JPH05199899A - 核酸の固定化 - Google Patents
核酸の固定化Info
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- JPH05199899A JPH05199899A JP4189189A JP18918992A JPH05199899A JP H05199899 A JPH05199899 A JP H05199899A JP 4189189 A JP4189189 A JP 4189189A JP 18918992 A JP18918992 A JP 18918992A JP H05199899 A JPH05199899 A JP H05199899A
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Abstract
(57)【要約】
【目的】 核酸についてのより高感度の試験を得るため
に固定化の効果を増大させること。 【構成】 ヌクレオチド配列において直接隣接していな
い固定化可能な基によって修飾されたヌクレオチド２個
以上を有する核酸プローブを使用する核酸の検出方法。
に固定化の効果を増大させること。 【構成】 ヌクレオチド配列において直接隣接していな
い固定化可能な基によって修飾されたヌクレオチド２個
以上を有する核酸プローブを使用する核酸の検出方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の検出方法、核酸
を固定化するために使用する特定の核酸および核酸検出
用システムに関する。
を固定化するために使用する特定の核酸および核酸検出
用システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の固定化は、多くの領域、例えば、
核酸を他の物質と分離する場合、核酸混合物から特定の
ヌクレオチド配列を有する核酸を単離する場合、および
さらに核酸の検出(核酸診断用薬)のために重要である。
全てのこれらの領域において、核酸の、該核酸と実質的
に相補的なヌクレオチド配列を有し、かつある条件下で
所望の核酸とハイブリダイズ可能な核酸に対する特定の
親和性を利用する。このために使用される相補的核酸
(以下の捕捉プローブを意味する)は、通常、例えば、
膜、ゲル、ビーズまたはチューブのような固相に結合さ
れる。最近、共有結合捕捉プローブを介する核酸の固相
への固定化がいくつかの点で欠点を有すること、例えば
固定化速度が低下することが立証された。したがって、
親和性結合を介して固相に捕捉プローブを特異的に結合
することが示唆された。例えば、抗体／ハプテンまたは
ビオチン／(ストレプト)アビジンを介するこのような結
合は、液体における核酸と捕捉プローブとのハイブリダ
イゼーションおよび次なる得られたハイブリッドの固定
化を可能にする。このような方法は例えばＥＰ−Ａ−０
１３９４８９に開示されている。
核酸を他の物質と分離する場合、核酸混合物から特定の
ヌクレオチド配列を有する核酸を単離する場合、および
さらに核酸の検出(核酸診断用薬)のために重要である。
全てのこれらの領域において、核酸の、該核酸と実質的
に相補的なヌクレオチド配列を有し、かつある条件下で
所望の核酸とハイブリダイズ可能な核酸に対する特定の
親和性を利用する。このために使用される相補的核酸
(以下の捕捉プローブを意味する)は、通常、例えば、
膜、ゲル、ビーズまたはチューブのような固相に結合さ
れる。最近、共有結合捕捉プローブを介する核酸の固相
への固定化がいくつかの点で欠点を有すること、例えば
固定化速度が低下することが立証された。したがって、
親和性結合を介して固相に捕捉プローブを特異的に結合
することが示唆された。例えば、抗体／ハプテンまたは
ビオチン／(ストレプト)アビジンを介するこのような結
合は、液体における核酸と捕捉プローブとのハイブリダ
イゼーションおよび次なる得られたハイブリッドの固定
化を可能にする。このような方法は例えばＥＰ−Ａ−０
１３９４８９に開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特に
核酸についてのより高感度の試験を得るために固定化の
効果を増大させることである。
核酸についてのより高感度の試験を得るために固定化の
効果を増大させることである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、検出可能に標
識した核酸または検出可能に標識した核酸ハイブリッド
を、固定化可能な核酸プローブとハイブリダイズし；得
られたハイブリッドを固定化し；標識の量によって固定
化ハイブリッドの量を検出することからなり、該固定化
可能な核酸プローブがヌクレオチド配列において直接隣
接していない固定化可能な基によって修飾されたヌクレ
オチド２個以上を含有することを特徴とする核酸分析物
の検出方法に関する。
識した核酸または検出可能に標識した核酸ハイブリッド
を、固定化可能な核酸プローブとハイブリダイズし；得
られたハイブリッドを固定化し；標識の量によって固定
化ハイブリッドの量を検出することからなり、該固定化
可能な核酸プローブがヌクレオチド配列において直接隣
接していない固定化可能な基によって修飾されたヌクレ
オチド２個以上を含有することを特徴とする核酸分析物
の検出方法に関する。
【０００５】本発明は、核酸を検出するための方法およ
びシステムにおいて使用する核酸にも関する。
びシステムにおいて使用する核酸にも関する。
【０００６】本発明の範囲内の核酸分析物は検出される
べき核酸である。通常、さらなる成分、例えば組織また
は液体をも含有する試料中に存在する。特に、試料中に
は検出されるべきでないさらなる核酸もある。核酸は、
例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの断片のようない
ずれのタイプの核酸であってもよい。核酸分析物が最初
に二本鎖形態で試料中に存在する場合は一本鎖形態に変
換するのが好ましい。核酸分析物を固相に結合させる場
合、溶解させるのが好ましい。
べき核酸である。通常、さらなる成分、例えば組織また
は液体をも含有する試料中に存在する。特に、試料中に
は検出されるべきでないさらなる核酸もある。核酸は、
例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの断片のようない
ずれのタイプの核酸であってもよい。核酸分析物が最初
に二本鎖形態で試料中に存在する場合は一本鎖形態に変
換するのが好ましい。核酸分析物を固相に結合させる場
合、溶解させるのが好ましい。
【０００７】検出可能に標識した核酸は存在または量を
検出システムの助けをかりて決定できる核酸と解され
る。このために、検出可能に標識した核酸は正常なヌク
レオチド配列と比較して修飾を有する。適切な修飾は当
業者によく知られている。修飾の例としては、酵素、着
色分子または蛍光分子およびリガンドのような、通常、
核酸に存在しない化学基が挙げられ、好ましくは免疫学
的に結合可能な残基である。後者の例は、特に、ジゴキ
シゲニンのようなハプテン、およびビオチンのようなビ
タミンである。酵素の場合、通常、検出は酵素によって
触媒された色形成反応を介して行われる。着色分子また
は蛍光分子は光度測定手段または蛍光測定手段によって
直接検出され得る。リガンドは、通常、リガンドに対し
て親和性を有する対応する酵素標識または色素標識レセ
プターと接触させられ、これによって検出される。
検出システムの助けをかりて決定できる核酸と解され
る。このために、検出可能に標識した核酸は正常なヌク
レオチド配列と比較して修飾を有する。適切な修飾は当
業者によく知られている。修飾の例としては、酵素、着
色分子または蛍光分子およびリガンドのような、通常、
核酸に存在しない化学基が挙げられ、好ましくは免疫学
的に結合可能な残基である。後者の例は、特に、ジゴキ
シゲニンのようなハプテン、およびビオチンのようなビ
タミンである。酵素の場合、通常、検出は酵素によって
触媒された色形成反応を介して行われる。着色分子また
は蛍光分子は光度測定手段または蛍光測定手段によって
直接検出され得る。リガンドは、通常、リガンドに対し
て親和性を有する対応する酵素標識または色素標識レセ
プターと接触させられ、これによって検出される。
【０００８】検出可能に標識した核酸ハイブリッドは少
なくとも２個の核酸からなる部分二本鎖ハイブリッドと
解される。この場合、両核酸またはそれらの１つだけを
上記のように検出可能に標識してよい。該核酸ハイブリ
ッドが一本鎖領域を有することは重要である。いわゆる
サンドイッチ試験法において、該ハイブリッドは(非標
識)核酸分析物および検出可能に標識したプローブ検出
物からなるのが好ましい。
なくとも２個の核酸からなる部分二本鎖ハイブリッドと
解される。この場合、両核酸またはそれらの１つだけを
上記のように検出可能に標識してよい。該核酸ハイブリ
ッドが一本鎖領域を有することは重要である。いわゆる
サンドイッチ試験法において、該ハイブリッドは(非標
識)核酸分析物および検出可能に標識したプローブ検出
物からなるのが好ましい。
【０００９】固定化可能な核酸プローブは、通常の核酸
には存在しない残基によって修飾される核酸プローブと
解される。このような残基は、他の物質に対して親和性
を有する残基である。例としては、リガンドおよびレセ
プター間の生物特異的反応、例えば免疫学的反応、糖お
よびレクチン間またはビタミンおよび結合蛋白間の反応
の相手である。特に好ましい残基は、ハプテンまたはビ
オチンである。本発明の方法において、固定化可能な核
酸プローブ上の残基は検出可能に標識した核酸の検出可
能な残基とは異なる。
には存在しない残基によって修飾される核酸プローブと
解される。このような残基は、他の物質に対して親和性
を有する残基である。例としては、リガンドおよびレセ
プター間の生物特異的反応、例えば免疫学的反応、糖お
よびレクチン間またはビタミンおよび結合蛋白間の反応
の相手である。特に好ましい残基は、ハプテンまたはビ
オチンである。本発明の方法において、固定化可能な核
酸プローブ上の残基は検出可能に標識した核酸の検出可
能な残基とは異なる。
【００１０】以下に記載の検出方法の工程は個々の工程
としては公知であるかまたは公知の方法と同様に行うこ
とができる。特に、分子クローニング(Ｍolecular Ｃlo
ning)[編集者サンブルーク(Ｓambrook)ら、ＣＳＨ １９
８９]を引用する。これらは、標識ヌクレオシド三リン
酸の製造について知られている方法、修飾および非修飾
オリゴヌクレオチドの化学合成、ハイブリダイズされる
べき核酸間のホモロジーの程度、それらのＧＣ含量およ
びそれらの長さに依存する特異性が達成され得るハイブ
リダイゼーション条件の選択、ならびにポリメラーゼの
助けをかりて、所望によりいわゆるプライマーを使用し
てヌクレオシド三リン酸からの核酸の形成を含む。本発
明の実質的な特徴は特定の捕捉プローブの使用である。
としては公知であるかまたは公知の方法と同様に行うこ
とができる。特に、分子クローニング(Ｍolecular Ｃlo
ning)[編集者サンブルーク(Ｓambrook)ら、ＣＳＨ １９
８９]を引用する。これらは、標識ヌクレオシド三リン
酸の製造について知られている方法、修飾および非修飾
オリゴヌクレオチドの化学合成、ハイブリダイズされる
べき核酸間のホモロジーの程度、それらのＧＣ含量およ
びそれらの長さに依存する特異性が達成され得るハイブ
リダイゼーション条件の選択、ならびにポリメラーゼの
助けをかりて、所望によりいわゆるプライマーを使用し
てヌクレオシド三リン酸からの核酸の形成を含む。本発
明の実質的な特徴は特定の捕捉プローブの使用である。
【００１１】本発明の方法の第１工程で、核酸分析物を
使用して検出可能に標識した核酸または検出可能に標識
した核酸ハイブリッドを生産する。これは、例えば、核
酸分析物自体を検出可能に標識することによって行うこ
とができる。これは、標識ヌクレオシド三リン酸の酵素
的一体化によって、または標識ヌクレオシド三リン酸で
核酸分析物を伸長すること(テイリング)によって達成で
きる。さらに、検出可能に標識したモノヌクレオシド三
リン酸または検出可能に標識したオリゴヌクレオチドを
一体化しつつ、核酸分析物の領域を増幅することが可能
である。従来技術によって、これについての多くの方法
が知られている。
使用して検出可能に標識した核酸または検出可能に標識
した核酸ハイブリッドを生産する。これは、例えば、核
酸分析物自体を検出可能に標識することによって行うこ
とができる。これは、標識ヌクレオシド三リン酸の酵素
的一体化によって、または標識ヌクレオシド三リン酸で
核酸分析物を伸長すること(テイリング)によって達成で
きる。さらに、検出可能に標識したモノヌクレオシド三
リン酸または検出可能に標識したオリゴヌクレオチドを
一体化しつつ、核酸分析物の領域を増幅することが可能
である。従来技術によって、これについての多くの方法
が知られている。
【００１２】１つの可能性は、核酸分析物を鋳型核酸と
して使用してＥＰ−Ａ−０２００３６２によるポリメラ
ーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって増幅を行うことである。
この場合、一方が核酸分析物の領域と相補的であり、他
方が核酸分析物の対向鎖の一部分と相補的である２個の
プライマーを使用して、鋳型上でのプライマーの伸長に
よって核酸分析物の鎖および対向鎖の多数コピーを得
る。検出可能に標識した核酸を生産するために、プライ
マーの伸長において少なくとも１個の検出可能に標識し
たモノヌクレオシド三リン酸を使用するか、または標識
プライマーを使用する。
して使用してＥＰ−Ａ−０２００３６２によるポリメラ
ーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって増幅を行うことである。
この場合、一方が核酸分析物の領域と相補的であり、他
方が核酸分析物の対向鎖の一部分と相補的である２個の
プライマーを使用して、鋳型上でのプライマーの伸長に
よって核酸分析物の鎖および対向鎖の多数コピーを得
る。検出可能に標識した核酸を生産するために、プライ
マーの伸長において少なくとも１個の検出可能に標識し
たモノヌクレオシド三リン酸を使用するか、または標識
プライマーを使用する。
【００１３】さらなる可能性は、オリゴヌクレオチドの
少なくとも１個が検出可能に標識される場合、ＷＯ９０
／０６３７６によるリガーゼ連鎖反応の使用から生じ
る。
少なくとも１個が検出可能に標識される場合、ＷＯ９０
／０６３７６によるリガーゼ連鎖反応の使用から生じ
る。
【００１４】さらなる可能性は、ＥＰ−Ａ−０３２９８
２２に開示されている。この方法では、核酸分析物の実
質的な部分と相補的なＤＮＡ鎖が得られ、プロモーター
を含有するプライマーが一体化される。核酸分析物の分
解後、転写可能な二本鎖が得られ、これを使用して標識
モノヌクレオシド三リン酸を一体化しつつ、多数の検出
可能に標識した転写体を得ることができる。
２２に開示されている。この方法では、核酸分析物の実
質的な部分と相補的なＤＮＡ鎖が得られ、プロモーター
を含有するプライマーが一体化される。核酸分析物の分
解後、転写可能な二本鎖が得られ、これを使用して標識
モノヌクレオシド三リン酸を一体化しつつ、多数の検出
可能に標識した転写体を得ることができる。
【００１５】本発明方法は、例えばＥＰ−Ａ−０１９２
１６８によるサンドイッチ核酸アッセイの形態の場合に
特に有効であることが証明された。本発明の方法は、特
定のタイプの捕捉プローブを使用する公知のサンドイッ
チアッセイとは異なる。
１６８によるサンドイッチ核酸アッセイの形態の場合に
特に有効であることが証明された。本発明の方法は、特
定のタイプの捕捉プローブを使用する公知のサンドイッ
チアッセイとは異なる。
【００１６】さらなる工程において、ハイブリダイゼー
ション条件下、検出可能に標識した核酸または検出可能
に標識した核酸ハイブリッドを、固定化可能な核酸プロ
ーブと接触させる。
ション条件下、検出可能に標識した核酸または検出可能
に標識した核酸ハイブリッドを、固定化可能な核酸プロ
ーブと接触させる。
【００１７】本発明の固定化可能な核酸プローブは、ヌ
クレオチド配列において直接隣接していない固定化可能
な基によって修飾されたヌクレオチド２個以上を含有す
る。リガンド(レセプター基)の数は別として、リガンド
間の距離はきわめて重大であり、この効果を認めるため
には好ましくは１０ヌクレオチド以上であるべきであ
る。例えば、直接連続して結合されたビオチン残基(ビ
オチンはリガンドと一致する)５個を含有し、かつスト
レプトアビジンマトリックスに分析物を結合するために
捕捉プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、ビオチン残基１個と連結しているだけの参照プ
ローブと比較して、総合アッセイにおける感度を増大さ
せなかった(実施例２参照)。「捕捉プローブ」は、検出
されるべき核酸分析物と適当な手段でハイブリダイズ可
能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ)であり得る。それは、一本鎖(例えばオ
リゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチ
ド)または二本鎖(例えば、プラスミド、断片)であり得
る。後者の場合、捕捉プローブは、分析物とのハイブリ
ダイゼーション前に変性されなければならない。特に好
ましい具体例は、各々の場合に核酸プローブの末端ヌク
レオチドが各々修飾されている核酸プローブを利用す
る。
クレオチド配列において直接隣接していない固定化可能
な基によって修飾されたヌクレオチド２個以上を含有す
る。リガンド(レセプター基)の数は別として、リガンド
間の距離はきわめて重大であり、この効果を認めるため
には好ましくは１０ヌクレオチド以上であるべきであ
る。例えば、直接連続して結合されたビオチン残基(ビ
オチンはリガンドと一致する)５個を含有し、かつスト
レプトアビジンマトリックスに分析物を結合するために
捕捉プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、ビオチン残基１個と連結しているだけの参照プ
ローブと比較して、総合アッセイにおける感度を増大さ
せなかった(実施例２参照)。「捕捉プローブ」は、検出
されるべき核酸分析物と適当な手段でハイブリダイズ可
能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ)であり得る。それは、一本鎖(例えばオ
リゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチ
ド)または二本鎖(例えば、プラスミド、断片)であり得
る。後者の場合、捕捉プローブは、分析物とのハイブリ
ダイゼーション前に変性されなければならない。特に好
ましい具体例は、各々の場合に核酸プローブの末端ヌク
レオチドが各々修飾されている核酸プローブを利用す
る。
【００１８】上記の距離に関する要求を満たすために、
標識を３'−および５'−末端に適切に結合する１１〜４
０ヌクレオチド長さを有するオリゴデオキシヌクレオチ
ドであるのが好ましい。
標識を３'−および５'−末端に適切に結合する１１〜４
０ヌクレオチド長さを有するオリゴデオキシヌクレオチ
ドであるのが好ましい。
【００１９】固定化可能な残基は、原則的には、ヌクレ
オチドの塩基部分または糖部分またはリン酸塩部分と結
合することができる。このような固定化可能な核酸プロ
ーブは、公知の方法に従って、または公知の方法と同様
に生産することができる。リガンドの修飾塩基を有する
ヌクレオチドへの結合は、例えば、ヌークリイック・ア
シッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes.)、１５(１
２)、第４８５７頁〜第４８７６頁(１９８７)；ヌーク
リイック・アシッズ・リサーチ、１６(９)、第４０７７
頁〜第４０９５頁(１９８８)；ヌークリイック・アシッ
ズ・リサーチ、１７、第４６４３頁〜第７６５０頁(１
９８９)に開示されているか、あるいは、リガンドを既
に含有する修飾ヌクレオチドを導入することによって行
うことができる［例えば、ヌークリイック・アシッズ・
リサーチ、１８(１５)、第４３５５頁〜第４３６０頁
(１９９０)］。固定化可能な残基に結合するために使用
できる合成オリゴヌクレオチドにおいていくつかの主要
アミノ基を一体化するためのさらなる適当な化学的方法
は、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１７(１
８)、第７１７９頁〜第７１９４頁(１９８９)に開示さ
れている。リガンドの核酸への結合は、ビスルフィド触
媒アミノ基転移によっても行われ得る［ヌークリイック
・アシッズ・リサーチ、１２(２)、第９８９頁〜第１０
０２頁(１９８４)］。いくつかの固定化可能な残基の結
合は、酵素的方法によっても、例えば、適当な残基を含
有するヌクレオシド三リン酸を使用するテイリングによ
って［ＤＮＡ、５(４)、第３３３頁〜第３３７頁(１９
８６)］またはランダムプライミングによって［アナリ
ティカル・バイオケミストリー(Ａnalyt.Ｂiochem.)、
１３２、第６頁、１９８３］行われ得る。
オチドの塩基部分または糖部分またはリン酸塩部分と結
合することができる。このような固定化可能な核酸プロ
ーブは、公知の方法に従って、または公知の方法と同様
に生産することができる。リガンドの修飾塩基を有する
ヌクレオチドへの結合は、例えば、ヌークリイック・ア
シッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes.)、１５(１
２)、第４８５７頁〜第４８７６頁(１９８７)；ヌーク
リイック・アシッズ・リサーチ、１６(９)、第４０７７
頁〜第４０９５頁(１９８８)；ヌークリイック・アシッ
ズ・リサーチ、１７、第４６４３頁〜第７６５０頁(１
９８９)に開示されているか、あるいは、リガンドを既
に含有する修飾ヌクレオチドを導入することによって行
うことができる［例えば、ヌークリイック・アシッズ・
リサーチ、１８(１５)、第４３５５頁〜第４３６０頁
(１９９０)］。固定化可能な残基に結合するために使用
できる合成オリゴヌクレオチドにおいていくつかの主要
アミノ基を一体化するためのさらなる適当な化学的方法
は、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１７(１
８)、第７１７９頁〜第７１９４頁(１９８９)に開示さ
れている。リガンドの核酸への結合は、ビスルフィド触
媒アミノ基転移によっても行われ得る［ヌークリイック
・アシッズ・リサーチ、１２(２)、第９８９頁〜第１０
０２頁(１９８４)］。いくつかの固定化可能な残基の結
合は、酵素的方法によっても、例えば、適当な残基を含
有するヌクレオシド三リン酸を使用するテイリングによ
って［ＤＮＡ、５(４)、第３３３頁〜第３３７頁(１９
８６)］またはランダムプライミングによって［アナリ
ティカル・バイオケミストリー(Ａnalyt.Ｂiochem.)、
１３２、第６頁、１９８３］行われ得る。
【００２０】化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
は、本発明の範囲内で特に好ましい。というのは、それ
らが２個の修飾ヌクレオチド間の距離を予め正確に決定
できるという長所を有するからである。
は、本発明の範囲内で特に好ましい。というのは、それ
らが２個の修飾ヌクレオチド間の距離を予め正確に決定
できるという長所を有するからである。
【００２１】検出プローブとして多数の標識核酸の使用
は既に公知であった。例えば、ＥＰ−Ａ−０３３０２２
１では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
ビオチンで標識し、次いで、ストレプトアビジン−酵素
複合体によってビオチンを検出する。dＴＴＰの同時一
体化によるヌクレオチド配列におけるビオチン−dＵＭ
Ｐ残基２個の分離がさらなる欠点であると記載されてい
る。ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１８(１
５)、第４３５８頁には、核酸にいくつかの固定化可能
な残基を結合することによって、それらの固相への結合
を改善できることが示されている。
は既に公知であった。例えば、ＥＰ−Ａ−０３３０２２
１では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
ビオチンで標識し、次いで、ストレプトアビジン−酵素
複合体によってビオチンを検出する。dＴＴＰの同時一
体化によるヌクレオチド配列におけるビオチン−dＵＭ
Ｐ残基２個の分離がさらなる欠点であると記載されてい
る。ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１８(１
５)、第４３５８頁には、核酸にいくつかの固定化可能
な残基を結合することによって、それらの固相への結合
を改善できることが示されている。
【００２２】ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１
８、第４３４５頁〜第４３５４頁(１９９０)でも、検出
プローブとして多数の標識核酸を使用する。標識をリン
酸塩残基に結合する多数の標識核酸の生産は、ＷＯ９０
／０８８３８に開示されている。
８、第４３４５頁〜第４３５４頁(１９９０)でも、検出
プローブとして多数の標識核酸を使用する。標識をリン
酸塩残基に結合する多数の標識核酸の生産は、ＷＯ９０
／０８８３８に開示されている。
【００２３】試料が核酸分析物を含有する場合、検出可
能に標識した核酸または検出可能に標識した核酸ハイブ
リッドと固定化可能な核酸プローブとから核酸ハイブリ
ッドが得られる。本発明の方法では、これを、固定化可
能な残基を介して固相に結合させる。固相の表面は、例
えば、レセプターのような核酸プローブの固定化可能な
残基に対する親和性を有する基を含有する。固定化可能
な基がハプテンである場合、固相はこのハプテンに対す
る抗体を含有するのが好ましい。ビオチンの場合、固相
はアビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン
結合蛋白を含有する。
能に標識した核酸または検出可能に標識した核酸ハイブ
リッドと固定化可能な核酸プローブとから核酸ハイブリ
ッドが得られる。本発明の方法では、これを、固定化可
能な残基を介して固相に結合させる。固相の表面は、例
えば、レセプターのような核酸プローブの固定化可能な
残基に対する親和性を有する基を含有する。固定化可能
な基がハプテンである場合、固相はこのハプテンに対す
る抗体を含有するのが好ましい。ビオチンの場合、固相
はアビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン
結合蛋白を含有する。
【００２４】固定化可能なハイブリッドの量は核酸分析
物の量または存在についての測度である。この量は固相
上に固定化される標識の量を介して検出され得る。これ
は公知の方法で行われるのが好ましく、使用される標識
のタイプに左右される。検出反応を行う前に、固相を液
相から取り出すのが好ましい。これによって、同時に、
液体と一緒に、検出可能に標識した核酸もしくは検出可
能に標識した核酸ハイブリッドの生産ための出発物質ま
たはサンドイッチハイブリダイゼーションの場合の過剰
の検出可能に標識した核酸が除去される。本発明方法に
よる核酸の検出は、特に該試験が定量的に行われるべき
である場合に、既知の核酸分析物含量を有する１または
いくつかの試料について得られた単一または複数の測定
シグナルと未知の核酸分析物含量を有する試料について
得られた測定シグナルとの比較を含む。記録されたデー
タの形態でも提供され得る検量線の使用が好ましい。
物の量または存在についての測度である。この量は固相
上に固定化される標識の量を介して検出され得る。これ
は公知の方法で行われるのが好ましく、使用される標識
のタイプに左右される。検出反応を行う前に、固相を液
相から取り出すのが好ましい。これによって、同時に、
液体と一緒に、検出可能に標識した核酸もしくは検出可
能に標識した核酸ハイブリッドの生産ための出発物質ま
たはサンドイッチハイブリダイゼーションの場合の過剰
の検出可能に標識した核酸が除去される。本発明方法に
よる核酸の検出は、特に該試験が定量的に行われるべき
である場合に、既知の核酸分析物含量を有する１または
いくつかの試料について得られた単一または複数の測定
シグナルと未知の核酸分析物含量を有する試料について
得られた測定シグナルとの比較を含む。記録されたデー
タの形態でも提供され得る検量線の使用が好ましい。
【００２５】さらに本発明は、核酸を固定化するために
使用する、ヌクレオチド配列において直接隣接していな
い固定化可能な基によって修飾されたヌクレオチドを２
個以上含有する核酸に関する。これは、当該本発明の核
酸プローブが驚くほど改良された固定化を保証にすると
いう事実に基づく。該方法は、例えば、核酸の親和性分
離において使用され得る。
使用する、ヌクレオチド配列において直接隣接していな
い固定化可能な基によって修飾されたヌクレオチドを２
個以上含有する核酸に関する。これは、当該本発明の核
酸プローブが驚くほど改良された固定化を保証にすると
いう事実に基づく。該方法は、例えば、核酸の親和性分
離において使用され得る。
【００２６】本発明は、それらの個々のヌクレオチド配
列において直接隣接していない固定化可能な基によって
修飾されたヌクレオチド２個以上を含有する１またはい
くつかの核酸および核酸の固定化可能な基に対する特異
的な親和性を有する少なくとも１つの固相を含有する核
酸検出用システムにも関する。検出方法を開始する前
に、該システムにおいて核酸および固相がお互いに分離
して存在するのが好ましい。さらに、該システムは、核
酸の検出に必要であるかまたは該検出を助けるさらなる
成分を含有することもできる。これらは、特に、標識を
検出するためのpＨ緩衝液および試薬を含む。
列において直接隣接していない固定化可能な基によって
修飾されたヌクレオチド２個以上を含有する１またはい
くつかの核酸および核酸の固定化可能な基に対する特異
的な親和性を有する少なくとも１つの固相を含有する核
酸検出用システムにも関する。検出方法を開始する前
に、該システムにおいて核酸および固相がお互いに分離
して存在するのが好ましい。さらに、該システムは、核
酸の検出に必要であるかまたは該検出を助けるさらなる
成分を含有することもできる。これらは、特に、標識を
検出するためのpＨ緩衝液および試薬を含む。
【００２７】「図１」は、サンドイッチ試験において本
発明の捕捉プローブＦを介する核酸分析物Ａの、ストレ
プトアビジンＳを塗布した固相への結合を示す模式図で
ある。検出可能に(菱形で示す)標識したプローブ検出物
をＤと記す。
発明の捕捉プローブＦを介する核酸分析物Ａの、ストレ
プトアビジンＳを塗布した固相への結合を示す模式図で
ある。検出可能に(菱形で示す)標識したプローブ検出物
をＤと記す。
【００２８】「図２」は、本発明の捕捉プローブを介す
る標識核酸分析物Ａ'の、ストレプトアビジンＳを塗布
した固相壁への結合を示す模式図である。
る標識核酸分析物Ａ'の、ストレプトアビジンＳを塗布
した固相壁への結合を示す模式図である。
【００２９】「図３」は、固定化可能な基を、本発明に
従って該基を分離して隣接ヌクレオチド上に配置するサ
ンドイッチ核酸試験の感度の増大を示すグラフである。
オリゴヌクレオチドの各末端にあるビオチン残基２個だ
けを使用する場合の感度の増大がビオチン残基１０個を
一端で使用した場合よりも思いがけなくかなり多いこと
は明らかである(実施例２参照)。
従って該基を分離して隣接ヌクレオチド上に配置するサ
ンドイッチ核酸試験の感度の増大を示すグラフである。
オリゴヌクレオチドの各末端にあるビオチン残基２個だ
けを使用する場合の感度の増大がビオチン残基１０個を
一端で使用した場合よりも思いがけなくかなり多いこと
は明らかである(実施例２参照)。
【００３０】「図４」は、３０ヌクレオチド長さのオリ
ゴヌクレオチドについてビオチン残基１個の使用と比較
してビオチン残基２個を使用する場合のサンドイッチ試
験における感度の増大を示すグラフである。
ゴヌクレオチドについてビオチン残基１個の使用と比較
してビオチン残基２個を使用する場合のサンドイッチ試
験における感度の増大を示すグラフである。
【００３１】「図５」は、２０nt長さを有するオリゴヌ
クレオチドを用いる以外は、「図４」と同様の感度の比
較を示すグラフである。
クレオチドを用いる以外は、「図４」と同様の感度の比
較を示すグラフである。
【００３２】「図６」は、核酸分析物を増幅し、同時に
ＰＣＲによって標識し、ビオチン残基１個または２個を
有する１５ヌクレオチド長さの核酸プローブを捕捉プロ
ーブとして使用した方法についての感度の比較を示すグ
ラフである。
ＰＣＲによって標識し、ビオチン残基１個または２個を
有する１５ヌクレオチド長さの核酸プローブを捕捉プロ
ーブとして使用した方法についての感度の比較を示すグ
ラフである。
【００３３】「図４」〜「図６」において示す曲線は、
核酸分析物の未知の量を決定するための検量線として使
用することもできる。
核酸分析物の未知の量を決定するための検量線として使
用することもできる。
【００３４】下記「化１」はアミノモディファイヤーII
の構造式を示す。
の構造式を示す。
【化１】
【００３５】以下の実施例において本発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【００３６】
実施例１ オリゴヌクレオチドの生産 Ａ）注釈 カルサーズ(Ｃaruthers)らによって公表された「ホスホ
ルアミダイト法(phosphoramidite method)」（Ｍethods
Ｅnzymol.、１５４、２８７、１９８７）を使用してバ
イオサーチ・カンパニー(Ｂiosearch Ｃompany)から入
手したＤＮＡ合成器８７００によって全てのオリゴヌク
レオチドを生産した。
ルアミダイト法(phosphoramidite method)」（Ｍethods
Ｅnzymol.、１５４、２８７、１９８７）を使用してバ
イオサーチ・カンパニー(Ｂiosearch Ｃompany)から入
手したＤＮＡ合成器８７００によって全てのオリゴヌク
レオチドを生産した。
【００３７】使用したβ−シアノエチル−ヌクレオシド
ホスホルアミダイトは、ロート(Ｒoth)（ドイツ連邦共
和国カールスルーエ）から入手し、Ｄ−ビオチノイル−
アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルはベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannhe
im)（ドイツ連邦共和国マンハイム）から入手し、アミ
ノモディファイヤー２(ＡＭII)はベックマン・インスト
ゥルメンツ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテ
ル・ハフツング(Ｂeckmann Ｉnstruments ＧmbＨ)（ア
メリカ合衆国カリフォルニア州フラートン）から入手し
た。他の全ての試薬および溶媒は、入手できる最良の質
で使用した。
ホスホルアミダイトは、ロート(Ｒoth)（ドイツ連邦共
和国カールスルーエ）から入手し、Ｄ−ビオチノイル−
アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルはベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannhe
im)（ドイツ連邦共和国マンハイム）から入手し、アミ
ノモディファイヤー２(ＡＭII)はベックマン・インスト
ゥルメンツ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテ
ル・ハフツング(Ｂeckmann Ｉnstruments ＧmbＨ)（ア
メリカ合衆国カリフォルニア州フラートン）から入手し
た。他の全ての試薬および溶媒は、入手できる最良の質
で使用した。
【００３８】ファルマシア(Ｐharmacia)（ドイツ連邦共
和国フライブルク）からのモノ(Ｍono) Ｑ ＨＲ ５／５
イオン交換カラムまたはＣ18カラム［リクロソルブ(Ｌi
Ｃhrosorb) ＲＰ １８−５、ツェーエス−クロマトグラ
フィー・ゼルヴィース(ＣＳ−Ｃhromatographie Ｓervi
ce)、ドイツ連邦共和国ランゲルヴェーエ］を使用し
て、ＨＰＬＣ［スペクトラ・フィジクス(Ｓpectra Ｐhy
sics)、ドイツ連邦共和国ダルムスタット］によってビ
オチニル化オリゴヌクレオチドの精製を行った。透析の
ために、スペクトラ／ポル(Ｓpectra／Ｐor) １０００
メンブランズ［ロート(Ｒoth)、ドイツ連邦共和国カー
ルスルーエ］を使用した。
和国フライブルク）からのモノ(Ｍono) Ｑ ＨＲ ５／５
イオン交換カラムまたはＣ18カラム［リクロソルブ(Ｌi
Ｃhrosorb) ＲＰ １８−５、ツェーエス−クロマトグラ
フィー・ゼルヴィース(ＣＳ−Ｃhromatographie Ｓervi
ce)、ドイツ連邦共和国ランゲルヴェーエ］を使用し
て、ＨＰＬＣ［スペクトラ・フィジクス(Ｓpectra Ｐhy
sics)、ドイツ連邦共和国ダルムスタット］によってビ
オチニル化オリゴヌクレオチドの精製を行った。透析の
ために、スペクトラ／ポル(Ｓpectra／Ｐor) １０００
メンブランズ［ロート(Ｒoth)、ドイツ連邦共和国カー
ルスルーエ］を使用した。
【００３９】Ｂ）ビオチニル化オリゴヌクレオチドの合
成および精製 トリチル−オフおよびクリーブ−オフプログラムを使用
して、１μmolの大きさでバイオサーチ・シンセサイザ
ー(Ｂiosearch synthesizer)でビオチニル化オリゴヌク
レオチドを全て調製した。アミノモディファイヤー２と
一緒に利用できる担体がなかったので、チミジン担体を
使用し、次いで、標準的な結合プログラムに従って、こ
れにアミノモディファイヤー２(「化１」参照)を縮合し
た(アセトニトリル中０.１Ｍ)。
成および精製 トリチル−オフおよびクリーブ−オフプログラムを使用
して、１μmolの大きさでバイオサーチ・シンセサイザ
ー(Ｂiosearch synthesizer)でビオチニル化オリゴヌク
レオチドを全て調製した。アミノモディファイヤー２と
一緒に利用できる担体がなかったので、チミジン担体を
使用し、次いで、標準的な結合プログラムに従って、こ
れにアミノモディファイヤー２(「化１」参照)を縮合し
た(アセトニトリル中０.１Ｍ)。
【００４０】アミノモディファイヤーの後、アンモニア
処理の間に攻撃からアミノモディファイヤーの主要なヒ
ドロキシル基を保護するために、および再度部分的に切
除されることからグリセリル残基を保護するために、
５'末端に別のチミジンを結合した。５５℃／５時間
で、濃ＮＨ3溶液で保護基の合成および切断を完了した
後、全ての溶媒を真空除去し、残留物を水に取り、生成
物をイオン交換クロマトグラフィー［モノ(Ｍono) Ｑ
ＨＲ ５／５；Ａ：０.２５mＭ Ｔris／ＨＣl、０.３Ｍ
ＮaＣl；Ｂ：０.２５ Ｔris／ＨＣl、１Ｍ ＮaＣl；Ｂ
０〜１００％を６０分以内、流速１ミリリットル／分］
によって精製した。次いで、オリゴデオキシヌクレオチ
ドを透析によって脱塩した［スペクトラ／ポル(Ｓpectr
a／Ｐor) １０００、ロート(Ｒoth)］。その後、０.０
５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液０.５ミリリットル
にオリゴデオキシヌクレオチド５〜１０Ｏ.Ｄ.260nmを
取り、次いで、Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５mgのＤＭＦ
０.５ミリリットル中溶液を添加することによって、オ
リゴヌクレオチドをビオチニル化した。反応混合物を３
７℃で一晩インキュベートし、次いで、該溶媒を真空除
去し、残留物を再蒸留水に取り、過剰のビオチンを濾過
によって除去した。Ａ：０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモ
ニウム(pＨ７)；５％アセトニトル、Ｂ：０.１Ｍ酢酸ト
リエチルアンモニウム(pＨ７)；４０％アセトニトリル
の勾配液を用いて逆相ＨＰＬＣによってさらに精製を行
った。該勾配液を、流速２ミリリットル／分で４０分以
内、Ｂ２０％からＢ８０％まで流した。２倍のビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドと対応するアミノモディファイ
ヤー修飾出発オリゴヌクレオチドとの間の保持時間の差
は、配列の長さに依存して２〜４分であった。透析を繰
り返した後、１.５〜３.５Ｏ.Ｄ.260のビオチニル化オ
リゴデオキシヌクレオチドを得ることができた。
処理の間に攻撃からアミノモディファイヤーの主要なヒ
ドロキシル基を保護するために、および再度部分的に切
除されることからグリセリル残基を保護するために、
５'末端に別のチミジンを結合した。５５℃／５時間
で、濃ＮＨ3溶液で保護基の合成および切断を完了した
後、全ての溶媒を真空除去し、残留物を水に取り、生成
物をイオン交換クロマトグラフィー［モノ(Ｍono) Ｑ
ＨＲ ５／５；Ａ：０.２５mＭ Ｔris／ＨＣl、０.３Ｍ
ＮaＣl；Ｂ：０.２５ Ｔris／ＨＣl、１Ｍ ＮaＣl；Ｂ
０〜１００％を６０分以内、流速１ミリリットル／分］
によって精製した。次いで、オリゴデオキシヌクレオチ
ドを透析によって脱塩した［スペクトラ／ポル(Ｓpectr
a／Ｐor) １０００、ロート(Ｒoth)］。その後、０.０
５Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液０.５ミリリットル
にオリゴデオキシヌクレオチド５〜１０Ｏ.Ｄ.260nmを
取り、次いで、Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５mgのＤＭＦ
０.５ミリリットル中溶液を添加することによって、オ
リゴヌクレオチドをビオチニル化した。反応混合物を３
７℃で一晩インキュベートし、次いで、該溶媒を真空除
去し、残留物を再蒸留水に取り、過剰のビオチンを濾過
によって除去した。Ａ：０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモ
ニウム(pＨ７)；５％アセトニトル、Ｂ：０.１Ｍ酢酸ト
リエチルアンモニウム(pＨ７)；４０％アセトニトリル
の勾配液を用いて逆相ＨＰＬＣによってさらに精製を行
った。該勾配液を、流速２ミリリットル／分で４０分以
内、Ｂ２０％からＢ８０％まで流した。２倍のビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドと対応するアミノモディファイ
ヤー修飾出発オリゴヌクレオチドとの間の保持時間の差
は、配列の長さに依存して２〜４分であった。透析を繰
り返した後、１.５〜３.５Ｏ.Ｄ.260のビオチニル化オ
リゴデオキシヌクレオチドを得ることができた。
【００４１】実施例２ 修飾の部位を考慮に入れるサンドイッチ形態でのＨＢＶ
ＤＮＡ分析物の検出固相にＤＮＡ分析物を結合してい
るサンドイッチ状態で試験を行う。プラスミドでクロー
ン化されるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの部分的な配列をＤ
ＮＡ分析物として使用する。配列がＨＢＶ ＤＮＡの一
領域と相補的なビオチン標識オリゴヌクレオチドによっ
て、該ＤＮＡ分析物をストレプトアビジン固相に結合さ
せる。次いで、ＤＮＡ分析物の他の領域と相補的なジゴ
キシゲニン標識オリゴヌクレオチドによって、結合した
ＤＮＡ分析物の検出を行う。これを、ホースラディッシ
ュ・ペルオキシダーゼとコンジュゲートされる抗ジゴキ
シゲニン抗体によって認識させることができ、次いで、
該ハイブリッドを酵素触媒色形成反応によって検出す
る。
ＤＮＡ分析物の検出固相にＤＮＡ分析物を結合してい
るサンドイッチ状態で試験を行う。プラスミドでクロー
ン化されるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの部分的な配列をＤ
ＮＡ分析物として使用する。配列がＨＢＶ ＤＮＡの一
領域と相補的なビオチン標識オリゴヌクレオチドによっ
て、該ＤＮＡ分析物をストレプトアビジン固相に結合さ
せる。次いで、ＤＮＡ分析物の他の領域と相補的なジゴ
キシゲニン標識オリゴヌクレオチドによって、結合した
ＤＮＡ分析物の検出を行う。これを、ホースラディッシ
ュ・ペルオキシダーゼとコンジュゲートされる抗ジゴキ
シゲニン抗体によって認識させることができ、次いで、
該ハイブリッドを酵素触媒色形成反応によって検出す
る。
【００４２】ＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris−ＨＣl、１mＭ
ＥＤＴＡ、pＨ７.５)中、４.４μg／ミリリットル、
２.２μg／ミリリットル、１.１μg／ミリリットル、
０.５５μg／ミリリットルの範囲のプラスミドの希釈シ
リーズを調製する。二本鎖ＤＮＡを変性させるために、
プラスミド溶液９０マイクロリットルに５Ｍ ＮaＯＨ１
０マイクロリットルを添加し、室温で１０分間、インキ
ュベートする。次いで、ストレプトアビジンで塗布した
微量滴定プレートのウエルに該変性調製物２０マイクロ
リットルをピペットで入れ、次いで、ハイブリダイゼー
ション溶液(５０mＭ リン酸ナトリウム緩衝液、０.７５
Ｍ ＮaＣl、０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム、０.０５
％ウシ血清アルブミン、pＨ５.４)１８０マイクロリッ
トルの添加によって中和する。この結果、該試験におけ
る以下の濃度のプラスミドが得られる：５０、１００、
２００、４００ng／ミリリットル。ハイブリダイゼーシ
ョン溶液は、さらに、ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレ
オチド(５'末端をジゴキシゲニンで１回標識した、ＨＢ
Ｖゲノムの２８７ｃ−２４８ｃ位)２００ng／ミリリッ
トルおよびビオチン標識オリゴヌクレオチド(ＨＢＶゲ
ノムの２４５６ｃ−２４１７ｃ位)２００ng／ミリリッ
トルを含有する。該試験は、種々のビオチン標識度を有
するオリゴヌクレオチドで行われる：
ＥＤＴＡ、pＨ７.５)中、４.４μg／ミリリットル、
２.２μg／ミリリットル、１.１μg／ミリリットル、
０.５５μg／ミリリットルの範囲のプラスミドの希釈シ
リーズを調製する。二本鎖ＤＮＡを変性させるために、
プラスミド溶液９０マイクロリットルに５Ｍ ＮaＯＨ１
０マイクロリットルを添加し、室温で１０分間、インキ
ュベートする。次いで、ストレプトアビジンで塗布した
微量滴定プレートのウエルに該変性調製物２０マイクロ
リットルをピペットで入れ、次いで、ハイブリダイゼー
ション溶液(５０mＭ リン酸ナトリウム緩衝液、０.７５
Ｍ ＮaＣl、０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム、０.０５
％ウシ血清アルブミン、pＨ５.４)１８０マイクロリッ
トルの添加によって中和する。この結果、該試験におけ
る以下の濃度のプラスミドが得られる：５０、１００、
２００、４００ng／ミリリットル。ハイブリダイゼーシ
ョン溶液は、さらに、ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレ
オチド(５'末端をジゴキシゲニンで１回標識した、ＨＢ
Ｖゲノムの２８７ｃ−２４８ｃ位)２００ng／ミリリッ
トルおよびビオチン標識オリゴヌクレオチド(ＨＢＶゲ
ノムの２４５６ｃ−２４１７ｃ位)２００ng／ミリリッ
トルを含有する。該試験は、種々のビオチン標識度を有
するオリゴヌクレオチドで行われる：
【００４３】ＨＢＶ−Ｏli ７−４（１ビオチン、４０
mer）、配列番号１： ５'−Ｔ(bio−ＡＭII)−CATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCTTC
TGCGACGCGGCG−３'
mer）、配列番号１： ５'−Ｔ(bio−ＡＭII)−CATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCTTC
TGCGACGCGGCG−３'
【００４４】ＨＢＶ−Ｏli ７−５（５ビオチン、４０
mer）、配列番号２： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)５−CATTGAGATTCCCGAGATTCAGAT
CTTCTGCGACGCGGCG−３'
mer）、配列番号２： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)５−CATTGAGATTCCCGAGATTCAGAT
CTTCTGCGACGCGGCG−３'
【００４５】ＨＢＶ−Ｏli ７−６（１０ビオチン、４
０mer）、配列番号３： ５'Ｔ−(bio−ＡＭII)１０−CATTGAGATTCCCGAGATTGAGAT
CTTCTGCGACGCGGCG−３'
０mer）、配列番号３： ５'Ｔ−(bio−ＡＭII)１０−CATTGAGATTCCCGAGATTGAGAT
CTTCTGCGACGCGGCG−３'
【００４６】ＨＢＶ−Ｏli ７−７（２ビオチン、４０
mer）、配列番号４： ５’Ｔ−（ｂｉｏ−ＭＩＩ）−ＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣ
ＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣ
ＧＧＣＧ−（ＡＭＩＩ−ｂｉｏ）−Ｔ−３’
mer）、配列番号４： ５’Ｔ−（ｂｉｏ−ＭＩＩ）−ＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣ
ＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣ
ＧＧＣＧ−（ＡＭＩＩ−ｂｉｏ）−Ｔ−３’
【００４７】振盪しつつ、微量滴定プレートでハイブリ
ダイゼーション調製物を３７℃で３時間インキュベート
する。溶液を吸引した後、該試験から非結合反応相手を
除去するために、３７℃で、０．３Ｍ ＮaＣl、０.０３
Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％ドデシル硫酸ナトリウ
ムで２×１０分、次いで、室温で短時間、０.９％ＮaＣ
lで１回洗浄する。１００mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.
５)、０.９％ＮaＣl、１％ウシ血清アルブミン中抗ジゴ
キシゲニン抗体−ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼコンジュゲート体２０mＵ／ミリリットルを添加し、
振盪しつつ、３７℃で３０分間インキュベートする。室
温で、０.９％ＮaＣlで３回、簡単に洗浄して非結合コ
ンジュゲート体を除去する。基質溶液ＡＢＴＳR(１.９m
Ｍ、２,２'アジノ.ジ−[３−エチルベンゾチアゾリンス
ルホン酸(６)]−ジアンモニウム塩)の添加によって検出
反応を開始する。振盪しつつ、３７℃で３０分間インキ
ュベーションを行う。次いで、ＥＬＩＳＡ読取器によっ
て４０５nmで吸光度を測定する。結果を「図３」に示
す。
ダイゼーション調製物を３７℃で３時間インキュベート
する。溶液を吸引した後、該試験から非結合反応相手を
除去するために、３７℃で、０．３Ｍ ＮaＣl、０.０３
Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％ドデシル硫酸ナトリウ
ムで２×１０分、次いで、室温で短時間、０.９％ＮaＣ
lで１回洗浄する。１００mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.
５)、０.９％ＮaＣl、１％ウシ血清アルブミン中抗ジゴ
キシゲニン抗体−ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼコンジュゲート体２０mＵ／ミリリットルを添加し、
振盪しつつ、３７℃で３０分間インキュベートする。室
温で、０.９％ＮaＣlで３回、簡単に洗浄して非結合コ
ンジュゲート体を除去する。基質溶液ＡＢＴＳR(１.９m
Ｍ、２,２'アジノ.ジ−[３−エチルベンゾチアゾリンス
ルホン酸(６)]−ジアンモニウム塩)の添加によって検出
反応を開始する。振盪しつつ、３７℃で３０分間インキ
ュベーションを行う。次いで、ＥＬＩＳＡ読取器によっ
て４０５nmで吸光度を測定する。結果を「図３」に示
す。
【００４８】実施例３ 鎖長さおよび修飾部位を考慮に入れるサンドイッチフォ
ーマットでのＨＢＶ−ＤＮＡ分析物の検出 １０mＭ Ｔris−ＨＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ７.５中６
２.５〜２５０ng／ミリリットルの範囲でＨＢＶ−特異
的配列を含有するプラスミドの希釈シリーズを調製す
る。プラスミド溶液９０マイクロリットルに５Ｍ ＮaＯ
Ｈ １０マイクロリットルを添加し、室温で１０分間イ
ンキュベートする。ストレプトアビジンで塗布した微量
滴定プレートのウエルにこの変性調製物２０マイクロリ
ットルをピペットで入れ、ハイブリダイゼーション溶液
(５０mＭリン酸塩緩衝液、０.７５Ｍ ＮaＣl、０.０７
５Ｍクエン酸ナトリウム、０.０５％ウシ血清アルブミ
ン(ＢＳＡ)、pＨ５.４)１８０マイクロリットルを添加
する。該ハイブリダイゼーション溶液にビオチン標識捕
捉オリゴヌクレオチド２００ng／ミリリットルおよびジ
ゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチド(ＨＢＶゲノムの
４０５−４４４位、４０mer、３'および５'末端でジゴ
キシゲニンによって２回標識された)２００ng／ミリリ
ットルを添加する。かくして、試験におけるＤＮＡ分析
物濃度は６.２５、１２.５、２５および５０ng／ミリリ
ットルである。
ーマットでのＨＢＶ−ＤＮＡ分析物の検出 １０mＭ Ｔris−ＨＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ７.５中６
２.５〜２５０ng／ミリリットルの範囲でＨＢＶ−特異
的配列を含有するプラスミドの希釈シリーズを調製す
る。プラスミド溶液９０マイクロリットルに５Ｍ ＮaＯ
Ｈ １０マイクロリットルを添加し、室温で１０分間イ
ンキュベートする。ストレプトアビジンで塗布した微量
滴定プレートのウエルにこの変性調製物２０マイクロリ
ットルをピペットで入れ、ハイブリダイゼーション溶液
(５０mＭリン酸塩緩衝液、０.７５Ｍ ＮaＣl、０.０７
５Ｍクエン酸ナトリウム、０.０５％ウシ血清アルブミ
ン(ＢＳＡ)、pＨ５.４)１８０マイクロリットルを添加
する。該ハイブリダイゼーション溶液にビオチン標識捕
捉オリゴヌクレオチド２００ng／ミリリットルおよびジ
ゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチド(ＨＢＶゲノムの
４０５−４４４位、４０mer、３'および５'末端でジゴ
キシゲニンによって２回標識された)２００ng／ミリリ
ットルを添加する。かくして、試験におけるＤＮＡ分析
物濃度は６.２５、１２.５、２５および５０ng／ミリリ
ットルである。
【００４９】ＨＢＶ−Ｏli ２５−３（２３２７−２３
５６位、３０mer、１ビオチン）、配列番号５： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGA
CGAC−３'
５６位、３０mer、１ビオチン）、配列番号５： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGA
CGAC−３'
【００５０】ＨＢＶ−Ｏli ２５−４（２３２７−２３
５６位、３０mer、２ビオチン）、配列番号６： ５'-Ｔ-(bio-ＡＭII)-CACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAC
-(ＡＭII-bio-)Ｔ-３'
５６位、３０mer、２ビオチン）、配列番号６： ５'-Ｔ-(bio-ＡＭII)-CACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAC
-(ＡＭII-bio-)Ｔ-３'
【００５１】ＨＢＶ−Ｏli ３３−１（２３３２−２３
５１位、２０mer、１ビオチン）、配列番号７： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CCGGAAACTACTGTTGTTAG−３'
５１位、２０mer、１ビオチン）、配列番号７： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CCGGAAACTACTGTTGTTAG−３'
【００５２】ＨＢＶ−Ｏli ３３−２（２３３２−２３
５１位、２０mer、２ビオチン）、配列番号８： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CCGGAAACTACTGTTGTTAG−(Ａ
ＭII−Ｂio)−Ｔ−３'
５１位、２０mer、２ビオチン）、配列番号８： ５'−Ｔ−(bio−ＡＭII)−CCGGAAACTACTGTTGTTAG−(Ａ
ＭII−Ｂio)−Ｔ−３'
【００５３】所定の位置はＨＢＶゲノムに関係する。
【００５４】ハイブリダイゼーション調製物を３７℃で
３時間振盪する。次いで、３７℃で０.３Ｍ ＮaＣl、
０.０３Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％ドデシル硫酸ナ
トリウムで２×１０分、次いで、室温で、０.９％ＮaＣ
lで簡単に１回洗浄する。次いで、抗ジゴキシゲニン抗
体−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲ
ート体(１００mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ７.５、０.９％Ｎ
aＣl、１％ＢＳＡ中２００mＵ／ミリリットル)２００マ
イクロリットルを添加し、振盪しつつ、３７℃で３０分
間インキュベートする。０.９％ＮaＣlで３回、再度洗
浄した後、基質溶液(１.９mＭ ＡＢＴＳR)をピペットで
入れ、３７℃で３０分間、再度振盪し、次いで、ＥＬＩ
ＳＡ読取器によって４０５nmで吸光度を測定する。
３時間振盪する。次いで、３７℃で０.３Ｍ ＮaＣl、
０.０３Ｍクエン酸ナトリウム、０.２％ドデシル硫酸ナ
トリウムで２×１０分、次いで、室温で、０.９％ＮaＣ
lで簡単に１回洗浄する。次いで、抗ジゴキシゲニン抗
体−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲ
ート体(１００mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ７.５、０.９％Ｎ
aＣl、１％ＢＳＡ中２００mＵ／ミリリットル)２００マ
イクロリットルを添加し、振盪しつつ、３７℃で３０分
間インキュベートする。０.９％ＮaＣlで３回、再度洗
浄した後、基質溶液(１.９mＭ ＡＢＴＳR)をピペットで
入れ、３７℃で３０分間、再度振盪し、次いで、ＥＬＩ
ＳＡ読取器によって４０５nmで吸光度を測定する。
【００５５】３０ntオリゴヌクレオチドに関する結果を
「図４」に示し、２０ntオリゴヌクレオチドに関する結
果を「図５」に示す。
「図４」に示し、２０ntオリゴヌクレオチドに関する結
果を「図５」に示す。
【００５６】実施例４ １回および２回標識オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ生
成物の検出 Ｂ型肝炎ウイルスに関するＤＮＡ試験について、まず、
ポリメラーゼ連鎖反応(ＥＰ−Ａ−０２００３６２)によ
ってウイルスＤＮＡを増幅させる。この増幅の間に、ジ
ゴキシゲニンは、Ｄig−１１−dＵＴＰの形態でＤＮＡ
と一体化される(ＥＰ−Ａ−３２４４７４)。次いで、こ
のハプテンによって、ヘテロジニアス免疫アッセイでＰ
ＣＲ生成物が高感度で検出される。領域がＰＣＲ生成物
の領域と相補的なビオチン標識オリゴヌクレオチドによ
って、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡのストレプトアビトジ
ン塗布管壁への結合を行う。抗ジゴキシゲニン抗体−ホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート体
を使用して、再度、該試験を行い、次いで、着色反応を
行う。
成物の検出 Ｂ型肝炎ウイルスに関するＤＮＡ試験について、まず、
ポリメラーゼ連鎖反応(ＥＰ−Ａ−０２００３６２)によ
ってウイルスＤＮＡを増幅させる。この増幅の間に、ジ
ゴキシゲニンは、Ｄig−１１−dＵＴＰの形態でＤＮＡ
と一体化される(ＥＰ−Ａ−３２４４７４)。次いで、こ
のハプテンによって、ヘテロジニアス免疫アッセイでＰ
ＣＲ生成物が高感度で検出される。領域がＰＣＲ生成物
の領域と相補的なビオチン標識オリゴヌクレオチドによ
って、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡのストレプトアビトジ
ン塗布管壁への結合を行う。抗ジゴキシゲニン抗体−ホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート体
を使用して、再度、該試験を行い、次いで、着色反応を
行う。
【００５７】１ミリリットル当たりＢ型肝炎ウイルス１
×１０10個のウイルス力価を有するＨＢe−陽性ヒト血
漿を、該希釈液中のウイルス含量がウイルス１×１０7
個／ミリリットルとなるように、正常な血清中で希釈す
る。溶解のために、ウイルス希釈液１０マイクロリット
ルに０.２Ｍ ＮaＯＨ １０マイクロリットルを添加し、
３７℃で１時間インキュベートする。中和混合物(１０
０mＭ ＫＣl、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ６.５、３mＭ
ＭgＣl2)３０マイクロリットルの添加によって溶解調
製物を中和する。次なる増幅反応でこの溶液２０マイク
ロリットルを使用する（増幅条件：５０mＭ ＫＣl、１
０mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ８.９、１.５mＭ ＭgＣl2、
０.０１％ゼラチン中、ＰＣＲプライマー各々２００n
Ｍ、dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ各々２００μＭ、dＴＴ
Ｐ １７５μＭ、ジゴキシゲニン−１１−２'−dＵＴＰ
２５μＭ、サーマス・アクアティカス(Ｔhermus aquati
cus)ＤＮＡポリメラーゼ２.５Ｕ；合計容量１００マイ
クロリットル）。該調製物を鉱油１００マイクロリット
ルの層で被覆し、サーモ−サイクラー(thermo-cycler)
[パーキン−エルマー(Ｐerkin−Ｅlmer)]（９２℃で３
０秒、５０℃で３０秒、７０℃で６０秒）で３０サイク
ルの間インキュベートする。
×１０10個のウイルス力価を有するＨＢe−陽性ヒト血
漿を、該希釈液中のウイルス含量がウイルス１×１０7
個／ミリリットルとなるように、正常な血清中で希釈す
る。溶解のために、ウイルス希釈液１０マイクロリット
ルに０.２Ｍ ＮaＯＨ １０マイクロリットルを添加し、
３７℃で１時間インキュベートする。中和混合物(１０
０mＭ ＫＣl、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ６.５、３mＭ
ＭgＣl2)３０マイクロリットルの添加によって溶解調
製物を中和する。次なる増幅反応でこの溶液２０マイク
ロリットルを使用する（増幅条件：５０mＭ ＫＣl、１
０mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ８.９、１.５mＭ ＭgＣl2、
０.０１％ゼラチン中、ＰＣＲプライマー各々２００n
Ｍ、dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ各々２００μＭ、dＴＴ
Ｐ １７５μＭ、ジゴキシゲニン−１１−２'−dＵＴＰ
２５μＭ、サーマス・アクアティカス(Ｔhermus aquati
cus)ＤＮＡポリメラーゼ２.５Ｕ；合計容量１００マイ
クロリットル）。該調製物を鉱油１００マイクロリット
ルの層で被覆し、サーモ−サイクラー(thermo-cycler)
[パーキン−エルマー(Ｐerkin−Ｅlmer)]（９２℃で３
０秒、５０℃で３０秒、７０℃で６０秒）で３０サイク
ルの間インキュベートする。
【００５８】ＰＣＲプライマーの位置のために(ＨＢＶ
ゲノムでのＰＣＲプライマー１：１９３７−１９６０
位；ＰＣＲプライマー２：２４３４ｃ−２４６０ｃ
位)、５００bp長さのＤＮＡ断片が製造され、次いで、
これをストレプトアビジン塗布微量滴定プレートにおけ
る二成分試験系で検出する。
ゲノムでのＰＣＲプライマー１：１９３７−１９６０
位；ＰＣＲプライマー２：２４３４ｃ−２４６０ｃ
位)、５００bp長さのＤＮＡ断片が製造され、次いで、
これをストレプトアビジン塗布微量滴定プレートにおけ
る二成分試験系で検出する。
【００５９】血清１ミリリットル当たりウイルス１×１
０7個の初期ウイルス濃度に関してウイルス１×１０5〜
１×１０4個／ミリリットルの範囲に匹敵する希釈がな
されるようにＰＣＲ調製物をＨ2Ｏで希釈する。変性の
ため、該希釈ＰＣＲ調製物２０マイクロリットルを、室
温で１０分間、最終濃度０.１Ｎ ＮaＯＨ ５０マイクロ
リットル容量中でインキュベートする。変性溶液２０マ
イクロリットルをハイブリダイゼーション溶液(１Ｍ Ｎ
aＣl、０.１Ｍ クエン酸ナトリウム、６７.５mＭリン酸
ナトリウム、０.０５％ＢＳＡ、pＨ６.７)１８０マイク
ロリットルと一緒に微量滴定プレートのストレプトアビ
ジン塗布ウエル中にピペットで入れる。該ハイブリダイ
ゼーション緩衝液にビオチン標識オリゴヌクレオチドを
１００ng／ミリリットルの濃度で添加する：
０7個の初期ウイルス濃度に関してウイルス１×１０5〜
１×１０4個／ミリリットルの範囲に匹敵する希釈がな
されるようにＰＣＲ調製物をＨ2Ｏで希釈する。変性の
ため、該希釈ＰＣＲ調製物２０マイクロリットルを、室
温で１０分間、最終濃度０.１Ｎ ＮaＯＨ ５０マイクロ
リットル容量中でインキュベートする。変性溶液２０マ
イクロリットルをハイブリダイゼーション溶液(１Ｍ Ｎ
aＣl、０.１Ｍ クエン酸ナトリウム、６７.５mＭリン酸
ナトリウム、０.０５％ＢＳＡ、pＨ６.７)１８０マイク
ロリットルと一緒に微量滴定プレートのストレプトアビ
ジン塗布ウエル中にピペットで入れる。該ハイブリダイ
ゼーション緩衝液にビオチン標識オリゴヌクレオチドを
１００ng／ミリリットルの濃度で添加する：
【００６０】ＨＢＶ−Ｏli ３４−１（２２９９−２３
１３位、１５mer、１ビオチン）、配列番号９： ５'−Ｔ−(ＡＭII−bio)−AGACCACCAAATGCC−３'
１３位、１５mer、１ビオチン）、配列番号９： ５'−Ｔ−(ＡＭII−bio)−AGACCACCAAATGCC−３'
【００６１】ＨＢＶ−Ｏli ３４−２（２２９９−２３
１３位、１５mer、２ビオチン）、配列番号１０： ５'−Ｔ−(ＡＭII−bio)−AGACCACCAAATGCC−(bio−Ａ
ＭIIＨ)−Ｔ−３'
１３位、１５mer、２ビオチン）、配列番号１０： ５'−Ｔ−(ＡＭII−bio)−AGACCACCAAATGCC−(bio−Ａ
ＭIIＨ)−Ｔ−３'
【００６２】振盪しつつ、３７℃で３時間、ハイブリダ
イゼーション調製物をインキュベートする。次いで、該
溶液を吸引し、該ウエルを０.９％ＮaＣlで３回洗浄す
る。２００mＵ／ミリリットル抗ジゴキシゲニン抗体−
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート
体の１００mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ７.５、０.９％ＮaＣ
l、１％ＢＳＡ中溶液２００マイクロリットルを添加
し、３７℃で３０分間インキュベートする。０.９％Ｎa
Ｃlで再度洗浄した後、ＡＢＴＳR２００マイクロリット
ルの添加によって基質反応を開始する。３０分後に４０
５nmで光度測定を行う。結果を「図６」に示す。
イゼーション調製物をインキュベートする。次いで、該
溶液を吸引し、該ウエルを０.９％ＮaＣlで３回洗浄す
る。２００mＵ／ミリリットル抗ジゴキシゲニン抗体−
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート
体の１００mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ７.５、０.９％ＮaＣ
l、１％ＢＳＡ中溶液２００マイクロリットルを添加
し、３７℃で３０分間インキュベートする。０.９％Ｎa
Ｃlで再度洗浄した後、ＡＢＴＳR２００マイクロリット
ルの添加によって基質反応を開始する。３０分後に４０
５nmで光度測定を行う。結果を「図６」に示す。
【００６３】
【発明の効果】本発明によれば固定化の効果を増大させ
た高感度の核酸の分析が行える。
た高感度の核酸の分析が行える。
【００６４】
【００６５】配列番号：１ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２４５６ｃ−２４１７ｃ（Ｈpb
adw−データバンク） アンチセンス 修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチンを介してアミ
ノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAT TGA GAT TCC CGA GAT TGA GAT CTT CTG CGA CGC GGC G-3'
adw−データバンク） アンチセンス 修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチンを介してアミ
ノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAT TGA GAT TCC CGA GAT TGA GAT CTT CTG CGA CGC GGC G-3'
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２４５６ｃ−２４１７ｃ アンチセンス 修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ５ビオチンを介してア
ミノモディファイヤーII５個と結合させる。 配列 ５’−Ｎ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＧＣ Ｇ−３’
ミノモディファイヤーII５個と結合させる。 配列 ５’−Ｎ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＧＣ Ｇ−３’
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２４５６ｃ−２４１７ｃ アンチセンス 修飾Ｎ：この上のＴを、３’−Ｏ １０ビオチンを介し
てアミノモディファイヤーII１０個と結合させる。 配列 5'-N CAT TGA GAT TCC CGA GAT TGA GAT CTT CTG CGA CGC GGC G-3'
てアミノモディファイヤーII１０個と結合させる。 配列 5'-N CAT TGA GAT TCC CGA GAT TGA GAT CTT CTG CGA CGC GGC G-3'
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：４２塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２４５６ｃ−２４１７ｃ アンチセンス ５'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 ５’−Ｎ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＧＣ Ｎ−３’
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 ５’−Ｎ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＧＣ Ｎ−３’
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２３２７−２３５６ 修飾Ｎ：この上のＴを、３’−Ｏ ビオチンを介してア
ミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAC TTC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GAC GAC 3'
ミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAC TTC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GAC GAC 3'
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２３２７−２３５６ ５'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAC TTC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GAC GAC N-3'
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N CAC TTC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GAC GAC N-3'
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２３３２−２３５１ 修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチンを介してア
ミノモディファイヤーIIに結合させる。 配列 5'-NC CGG AAA CTA CTG TTG TTA G-3'
ミノモディファイヤーIIに結合させる。 配列 5'-NC CGG AAA CTA CTG TTG TTA G-3'
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾Ｎを有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２３３２−２３５１ ５'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-NC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GN-3'
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-NC CGG AAA CTA CTG TTG TTA GN-3'
【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：１６塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾を有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２２９９−２３１３ 修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチンを介してア
ミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N AGA CCA CCA AAT GCC-3'
ミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N AGA CCA CCA AAT GCC-3'
【００７４】配列番号：１０ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：ヌクレオチド配列 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：修飾を有するゲノムＤＮＡの一部分 存在位置：ＨＢＶゲノム２２９９−２３１３ ５'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、３'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N AGA CCA CCA AAT GCC N-3'
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 ３'末端での修飾Ｎ：この上のＴを、５'−Ｏ ビオチン
を介してアミノモディファイヤーIIと結合させる。 配列 5'-N AGA CCA CCA AAT GCC N-3'
【図１】 サンドイッチ試験において本発明の捕捉プロ
ーブＦを介する核酸分析物Ａの、ストレプトアビジンＳ
を塗布した固相への結合を示す模式図。
ーブＦを介する核酸分析物Ａの、ストレプトアビジンＳ
を塗布した固相への結合を示す模式図。
【図２】 本発明の捕捉プローブを介する標識核酸分析
物Ａ'の、ストレプトアビジンＳを塗布した固相壁への
結合を示す模式図。
物Ａ'の、ストレプトアビジンＳを塗布した固相壁への
結合を示す模式図。
【図３】 固定化可能な基を、本発明に従って該基を分
離することによって、隣接ヌクレオチド上に配置するサ
ンドイッチ核酸試験の感度の増大を示すグラフ。
離することによって、隣接ヌクレオチド上に配置するサ
ンドイッチ核酸試験の感度の増大を示すグラフ。
【図４】 ３０ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド
についてビオチン残基１個の使用と比較してビオチン残
基２個を使用する場合のサンドイッチ試験における感度
の増大を示すグラフ。
についてビオチン残基１個の使用と比較してビオチン残
基２個を使用する場合のサンドイッチ試験における感度
の増大を示すグラフ。
【図５】 ２０ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド
についてビオチン残基１個の使用と比較してビオチン残
基２個を使用する場合のサンドイッチ試験における感度
の増大を示すグラフ。
についてビオチン残基１個の使用と比較してビオチン残
基２個を使用する場合のサンドイッチ試験における感度
の増大を示すグラフ。
【図６】 核酸分析物を増幅し、同時にＰＣＲによって
標識し、ビオチン残基１個または２個を有する１５ヌク
レオチド長さの核酸プローブを捕捉プローブとして使用
した方法についての感度の比較を示すグラフ。
標識し、ビオチン残基１個または２個を有する１５ヌク
レオチド長さの核酸プローブを捕捉プローブとして使用
した方法についての感度の比較を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュテファニー・ケーラー ドイツ連邦共和国デー−8130シュタルンベ ルク、ヴュルムシュトラーセ22アー番 (72)発明者 コルネリア・クルーゼ・ミュラー ドイツ連邦共和国デー−8132トゥートツィ ング、ベリンガーヴェーク10番 (72)発明者 ルドルフ・ザイブル ドイツ連邦共和国デー−8122ペンツベル グ、サーランガーシュトラーセ46番
Claims (4)
- 【請求項１】 検出可能に標識した核酸または検出可能
に標識した核酸ハイブリッドを、固定化可能な核酸プロ
ーブとハイブリダイズし；得られたハイブリッドを固定
化し；標識の量によって固定化ハイブリッドの量を検出
することからなり、 該固定化可能な核酸プローブがヌクレオチド配列におい
て直接隣接していない固定化可能な基によって修飾され
たヌクレオチド２個以上を含有することを特徴とする核
酸分析物の検出方法。 - 【請求項２】 修飾ヌクレオチドが核酸プローブの末端
ヌクレオチドを示す請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 核酸の固定化のために使用する、ヌクレ
オチド配列において直接隣接していない固定化可能な基
によって修飾されたヌクレオチド２個以上を含有する核
酸。 - 【請求項４】 各ヌクレオチド配列において直接隣接し
ていない固定化可能な基によって修飾されたヌクレオチ
ド２個以上を含有する核酸１個以上および該核酸の固定
化可能な基に対する特異的親和性を有する少なくとも１
つの固相を含有することを特徴とする核酸検出用システ
ム。
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