、O-甲基酪胺酸、O-硝基苯甲基半胱胺酸；及3-(萘-2-基胺基)-2-胺基-丙酸。
有些例子中，非天然胺基酸係利用吡咯烷基(pyrrolysyl)-tRNA配對引入細胞激素(例如： IL多肽)中。有些例子中，PylRS得自古細菌，例如：來自產甲烷之古細菌。有些例子中，PylRS係得自巴氏甲烷八叠球菌( Methanosarcina barkeri)、馬氏甲烷八叠球菌( Methanosarcina mazei)、或醋酸甲烷八叠球菌( Methanosarcina acetivorans)。可利用吡咯烷基-tRNA配對引進之UAA實例包括(但不限於)：經醯胺及胺甲酸酯取代之離胺酸，如：2-胺基-6-((R)-四氫呋喃-2-羧醯胺基)己酸、 N-ε- D-脯胺醯基- L-離胺酸、及 N-ε-環戊基氧羰基- L-離胺酸； N-ε-丙烯醯基- L-離胺酸； N-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)乙氧基)羰基]- L-離胺酸；及 N-ε-(1-甲基環丙-2-烯羧醯胺基)離胺酸。有些實施例中，本文所揭示IL-2接合物可採用藉由選擇性帶有非天然胺基酸(如： N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸(AzK))之馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei) tRNA，使用巴氏甲烷八叠球菌( M. barkeri)吡咯烷基-tRNA合成酶( MbPylRS)製備。其他方法係彼等習此相關技藝者已知，如：彼等揭示於Zhang等人，Nature 2017, 551(7682): 644-647，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
有些例子中，非天然胺基酸係利用US 9,988,619與US 9,938,516揭示之合成酶引入本文說明之細胞激素(例如：IL多肽)中，其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
由已引進本文所揭示構築體或載體之宿主細胞於合適培養基中培養或維持，以產生所需之tRNA、tRNA合成酶及蛋白質。該培養基亦包含可使所需蛋白質引進非天然胺基酸(群)之非天然胺基酸(群)。有些實施例中，宿主細胞亦可包含來自細菌、植物或藻類之核苷三磷酸轉運子(NTT)。有些實施例中，本文所揭示IL-2接合物係利用表現NTT之宿主細胞製備。有些實施例中，宿主細胞中使用之核苷酸核苷三磷酸轉運子可選自：TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8 (假微型海鏈藻(T. pseudonana))、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6 (三角褐指藻(P. tricornutum))、GsNTT (嗜硫原始紅藻(Galdieria sulphuraria))、AtNTT1、AtNTT2 (阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana))、CtNTT1、CtNTT2 (砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis))、PamNTT1、PamNTT2 (嗜阿米巴前衣原體(Protochlamydia amoebophila))、CcNTT (嗜核殺手桿菌(Caedibacter caryophilus))、RpNTT1 (普氏立克次體(Rickettsia prowazekii))。有些實施例中，NTT係選自：PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、及PtNTT6。有些實施例中，NTT為PtNTT1。有些實施例中，NTT為PtNTT2。有些實施例中，NTT為PtNTT3。有些實施例中，NTT為PtNTT4。有些實施例中，NTT為PtNTT5。有些實施例中，NTT為PtNTT6。其他可使用之NTT揭示於Zhang等人， Nature2017, 551(7682): 644-647；Malyshev等人， Nature2014 (509(7500), 385-388；及Zhang等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114：1317–1322；此等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
正交 tRNA合成酶/tRNA配對可以使tRNA帶有非天然胺基酸，並可以讓非天然胺基酸因應密碼子而引入多肽鏈中。aaRS-tRNA配對實例包括(但不限於)：詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii) ( Mj -Tyr) aaRS/tRNA配對、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus) tRNA CUA配對、大腸桿菌( E. coli)LeuRS ( Ec -Leu)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus) tRNA CUA配對、及吡咯烷基-tRNA配對。根據本發明可使用之其他aaRS-tRNA配對包括彼等衍生自馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)者，彼等說明於Feldman等人，J Am Chem Soc., 2018 140：1447–1454；及Zhang等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114：1317–1322；此等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些實施例中，提供在表現NTT與tRNA合成酶之細胞系統中製備本文所揭示IL-2接合物之方法。有些本文所說明實施例中，NTT係選自：PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、及PtNTT6，及tRNA合成酶係選自：詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr) / 嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、及馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT1，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT2，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT3，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT3，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT4，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT5，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。有些實施例中，NTT為PtNTT6，及tRNA合成酶係衍生自詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)、大腸桿菌( E. coli)TyrRS ( Ec -Tyr)/嗜熱芽胞桿菌( B. stearothermophilus)、或馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)。
有些實施例中，本文所揭示IL-2接合物可於細胞中製備，如：大腸桿菌( E. coli)，其包含(a)核苷酸三磷酸轉運子 PtNTT2 (包括截短變體，其中已刪除全長蛋白質之第一段65個胺基酸殘基)，(b)質體，其包含之雙股寡核苷酸係編碼具有所需胺基酸序列之IL-2 變體且包含非天然鹼基對，其包含第一非天然核苷酸與第二非天然核苷酸，在所需位置提供密碼子，即可在此位置引進非天然胺基酸，如： N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸(AzK)，(c)編碼衍生自馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)之tRNA之質體，其包含非天然核苷酸，以提供已辨識之反密碼子(相對於IL-2 變體之密碼子)替代其原始序列，及(d)編碼巴氏甲烷八叠球菌( M. barkeri)所衍生之吡咯烷基-tRNA合成酶( MbPylRS)之質體，其可與編碼tRNA之質體相同或為不同質體。有些實施例中，細胞進一步補充包含一或多個非天然鹼基之去氧核糖三磷酸酯。有些實施例中，細胞進一步補充包含一或多個非天然鹼基之核糖三磷酸酯。有些實施例中，細胞進一步補充一或多個非天然胺基酸，如： N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸(AzK)。有些實施例中，編碼所需IL-2 變體之胺基酸序列之雙股寡核苷酸在例如：編碼具有SEQ ID NO：1之蛋白質之序列之位置34、37、40、41、42、43、44、61、64、68、或71包含密碼子AXC。有些實施例中，細胞進一步包含質體，其可為蛋白質表現質體或另一種質體，其編碼來自馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)之正交 tRNA基因 ，其包含AXC-匹配反密碼子GYT替代其原始序列，其中Y為非天然核苷酸 ，其係與密碼子中之非天然核苷酸互補且可以相同或不同。有些實施例中，密碼子中之非天然核苷酸與反密碼子中之非天然核苷酸不同且互補。有些實施例中，密碼子中之非天然核苷酸係與反密碼子中之非天然核苷酸相同。有些實施例中，在雙股寡核苷酸中構成非天然鹼基對之第一與第二非天然核苷酸可衍生自
Figure 02_image129
，
Figure 02_image133
與
Figure 02_image137
。有些實施例中，構成雙股寡核苷酸中非天然鹼基對之第一與第二非天然核苷酸可衍生自
Figure 02_image129
與
Figure 02_image137
。有些實施例中，第一與第二非天然核苷酸之三磷酸酯包括
Figure 02_image141
，
Figure 02_image143
與
Figure 02_image149
、或其鹽類。有些實施例中，第一與第二非天然核苷酸之三磷酸酯包括
Figure 02_image141
與
Figure 02_image149
、或其鹽類。有些實施例中，衍生包含第一非天然核苷酸與第二非天然核苷酸之雙股寡核苷酸之mRNA可包含密碼子，其包含衍生自：
Figure 02_image127
，
Figure 02_image131
，與
Figure 02_image135
之非天然核苷酸。有些實施例中，馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)tRNA可包含反密碼子，其包含可辨識包含mRNA之非天然核苷酸之密碼子之非天然核苷酸。馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei) tRNA中之反密碼子可包含衍生自
Figure 02_image127
，
Figure 02_image131
與
Figure 02_image135
之非天然核苷酸。有些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image127
之非天然核苷酸。有些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image131
之非天然核苷酸。有些實施例中，mRNA 包含衍生自
Figure 02_image135
之非天然核苷酸。有些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image127
之非天然核苷酸。有些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image131
之非天然核苷酸。有些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image135
之非天然核苷酸。有些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image127
之非天然核苷酸及tRNA包含衍生自
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之非天然核苷酸。有些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image135
之非天然核苷酸及tRNA包含衍生自
Figure 02_image127
之非天然核苷酸。宿主細胞係於包含適當營養素之培養基中培養，其中並補充：(a)去氧核糖核苷之三磷酸酯，其包含編碼含有密碼子之細胞激素基因之質體(群)在複製時所必需之一或多個非天然鹼基，(b)核糖核苷之三磷酸酯，其包含以下轉錄所必需之一或多個非天然鹼基：(i)對應於細胞激素之編碼序列且包含含有一或多個 非天然鹼基之密碼子之mRNA，及(ii)包含含有一或多個非天然鹼基之反密碼子之tRNA，及(c)計畫引至所需細胞激素之多肽序列中之非天然胺基酸。宿主細胞隨後維持在可以表現所需蛋白質之條件下。
表現所得包含AzK之蛋白質可採用彼等習此相關技藝者已知之方法純化，然後可與炔烴(如：包含如本文所揭示具有所需平均分子量之PEG鏈之DBCO)，於彼等習此相關技藝者已知之條件下反應，產生本文所揭示IL-2接合物。其他方法係彼等習此相關技藝者已知，如：彼等揭示於Zhang等人，Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；及 WO2019/028425；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
表現所得包含一或多個非天然胺基酸，例如：AzK，之蛋白質可採用彼等習此相關技藝者已知之方法純化，然後可與炔烴(如：包含如本文所揭示具有所需平均分子量之PEG鏈之DBCO)，於彼等習此相關技藝者已知之條件下反應，產生本文所揭示IL-2接合物。其他方法係彼等習此相關技藝者已知，如：彼等揭示於Zhang等人，Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；及 WO2019/028425；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
或者，包含非天然胺基酸(群)之細胞激素(例如：IL-2)多肽之製法為在宿主細胞中引進本文所說明包含tRNA及胺基醯基tRNA合成酶及包含帶有一或多個讀碼框內正交(終止)密碼子之所需核酸序列之核酸構築體。宿主細胞於包含適當營養素之培養基中培養，其中並補充：(a)去氧核糖核苷之三磷酸酯，其包含編碼含有新密碼子與反密碼子之細胞激素基因之質體(群)在複製時所必需之一或多個非天然鹼基，(b) mRNA在轉錄時所需之核糖核苷之三磷酸酯，該mRNA對應於：(i)包含密碼子之細胞激素序列，及(ii)包含反密碼子之正交tRNA，及(c)非天然胺基酸。宿主細胞隨後維持在可以表現所需蛋白質之條件下。非天然胺基酸(群)會因應非天然密碼子而引至多肽鏈中。例如：將一或多個非天然胺基酸引入細胞激素(例如：IL-2)多肽中。或者，可將兩個或更多個非天然胺基酸引至細胞激素(例如：IL-2)多肽中，在蛋白質中兩個或更多個位點。
一旦在宿主細胞中產生引進非天然胺基酸(群)之細胞激素(例如：IL-2)多肽時，即可採用相關技藝習知之各種不同方法自其中萃取，包括酵素、化學、及/或滲透性溶胞及物理性瓦解。細胞激素(例如：IL-2)多肽可採用相關技藝習知之標準技術純化，如：製備性離子交換層析法、疏水性層析法、親和性層析法、或彼等習此相關技藝者已知之任何其他合適技術。
合適之宿主細胞可包括細菌細胞(例如：大腸桿菌(E. coli)、BL21(DE3))，但最合適之宿主細胞為真核生物細胞，例如：昆蟲細胞(例如：果蠅( Drosophila)如：果蠅( Drosophila melanogaster))、酵母細胞、線蟲(例如：秀麗隱桿線蟲( C. elegans))、小鼠(例如：小家鼠( Mus musculus))、或哺乳動物細胞(如：中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞、人類 293T細胞、HeLa細胞、NIH 3T3細胞、及小鼠紅白血病(MEL)細胞)或人類細胞或其他真核生物細胞。其他合適之宿主細胞係彼等習此相關技藝者已知。合適時，宿主細胞為哺乳動物細胞，如：人類細胞或昆蟲細胞。有些實施例中，合適之宿主細胞包含大腸桿菌( E coli)。
本發明實施例中一般可使用之其他合適宿主細胞為彼等實例章節中所述及者。載體 DNA可利用習知轉化或轉染技術引至宿主細胞中。本文所採用術語「轉化」及「轉染」計畫指用於引進外來核酸分子(例如：DNA)進入宿主細胞中之各種不同習知技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共同沉澱法、DEAE-葡聚醣-介導轉染法、脂染法、或電穿孔法。適合轉化或轉染宿主細胞之方法係相關技藝習知者。
當建立細胞株時，通常較佳為製備穩定細胞株。例如：已知哺乳動物細胞之穩定轉染依所採用之表現載體及轉染技術而定，僅極小比例的細胞可整合外來DNA引入其基因體。為了判別及選拔此等整合體，通常將編碼可選拔之標記物(例如：針對抗生素之抗性)連同所需之基因一起引至宿主細胞中。較佳之可選拔標記物包括彼等對諸如：G418、潮黴素(hygromycin)、或胺甲喋呤(methotrexate)等藥物賦與抗性者。編碼可選拔標記物之核酸分子可在相同載體上引至宿主細胞中，或可在分開的載體上引進。經所引入核酸分子穩定轉染之細胞可利用藥物選拔法判別(例如：已引進可選拔標記物基因之細胞將會存活，其他細胞則死亡)。
一項實施例中，由本文所說明構築體整合引入宿主細胞基因體中。穩定整合之優點在於可在個別細胞或純系之間達成均一性。另一項優點為可以進行最佳產物的選拔。因此，需要建立穩定的細胞株。另一項實施例中，由本文所說明構築體轉染至宿主細胞中。由構築體轉染至宿主細胞中之優點為可以最大化蛋白質產量。一項態樣中，說明一種包含本文所說明核酸構築體或載體之細胞。 醫藥組成物及調配物
有些實施例中，本文所說明包含細胞激素接合物(例如：IL-2接合物)之醫藥組成物及調配物係採用多種投藥途徑投與受試者，包括(但不限於)：非經腸式、經口、頰、直腸、舌下、或穿皮式投藥途徑。有些例子中，非經腸式投藥法包括經靜脈內、皮下、肌內、腦內、鼻內、動脈內、關節內、皮內、玻璃體內、骨內輸注、腹膜內、或鞘內投藥。有些例子中，醫藥組成物係調配成局部投藥。其他例子中，醫藥組成物係調配成全身投藥。有些實施例中，本文所說明醫藥組成物及調配物係經靜脈內、皮下、及肌內投藥法投與受試者。有些實施例中，本文所說明醫藥組成物及調配物係經靜脈內投藥法投與受試者。有些實施例中，本文所說明醫藥組成物及調配物係採用投藥法投與受試者。有些實施例中，本文所說明醫藥組成物及調配物係經肌內投藥法投與受試者。
有些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)：水性勻散液、自行乳化勻散液、固體溶液、脂質體勻散液、氣溶膠、固體劑型、粉劑、立即釋放調配物、控制釋放調配物、快速熔化調配物、錠劑、膠囊、丸劑、延緩釋放調配物、長期釋放調配物、脈衝釋放調配物、多重顆粒調配物(例如：奈米粒子調配物)、及混合立即釋放與控制釋放之調配物。
有些實施例中，醫藥調配物包括依據與本文所揭示組成物之相容性及所需劑型之釋放型態性質所選擇之載劑或載劑材料。載劑材料實例包括例如：結合劑、懸浮劑、崩解劑、填充劑、界面活性劑、溶解劑、安定劑、潤滑劑、濕化劑、稀釋劑、與類似物。醫藥上相容之載劑材料包括(但不限於)：金合歡膠、明膠、膠態二氧化矽、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、甘油、矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、膽固醇、膽固醇酯、酪蛋白鈉、大豆卵磷脂、牛磺膽酸、磷脂醯膽鹼、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸二鉀、纖維素及纖維素接合物、糖類、硬脂醯乳酸鈉、鹿角菜膠、單酸甘油酯、二酸甘油酯、預糊化澱粉、與類似物。參見例如： Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E.； Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A.與Lachman, L.編輯； Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；與 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams & Wilkins1999)；其等揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
有些例子中，醫藥組成物係調配成免疫脂質體，其包含複數個IL-2接合物，直接或間接結合脂質體之脂質雙層。脂質實例包括(但不限於)：脂肪酸；磷脂；固醇類，如：膽固醇；鞘脂，如：鞘磷脂；鞘糖脂，如：神經節苷脂、紅細胞糖苷酯、及腦苷脂；界面活性劑胺類，如：硬脂基、油基、及亞油基胺類。
有些例子中，醫藥調配物進一步包括pH調整劑或緩衝劑，其包括醫藥上可接受之酸、鹼、或緩衝劑。
有些例子中，醫藥調配物包括一或多種醫藥上可接受之鹽類，例如：其含量使組成物之滲透壓達到可接受之範圍內。
有些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)：諸如：海藻糖、蔗糖、甘露糖醇、麥芽糖、葡萄糖之糖類，或諸如：磷酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸銨之鹽類，及/或其他製劑，如：肝素，以提高多肽之溶解性及活體內安定性。
有些例子中，醫藥調配物進一步包括稀釋劑，其可用於安定化合物，因為其等可提供更穩定的環境。相關技藝中利用鹽類溶於緩衝溶液(其亦可提供控制或維持pH)中來作為稀釋劑，包括(但不限於)：磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液。有些例子中，稀釋劑會增加組成物體積，以利於壓縮或提供足夠體積進行均勻掺合，以供填充膠囊。
有些例子中，醫藥調配物包括崩解劑(disintegration agent)或分解劑(disintegrant)，有利於物質分解或崩解。術語「分解劑」同時包括劑型接觸到胃腸液體時之溶解與勻散。崩解劑實例包括澱粉，例如：天然澱粉，如：玉米澱粉或馬鈴薯澱粉、預糊化澱粉(如：National 1551或Amijel ®)、或乙醇酸澱粉鈉(如：Promogel ®或Explotab ®)、纖維素(如：木產物)、甲基結晶纖維素(例如：Avicel ®、Avicel ®PH101、Avicel ®PH102、Avicel ®PH105、Elcema ®P100、Emcocel ®、Vivacel ®、Ming Tia ®、與Solka-Floc ®)、甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素、或交聯纖維素(如：交聯羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol ®)、交聯羧甲基纖維素、或交聯之交聯羧甲基纖維素)、交聯澱粉(如：乙醇酸澱粉鈉)、交聯聚合物(如：交聯聚維酮(crospovidone))、交聯聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鹽(如：藻酸或藻酸之鹽類如：藻酸鈉)、黏土(如：Veegum ®HV (矽酸鎂鋁))、膠質(如：洋菜、關華豆膠、刺槐豆膠、卡拉膠(Karaya)、果膠、或黃蓍膠)、乙醇酸澱粉鈉、皂土、天然海綿、界面活性劑、樹脂(如：陽離子交換樹脂)、柑橘渣、月桂基硫酸鈉、與澱粉組合之月桂基硫酸鈉，及類似物。
有些例子中，醫藥調配物包括填充劑(如：乳糖、碳酸鈣、磷酸鈣、二鹼價磷酸鈣、硫酸鈣、微晶纖維素、纖維素粉末、右旋糖、葡萄糖結合劑(dextrate)、葡聚糖、澱粉、預糊化澱粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉、聚乙二醇、與類似物。
本文所說明醫藥調配物中亦可視需要包括潤滑劑與助滑劑，供防止、減少或抑制材料之黏附或磨擦。潤滑劑實例包括例如：硬脂酸、氫氧化鈣、滑石、硬脂基富馬酸鈉、烴類如：礦物油、或氫化植物油如：氫化大豆油(Sterotex ®)、高碳數脂肪酸與其等之鹼金屬及鹼土金屬鹽類(如：鋁、鈣、鎂、鋅)、硬脂酸、硬脂酸鈉、甘油、滑石、蠟類、Stearowet ®、硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、白胺酸、聚乙二醇(例如：PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如：Carbowax™、油酸鈉、苯甲酸鈉、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、月桂基硫酸鎂或鈉、膠態矽石如：Syloid™、Cab-O-Sil ®、澱粉如：玉米澱粉、矽油、界面活性劑、與類似物。
塑化劑包括用於軟化微囊封材料或膜衣以降低其脆性之化合物。合適塑化劑包括例如：聚乙二醇如：PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350、與PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纖維素與三醋精。塑化劑亦具有勻散劑或濕化劑之功能。
溶解劑包括如：三醋精、檸檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium doccusate)、維他命E TPGS、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羥基乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基環糊精、乙醇、正丁醇、異丙醇、膽固醇、膽鹽、聚乙二醇200-600、四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、卡必醇(transcutol)、丙二醇、與異山梨醇二甲醚、及類似物。
安定劑包括諸如：任何抗氧化劑、緩衝劑、酸類、防腐劑、及類似物之化合物。安定劑實例包括L-精胺酸鹽酸鹽、三羥甲基胺基甲烷(tromethamine)、白蛋白(人類)、檸檬酸、苯甲基醇、苯酚、二磷酸二鈉脫水物、丙二醇、間甲酚(metacresol或m-cresol)、乙酸鋅、聚山梨酸酯-20或Tween® 20、或緩血酸胺(trometamol)。
懸浮劑包括諸如：聚乙烯吡咯烷酮之化合物，例如：聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25、或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇，例如：聚乙二醇可具有分子量約300至約6000、或約3350至約4000、或約7000至約5400、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基甲基纖維素乙酸酯硬脂酸酯、聚山梨酸酯-80、羥基乙基纖維素、藻酸鈉、膠質諸如例如：黃蓍膠與金合歡膠、關華豆膠、黃原膠類(包括黃原膠)、糖類、纖維素類諸如例如：羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、聚山梨酸酯-80、藻酸鈉、聚乙氧基化山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚乙氧基化山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚維酮(povidone)、及類似物。
界面活性劑包括諸如：月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sdium docusate)、Tween 60或80、三醋精(triacetin)、維生素E TPGS、山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚山梨酸酯、泊洛沙姆(polaxomers)、膽鹽類、甘油基單硬脂酸酯、環氧乙烷與氧化丙烯之共聚物，例如：Pluronic ®(BASF)、及類似物之化合物。其他界面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯及植物油類，例如：聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油、與聚氧乙烯烷基醚類，及烷基苯基醚類，例如：octoxynol 10、octoxynol 40。有時候，亦包括界面活性劑來加強物理安定性或用於其他目的。
黏度加強劑包括例如：甲基纖維素、黃原膠、羧甲基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素乙酸酯硬脂酸酯、羥基丙基甲基纖維素酞酸酯、卡波姆(carbomer)、聚乙烯醇、藻酸鹽類、金合歡膠、殼聚糖及其組合。
濕化劑包括諸如：油酸、單硬脂酸甘油酯、山梨糖醇酐單油酸酯、山梨糖醇酐單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、多庫酯鈉(sodium docusate) 、油酸鈉、月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium doccusate)、三醋精、Tween 80、維生素E TPGS、銨鹽類、及類似物之化合物。 治療方法 癌症類型
有些實施例中，癌症係選自：腎細胞癌瘤(RCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭與頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、典型何杰金氏淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma)(cHL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、泌尿上皮癌、微小衛星體不穩定癌、微小衛星體穩定癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌(CRC)、子宮頸癌、肝細胞癌瘤(HCC)、默克細胞(Merkel cell)癌瘤(MCC)、黑色素瘤、小細胞肺癌(SCLC)、食道癌、食道鱗狀細胞癌瘤 (ESCC)、膠質母細胞瘤、間皮瘤、乳癌、三陰性乳癌、攝護腺癌、去勢抗性攝護腺癌、轉移性去勢抗性攝護腺癌、或具有DNA損傷反應(DDR)缺陷之轉移性去勢抗性攝護腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突變負荷之腫瘤、皮膚鱗狀細胞癌瘤(CSCC)、鱗狀細胞皮膚癌(SCSC)、低表現至無表現PD-L1之腫瘤、全身擴散至肝臟與CNS超出其原發解剖部位原點之腫瘤、及瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
有些實施例中，該反應為完全反應(CR)、部份反應(PR)或穩定疾病(SD)。 投藥
有些實施例中，IL-2接合物係經靜脈內、皮下、肌內、腦內、鼻內、動脈內、關節內、皮內、玻璃體內、骨內輸注、腹膜內、或鞘內投與受試者。有些實施例中，IL-2接合物係經靜脈內、皮下、或肌內投與受試者。有些實施例中，IL-2接合物係經靜脈內投與受試者。有些實施例中，IL-2接合物係經皮下投與受試者。有些實施例中，IL-2接合物係經肌內投與受試者。有些實施例中，IL-2接合物係經靜脈內投與受試者。
IL-2接合物可以投與超過一次，例如：2次、3次、4次、5次、或更多次。有些實施例中，治療期可長達24個月，如：1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月。有些實施例中，治療期可以進一步再延長另外的24個月。
有些實施例中，IL-2接合物係約每兩週一次、約每三週一次、或約每四週一次投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係約每兩週一次投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係約每三週一次投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係約每四週一次投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係約每14、15、16、17、18、19、20、或21天投與一次。
有些例子中，所需劑量通常呈單劑量或呈分割劑量，同時(或在短時間內)或依適當間隔投藥，例如：每天投與2、3、4個、或更多個小劑量。
有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為8 µg/kg、16 µg/kg、24 µg/kg、32 µg/kg、或40 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為8 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為16 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為24 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為32 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為40 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為8至40 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為8至16 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為24至32 µg/kg投與有此需要之受試者。有些實施例中，IL-2接合物係以劑量為24至40 µg/kg投與有此需要之受試者。 受試者
有些實施例中，IL-2接合物係投與成人。有些實施例中，成人為男性。其他實施例中，成人為女性。有些實施例中，成人年齡為至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95歲。有些實施例中， IL-2接合物係投與嬰兒、幼童、或青少年。有些實施例中，受試者年齡為至少1個月、2個月、3個月、6個月、9個月或12個月齡。有些實施例中，受試者年齡為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19歲。
有些實施例中，受試者患有可藉由 RECIST v1.1量測判斷之疾病(亦即癌症)。有些實施例中，受試者已被判斷具有美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group)(ECOG)體能表現狀態為0或1。有些實施例中，受試者經醫師判斷具有適度心血管、血液、肝與腎功能。有些實施例中，受試者經(例如：醫師)判斷具有超過或等於12週之預期壽命。有些實施例中，受試者在接受投與第一劑治療劑量之前已曾接受抗癌療法。
有些實施例中，受試者患有實體腫瘤癌症。有些實施例中，受試者患有轉移性實體腫瘤。有些實施例中，受試者患有晚期實體腫瘤。有些實施例中，受試者患有難治性癌症。有些實施例中，受試者患有復發性癌症。
有些實施例中，受試者對本文所揭示任何IL-2接合物、PEG、或聚乙二醇基化藥物沒有已知過敏性或禁忌症。 投藥效應
有些實施例中，投與IL-2接合物可提供完整反應、部份反應或穩定疾病。
有些實施例中，在投與IL-2接合物後，採用實體腫瘤之免疫相關反應評估標準(Immune-related Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(iRECIST)量測受試者經歷之反應。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之客觀反應率(Objective Response Rate)(ORR)評估。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之反應持續時間(Duration of Response)(DOR)評估。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之無惡化存活期(Progression-Free Survival) (PFS)評估。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之總存活率(Overall Survival)評估。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之開始反應時間(Time to Response)(TTR) 評估。有些實施例中，在投與IL-2接合物後，受試者經歷根據第1.1版RECIST之疾病控制率(Disease Control Rate)(DCR)評估。任何此等實施例中，受試者之經歷係由醫師依據受試者之放射線影像評估。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第2級、第3級、或第4級血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第2級血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第3級血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第4級血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者喪失血管張力。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之血漿蛋白質與體液外滲至血管外空間。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之高血壓及降低之器官灌流。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之嗜中性白血球功能受損。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之趨化性下降。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物與受試者中瀰漫性感染風險提高無關。有些實施例中，瀰漫性感染為敗血症或細菌性心內膜炎。有些實施例中，瀰漫性感染為敗血症。有些實施例中，瀰漫性感染為細菌性心內膜炎。有些實施例中，受試者在接受投與IL-2接合物之前曾接受過治療任何先存在之細菌感染。有些實施例中，受試者在接受投與IL-2接合物之前，接受選自苯唑青黴素(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、與萬古黴素(vancomycin)之抗細菌劑治療。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會使受試者中已存在或初次發病之自體免疫疾病或發炎疾病惡化。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會使受試者中已存在或初次發病之自體免疫疾病惡化。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會使受試者中已存在或初次發病之發炎疾病惡化。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係選自：克隆恩氏症(Crohn’s disease)、硬皮症、甲狀腺炎、發炎性關節炎、糖尿病、外眼-延髓重症肌無力、新月形IgA腎小球腎炎、膽囊炎、腦血管炎、史帝文生-強生症候群(Stevens-Johnson syndrome)與大疱性類天疱瘡。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係克隆恩氏症(Crohn’s disease)。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係硬皮症。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係甲狀腺炎。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係發炎性關節炎。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係糖尿病。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係外眼-延髓重症肌無力。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係新月形IgA腎小球腎炎。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係膽囊炎。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係腦血管炎。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係史帝文生-強生症候群(Stevens-Johnson syndrome)。有些實施例中，受試者中之自體免疫疾病或發炎疾病係大疱性類天疱瘡。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者改變心智狀態、語言困難、皮質性盲症、肢體或步態失調、幻覺、躁動、遲鈍、或昏迷。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之癲癇發作。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會成為患有已知癲癇發作疾患之受試者之禁忌。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之毛細血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第2級、第3級、或第4級毛細血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第2級毛細血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第3級毛細血管滲漏症候群。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之第4級毛細血管滲漏症候群。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會在投藥後引起受試者之平均動脈壓下降。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會引起受試者低血壓。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者經歷到低於90 mm Hg之收縮壓或從收縮壓基線值下降20 mm Hg。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之水腫或腎或肝功能損傷。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之嗜酸性白血球增多。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者周邊血液之嗜酸性白血球計數超過500/μL。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之周邊血液之嗜酸性白血球計數超過500µL至1500/μL。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之周邊血液之嗜酸性白血球計數超過1500/μL至5000/μL。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會引起受試者之周邊血液之嗜酸性白血球計數超過5000/μL。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會成為正在接受精神病藥物療法之受試者的禁忌。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會成為正在接受腎毒性、骨髓病性、心毒性、或肝毒性藥物療法之受試者的禁忌。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會成為正在接受胺基糖苷、細胞毒性化療法、阿黴素(doxorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)、或天冬醯胺酶療法之受試者的禁忌。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會成為正在接受包含抗腫瘤劑之組合療法之受試者的禁忌。有些實施例中，抗腫瘤劑係選自：達卡巴嗪(dacarbazine)、順鉑(cis-platinum)、太莫西芬(tamoxifen)與干擾素-α。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不會在投藥後引起受試者之一或多種第4級不良事件。有些實施例中，第4級不良事件係選自：體溫過低；休克；心跳過緩；心室性期外收縮；心肌絕血；昏厥；出血；心房節律不整；靜脈炎；AV第二級傳導阻滯；心內膜炎；心包膜積水；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈疾患；口腔炎；噁心及嘔吐；肝臟功能檢驗異常；胃腸出血；吐血；帶血絲腹瀉；胃腸疾患；腸穿孔；胰臟炎；貧血；白血球減少；白血球增多症；低血鈣症；鹼性磷酸酶升高；血液尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白質態氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；躁動；神經病變；偏執反應；抽搐；大發作抽搐；譫妄症；氣喘、肺水腫；換氣過度；低氧；咯血；換氣不足；氣胸；瞳孔放大；瞳孔異常；腎功能異常；腎衰竭；及急性腎小管壞死。有些實施例中，對一群受試者投與IL-2接合物不會在投藥後在超過1%之受試者中引起一或多種第4級不良事件。有些實施例中，第4級不良事件係選自：體溫過低；休克；心跳過緩；心室性期外收縮；心肌絕血；昏厥；出血；心房節律不整；靜脈炎；AV第二級傳導阻滯；心內膜炎；心包膜積水；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈疾患；口腔炎；噁心及嘔吐；肝臟功能檢驗異常；胃腸出血；吐血；帶血絲腹瀉；胃腸疾患；腸穿孔；胰臟炎；貧血；白血球減少；白血球增多症；低血鈣症；鹼性磷酸酶升高；血液尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白質態氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；躁動；神經病變；偏執反應；抽搐；大發作抽搐；譫妄症；氣喘、肺水腫；換氣過度；低氧；咯血；換氣不足；氣胸；瞳孔放大；瞳孔異常；腎功能異常；腎衰竭；及急性腎小管壞死。
有些實施例中，對一群投與受試者IL-2接合物不會在投藥後在超過1%之受試者中引起一或多種不良事件，其中該一或多種不良事件係選自：十二指腸潰瘍；腸壞死；心肌炎；上心室心搏過速；因視神經炎繼發之永久或暫時性失明；暫時性腦缺血；腦膜炎；腦水腫；心包膜炎；過敏性間質性腎炎；氣管-食道瘻管。
有些實施例中，對一群受試者投與IL-2接合物不會在投藥後在超過1%之受試者中引起一或多種不良事件，其中該一或多種不良事件係選自：惡性高熱；心臟驟停；心肌梗塞；肺栓塞；中風；腸穿孔；肝或腎衰竭；造成自殺的嚴重抑鬱症；肺水腫；呼吸驟停；呼吸衰竭。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會刺激受試者之CD8+細胞。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會刺激受試者之NK細胞。該刺激可包括在例如：投藥後約4、5、6、或7天，或投藥後約1、2、3、或4週時增加受試者之CD8+細胞數。有些實施例中，CD8+細胞包括記憶 CD8+細胞。有些實施例中，CD8+細胞包括效應CD8+細胞。該刺激可包括在例如：投藥後約4、5、6、或7天，或投藥後約1、2、3、或4週時增加受試者中呈Ki67陽性之CD8+細胞之比例。該刺激可包括在例如：投藥後約4、5、6、或7天，或投藥後約1、2、3、或4週時，增加受試者之NK細胞數。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物後，CD8+細胞擴增至少1.5倍，如：至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、或1.9倍。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物後，NK細胞擴增至少5倍，如：至少5.5倍、6倍、或6.5倍。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物後，嗜酸性白血球擴增不超過約2倍，如：不超過約1.5倍、1.4倍、或1.3倍。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物後，CD4+細胞擴增不超過約2倍，如：不超過約1.8倍、1.7倍、或1.6倍。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物後，CD8+細胞及/或NK細胞之擴增不超過CD4+細胞及/或嗜酸性白血球之擴增。有些實施例中，CD8+細胞之擴增超過CD4+細胞之擴增。有些實施例中，NK細胞之擴增超過CD4+細胞之擴增。有些實施例中，CD8+細胞之擴增超過嗜酸性白血球之擴增。有些實施例中，NK細胞之擴增超過嗜酸性白血球之擴增。擴增倍數係相對於投與IL-2接合物之前所量測基線值來決定。有些實施例中，擴增倍數係在投藥後任何時間點決定，如：在投藥後約4、5、6、或7天，或投藥後約1、2、3、或4週。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會增加受試者之周邊CD8+ T與NK細胞數，不會增加受試者之周邊CD4+ 調節性T細胞數。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會增加受試者之周邊CD8+ T與NK細胞數，不會增加受試者之周邊嗜酸性白血球數。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物會增加受試者之周邊CD8+ T與NK細胞數，不會增加受試者之腫瘤內CD8+ T與NK細胞數且不會增加受試者之腫瘤內CD4+ 調節性T細胞數。
有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不需要利用到重症加護設施或心肺或重症加護醫學之相關技藝專家。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不需要利用到重症加護設施或心肺或重症加護醫學之相關技藝專家。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不需要利用到重症加護設施。有些實施例中，對受試者投與IL-2接合物不需要利用到心肺或重症加護醫學之相關技藝專家。
有些實施例中，投與IL-2接合物不會引起劑量限制性毒性。有些實施例中，投與IL-2接合物不會引起嚴重之細胞激素釋放症候群。有些實施例中，IL-2接合物不會誘發抗藥物抗體(ADA)，亦即對抗IL-2接合物之抗體。有些實施例中，由對抗PEG之抗體之直接免疫分析法及/或對抗IL-2接合物之抗體之ELISA 來決定沒有誘發ADA。若量測之ADA含量與基線(治療前)含量或與未處理對照組之含量沒有統計上顯著差異時，則該IL-2接合物被視為不會誘發ADA。 套組 / 製品
本文在某些實施例中揭示套組及製品，用於本文所說明一或多種方法及組成物。此等套組包括載劑、包裝、或容器，其可以分隔，以便容納一或多個容器，如：小瓶、管子、及類似物，各容器包含用於本文所說明方法之分開元素之一。合適之容器包括例如：大瓶、小瓶、針筒、及試管。一項實施例，容器係由各種不同材料形成，如：玻璃或塑膠。
套組通常包括列出內容物之標籤及/或使用說明書，及指示用法之包裝插頁。通常亦包括一組說明。
一項實施例中，標籤在容器上或與容器組合。一項實施例中，當形成標籤之字母、數字、或其他特徵係附貼、模塑或刻入容器本身時，標籤係在容器上；當標籤存在於亦容納容器之接收槽或載體中(例如：成為包裝插頁)時，標籤係與容器組合。一項實施例中，標籤係用於指示該內容物係用於特定醫療用途。標籤亦指示該內容物的使用方向，如：用在本文所說明之方法中。
某些實施例中，醫藥組成物係呈包裝或分配裝置，其包含一或多個含有本文所提供化合物之單位劑型。該包裝例如：包含金屬或塑膠箔，如：發泡包。一項實施中，包裝或分配裝置附隨投藥說明書。一項實施例中，包裝或分配裝置亦附隨與容器組合之通知單，其形式係由管理醫藥之製造、使用或販賣之政府機構所規定，該通知單反映該藥物形式已被當局核准用於人類或獸用投藥。此等通知單為例如：由美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration)核准用於藥物之標籤，或為核准產品之插頁。一項實施例中，亦製備在可相容之醫藥載劑中調配包含本文所提供化合物之組成物，置入適當容器中，並標示針對適應症之治療。 實例
提供此等實例僅供例示目的，並未限制本文所提供申請專利範圍。
實例1提供製備本文所說明IL-2接合物之示例性方法之詳細說明。 實例 1. 聚乙二醇基化 IL-2 接合物之製備
本實例提供製備本文所說明IL-2接合物之示例性方法之詳細說明。
用於生物接合之IL-2接合物係採用本文揭示之方法，在大腸桿菌( E. coli)中，呈包涵體表現，該方法使用：(a)表現質體，其編碼(i)具有所需胺基酸序列之蛋白質，該基因包含第一非天然鹼基對，在所需位置提供密碼子，供納入非天然胺基酸 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸 (AzK)，及(ii)衍生自馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)Pyl之tRNA，該基因包含第二非天然核苷酸，以提供相配之反密碼子來替代其原始序列；(b) 編碼巴氏甲烷八叠球菌( M. barkeri)所衍生吡咯烷基-tRNA合成酶( MbPylRS)之質體，(c) N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸 (AzK)；及(d)核苷酸三磷酸轉運子PtNTT2之截短變體，其中刪除全長度蛋白質之第一段65個胺基酸殘基。編碼所需IL-2 變體之胺基酸序列之雙股寡核苷酸在編碼具有SEQ ID NO：1之蛋白質之序列包含密碼子AXC作為密碼子64，其中P64被本文所說明非天然胺基酸置換。編碼來自馬氏甲烷八叠球菌( M. mazei)之正交 tRNA基因之質體包含AXC-相配反密碼子GYT 替代其原始序列，其中Y為本文所揭示非天然核苷酸。X與Y係選自本文所揭示非天然核苷酸dTPT3與dNaM。該表現之蛋白質先採用標準製程從包涵體中萃取及再摺疊後，由包含AzK之 IL-2產物採用DBCO-介導之無銅點擊化學進行位點特異性聚乙二醇基化，使mPEG部份基團與AzK進行穩定的共價附接。反應實例示於反應圖1與2 (其中n指示重覆之PEG單位數)。AzK部份基團與DBCO炔基部份基團之反應可產生一種位置異構性產物或位置異構性產物之混合物。 反應圖 1.
Figure 02_image165
反應圖 2.
Figure 02_image119
實例 2. 投與 IL-2 接合物 (24 μ g /kg 與 32 μ g /kg [Q3W]) 後之生物標記效應臨床試驗 第一組 - 使用 24 μ g /kg 劑量
進行試驗來分析活體內投與本文所說明IL-2接合物之免疫學效力特徵。IL-2接合物包含SEQ ID NO：2，其中位置64為AzK_L1_PEG30kD，其中AzK_L1_PEG30kD 之定義為式(IV)或式(V)結構式、或式(IV)與式(V)之混合物，及30 kDa之線性mPEG鏈。此IL-2接合物亦可稱為包含其中位置64已被式(IV)或式(V)結構式、或式(IV)與式(V)之混合物置換之SEQ ID NO：1及30 kDa之線性mPEG鏈之IL-2接合物。IL-2接合物亦可稱為包含其中位置64已被式(XII)或式(XIII)結構式、或式(XII)與式(XIII)之混合物置換之SEQ ID NO：1及30 kDa之線性mPEG鏈之IL-2接合物。該化合物所採用之製備方法中，先製備具有SEQ ID NO：1之蛋白質，其中位置64脯胺酸已被 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸 AzK置換。該包含AzK之蛋白質即可在點擊化學條件下，與包含甲氧基、平均分子量30kDa之線性PEG基團之DBCO反應，然後採用標準製程純化及調配。
IL-2接合物係經由IV輸注30分鐘，投與劑量24 μg/kg，每3週一次[Q3W]。分析對下列生物標記之效應，作為安全性及/或效力之替代指標： 嗜 酸性白血球增多(周邊嗜酸性白血球計數升高)：與血管滲漏症候群(VLS)相關之IL-2-誘發細胞(嗜酸性白血球)增生之細胞替代標記； 介 白素 5 (IL-5) ：IL-2誘發活化第2型先天性淋巴樣細胞及釋出此趨化物造成嗜酸性白血球增多症與潛在VLS之細胞激素替代標記； 介 白素 6 (IL-6) ：IL-2誘發細胞激素釋放症候群(CRS)之細胞激素替代標記；及 干擾素 γ (IFN- γ ) ：IL-2誘發活化CD8+ 細胞毒性T淋巴球之細胞激素替代標記。
分析對下列生物標記之效應，作為抗腫瘤免疫反應之替代指標： 周邊 CD8+ 效應細胞：IL-2-誘發此等周邊標靶細胞增生之標記，其在浸潤時轉變成誘發可能潛在醫療反應之替代標記； 周邊 CD8+ 記憶細胞：IL-2-誘發此等周邊標靶細胞增生之標記，其在浸潤時轉變成誘發可能持久潛在醫療反應並維持記憶族群之替代標記； 周邊 NK 細胞：IL-2-誘發此等周邊標靶細胞增生之標記，其在浸潤時轉變成誘發可能快速醫療反應之替代標記；及 周邊 CD4+ 調節細胞：IL-2-誘發此等周邊標靶細胞增生之標記，其在浸潤時轉變成誘發免疫壓制性TME並抵消以效應子為主之醫療效力之替代標記。
受試者為男性或女性人類，在篩選時之年齡≥18歲。所有受試者過去曾接受抗癌療法治療，且符合下列至少一項：依據NCI CTCAE v5.0，與治療相關之毒性已緩解至第0或1級(脫髮除外)；或依據NCI CTCAE v5.0，在先經過醫療監視器(Medical Monitor)核可下，與治療相關之毒性已緩解至至少第2級。最常見腫瘤為結腸直腸或黑色素瘤。
受試者亦符合下列標準：提出知情同意書。美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group)(ECOG)體能表現狀態為0或1。由研究者判斷預期壽命超過或等於12週。由組織學或細胞學確認診斷為晚期及/或轉移性實體腫瘤。受試者患有晚期或轉移性實體腫瘤且已拒絕標準照護法；或沒有可以提供臨床效益之合理照護標準；或標準療法已無法耐受、無效、或不可行。依據RECIST v1.1.適當實驗室參數之可量測疾病包括：絕對淋巴球計數 ＞0.5倍正常下限值；血小板計數 ＞100 x 10 9/L；血紅素 ＞9.0 g/dL (在2週內沒有生長因子或輸血；1週即足以洗清所投與之ESA與CSF)；絕對嗜中性白血球計數 ＞1.5 x 10 9/L (2周內沒有生長因子)；凝血酶原時間(PT)與部份凝血酶原時間 (PTT) ≤ 1.5倍正常上限值(ULN)；天冬胺酸胺基轉移酶(AST)與丙胺酸胺基轉移酶(ALT) ≤ 2.5倍ULN，除非若出現肝轉移，則可能為 ≤ 5倍ULN；總膽紅素 ≤ 1.5 x ULN。停經前婦女與停經後不到12個月之婦女在開始治療試驗之前的7天內血清妊娠檢驗應為陰性。
Q3W 投藥法。10位患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體(4位[40%]男性，8位[80%]白人)，其年齡中值為67.5歲，範圍在(37-78)，接受IL-2接合物，劑量為24 μg/kg Q3W，長達9個週期(每個循環一劑)。本實例2之第一組及全篇討論中，每kg受試者之藥物質量(例如：24 μg/kg)係指IL-2質量， 不包括 PEG 與連接子的質量。
一位在初次掃瞄時具有部份反應之受試者在第二次與第三次掃瞄(曝露到PD-1之前)時證實持續6+個月；五位受試者開始出現疾病穩定(在6週時評估)，三位受試者在第一次評估時出現疾病惡化，及一位受試者因不良事件而退出治療。所有受試者在投藥後之CD8+ Ki67表現程度峰值均超過50百分比(50%-85%)。
一位患有未知起源之鱗狀細胞癌瘤之73歲男性受試者接受7個治療週期(24 µg/kg Q3W)，其亦已接受兩線全身性療法，包括抗-PD-1 (針對抗-PD-1之最佳反應：SD)，經過兩個週期後，顯示腫瘤縮小31%。已在帶有免疫敏感性腫瘤之其他患者中發現最大的腫瘤反應為腎細胞癌瘤 (RCC) (生長16%)與黑色素瘤 (在兩位受試者中觀察到生長10%；縮小2%；及縮小20%)。
周邊CD8+ T效應細胞擴增平均高於基線4.47倍。所有受試者均在投藥後出現升高之NK細胞 Ki67表現程度。受試者在投藥後之周邊NK細胞擴增峰值平均高於基線之7.67倍。
效力生物標記。量測周邊CD8+ T eff細胞計數( 圖 1A 至 B)。有些受試者在先前劑量後3週，觀察到CD8+比基線延長擴增(例如：變化超過或等於2倍)。亦量測表現Ki67之CD8+ T eff細胞百分比( 圖 2)。周邊CD8+記憶細胞計數示於 圖 16A 至 B。
周邊NK細胞計數示於 圖 3A 至 B。每位受試者均觀察到升高之NK細胞計數。亦量測表現Ki67之NK細胞百分比( 圖 4)。
周邊CD4+ T reg計數示於 圖 5A 至 B。亦量測表現Ki67之CD4+ T reg細胞百分比( 圖 6)。
量測嗜酸性白血球計數( 圖 7A 至 B)。該量測值升高未超過四倍，且一致低於Pisani 等人在 Blood1991 Sep 15；78(6):1538-44中針對患有IL-2誘發嗜酸性白血球增多症患者所報告之2328-15958個嗜酸性白血球/μL之範圍。亦量測IFN-γ、IL-5、與IL-6含量( 圖 8A 至 C)。該等量測值顯示已誘發IFN-γ，但分別誘發低量IL-5與IL-6，其等係與VLS及CRS相關之細胞激素，其中一位受試者例外，其在治療後(接受托珠單抗(tocilizumab)後)24小時之IL-6含量升高至約1100 pg/mL，但隨後即下降。
抗藥物抗體 (ADA)。處理組受試者在每一個投藥週期後取樣分析抗藥物抗體(ADA)。採用直接免疫分析法檢測抗-聚乙二醇自體抗體(檢測限值：36 ng/mL)。採用標記型IL-2接合物進行橋接MesoScale Discovery ELISA (bridging MesoScale Discovery ELISA)，檢測限值為4.66 ng/mL。此外，以基於細胞之分析法，使用CTLL-2細胞株，讀取STAT5磷酸化結果，分析對抗IL-2接合物之中和抗體(檢測限值：6.3 μg/mL) 。
從兩位接受5個投藥週期之受試者及一位接受4個投藥週期之受試者中，在每個投藥週期後收集樣本及分析。在定性分析期間，決定分析法特定之截斷點，作為達到陰性比例為1.09或更高(針對IL-2接合物ADA分析法)及2.08(針對PEG ADA分析法)時之訊號。在IL-2接合物分析法中呈陽性或沒有定論結果之樣本則進行確認試驗，其中在確認緩衝液(10 μg/mL IL-2接合物含於阻斷溶液中)之存在或不存在下分析樣本與對照組。在PEG分析法中呈陽性或沒有定論結果之樣本則進行確認試驗，其中在確認緩衝液(10 μg/mL IL-2接合物含於6%馬血清中)之存在或不存在下分析樣本與對照組。若樣本之吸光訊號受到的抑制程度等於或大於檢測步驟中之定性分析期間所決定之分析法特定截斷點(針對IL-2接合物之14.5% 或針對PEG之42.4%)時，則認為係「確認」之結果。沒有檢測到對抗IL-2接合物或PEG之確認ADA(未出示數據)。
結果綜合說明；討論。所有試驗之受試者在投藥後一個或多個時間點之CD8+ Ki67表現程度均超過50% (50%-85%)並擴增周邊CD8+ T 效應 (Teff)細胞。所有試驗之受試者在投藥後一個或多個時間點之NK細胞 Ki67表現程度均超過50% (50%-100%)並擴增周邊NK細胞。IL-5含量沒有顯著升高，且在第3天IL-6含量升高之受試者在隔日即下降。任何一位試驗之受試者均沒有誘發ADA。
AE為臨床研究受試者在接受投與醫藥產品後，不論因果歸因所發生之任何不要之醫學事件。劑量限制性毒性之定義為在治療週期第1天至第29天(含第29天) ±1天期間發生之AE，其並非一定或無疑地僅與外擾因素相關，且符合至少一項下列標準： •         第3級嗜中性白血球減少(絕對嗜中性白血球計數＜ 1000/mm 3＞ 500/mm 3) 持續 ≥ 7 天，或第4級嗜中性白血球減少持續任何時間期 •         第3級+發熱嗜中性白血球減少 •         第4級+血栓併血小板低下 (血小板計數＜ 25,000/mm 3) •         第3級+ 血栓併血小板低下 (血小板計數＜ 50,000-25,000/mm 3) 持續 ≥ 5天，或與臨床上顯著出血相關或需要輸注血小板 •         無法在10天內恢復符合絕對嗜中性白血球計數為至少1,000個細胞/mm 3及血小板計數為至少75,000個細胞/mm 3之標準 •         任何其他第4級+ 血液毒性持續 ≥ 5天 •         第3級+ ALT或AST組合膽紅素 ＞ 2倍ULN，沒有膽汁鬱積或另一種肇因如：病毒感染或其他藥物的證據(亦即海氏法則(Hy’s law)) •         第3級術前用藥發生之輸注相關反應；第4級輸注相關反應 •         第3級血管滲漏症候群，其定義為與體液積聚及肺水腫相關之低血壓 •         第3級+ 過敏性休克 •         第3級+ 低血壓 •         第3級+ 在開始採行可接受之標準醫學照護法處理後，無法在7天內緩解成＜ 2級之AE •         第3級+ 細胞激素釋放症候群 下列例外適用於非血液AE： •         第3級疲倦、噁心、嘔吐、或腹瀉，在採行最佳醫學處理≤ 3天緩解成≤ 2級 •         第3級發燒 (其定義為 ＞ 40°C 持續 ≤ 24小時) •         第3級未曾術前用藥下發生之輸注相關反應；後續劑量應使用術前用藥，且若反復出現反應，則為DLT •         第3級關節痛或皮疹，在開始採行可接受之標準醫學照護法(例如：全身性皮質類固醇療法)處理7天內緩解成≤ 2級 若受試者在基線即出現第1或2級ALT或AST升高，則視為間接歸因於肝轉移，第3級升高則亦必需≥ 3倍基線並持續 ＞ 7天。
嚴重AE之定義為造成以下任何後果之任何AE：死亡；威脅生命之AE；病人住院或延長目前住院；持續或顯著之失能或執行日常生活功能的能力已實質瓦解；或認知力異常/出生缺陷。可能不會造成死亡、可能威脅生命、或需要住院之重要醫學事件即可依據適當醫學判斷視為嚴重事件，其等可能危及受試者，可能需要醫學或手術干預，以防止上述一種後果發生。此等醫學事件實例包括需要進急診室或在家裡加護治療之過敏性支氣管痙攣、不會導致病人住院之血液惡病質或抽搐、或發展出藥物依賴性或藥物濫用。
沒有報告劑量限制性毒性。沒有累積毒性。有兩位治療相關SAE(1位G3急性腎損傷及1位G4 細胞激素釋放症候群)，其等已接受標準照護法緩解。總體而言，IL-2接合物可視為耐受性良好。
所有受試者均出現至少一種因治療出現之AE (TEAE)。TEAE詳細說明於表1。沒有TEAE為第5級。兩位受試者出現第3級事件，及三位受試者出現第4級事件。第3級事件包括：1位ALT/AST升高，1位嗜中性白血球計數下降，及1位急性腎損傷。第4級事件包括：1位CRS，1位淋巴球計數增加，及2位淋巴球計數下降。 表 1. 因治療出現之不良事件 (TEAE)
不良事件 (PT) ， n (%) 頻率 (N=10)
貧血 4 (40%)
類似流感之病態 6 (60%)
發熱 7 (70%)
畏寒 4 (40%)
疲倦 4 (40%)
噁心 6 (60%)
嘔吐 4 (40%)
ALT升高 4 (40%)
AST升高 6 (60%)
食慾下降 4 (40%)
低血磷 4 (40%)
淋巴球計數下降 6 (60%)
低血壓 2 (20%)
TEAE主要由類似流感症狀、噁心、或嘔吐組成。採用可接受之標準照護法緩解TEAE。與治療相關之AE為暫時性。發燒、低血壓、及低氧之AE係與IL-5/IL-6 細胞激素升高沒有相關性。一位受試者在24小時時之IL-6上升至1000 pg/mL (托珠單抗(tocilizumab)治療後)，其經過72小時降至100 pg/mL以下。對生命徵兆沒有顯著影響，沒有延長之QTc、或其他心臟毒性。
因此，IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。已測定IL-2接合物之活體內半衰期為約10小時。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。 第二組 - 使用 32 μ g /kg 劑量
延伸進行上述試驗，經由IV輸注30分鐘，於活體內投與IL-2接合物，劑量32 μg/kg，每3週一次[Q3W]，來分析免疫學效力特徵。分析對實例2所說明相同生物標記之效應，作為安全性及/或效力之替代指標。
此第二組之受試者符合實例2中受試者之相同標準。腫瘤型態包括子宮頸、結腸直腸、胰臟、與肉瘤。
Q3W 投藥法。6位患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體(5位[83.3%]男性，4位[66.7%]白人)接受IL-2接合物，劑量為32 μg/kg，Q3W (每個週期一劑)。本實例2之第二組及全篇討論中，每kg受試者之藥物質量(例如：32 μg/kg)係指IL-2質量， 不包括 PEG 與連接子質量。
效力生物標記。量測周邊CD8+ T eff細胞計數( 圖 10A 至 B)。有些受試者在3週時觀察到CD8+比基線延長擴增(例如：變化超過或等於4倍)。周邊CD8+記憶細胞計數示於 圖 14A 至 B。
周邊NK細胞計數示於 圖 11A 至 B 。每位受試者均觀察到升高之 NK細胞計數。
周邊CD4+ T reg計數示於 圖 12A 至 B。
量測嗜酸性白血球計數( 圖 13A 至 B)。量測值升高未超過四倍，且一致低於Pisani 等人在 Blood1991 Sep 15；78(6):1538-44中針對患有IL-2誘發嗜酸性白血球增多症患者所報告之2328-15958個嗜酸性白血球/μL之範圍。
亦量測IFN-γ、IL-5、與IL-6含量( 圖 15)。量測值顯示已誘發IFN-γ，但分別誘發低量IL-5與IL-6，其等係與VLS及CRS相關之細胞激素，其中一位受試者例外，其在治療後4小時之IL-6含量升高至約700 pg/mL，但隨後即下降。
結果總結；討論。所有接受試驗之受試者均在投藥後擴增周邊CD8+ T 效應(Teff)細胞、CD8+記憶細胞、NK細胞、與CD4+ T reg細胞。IL-5含量並未顯著升高，第3天之IL-6含量升高之受試者，隔日即下降。
一位受試者在第一個週期第一天的第16小時及在第二個週期第一天的第9小時經歷發燒。第二位受試者在第一個週期中投藥後16小時出現血壓升高(162/9 mm Hg)。第三位受試者經歷兩次輸注反應。第一次為第一個週期第一天投藥後2.5小時的第1級反應。第二次為第二個週期第一天投藥後4小時的第3級反應。第一個週期第一天，第四位受試者經歷第一級CRS，包括發燒、寒顫及血壓下降(135/63降至106/61 mm Hg)。第五位患者經歷G2 CRS，包括發燒與低血壓，已採用補液(hydration)及地塞美松(dexamethasone)處理。後來發展出之G3轉胺酶升高則採用地塞美松治療。經歷第二次G2CRS發作之C2D1受試者，已採用類固醇及補液處理。
總言之，所有6位受試者均出現至少一種因治療出現之AE (TEAE)。TEAE詳細說明於表2。沒有出現第4或5級TEAE。兩位患者出現第2級TEAE。四位患者出現第3級TEAE。 表 2. 因治療出現之不良事件 (TEAE) ： n = 6
系統器官分類 第 1 級 第 2 級 第 3 級 第 4 級 第 5 級
一般疾患及投藥部位病況 1/6 (16.7%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0% 0/6 (0%) 0/6 (0%)
胃腸疾患 2/6 (33.3%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
檢查 0/6 (0%) 2/6 (33.3%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
免疫系統疾患 1/6 (16.7%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
感染與傳染 0/6 (0%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
損傷、醫療處置造成的併發症 0/6 (0%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
神經系統疾患 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
皮膚與皮下組織疾患 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
代謝與營養疾患 1/6 (16.7%) 1/6 (16.7%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
呼吸、胸椎與縱膈疾患 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
肌肉骨骼與結締組織疾患 4/6 (66.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
精神疾患 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
血管疾患 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
兩位患者出現第2級治療相關AE(兩位均發熱)。四位患者出現第3級治療相關AE：1位輸注反應，1位轉胺酶升高(亦使用地塞美松(dexamethasone)治療第2級 CRS發燒及低血壓)，1位低血鈣及1位低血磷(亦於週期 2第1天出現第1級 CRS，發燒、畏寒及BP從135/62降至106/61 mm Hg)。TRAE詳細說明於表3。 表 3. 治療相關不良事件： n = 6
系統器官分類 第 1 級 第 2 級 第 3 級 第 4 級 第 5 級
一般疾患及投藥部位病況 1/6 (16.7%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
胃腸疾患 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
免疫系統疾患 1/6 (16.7%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
檢查 0/6 (0%) 2/6 (33.3%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
損傷、醫療處置造成的併發症 0/6 (0%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
代謝與營養疾患 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
肌肉骨骼與結締組織疾患 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
神經系統疾患 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
皮膚與皮下組織疾患 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
兩位患者出現SAE：一位患者出現第1級CRS (發燒、畏寒及BP從135/62降至106/61 mm Hg)，需要住院，但已採用補液及置換電解質處理。另一位患者在第一週期出現第3級轉胺酶升高，及在週期1與2均出現第2級 CRS(發燒與低血壓)，已使用地塞美松(dexamethasone)處理。
一位發生DLT，係與輸注相關之反應，需要降低劑量。雖然沒有因TEAE而停藥，但一位患者因TEAE (G3輸注反應)而降低劑量。沒有受試者出現過敏性休克。
採用可接受之標準照護法緩解與治療相關之AE。IL-5沒有顯著升高，沒有累積毒性、沒有終端器官毒性、及沒有與G3 高血壓及G4淋巴球減少相關之QTc延長或其他心臟毒性。因此IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。PK數據(表4)符合IL-2接合物之活體內半衰期為約10小時之結果。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。
PK分析中，取得受試者之樣本，以隨時間測定血液中藥物濃度。表4報告週期1與2所量測血液濃度之平均值與標準偏差。 表 4. 濃度相對於時間之綜合說明
週期 標稱時間 (hr) N 平均值 標準偏差
1 0.0 0 BLQ N/A
0.5 6 561 237
1.0 6 547 230
2.0 6 516 162
4.0 6 405 154
8.0 6 303 95.8
12.0 6 259 38.0
24.0 6 168 34.0
48.0 6 64.1 29.2
72.0 6 16.7 14.4
168.0 1 1.01 N/A
2 0.0 0 BLQ N/A
0.5 4 338 180
1.0 4 376 234
2.0 4 336 156
4.0 4 280 88.6
8.0 4 219 62.1
12.0 3 180 35.2
24.0 4 115 37.3
48.0 3 24.2 7.05
72.0 2 2.97 N/A
實例 3. 對食蟹 獼猴投與 IL-2 接合物
進行一項使用食蟹獼猴之試驗來檢視投與本文所說明IL-2接合物對多種不同細胞族群之效應。特定言之，採用實例2所說明IL-2接合物探討對CD8+ T eff細胞、CD4+ T reg細胞、嗜酸性白血球細胞、白血球細胞、與淋巴球細胞族群之效應。該試驗使用未經過處理之雄性食蟹獼猴進行。於第1、8、與15天經靜脈內投與三個週劑量之IL-2接合物，0.03、0.1、0.3、或1 mg/kg。於第-4天(投藥前取樣)及每劑後不同時間點收集血樣(參見圖 9A 至 C)。
分析血液樣本中，細胞子群之藥效學(PD)讀數。其中已量測PD讀數之細胞子群包括CD8+ T eff細胞、CD4+ T reg細胞、嗜酸性白血球細胞、白血球細胞、與淋巴球細胞。
投與劑量30、100、300、與1000 µg/kg之IL-2接合物會促進CD8+ T eff細胞擴增( 圖 9A)。投與高達劑量1000 µg/kg之IL-2接合物對周邊CD4+ T reg細胞擴增之影響很小至無影響( 圖 9B)。
此外，量測投與300 µg/kg之IL-2接合物後之嗜酸性白血球細胞、白血球細胞、與淋巴球細胞之細胞計數( 圖 9C)。食蟹獼猴在投與IL-2接合物後沒有觀察到血管滲漏症候群(VLS)徵兆。 實例 4. 投與 IL-2 接合物 (8 、 16 、與 24 μ g /kg [Q2W]) 後之生物標記效力臨床試驗
進行試驗來分析活體內投與實例2所採用IL-2接合物之免疫學效力特徵。IL-2接合物係經由IV輸注30分鐘，投與劑量8、16、或24 μg/kg，每2週一次[Q2W]。分析對實例2所說明相同生物標記之效應作為安全性及/或效力之替代指標。此等試驗之受試者符合實例2中受試者之相同標準。 第 1 組 - 使用 8 μg/kg劑量 ([Q2W])
四位患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體(4位[100%]男性，0位[0%]女性，白人，年齡中值64歲，範圍為49-70歲)接受IL-2接合物，劑量8 μg/kg，Q2W (每個週期1劑)。腫瘤型態包括結腸直腸、胰臟、與肉瘤。本實例4之各組及全篇討論中，每kg受試者之藥物質量(例如：8 μg/kg)係指IL-2質量， 不包括 PEG 與連接子質量。治療時間期為1.4-9.0個月(中值2.0個月)，受試者共接受4-20劑(中值5.0劑)。
其中三位受試者(75%) 經歷至少一種TEAE，均為第1級或第2級。沒有人因TEAE而停藥，沒有劑量限制性毒性。一位受試者因疾病惡化而死亡(第5級 AE)。沒有觀察到累積毒性、終端器官毒性、或QTc延長或其他心臟毒性。此外，IL-5沒有顯著升高。TEAE詳細說明於表5。 表 5. 因治療出現之不良事件 (TEAE) ， 8 μg/kg [Q2W] (n=4)
系統器官分類 第 1 級 第 2 級 第 3 級 第 4 級 第 5 級
一般疾患及投藥部位病況 0/4 (0%) 2/4 (50%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 1/4 (25%)
胃腸疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 2/4 (50%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
肝膽疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
檢查 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
感染與傳染 1/4 (25%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
損傷、醫療處置造成的併發症 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
神經系統疾患 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
皮膚與皮下組織疾患 2/4 (50%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
血管疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
血液與淋巴系統疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
代謝與營養疾患 1/4 (25%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
呼吸、胸椎與縱膈疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
腎與泌尿疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
肌肉骨骼與結締組織疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
心臟疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
免疫系統疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
精神疾患 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
產品問題 0/4 (0%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
效力生物標記。量測周邊CD8+ T eff細胞計數( 圖 17)，及周邊NK細胞計數示於 圖 18。周邊CD4+ T reg細胞計數示於 圖 19。周邊淋巴球細胞計數示於 圖 20 ，及周邊嗜酸性白血球細胞計數示於 圖 21。
經過1個與2個週期後之IL-2接合物平均濃度分別示於 圖 22A與 圖 22B。
細胞激素含量(IFN-γ、IL-6、與IL-5) 示於 圖 23。
因此，IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。 第二組 - 使用 16 μg/kg 劑量 ([Q2W])
四位患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體接受IL-2接合物，劑量16 μg/kg，Q2W (每個週期一劑)。腫瘤型態包括黑色素瘤、攝護腺、與結腸癌。
所有4位(100%)受試者均經歷至少一種TEAE；4位中有3位(75%)患者經歷至少一種第3-4級相關TEAE(1位第3級及2位第4級)。一位受試者經歷第3級淋巴球計數下降，及2位受試者經歷第4級淋巴球計數下降(一位出現第3級低血磷)；淋巴球計數下降持續2天。此等受試者沒有相關SAE(一位出現腸阻塞之不相關SAE)。沒有人因TEAE而停藥。沒有觀察到DLT。一位患者因疾病惡化阻止C2D1投藥而無法評估DLT。一位受試者在無症狀下顯示升高之IL-6 (1000 pg/mL)，可能為CRS。TEAE詳細示於表6。 表 6. 因治療出現之不良事件 (TEAE) ， 16 μg/kg [Q2W] (n=4)
系統器官分類 第 1 級 第 2 級 第 3 級 第 4 級 第 5 級
血液與淋巴疾患 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
胃腸疾患 2/4 (50%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
一般疾患與投藥病況 3/4 (75%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
免疫系統疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
檢查 1/4 (25%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 2/4 (50%) 0/4 (0%)
代謝與營養疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
肌肉骨骼與結締組織疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
精神疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
皮膚與皮下組織疾患 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%)
效力生物標記。量測周邊CD8+ T eff細胞計數( 圖 24)。CD8+擴增約2倍，類似第一組[Q2W](8 µg/kg劑量)觀察到之擴增。周邊NK細胞計數示於 圖 25。NK細胞擴增比第一組[Q2W](8 µg/kg劑量)高約1至20倍。周邊CD4+ T reg細胞計數示於 圖 26。周邊嗜酸性白血球細胞計數示於 圖 27。CD4+ T reg與嗜酸性白血球細胞之擴增類似第一組[Q2W](8 µg/kg劑量)之擴增。
細胞激素含量(IFN-γ、IL-6、與IL-5)示於 圖 28。
經過1個與2個週期後之IL-2接合物平均濃度分別示於 圖 29A與 圖 29B。
因此，IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。 第三組 - 使用 24 μg/kg劑量 ([Q2W])
三位患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體接受IL-2接合物，劑量16 μg/kg，Q2W (每個週期一劑)。腫瘤型態包括黑色素瘤與肺。
所有3位(100%)受試者經歷至少一種TEAE；3位中有2位(33.3%)受試者經歷至少一種第3-4級相關TEAE(2位第4級)。有兩例為第4級淋巴球計數下降 (一位受試者出現第1級轉胺酶升高及第1級TSH下降)。沒有DLT。亦沒有相關SAE。一位受試者需要維持劑量，以便接受治療特別關注之不良事件(COVID-19感染)，後來因PD結果而中斷IL-2接合物治療。沒有因TEAE而停藥。一位受試者因與IL-2接合物治療無關之GI出血(胃潰瘍)而維持C2D1之劑量。TEAE詳細說明於表7。 表 7. 因治療出現之不良事件 (TEAE) ， 24 μg/kg [Q2W] (n=3)
系統器官分類 第 1 級 第 2 級 第 3 級 第 4 級 第 5 級
胃腸疾患 2/3 (66%) 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
一般疾患與投藥病況 1/3 (33%) 2/3 (66%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
免疫系統疾患 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
感染與傳染 1/3 (33%) 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
損傷、中毒、及與醫療處置造成的併發症 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
檢查 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 2/3 (66%) 0/3 (0%)
代謝與營養疾患 1/3 (33%) 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
神經系統疾患 1/3 (33%) 1/3 (33%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
因此，IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。 實例 5. 投與 IL-2 接合物 (8 μ g /kg 與 16 μ g /kg [Q3W]) 後之生物標記效力臨床試驗
進行試驗來分析活體內投與實例2所採用IL-2接合物之免疫學效力特徵。IL-2接合物係經由IV輸注30分鐘，投與劑量8 μg/kg或16 μg/kg，每3週一次[Q3W]。分析對實例2所說明相同生物標記之效應，作為安全性及/或效力之替代指標。此等試驗之受試者符合實例2中受試者之相同標準。本實例5各組及全篇討論中，每kg受試者之藥物質量(例如：8 μg/kg)係指IL-2質量， 不包括 PEG 與連接子質量。 第 1 組： 8 μg/kg [Q3W] 投藥法
第1組(患有惡性實體腫瘤之個體)接受IL-2接合物，劑量8 μg/kg，Q3W，5個投藥週期。
四位初期疾病穩定之個體(在6週評估期；一位患者之腫瘤消退~12%)接受IL-2接合物治療。這四位受試者在投藥後之CD8+ Ki67表現程度均超過60%(65%-80%)。
測定第1組中4位個體之生物標記如下。周邊CD8+ T效應細胞擴增平均高於基線1.53倍；一位受試者高於基線2.1倍。所有四位受試者在投藥後之NK細胞 Ki67表現程度接近100%。所有四位受試者在投藥後之周邊NK細胞擴增，在第3天時平均高於基線3.9倍；一位受試者在第3天時高於基線5.0倍。從週期 1至週期2之PK參數沒有變化。前三位受試者中均未檢測到抗藥物抗體，其中兩位受試者一直量測到週期 5，一位受試者量測到週期 4。
在週期1與2期間，在投藥後1、2、3天時量測血清IFNγ、IL-6、與IL-5含量。其平均值與範圍示於表8。所有受試者均在投藥後1天觀察到該範圍之最高值。 表 8. 安全性 / 毒性生物標記 - 細胞激素綜合說明，第 1 組： Q3W ， 8 µg/kg
受試者 IFN γ pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜3.5 IL-6 pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜1.3 IL-5 pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜8.8
2001-0001 29.6 (BLQ-66.9) 2.6 (BLQ-6.5) BLQ (所有點均BLQ)
2001-0002 19.9 (3.7-90.4) 3.1 (1.33-11.6) BLQ (所有點均BLQ)
2001-0003 21.3 (5.6-53.5) 3.3 (BLQ-5.96) BLQ (所有點均BLQ)
2001-0004 38.1 (BLQ-60.8) 4 (BLQ-6.5) BLQ (所有點均BLQ)
所量測細胞激素含量圖解示於 圖 30。
Teachey 等人之 Cancer Discov .2016；6(6)；664–79已報告，在經過CAR-T細胞治療之急性淋巴母細胞白血病患者中，本試驗中所量測與嚴重細胞激素釋放症候群(CRS程度4或5)有關之三種細胞激素各數值高於非嚴重細胞激素釋放症候群(CRS程度0-3)。來自Teachey 等人，針對IFNγ、IL-6、與IL-5以中值(範圍)表示之數據再現於表9。 表 9. 與 CRS 程度 0-3 及 4-5 相關之 IFN γ 、 IL-6 、與 IL-5 含量報告
CRS 程度 IFN γ pg /mL IL-6 pg /mL IL-5 pg /mL
0-3 34.1 (2.14-8,233) 122 (0.40-20,892) 4.25 (0.39-264)
4-5 3,119 (160-15,482) 8,309 (580-102,476) 15.3 (1.71-333)
因此，表8與 圖 30中之結果與沒有嚴重CRS之結果相符。
IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。 第 2 組： 16 μg/kg [Q3W] 投藥
本實例報告3位患有惡性實體腫瘤之個體接受IL-2接合物，劑量16 μg/kg，Q3W至少2個週期之結果。第一劑後，一位受試者在投藥後之周邊CD8+ T 效應細胞擴增4.1倍；三位患者平均擴增2.2倍。所有三位受試者在投藥後第3天之周邊NK細胞擴增高於基線超過4倍；一位受試者高於基線11.4倍，平均7.2倍。
在週期1與2期間，在投藥後1、2、與3天量測血清IFNγ、IL-6、與IL-5含量。其平均值與範圍示於表10。在所指示之3位受試者中，在投藥後1天觀察到該範圍之最高值。 表 10. 安全性 / 毒性生物標記 - 細胞激素綜合說明，第 2 組： Q3W ， 16 µg/kg
受試者 IFN γ pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜3.5 IL-6 pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜1.3 IL-5 pg/mL 平均值 ( 範圍 ) BLQ＜8.8
1002-0005 91 (BLQ-349) 29.2 (3-114) BLQ (所有點均BLQ)
1004-0006 196.8 (BLQ-817) 21 (1.5-112) BLQ (所有點均BLQ)
1002-0007 190.1 (5.4-641) 62.5 (BLQ-153) BLQ (所有點均BLQ)
4 位受試者所量測細胞激素含量以圖解示於 圖 31。此等結果亦與沒有嚴重CRS之結果相符。
採用FACS與CBC量測第1-2組之嗜酸性白血球計數(圖 32A-D)。量測值一致低於Pisani 等人在 Blood1991 Sep 15；78(6):1538-44中針對患有IL-2誘發嗜酸性白血球增多症患者所報告之2328-15958個嗜酸性白血球/μL之範圍 。亦量測第1與2組之周邊淋巴球計數(圖 33A 至 D)。
第 1 與 2 組之效力生物標記。量測第1與2組之周邊CD8+ T eff計數(圖 34A-D)。有些受試者在先前劑量後3週，觀察到CD8+比基線延長擴增(例如：變化超過或等於2倍)。亦量測第1與2組中表現Ki67之CD8+ T eff細胞百分比(圖 35A 至 B)。
周邊記憶CD8+計數示於圖 36A 至 B。周邊NK細胞計數示於圖 37A 至 D。有些受試者在先前劑量後3週，觀察到NK細胞比基線延長擴增(例如：變化超過或等於5倍)。亦量測第1與2組中表現Ki67之NK細胞百分比(圖 38A 至 B)。
第1與2組之周邊CD4+ T reg計數示於圖 39A 至 B。亦量測第1與2組中表現Ki67之CD4+ T reg細胞百分比(圖 40A-B)。
結果綜合說明；討論。如上述討論接受8 µg/kg劑量之受試者在投藥後之CD8+ Ki67表現程度超過60% (65%-80%)，周邊CD8+ T 效應(Teff)細胞擴增平均高於基線1.53倍。所有4位受試者在投藥後之NK細胞 Ki67表現程度亦接近100%，在第3天之周邊NK細胞擴增平均高於基線3.9倍。如上述討論接受16 µg/kg劑量之3位受試者中，1位在第7天之投藥後周邊CD8+ Teff細胞擴增高於基線4.1倍；3位受試者平均擴增2.2倍。沒有觀察到抗藥物抗體 (IL-2或PEG)，且IL-5與IL-6含量沒有顯著升高。此外，從週期 1至週期2之PK數據未指示AUC下降(未出示數據)。
任一劑量均未報告劑量限制性毒性，且沒有報告會造成中斷之治療相關不良事件(TRAE)或治療相關嚴重AE。
10位接受Q3W之8或16 µg/kg劑量之受試者之TEAE已詳細示於表11。沒有TEAE為第5級。兩位受試者具有第4級事件(一位AST升高，及一位淋巴球計數下降)。一位受試者具有第3級事件 (AST升高)。 表 11.
不良事件 (PT) ， n (%) 頻率 (N=10)
貧血 1 (10%)
類似流感之病態 7 (70%)
發熱 3 (30%)
畏寒 3 (30%)
疲倦 1 (10%)
噁心 5 (50%)
嘔吐 7 (70%)
ALT升高 2 (20%)
AST升高 2 (20%)
食慾下降 1 (10%)
低血磷 1 (10%)
淋巴球計數下降 1 (10%)
低血壓 2 (20%)
TEAE主要由類似流感症狀、噁心、或嘔吐組成。採用可接受之標準照護法緩解TEAE。與治療相關之AE為暫時性。發燒、低血壓、及低氧之AE係與IL-5/IL-6 細胞激素升高沒有相關性。對生命徵兆沒有顯著影響，沒有延長之QTc、或其他心臟毒性。因此，IL-2接合物證實令人鼓舞的PD數據，且一般耐受性良好。已測定IL-2接合物之活體內半衰期為約10小時。總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患有免疫敏感性腫瘤之患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。
所選個體之結果。一位患有攝護腺腺癌瘤之受試者接受10個週期之Q3W 16 µg/kg劑量，並顯示疾病穩定(在2個週期後下降24%)。此受試者在第10個週期後因PSA上升而退出治療。
一位患有非小細胞肺癌之受試者接受至少6個週期之Q3W 16 µg/kg劑量，並顯示疾病穩定(在5個週期後下降17.9%)。
抗藥物抗體 (ADA)。處理組受試者在每一個投藥週期後取樣分析抗藥物抗體(ADA)。採用直接免疫分析法檢測抗-聚乙二醇自體抗體(檢測限值：36 ng/mL)。採用標記型IL-2接合物進行橋接MesoScale Discovery ELISA (bridging MesoScale Discovery ELISA)，檢測限值為4.66 ng/mL。此外，以基於細胞之分析法，使用CTLL-2細胞株，讀取STAT5磷酸化結果，分析對抗IL-2接合物之中和抗體(檢測限值：6.3 μg/mL)。
從兩位接受5個投藥週期之受試者及一位接受4個投藥週期之受試者中，在每個投藥週期後收集樣本。在定性分析期間，決定分析法特定之截斷點，作為達到陰性比例為1.09或更高(針對IL-2接合物ADA分析法)及2.08(針對PEG ADA分析法)時之訊號。在IL-2接合物分析法中呈陽性或沒有定論結果之樣本則進行確認試驗，其中在確認緩衝液(10 μg/mL IL-2接合物含於阻斷溶液中)之存在或不存在下分析樣本與對照組。在PEG分析法中呈陽性或沒有定論結果之樣本則進行確認試驗，其中在確認緩衝液(10 μg/mL IL-2接合物含於6%馬血清中)之存在或不存在下分析樣本與對照組。若樣本之吸光訊號等於或大於檢測步驟中之定性分析期間所決定之分析法特定截斷點(針對IL-2接合物之14.5% 或針對PEG之42.4%)時，則認為係「確認」之結果。沒有檢測到對抗IL-2接合物或PEG之確認ADA(未出示數據)。 實例 6. IL-2 接合物 (40 μ g /kg [Q3W]) 投藥後之生物標記效應臨床試驗
進行試驗來分析活體內投與實例2所採用IL-2接合物之免疫學效力特徵。IL-2接合物係經由IV輸注30分鐘，投與劑量40 μg/kg，每3週一次[Q3W]。分析對實例2所說明相同生物標記之效應，作為安全性及/或效力之替代指標。此等試驗之受試者符合實例2中受試者之相同標準。本實例6之各組及全篇討論中，每kg受試者之藥物質量(例如：40 μg/kg)係指IL-2質量， 不包括 PEG 與連接子質量。
該試驗設計係以40 μg/kg劑量之IL-2接合物Q3W投與6位患有惡性晚期或轉移性實體腫瘤之個體。已取得其中4位受試者之結果，數據出示如下。
有關受試者之TEAE 之數據綜合說明於表12。 表 12. 因治療出現之不良事件 (TEAE) ， 40 μg/kg [Q3W] (n=4)
主要系統器官分類 佔 多數之名詞 n (%) 所有等級 分級 ≥ 3
參試者中出現TEAE之人數 4 (100) 3 (75.0)
感染與傳染 1 (25.0) 1 (25.0)
單純疱疹 0 0
泌尿道感染 1 (25.0) 1 (25.0)
血液與淋巴系統疾患 1 (25.0) 0
淋巴球減少 0 0
嗜中性白血球減少 0 0
活化蛋白質C抗性 1 (25.0) 0
貧血 0 0
缺鐵性貧血 0 0
血栓併血小板低下 0 0
血小板增多症 0 0
免疫系統疾患 2 (50.0) 0
細胞激素釋放症候群 2 (50.0) 0
代謝與營養疾患 1 (25.0) 0
低血鎂症 1 (25.0) 0
低血磷症 1 (25.0) 0
低血鈣症 0 0
食慾下降 0 0
脫水 0 0
食慾異常 0 0
低白蛋白血症 0 0
低血鉀症 0 0
精神疾患 0 0
失眠 0 0
神經系統疾患 1 (25.0) 0
頭暈 0 0
頭痛 0 0
味覺障礙 1 (25.0) 0
平衡障礙 0 0
注意力紊亂 0 0
心臟疾患 2 (50.0) 0
心搏過速 2 (50.0) 0
竇性心搏過速 0 0
心房纖維性顫動 0 0
心悸 0 0
心室心律不整 0 0
血管疾患 2 (50.0) 0
低血壓 2 (50.0) 0
潮紅 1 (25.0) 0
高血壓 0 0
呼吸、胸椎與縱膈疾患 1 (25.0) 0
咳嗽 1 (25.0) 0
呼吸速迫 0 0
呼吸困難 0 0
運動性呼吸困難 0 0
低氧 0 0
端坐呼吸 0 0
喘鳴 0 0
胃腸疾患 2 (50.0) 1 (25.0)
噁心 1 (25.0) 0
嘔吐 2 (50.0) 1 (25.0)
腹瀉 2 (50.0) 0
口乾 0 0
上腹部疼痛 0 0
              黏膜炎 0 0
皮膚與皮下組織疾患 1 (25.0) 0
多汗 0 0
搔癢 0 0
皮疹 0 0
丘疹斑塊狀紅疹 0 0
脫髮 0 0
皮膚乾燥 0 0
夜間盜汗 0 0
肢端紅腫症候群 1 (25.0) 0
肌肉骨骼與結締組織疾患 0 0
肌肉痛 0 0
關節痛 0 0
關節腫大 0 0
腎與泌尿疾患 0 0
急性腎損傷 0 0
一般疾患及投藥部位病況 2 (50.0) 1 (25.0)
發熱 2 (50.0) 1 (25.0)
類似流感之病態 0 0
畏寒 1 (25.0) 0
疲倦 0 0
疼痛 0 0
檢查 3 (75.0) 3 (75.0)
淋巴球計數下降 2 (50.0) 2 (50.0)
丙胺酸胺基轉移酶升高 1 (25.0) 0
天冬胺酸胺基轉移酶升高 1 (25.0) 0
血小板計數下降 0 0
血液鹼性磷酸酶升高 0 0
血液膽紅素升高 1 (25.0) 1 (25.0)
轉胺酶升高 0 0
γ-麩胺醯基轉移酶升高 0 0
嗜中性白血球計數下降 0 0
血液肌酸酐升高 0 0
血液葡萄糖升高 0 0
血液乳酸脫氫酶升高 0 0
血鈉下降 0 0
血液甲狀腺刺激激素下降 0 0
肝功能檢驗異常 0 0
肝功能檢驗升高 0 0
淋巴球計數升高 0 0
白血球細胞計數下降 0 0
損傷、中毒、及與醫療處置造成的併發症 0 0
輸注相關反應 0 0
沒有出現劑量限制性毒性，且沒有因AE而中斷。
接受劑量範圍8至40 μg/kg之IL-2接合物之受試者在周邊血液樣本中出現升高之CD8 +T-效應細胞，但CD4 +T-調節細胞則未升高(圖 41A 至 B)。 圖 41C顯示接受劑量範圍8至40 μg/kg之IL-2接合物之受試者在周邊血液樣本中出現升高之NK細胞。
總體而言，該等結果可視為支持IL-2接合物之非-α優先活性，在患者中具有可耐受之安全性型態、令人鼓舞的PD、及活性之初步證據。
雖然本文已出示及說明本發明較佳實施例，但習此相關技藝者咸了解，此等實施例僅供舉例。彼等習此相關技藝者可以在不偏離本揭示內容下進行許多種變化、改變、及取代。應咸了解，可採用本文所說明本發明實施例之不同替代選項來操作本發明。計畫在下列申請專利範圍中界定本發明範圍及此等申請專利範圍內之方法與結構式及其等所涵蓋之同等物。本文所摘錄所有專利案與科學文獻之完整揭示內容已以全文引用方式併入本文中。若任何引用之材料與本揭示所表達內容程度不一致時，以本表達內容為準。
無
本發明之各種不同態樣已特別說明於附錄之申請專利範圍中。將可參考下文利用本發明原理之例示性實施例之詳細說明及下列附圖，更了解本發明之特色及優點：
圖 1A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff計數之變化。此時及其他內容中，如：「C1D1」之代號係表示治療週期與治療日(例如：治療週期1，第1天)。「PRE」表示在投藥前之基線量測值；24HR指示投藥後 24小時；及依此類推。
圖 1B顯示投與第一劑24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之周邊CD8+ T eff細胞擴增峰值。數據已經過處理前(C1D1) CD8+ T細胞計數標準化。
圖 1C顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff細胞計數。
圖 2顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67之CD8+ T eff細胞之百分比。
圖 3A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數之變化。
圖 3B顯示投與第一劑24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之周邊NK細胞擴增峰值。數據已經過處理前(C1D1)NK細胞計數標準化。
圖 3C顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數之變化。
圖 3D顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數。
圖 4顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67之NK細胞百分比。
圖 5A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg計數之變化。
圖 5B顯示投與第一劑24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之周邊CD4+ T reg細胞擴增峰值。數據已經過處理前(C1D1)CD4+ T細胞計數標準化。
圖 5C顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg細胞計數。
圖 6顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67之CD4+ T reg細胞百分比。
圖 7A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之嗜酸性白血球細胞計數之變化。
圖 7B顯示投與第一劑24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之周邊嗜酸性白血球細胞擴增峰值。數據已經過處理前(C1D1)嗜酸性白血球細胞計數標準化。
圖 7C顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之嗜酸性白血球細胞計數。
圖 8A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之IFN-γ、IL-5、與IL-6之血清含量。
圖 8B顯示投與24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之IL-5之血清含量。BLQ = 低於定量限值。數據係以平均值作圖(範圍從BLQ至最大值)。
圖 8C顯示投與24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物後之IL-6之血清含量。BLQ = 低於定量限值。數據係以平均值作圖(範圍從BLQ至最大值)。
圖 9A顯示對食蟹獼猴投與30 µg/kg、100 µg/kg、300 µg/kg、與1000 µg/kg之IL-2接合物後之CD8+ T eff細胞擴增。
圖 9B顯示投與30 µg/kg、100 µg/kg、300 µg/kg、與1000 µg/kg之IL-2接合物後之周邊CD4+ T reg細胞之最小擴增。
圖 9C顯示投與300 µg/kg之IL-2接合物後之嗜酸性白血球、白血球細胞、與淋巴球之細胞計數。
圖 10A顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff計數變化。
圖 10B顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff細胞計數。
圖 11A顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數變化。
圖 11B顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數。
圖 12A顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg計數變化。
圖 12B顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg細胞計數。
圖 13A顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之嗜酸性白血球細胞計數變化。
圖 13B顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之嗜酸性白血球細胞計數。
圖 14A顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之CD8+記憶細胞計數變化。
圖 14B顯示接受32 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之CD8+記憶細胞計數。
圖 15顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之IFN-γ、IL-5、與IL-6 含量。
圖 16A顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之CD8+記憶細胞計數變化。
圖 16B顯示接受24 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之CD8+記憶細胞計數。
圖 17顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff細胞計數變化。
圖 18顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊NK細胞計數變化。
圖 19顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg細胞計數變化。
圖 20顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊淋巴球細胞計數變化。
圖 21顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊嗜酸性白血球細胞計數變化。
圖 22A與 圖 22B顯示接受投與8 µg/kg [Q2W]之指定受試者分別在經過1個週期及2個週期後，在投藥後之指定時間之IL-2接合物平均濃度。
圖 23顯示接受8 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之IFN-γ、IL-6、與IL-5含量。
圖 24顯示接受16 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff細胞計數變化。
圖 25顯示接受16 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊NK細胞計數變化。
圖 26顯示接受16 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg細胞計數變化。
圖 27顯示接受16 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊嗜酸性白血球細胞計數變化。
圖 28顯示接受16 µg/kg [Q2W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之IFN-γ、IL-6、與IL-5含量。
圖 29A與 圖 29B顯示接受投與16 µg/kg [Q2W]之指定受試者分別在經過1個週期及2個週期後，在投藥後之指定時間之IL-2接合物平均濃度。
圖 30顯示接受8 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之指定細胞激素之血清含量。
圖 31顯示接受16 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之指定細胞激素之血清含量。
圖 32A 至 D顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之嗜酸性白血球細胞計數，係採用細胞儀或CBC(全血細胞計數)量測。
圖 33A 至 D顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之淋巴球計數。
圖 34A 至 D顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD8+ T eff計數。
圖 35A 至 B顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67之CD8+ T eff細胞百分比。
圖 36A 至 B顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊記憶CD8+計數。
圖 37A 至 D顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊天然殺手(NK)細胞計數。
圖 38A 至 B顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67 之NK細胞百分比。
圖 39A 至 B顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之周邊CD4+ T reg計數。
圖 40A 至 B顯示接受8 µg/kg [Q3W]或16 µg/kg [Q3W]處理之指定受試者在投與IL-2接合物後之指定時間之表現Ki67之CD4+ T reg細胞百分比。
圖 41A顯示接受8-40 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之受試者之周邊CD8+ T eff細胞計數變化。
圖 41B顯示接受8-40 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之受試者之周邊CD4+ T reg細胞計數變化。
圖 41C顯示接受8-40 µg/kg [Q3W]之IL-2接合物處理之受試者之周邊天然殺手(NK)細胞計數變化。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 110137589-A0101-11-0002-1

Claims (70)

  1. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  2. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  3. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與，其為約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  4. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  5. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  6. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  7. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  8. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  9. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  10. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  11. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  12. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中PEG具有分子量約30 kDa。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2 包含胺基酸序列SEQ ID NO：2，其中[AzK_L1_PEG30kD]為具有式(XVI)或式(XVII)結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image039
    式(XVI)；
    Figure 03_image041
    式(XVII)； 其中： m為2； n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約30 kDa之整數；及 波浪線代表SEQ ID NO：2中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物。
  16. 如請求項15之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中式(IA)結構式為具有式(XVI)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物與其中式(IA)結構式為具有式(XVII)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物。
  17. 如請求項1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中式(IA)結構式具有式(IVA)或式(VA)結構式：
    Figure 03_image043
    式(IVA)；
    Figure 03_image045
    式(VA)； 其中： W為具有平均分子量約25 kDa - 35 kDa之PEG基團；及 q為1、2、或3。
  18. 如請求項17之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物，且該醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中式(IA)結構式為具有式(IVA)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物與其中式(IA)結構式為具有式(VA)結構式之L-胺基酸之IL-2接合物。
  19. 如請求項1至13中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中胺基酸位置64具有式(XIIA)或(XIIIA)結構式：
    Figure 03_image047
    式(XIIA)；
    Figure 03_image049
    式(XIIIA)； 其中： n為讓-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有分子量約25 kDa - 35 kDa之整數； q為1、2、或3；及 波浪線代表SEQ ID NO：1中未被置換之胺基酸殘基之共價鍵。
  20. 如請求項19之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中係投與包含IL-2接合物與醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組成物，且該醫藥組成物包含IL-2接合物之混合物，其中該混合物包含其中SEQ ID NO：1 之胺基酸P64被式(XIIA)結構式置換之IL-2接合物與其中SEQ ID NO：1 之胺基酸P64被式(XIIIA)結構式置換之IL-2接合物。
  21. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  22. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  23. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  24. 一種在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，其包括對有此需要之受試者以IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  25. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  26. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  27. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  28. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  29. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  30. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  31. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  32. 一種用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法中之IL-2接合物，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  33. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg至40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  34. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約40 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  35. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約32 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  36. 一種以IL-2接合物於製造藥品上之用途，該藥品係用於在受試者中治療癌症及/或刺激CD8+及/或NK細胞之方法，該方法包括對有此需要之受試者以 IL-2接合物的形式投與約24 μg/kg之IL-2，其中IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中胺基酸位置P64被式(IA)結構式置換：
    Figure 03_image001
    式(IA) 其中： Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image004
    ； Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image004
    ； Z為CH 2及Y為
    Figure 03_image007
    ；或 Y為CH 2及Z為
    Figure 03_image007
    ； W為具有平均分子量約30 kDa之PEG基團； q為1、2、或3； X為具有如下結構式之L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1代表與前一個胺基酸殘基之附接點；及 X+1代表與下一個胺基酸殘基之附接點。
  37. 如請求項1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為1。
  38. 如請求項1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為2。
  39. 如請求項1至13及15至36中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中q為3。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少2次。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少3次。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少4次。
  43. 如請求項1至42中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係投與至少5次。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每兩週投與一次。
  45. 如請求項1至43中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每三週投與一次。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係約每14、15、16、17、18、19、20、或21天投與一次。
  47. 如請求項1至46中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有實體腫瘤癌症。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有轉移性實體腫瘤。
  49. 如請求項1至48中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有晚期實體腫瘤。
  50. 如請求項1至46中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有液體腫瘤。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有難治性癌症。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有復發性癌症。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中癌症係選自：腎細胞癌瘤(RCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭與頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、典型何杰金氏淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma)(cHL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、泌尿上皮癌、微小衛星體不穩定癌、微小衛星體穩定癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌(CRC)、子宮頸癌、肝細胞癌瘤(HCC)、默克細胞(Merkel cell)癌瘤(MCC)、黑色素瘤、小細胞肺癌(SCLC)、食道癌、食道鱗狀細胞癌瘤 (ESCC)、膠質母細胞瘤、間皮瘤、乳癌、三陰性乳癌、攝護腺癌、去勢抗性攝護腺癌、轉移性去勢抗性攝護腺癌、或具有DNA損傷反應(DDR)缺陷之轉移性去勢抗性攝護腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突變負荷之腫瘤、皮膚鱗狀細胞癌瘤(CSCC)、鱗狀細胞皮膚癌(SCSC)、低表現至無表現PD-L1之腫瘤、全身擴散至肝臟與CNS超出其原發解剖部位原點之腫瘤、及瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD8+細胞擴增至少約2倍。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中NK細胞擴增至少約2倍。
  56. 如請求項1至55中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中嗜酸性白血球擴增不超過約3.2倍。
  57. 如請求項1至55中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD4+細胞擴增不超過約3.2倍。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中CD8+細胞及/或NK細胞之擴增超過CD4+細胞及/或嗜酸性白血球之擴增。
  59. 如請求項1至58中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起劑量限制性毒性。
  60. 如請求項1至59中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起嚴重之細胞激素釋放症候群。
  61. 如請求項1至60中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會引起血管滲漏症候群。
  62. 如請求項1至61中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物係經靜脈內投與受試者。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物為醫藥上可接受之鹽、溶劑合物、或水合物。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中未對該受試者投與額外醫療劑。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中IL-2接合物不會誘發抗藥物抗體。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有鱗狀細胞癌瘤。
  67. 如請求項1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有結腸直腸癌。
  68. 如請求項1至65中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該受試者患有黑色素瘤。
  69. 如前述請求項中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該方法包括對受試者以IL-2接合物的形式投與24 μg/kg至32 μg/kg之IL-2。
  70. 如前述請求項中任一項之方法、所使用之IL-2接合物、或用途，其中該方法包括對受試者以IL-2接合物的形式投與32 μg/kg至40 μg/kg之IL-2。
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