JP2010512327A

JP2010512327A - 病的血管形成および脈管透過性の処置用の組成物および方法

Info

Publication number: JP2010512327A
Application number: JP2009540334A
Authority: JP
Inventors: リディーン; ジョーンズクリストファー; ロンドンネイル
Original assignee: ユニヴァーシティーオブユタリサーチファウンデーション
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2010-04-22
Also published as: US20110263483A1; WO2008073441A2; BRPI0720038A2; US20130102534A1; US20100069301A1; EP2104509A2; WO2008073441A3; US8309519B2; EP2104509A4; CN101600451A; US7994130B2; KR20090089462A; CA2672297A1

Abstract

脈管透過性および病的血管形成を抑制するための化合物、組成物および方法をここに記載する。脈管透過性および病的血管形成を抑制することが可能な化合物および組成物を生産および選別するための方法もまた、本出願に記載する。製薬上の組成物は本出願に記載の組成物に含まれる。本出願に記載の組成物は、たとえば、脈管透過性および病的血管形成を抑制する方法であって、特定の血管形成、透過性および炎症性因子で、たとえば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびトロンビンのようなものによって誘発される脈管透過性および病的血管形成を抑制する方法が含まれるものにおいて有用である。特定の病気および条件群を処置するための方法もまた本出願において提供する。

Description

（連邦政府により支援された研究に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられるグラント1R01 HL77671-01の下に、政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を持つ。

（本発明の背景）任意の器官系（オルガンシステム）の脊椎動物の脈管構造（vasculature）の形成は複合プロセスであり、それは増殖因子およびガイダンスキューの一群（コンスティレーション）によって組織化される（Jain（ジェイン）ら、2003年）が、最近の調査は、血管形成を調整（規制）するシグナルカスケード（信号伝達鎖）の本発明者らの理解を劇的に増加させた。たとえば、分子プログラムは、アクソン（軸索）の軌道（trajectory）および神経ネットワーク（回路網）の形成を方向づけ、成熟した脈管ネットワークの高度にステレオタイプのパターンを生み出すことにおいて重要な役割を持つことは、ますます明らかである（Carmeliet（カルメライト）ら、2005年；Urness（アーネス）ら、2004年；およびJones（ジョーンズ）ら、2007年）。

哺乳類において脈管発生（vascular development）の初期相の間、それは、脈管形成と呼ばれ、内皮細胞は分化し、移動し、および合体して、中心軸の血管（central axial vessel）、背の大動脈および主静脈を形成する。第2相は、血管形成と呼ばれ、成熟した循環系を形成するために新生神経叢からの新しい血管の出芽によって特徴づけられる。VEGF（またはVPF）は、これらの最初の2つの相の双方のために重要であり、すなわち、血管形成の間の内皮細胞の分化および生存ならびに血管形成の間の増殖および透過性である。この血管形成のリモデリング（再構築）に次いで、内皮は血小板由来増殖因子（PDGF）を分泌し、それは脈管平滑筋細胞の補充（リクルートメント、漸増）および分化を誘導する。しかる後、脈管平滑筋細胞はアンジオポエチンを分泌し、それは内皮および脈管平滑筋細胞の間の適切な相互作用を確実にする。最後に、脈管平滑筋細胞は、マトリックス（基材）タンパク質で、エラスチンのようなものを堆積し、それは脈管平滑筋細胞の増殖および分化を抑制し、それによって成熟した血管を安定化させる。このようにして、成熟した脈管ネットワークを確立し、および維持するために、血管の内皮および平滑筋コンパートメント（区画）は、自己分泌およびパラ分泌シグナル伝達（シグナリング）を介して相互作用しなければならない。脈管内皮を形成する内皮細胞間のギャップ（間隙）（細胞間結合）は、組織のタイプ（種類）および生理的状態に応じて厳密に調整される。たとえば、成熟した脈管床において、内皮細胞は互いに無関係に振る舞わず、むしろそれらは単層を形成するもので、それは内皮ルーメン（内腔）からの周囲の組織中への、タンパク質、流体（flud）および細胞の動きを防止する。

発生（発達）後でさえ、脈管系は、損傷、虚血、および炎症を引き起こす事象（イベント）、条件または病原体に絶えずさらされ、それは典型的に、サイトカインおよび血管形成因子で、脈管内皮増殖因子（VEGF）のようなものの放出を招く。初期に、VEGFは、脈管透過性因子（VPF）として、血管が漏れるように誘導するその能力に基づき、記述され、精製され、およびクローン化された。VEGFは内皮細胞-細胞間結合を不安定化し、内皮透過性に導き、内皮増殖および移動を刺激し、および脈管の出芽および浮腫を促す。これらの機能は、漏出性の新しい血管を生産する安定な脈管ネットワークを解体するのに役立つ。多くの状況において、損傷、虚血および炎症に応じたサイトカインおよび血管形成因子の放出は望ましく、そのような反応が導かれる点で、回復性の、または治癒（ヒーリング）のプロセスが惹起される。しかし、過剰な血管形成および血液漏出（例は、内皮透過性亢進）は、いくつかの病気および病的条件の病状を強調する。

たとえば、先進国世界において、網膜の、または脈絡叢の脈管床において、病的血管形成および内皮透過性亢進は、破局的な視力喪失の最も普通の原因である。新しく、および機能障害性の血管は、漏出し、出血し、または順に、浮腫、出血、または視力を損なう網膜剥離（retinal detachment compromising vision）を沈降する、線維症を刺激する。この病変形成を共有している主要な病気には、増殖糖尿病網膜症（DR）、非増殖糖尿病性黄斑浮腫（DME）、および加齢黄斑変性（AMD）が含まれる（Dorrell（ドレル）ら、2007年；Afzal（アフザル）ら、2007年）。65歳より上のおよそ1500万人のアメリカ人はAMDを患い、そしてこれらの患者の10%は、脈絡叢の新脈管新生（neovascularization）の結果として視力喪失を経験する。さらに、1600万人よりも多いアメリカ人は糖尿病であり、そして400,000人を超える新しい患者は網膜浮腫または新脈管新生を患う。2億人の糖尿病患者の現在の数字が世界的に次の20年において倍化し、およびそのような患者の8%を超えるものが微小脈管合併症（microvascular complications）を患いそうであると考えれば、糖尿病性眼病変からの視力喪失を経験する患者の数は残念なことに急速に増加することになっている。DR、DMEおよびAMDより流行的でないけれども、未熟児網膜症（ROP）および虚血性網膜静脈閉塞（IRVO）はまた、網膜または脈絡叢の脈管床において病的血管形成および内皮透過性亢進と関係し、そして効果的処置を欠く。

目の病気に加えて、病的血管形成はまた、腫瘍形成および増殖と関係する。腫瘍血管形成は、がん性の増殖中に侵入する血管のネットワークのまん延であり、栄養分および酸素が供給され、そして老廃物が除去される。血管形成と共に腫瘍増殖が進展し、それが伴わずに、それが停止する。腫瘍血管形成は、実際に、周囲の正常な宿主組織に信号を送る分子を放出するがん性腫瘍細胞から始められる。このシグナリング（信号伝達）は、宿主組織において一定の遺伝子を活性化し、それは順に、新しい血管の増殖を働きかけるためにタンパク質を作成する。血管形成は、アクチベーター（活性化因子）およびインヒビター（抑制剤）の分子の双方によって調整される。通常の条件下に、インヒビターは優勢であり、増殖がブロック（遮断）される。しかし、腫瘍の形成および増殖の間、腫瘍細胞は血管形成のアクチベーターを放出し、そのようなアクチベーターを数/濃度において増加させる。血管形成のアクチベーターにおけるそのような増加は、脈管内皮細胞の増殖および分裂を、および最終的に、新しい血管の形成を招く。

1ダースよりも多くの異なるタンパク質、ならびにいくつかのより一層小さな分子は、“血管形成性（angiogenic）”であるとして識別された。これらの分子の中で、2つのタンパク質は腫瘍の増殖を支えるために最も重要に見え、すなわち、脈管内皮増殖因子（VEGF）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）である。VEGFおよびbFGFは、多くの種類のがん細胞によって、そして一定の種類の通常の細胞によって生産される。VEGFおよびbFGFは、最初に腫瘍細胞の内部で合成され、そして次いで周囲の組織中に分泌される。それらが内皮細胞に遭遇するとき、それらは特定のタンパク質と結合し、そしてレセプター（受容体）と呼ばれ、細胞の外面に構える。VEGFまたはbFGFのいずれかをその適切な受容体に結合することは、内皮細胞の核に信号を送る一連のリレー（中継）タンパク質を活性化する。核信号は、最終的に一群の遺伝子が生産物を新しい内皮細胞増殖のために必要になるようにさせる。VEGFまたはbFGFによる内皮細胞の活性化は、新しい血管の創作に向けての一連のステップ（工程）を動かす。最初に、活性化された内皮細胞は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（細胞外基質分解酵素）（MMPs）、分解酵素の特別なクラス（部類）を生産する。これらの酵素は次いで、内皮細胞から周囲の組織中に放出される。MMPsは、細胞の間の空間を充填し、およびタンパク質および多糖類から形成される細胞外マトリックス（基質）−支持物質を分解する。このマトリックスの分解は、内皮細胞の移動を許容する。それらは周囲の組織中に移動すると、活性化された内皮細胞は分裂し始め、そして緩徐に血管の成熟したネットワークに発展する中空チューブ中に組織化される。

好ましくない脈管透過性によって特徴づけられる追加の病気および障害には、たとえば、脳腫瘍に関係する浮腫、悪性度に関係する腹水症、Meigs（メイグス）症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水、急性肺傷害、炎症性腸疾患、脳卒中での虚血/再灌流傷害、心筋梗塞、およびサイトカインストーム（急増）を招く感染性および非感染性の病気が含まれる。サイトカインストームは健康な、および活発な免疫系の全身性の発現（systemic expression）であるが、それは、迅速に繁殖することによって引き起こされる過剰免疫反応であり、そして高度にT細胞またはナチュラルキラー細胞を活性化し、そして150よりも多くの炎症性メディエーター（媒介物）（サイトカイン、酸素遊離基、および凝固因子）の放出を招く。炎症誘発性の（pro-inflammatory）サイトカイン（腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor）-アルファ、インターロイキン（InterLeukin）-1、およびインターロイキン-6のようなもの）および抗炎症性サイトカイン（インターロイキン（interleukin）10、およびインターロイキン1受容体アンタゴニスト（拮抗物質）のようなもの）の双方は、血清において高まり、そしてそれは激しいもの（the fierce）であり、そしてこれらのサイトカインの致死的なインタープレー（相互関係）は、“サイトカインストリーム”と呼ばれることが多い。

サイトカインストリームは、たとえば、移植片対宿主病（GVHD）、成人呼吸促迫症候群（ARDS）、敗血症、トリインフルエンザ、天然痘、および全身性炎症反応症候群（SIRS）を含む、多数の感染性および非感染性の病気において起こる場合がある。迅速な介入の不存在において、サイトカインストームは、永久的な肺損傷（permanent lung damage）および多くの場合、死を招くことがありうる。多くの患者はARDSを現し、それは容量過負荷（voume overload）または左室機能の低下（depressed left ventricular function）と関係しない肺水腫によって特徴づけられる。サイトカインストームを増悪する（precipitating）病気の末期の徴候には、次の１種またはそれよりも多くのもの、すなわち、低血圧；頻拍症（心搏急速）；呼吸困難；発熱；虚血または不十分な組織内灌流；制御不能な出血；重度の代謝調節不全；および多システム臓器不全が含まれうる。サイトカインストームを促進する感染からの死は、サイトカインストームから招かれる徴候に起因することが多く、そして従ってそれらは、関連した病原体によって直接引き起こされない。たとえば、重度のインフルエンザ感染における死は、トリインフルエンザまたは“鳥インフルエンザ（bird flu）”によるようなもので、それらは典型的にARDSの結果であり、それはウイルス感染によって引き金を引かれるサイトカインストームから招かれる。

血管形成および脈管透過性におけるその関与のため、多くの注意が、血管内皮増殖因子（VEGF）に集中した。VEGFによって媒介された血管形成および脈管性水腫を減少させる生産物は、目下、市場に出されており、そして患者にとって利用可能である。たとえば、抗VEGF抗体Ranibizumab（ラニビスマブ）（Lucentis（ルセンティス））、Bevacizumab（ベバシズマブ）（Avastin（アバスチン））の抗体断片（フラグメント）で、それは、それ自体でVEGF抗体であり（Rosenfeld（ローゼンフェルド）ら、2006年；Brown（ブラウン）ら、2006年）、AMDの処置のために商業上入手可能である。この生産物の発展および成功は、病気の処置および病的な血管形成または内皮的な透過性亢進に関係する条件のための代わりの戦略において膨大な商業上の利益に引き金を引いた。VEGFのシグナリングを抑制するための他のアプローチ（取組み）には、たとえば、抗VEGFアプタマー、可溶性VEGF受容体外部ドメイン、受容体チロシンキナーゼインヒビター抑制剤、およびVEGFまたはその受容体に対するsiRNAが含まれる。AMDに関して、そのような戦略は見込みを示した。しかし、病的血管形成および血液漏出に関係した他の条件を処置するための似た取組みにおける途方もなく大きな関心が残る。さらに、VEGFが、血管形成および脈管透過性に貢献する、多くの血管形成、透過性および炎症性の因子のうちの1種に過ぎず、経路を識別し、およびVEGFの機能ならびに他の血管形成、透過性、または炎症性の因子の機能に影響を及ぼす方法を開発することにおいて、継続される価値が存在する。

（概略）概して、化合物、組成物および方法で、脈管透過性および病的な血管形成を抑制するためのものを、本明細書に記載する。脈管透過性および病的な血管形成を抑制することが可能な化合物および組成物を生産し、そして選別するための方法もまた、本明細書に記載する。製薬上の組成物は本明細書に記載する組成物に含まれる。

たとえば、本記載に従う組成物は、たとえば、脈管透過性および病的な血管形成を抑制する方法において用いることができ、その方法には、特定の血管形成、透過性および炎症性の因子で、たとえば、VEGF、bFGFおよびトロンビンのようなものによって誘導される脈管透過性および病的な血管形成を抑制する方法が含まれる。特定の病気および条件を処置するための方法もまた、本明細書に提供される。

本明細書で提供する明細書の追加的な局面は、例および材料および方法、特許請求の範囲、および図を含み、図面の簡単な説明を含める、詳細な説明への参照によって明らかになる。

添付の図面は、それは本明細書において組み込まれ、その1部分を構成し、それは開示された方法および組成物のいくつかの具体例を例証し、そして記載と一緒に、開示された方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。本明細書で用いられるように、用語“モック（模擬試験）”は、活性なSlit（スリット）タンパク質を含まない見せかけの（sham）調製を指し示す。

Robo（ロボ）4によって媒介される脈管ガイダンスが受容体の細胞質の尾部（テイル）を必要とすることを示す。48hpf TG（fli：egfp（高感度緑色蛍光タンパク質））y1の胚の共焦点顕微鏡検査の結果を示し、（A）注入されないもの、（B）robo4 モルフォリノ、（C）robo4モルフォリノおよび野生型のネズミrobo4 RNA、および（D）robo4 モルフォリノおよびrobo4Δテイル（尾部）RNAによって注入されるものである。定量化は図7に示される。図1Eは、robo4モルファントの胚における不完全な脈管ガイダンスのモデル（模型）を示す。5Xおよび20Xのイメージ（画像）はそれぞれ、左側および右側のパネル（鏡板）で示される。DLAV=背側の縦方向の合流する血管（dorsal longitudinal anastomosing vessel）。PAV=側索の血管（parachordal vessel）。DA=背側の大動脈。PCV =後側の主静脈（posterior cardinal vein）。走触性のRobo4に依存する抑制が細胞質の尾部のアミノ末端基の半分を必要とすることを示す。図2Aは、走触性の移動のアッセイにおいて用いられるcDNA構築物の略図を示す。TMは貫膜ドメイン（分域）を表す。CC0およびCC2は、Roboファミリー（系統群）において見出される保存された細胞質のシグナリングのモチーフ（主要素）である。HA=血球凝集素のエピトープ。図2Bは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でコ-トランスフェクション（同時形質移入）され、そして36時間後に、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物（Mock preparation）またはSlit（スリット）2のいずれかで被覆される膜の上で走触性の移動を受けたことを示す。Robo4構築物の発現はウェスタンブリッティング（ブロット法）（Inset（挿入図））によって確かめた。結果は、平均（mean）±SE（標準偏差）として提示する。図2Cは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でコ-トランスフェクション（同時形質移入）され、そして36時間後に、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物（Mock preparation）またはSlit（スリット）2のいずれかで被覆される膜の上で走触性の移動を受けたことを示す。Robo4構築物の発現はウェスタンブリッティング（ブロット法）（Inset（挿入図））によって確かめた。結果は、平均（mean）±SE（標準偏差）として提示する。 Robo4がHEK293細胞において、Hic-5およびパキシリン（細胞-マトリックス接着関連タンパク質）と相互作用することを示す。図3Aは、HEK293細胞がRobo4の細胞質の尾部-HAおよびHic-5-V5、またはエンプティー（空）のベクター（pcDNA3）およびHic-5-V5で、コ-トランスフェクションされたことを示す。Robo4はHA抗体とともに免疫沈降し、そしてHic-5はV5抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図3Bは、Cho-Kl、HEK 293およびNIH 3T3細胞からの全細胞溶解物が、Hic-5およびパキシリンに対する抗体を用いてプローブで探られたことを示す。図3Cは、HEK293細胞がパキシリン-V5およびRobo4の細胞質の尾部-HAまたは空のベクター（pcDNA3）でコ-トランスフェクションされたことを示す。Robo4はHA抗体とともに細胞溶解物から免疫沈降され、そしてパキシリンはV5抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図3Dは、HEK293細胞が全長Robo4-HAおよびパキシリン-V5でトランスフェクションされ、そして5分間Slit2で刺激されたことを示す。Robo4はHA抗体で細胞溶解物から免疫沈降され、そしてパキシリンはV5抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。パキシリンが、走触性のRobo4に依存する抑制のために必要である新しいモチーフを通してRobo4と相互作用することを示す。図4Aは、パネルBにおいて示されるプルダウンアッセイで用いられるGST- Robo4融合タンパク質の略図を示す。図4Bは、GST-Robo4融合タンパク質がE. coli（大腸菌）から精製され、そして組換え型の精製されたパキシリンとともにインキュベーションされたこと示す。パキシリンは、パキシリンに特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図4Cは、パネルDにおいて記載するプルダウンアッセイで用いられるGST-Robo4融合タンパク質の略図を示す。図4Dは、GST-Robo4融合タンパク質が精製された形態のE. coliであり、そして組換え型の精製されたパキシリンとともにインキュベーションされたことを示す。パキシリンは、パキシリンに特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図4Eは、GST-Robo4の野生型またはGST-Robo4ΔPIMがE. coliから精製され、そして組換え型の精製されたパキシリンとともに、またはインビトロ（試験管内）の転写された/翻訳されたMena（メナ）-V5においてインキュベーションされたことを示す。パキシリンおよびMenaはそれぞれ、パキシリンに特異的なモノクローナル抗体およびV5抗体を用いて検出された。図4Fは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のいずれかもで被覆される膜の上で走触性の移動を受けたことを示す。Robo4構築物の発現は、ウェスタンブロッティング（挿入図）によって確かめた。結果は、平均±SEとして提示される。 Robo4がRac（ラック）の不活化を通して広がる細胞を抑圧することを示す。図5Aは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、細胞伝播（拡散）アッセイ（cell spreading assay）を、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のどちらかで被覆されるカバーグラスの上で受けさせたことを示す。結果は、平均±SEとして提示される。図5Bは、HEK293細胞が指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のどちらかで被覆されるディッシュ（皿）の上へプレーティング（板状培養）されたことを示す。5分のインキュベーションに次いで、細胞を溶解し、そしてGTP-RacをGST-PBDとともに沈殿させた。Racは、Rac特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。 Robo4がRac（ラック）の不活化を通して広がる細胞を抑圧することを示す。図5Dは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、細胞伝播（拡散）アッセイ（cell spreading assay）を、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のどちらかで被覆されるカバーグラスの上で受けさせたことを示す。結果は、平均±SEとして提示される。図5Eは、HEK293細胞が指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のどちらかで被覆されるディッシュ（皿）の上へプレーティング（板状培養）されたことを示す。5分のインキュベーションに次いで、細胞を溶解し、そしてGTP-RacをGST-PBDとともに沈殿させた。Racは、Rac特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。 Robo4がRac（ラック）の不活化を通して広がる細胞を抑圧することを示す。図5Gは、HEK293細胞がGFPおよび指示された構築物でトランスフェクションされ、そして36時間後に、細胞伝播（拡散）アッセイ（cell spreading assay）を、5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のどちらかで被覆されるカバーグラスの上で受けさせたことを示す。結果は、平均±SEとして提示される。図5Hは、HUVECがSlit2とともに60分間インキュベーションされ、5分間25ng/mlのVEGFで刺激され、溶解され、そしてGTP-RacがGST-PBDとともに沈殿されたことを示す。Racは、Racに特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出されました。（C）および（F）の付着誘導-および（I）VEGF誘導されたRac活性化のSlit2に依存する抑制は、デンシトメトリー（濃度測定）によって定量化された。結果は、平均±SEとして提示される。 Robo4がRac（ラック）の不活化を通して広がる細胞を抑圧することを示す。パキシリンΔLim（リム）4変種（ミュータント）がRobo4と相互作用せず、または細胞伝播のSlit2-Robo4によって媒介される抑制を支持しないことを示す。図6Aは、パネルB、CおよびDにおいて用いられるパキシリンの構築物の略図を示す。図6Bは、HEK293細胞がRobo4細胞質の尾部-HAおよびパキシリン-V5、または空のベクター（pcDNA3）およびパキシリン-V5でコ-トランスフェクションされたことを示す。Robo4はHA抗体とともに細胞溶解物から免疫沈降し、そしてパキシリンはV5抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図6Cは、HEK293細胞がRobo4細胞質の尾部-HAおよび野生型のパキシリン-V5またはパキシリンΔLim4-V5のいずれかでコ-トランスフェクションされたことを示す。Robo4はHA抗体とともに免疫沈降し、そしてパキシリンはV5抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図6Dは、内因性パキシリンが、siRNAを用いるHEK293細胞においてノックダウン（解体）され、そして野生型のチキン（ニワトリ）のパキシリンまたはチキンのパキシリンΔLim4のいずれかでも再構成されたことを示す。ノックダウンおよび再構成は、パキシリン抗体でのウェスタンブロッティングによって視覚化され、デンシトメトリーによって定量化された。パキシリンの発現は、35%の野生型のレベルであると定められた。図6Eは、ノックダウン/再構成を受けたHEK293細胞が5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のいずれかで被覆されるカバーグラスの上で伝播アッセイを受けたことを示す。結果は平均±SEとして提示される。パキシリンの相互作用のモチーフが、リパルシブ（反発的）な脈管ガイダンスのために必要であることを示す。図7Aは、注入されてないもの（n=66）、robo4 モルフォリノ（n=56）、robo4モルフォリノ、そして、野生型のネズミrobo4 RNA（n=60）、robo4モルフォリノおよびrobo4ΔテイルRNA（n=17）、およびrobo4モルフォリノおよびrobo4ΔPIM RNA（n=45）を注入したTG（fli：egfp）y1胚において脈管のパタリングの欠陥（pattering defects）の定量化を示す。代表的なイメージは、図1に示される。図7Bは、細胞移動（遊走）、伝播およびRacの活性化を抑制するSlit2-Robo4シグナリング軸（アクシス）のモデルを示す。スプライス-ブロッキングのモルフォリノがゼブラフィッシュの胚においてrobo4の発現を抑圧することを示す。図8Aは、Danio rerio（ダニオ・レリオ、ゼブラフィッシュ）およびコード化されたRobo4タンパク質におけるrobo4遺伝子座の略図を示す。スプライス-ブロッキングのモルフォリノで引き金を引かれるエクソンは、robo4 cDNAを増幅するために用いるプライマーのロケーション（位置）であるように指示される。図8Bは、注入されない胚およびrobo4スプライスブロッキングのモルフォリノを注入される胚からのRNAが分離（単離）され、そしてcDNAを逆転写するために用いられたことを示す。cDNAは次いで、robo4を増幅するために用いられ、そして結果として生じる断片（フラグメント）はアガロースゲル電気泳動によって分けられ、および臭化エチジウム染色によって視覚化された。 Hic-5がRobo4相互作用性タンパク質であることを示す。図9Aは、全長Hic-5の略図を示し、そしてcDNAクローンは酵母の2-ハイブリッドスクリーン法（two-hybrid screen）から回収した。図9BはS. cerevisiae（サッカロマイセス・セレビシエ）株PJ694-Aが、指示されたプラスミドで形質転換され、ロイシンおよびトリプトファンまたはロイシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびアラニンが不足する合成培地（メディア）に板状培養した。栄養欠損培地上で増殖することができるコロニーは同じ培地の上へスポットされ、レプリカ板状培養され、および写真撮影またはベーターガラクトシダーゼアッセイのために用いられるかのいずれもであった。パキシリンの相互作用のモチーフがRobo4細胞質の尾部においてCC0およびCC2の間にあることを示す。ネズミRobo4タンパク質の略図およびパキシリンの相互作用のモチーフを備えるアミノ酸の識別である。 Robo4の細胞質の尾部がCdc42活性化を抑制せず、srGAP1と相互作用しないことを示す。図11Aは、Robo4を発現するHEK293細胞が5μg/mlのフィブロネクチンおよびモックの調製物またはSlit2のいずれかで被覆される細菌のペトリ皿上に板状培養されたことを示す。5分のインキュベーションに次いで、細胞を溶解し、そしてGTP-Cdc42はGST-PBDとともに沈殿された。Cdc42は、Cdc42に特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。図11Bは、HEK293細胞が指示されたプラスミドでトランスフェクションされ、そしてRobol/Robo4がHA抗体とともに免疫沈降したことを示す。srGAP1は、Flag M2抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された。 Slitが、未熟児網膜症を減らすことを示し、それは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、および加齢黄斑変性に影響を及ぼす因子のためのFDA標準である。図12Aは、モック調製物を受け入れる野生型マウスにおいて、Slitタンパク質を受け入れるそれらのものと比較して、網膜のパーセント新血管新生を示す。処置されたマウスにおける新血管新生での63%の縮小が、野生型マウスと比較してSlit処理されたマウスにおいて存在した。N=6、P<0.003。図12Bは、モックの調製物を受け入れる野生型マウスにおいて、塩類溶液（saline）のコントロールを受け入れるものと比較した網膜のパーセント新血管新生を示す。N=5、P<0.85。図12Cは、ノックアウトマウスにおけるslitと比較した網膜のパーセント新血管新生を示す。N=1。 slitおよびネトリンがVEGFによって誘導された皮膚（真皮）の透過性を減らすことができることを示す。 slitがVEGF媒介網膜透過性を減らすことができることを示す。セマフォリン様VEGFが皮膚透過性を増やすことを示す。 Robo4がArf6の抑制を通してRacに依存する突出性の（protrusive）活性をブロック（阻止）することを示す。安定してαIIbまたはαIIb-Robo4細胞質の尾部を発現するCHO-K1細胞は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンおよびフィブリノゲンでコート（被覆）されるディッシュの上で板状培養され、溶解され、そしてGTP-Arf6はGST-GGA3とともに沈殿された。Arf6は、Arf6-に特異的なモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって検出された（図16A参照）。安定してαIIbまたはαIIb-Robo4細胞質の尾部を発現するCHO-K1細胞は、GFPおよび空のベクターまたはGITl-PBSのいずれかでコトランスフェクションされ、そしてフィブロネクチンまたはフィブロネクチンおよびフィブリノゲンで被覆されるカバーグラス上で伝播アッセイを受けた。GFPに対して陽性の細胞のエリア（面積）は、SEMを指示するエラーバーを用い、ImageJ（イメージJ）を用いて定められた（図16B参照）。HEK293細胞はGFPおよび指示され構築物でコトランスフェクションし、そして36時間後に、フィブロネクチンおよびモック調製物またはSlit2タンパク質のいずれか上で伝播アッセイを受けさせた（図16C参照）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均±SEを指し示す。Robo4およびARNOの発現は、ウェスタンブロッティングによって確かめた（データは示さない）。HEK293細胞は、GFPおよび指示された構築物でコ-トランスフェクションし、そして36時間後に、フィブロネクチンおよび、モックの調製物またはSlit2タンパク質のいずれかで被覆したディッシュ上で板状培養した。GTP-Racは、GST-PBDとともに沈殿し、そしてRacはRac1に特異的なモノクローナル抗体で検出された（図16D参照）。 Robo4受容体がSlitリガンドと結合することを実証する免疫沈降反応の結果を例証する。図17Aは、トランスフェクションされなかったヒト胎児由来腎臓細胞（HEK）、mycエピトープをタグ付けられたSlitでトランスフェクションされたHEK細胞（Slit-myc）、HAエピトープをタグ付けられたRobo4でトランスフェクションされたHEK細胞（Robo4-HA）およびコントロールベクターでトランスフェクションされたHEK細胞（コントロール-HEK）からの細胞溶解物の免疫沈降の結果を示す。以前に報告されたように（レーン1）、Slit-mycの細胞溶解物のウェスタンブロット分析はコントロールとして役立ち、そしてSlitタンパク質がおよそ210kDの質量を持つことを実証する。Slit-mycタンパク質はまた、Slit-mycおよびRobo4-HA細胞可溶化物を組み合わせ、抗HA抗体とともに免疫沈降した後、抗myc抗体でのウェスタンブロットによって検出される（レーン6）。この相互作用の特異性は、溶解物のすべての他の組合せを有する検出可能なSlitタンパク質の不存在によって確かめられる。溶解物の同じ量が各々の実験において用いられた。レーン2-6におけるより一層低いバンドは、免疫グロブリンの重鎖に対応する。図17Bは、トランスフェクションされなかったHEK細胞（HEK CM）、mycエピトープをタグ付けられたSlitでトランスフェクションされたHEK細胞（Slit-myc CM）、HAエピトープをタグ付けられたRobo4のN末端可溶性細胞外ドメインでトランスフェクションされたHEK細胞（Robo4-HA CM）およびコントロールベクターでトランスフェクションされたHEK細胞（コントロール-HEK CM）からの条件培地の免疫沈降の結果を示す。全長のSlit-mycタンパク質（210KD）およびそのC-末端のタンパク質分解性断片（70のKD）は、抗myc抗体によってSlit-myc CMにおいて検出される。図17 Aにおけるように、Slit-mycタンパク質はまた、Slit-mycおよびRobo4-HA条件培地を組み合わせ、そして抗HA抗体とともに免疫沈降した後、ウェスタンブロットによって検出される（レーン6）。この相互作用の特異性は、条件培地のすべての他の組合せを有するSlitタンパク質の不存在によって確かめられる。図17C-図17Fにおいて示すように、Slitタンパク質は、Robo4を発現する細胞の原形質膜と結合する。Slit-mycタンパク質の結合は抗myc抗体および抗マウス抗体を接合される（conjugated）Alexa（アレキサ）594を用いて検出した。結合は、コントロール-HEK細胞（図17D）ではなくRobo4-HEK細胞（図17F）の表面上で検出される。 Robo4発現が内皮特異的およびストーク（柄）細胞中心（stalk-cell centric）であることを示す。図18Aは、P5 Robo4^+/APマウスから調製され、エンドムチン（Endomucin）（内皮細胞）、NG2（ペリサイト、周皮細胞）およびアルカリホスファターゼ（AP;Robo4）のために染色される網膜のフラットマウント（flatmounts）を例証する。左上パネルにおいて右を示している一番上の矢印は先端細胞（tip cell）を指し示し、そして残りの矢印は周皮細胞（NG2-ポジティブ（陽性）な）を指し示す。“T”もまた、先端細胞を指し示す。図18Bは、網膜のフラットマウントが成体Robo4^+/APマウスから調製され、そしてNG2（周皮細胞）およびAP（Robo4）のために染色され、網膜フラットマウントを例証し、周皮細胞（NG2-陽性）を指し示す図18Bにおいて含まれる矢印を有する。図18Cは、PECAM、Robo1およびRobo4について特異的なプライマーを用いる指示された試料上で実行される量的RT-PCR（qPCR）の結果を示す。図18Cにおいて用いられるように、“HAEC”は、ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells）を表し、“HMVEC”は、毛細血管内皮細胞（Human Microvascular Endothelial Cells）を表し、および“HASMC”は大動脈平滑筋細胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells）を表す。図18Dは、Robo4、VE-カドヘリン、平滑筋のアクチンおよびERK1/2に対する抗体を有するHMVECおよびHASMCからの総細胞溶解物をプローブで探る結果を例証する。 Robo4シグナリングがVEGF-Aによって誘導された移動、管形成、透過性およびSrcファミリーのキナーゼ（SFK）の活性化を抑制することを示す。Robo4^+/+とRobo4^AP/APマウスから分離される肺内皮細胞（ECs）が、内皮細胞移動（図19A）、管形成（図19B）、インビトロの透過性（図19C）、Miles（マイルス）アッセイ（図19D）および網膜の透過性のアッセイ（図19E）において用いられた。ヒトの微小血管内皮細胞は、モックの調製物またはSlit2タンパク質の存在下に、VEGF-Aで5分間刺激され、溶解され、およびリン酸VEGFR2抗体でのウェスタンブロッティング（図19F）、リン酸Src抗体でのウェスタンブロッティング（図19G）およびRac活性化のアッセイ（図19H）を受けた。すべてのパネルにおいて、*はp<0.05を表し、**はp<0.005を表し、***はp<0.0005を表し、NSは“有意でない”を示し、およびエラーバーはSEMを表す。 Robo4シグナリングは、酸素によって誘導された網膜症（“OIR”）の動物モデルにおいて、および脈絡叢の新血管新生（“CNV”）の動物モデルにおいて、病的な血管形成を抑制することを示す。新生仔のRobo4^+/+およびRobo4^AP/APのマウスは、酸素によって誘導された網膜症を受け、およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン（緑色）で灌流された。網膜のフラットマウントは、各条件のために調製され、および蛍光顕微鏡検査によって分析された。矢印は、病理学的な血管形成のエリアを指し示す（図20Aを通して図20Dまで）。図20Aから図20Dにおいて観察される病的な血管形成の定量化は、図20Eにおいて提供される。CNVモデルにおいて、2-3月齢のRobo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスがレーザーによって誘導された脈絡叢の新血管新生を受けた。脈絡叢のフラットマウントが調製され、イソレクチンで染色され、および共焦点顕微鏡法によって分析された（図20Fを通して図20Iまで）。図20Fを通して図20Iまでで観察される病的な血管形成の定量化は、図20Jにおいて提供される。すべてのパネルにおいて、*はp<0.05を表し、**はp<0.005を表し、***はp<0.0005を表し、NSは“有意でない”を示し、およびエラーバーはSEMを表す。 Robo4シグナリングがbFGFによって誘導される血管形成およびトロンビンで刺激された内皮透過性亢進を抑制することを例証する。図21Aにおいて例証される結果を提供する実験を遂行する際に、ネズミ肺内皮細胞は、bFGFおよびモックの調製物またはSlit2タンパク質の存在下にマトリゲル上で管形成アッセイを受けた。図21Bにおいて例証される結果を提供する実験を遂行する際に、ネズミ（muring）肺内皮細胞は、フィブロネクチン被覆のトランスウェル（Transwells）上でトロンビンによって誘導される透過性アッセイを受けた。 Robo4シグナリングが急性肺傷害のモデルにおいて傷害および炎症を減らすことを示す。マウスは気管内のLPSに曝され、Slitタンパク質またはモックの調製物のいずれかで処置された。炎症性の細胞の濃度および気管支肺胞洗浄（BAL）におけるタンパク質は、Slitタンパク質での処置によって著しく減らされた。 Slitタンパク質のための異なる構築物を例証し、およびSlit2-D1（40kD）と同じくらい小さなその組換え型Slitペプチドが活性であることを示す。図23Aにおいて、Slitタンパク質のための異なる構築物を描く。4つのロイシン豊富なドメイン（LRR）、上皮増殖因子相同領域（EGF）およびc-末端タグ（MYC/HIS）が指し示される。異なるSlit構築物（2nM）によるVEGFによって媒介される内皮細胞移動の抑制は、図23Bに示される。トリインフルエンザのマウスモデルに従ってトリインフルエンザウイルスで感染されたマウスの生存に関して及ぼすSlitタンパク質を投与する影響を示す。例14において記載されるノックアウトマウスのゲノムの特色（genomic trait）を例証する。

材料、組成物および成分を開示し、それらは、そのために用いることができ、併用して用いることができ、そのための調製において用いることができ、または開示された方法および組成物の生産物である。これらおよび他の材料は、本明細書に開示し、そしてこれらの材料の組合せ、サブセット（部分集合）、相互作用、群、その他が開示されるとき、これらの化合物の各々の種々の個々のもの、および集合的組合せ（collective combination）および順列（permutation）の特定の言及は明示的に開示されないかもしれないが、各々は特に本明細書において予期され、および記載されることが理解される。たとえば、ポリペプチドが開示され、および議論され、およびポリペプチドを含む多数の分子に行われる多数の修飾が議論される場合、各々およびすべての組合せおよび順列のポリペプチドおよび可能な修飾は、とりわけそれと反対に示されない限り、特に予期される。それゆえ、分子A、B、およびCのクラス（部類）が分子D、E、およびFの分子のクラスと同様に開示され、および組合せの分子の例、A-Dが開示される場合、次いで各々が個々に規定されない場合でさえ、各々は個々におよび集合的に予期される。それゆえ、この例は、各々の組合せA-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、およびC-Fであり、それらは特に予期され、そしてA、B、およびC；D、E、およびF；そして、例の組合せA-Dの開示から開示されたと考慮されなければならない。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せはまた、特に予期され、および開示される。このように、たとえば、A-E、B-F、およびC-Eのサブ（下位）群は、特に予期され、およびA、B、およびC；D、E、およびF；そして、例の組合せA-Dの開示から開示されるものと考慮されなければならない。この概念は、この出願のすべての局面に適用され、それには、制限されないが、開示された組成物を作成し、および用いる方法における工程が含まれる。このように、実行することができる多種多様の追加的な工程がある場合、これらの追加的な工程の各々が、開示された方法の任意の特定の具体例、または具体例の組合せを用いて実行することができ、および各々のそのような組合せは特に予期され、および開示されたと考えなければならないと理解される。

この技術における熟練する者（当業者）は、単なる日常的な実験法、本明細書に記載する方法および組成物の特定の具体例に対する多くの等価物を認識し、または確定することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

開示された方法および組成物が記載された特定の方法論、プロトコル（手順）、および試薬に限られず、これらが変動しうるものと理解される。また、本明細書に用いる述語が特定の具体例だけを記述する目的であり、添付の特許請求の範囲によってだけ制限されるものである本発明の範囲が制限されることは意図されないと理解される。

他に定められない限り、本明細書で用いるすべての専門的および科学的な用語は本明細書の前後関係においてこの技術における技量の者によって普通に理解される意味を持つ。

本明細書において、および添付の特許請求の範囲において用いるように、単数形の“a”、“an”、および“the”には、前後関係で指図されない限り、複数の言及が含まれることに留意しなければならない。それゆえ、たとえば、“a polypeptide”への言及には、複数のそのようなポリペプチドが含まれ、“the polypeptide”への言及には、当業者、その他に知られるその1種またはそれよりも多くのポリペプチドおよび等価物（均等）への言及である。

“オプション（随意）の”または“オプション（随意）により”は、その後に記載された事象（発症）、状況、または材料が、起こりうるか、または存在しうるか、またはその可能性がないかを意味し、記載が、事象、事情、または材料が、起こるか、または存在するかの場合、およびそれが起こらないか、または存在しないかの場合が含まれることを意味する。

範囲は、本明細書において、“約”の1種の特定の値から、および/または“約”の別の特定の値にまでとして表現することができる。そのような範囲が表現されるとき、別の具体例には、1種の特定の値から、および/または他に特定の値までを含む。同様に、値が近似のものとして表されるとき、前例の“約”の使用によって、特定の値が別の具体例を形成することが理解される。範囲の各々の終点（エンドポイント）が他の終点に関して、および他の終点に無関係に、双方とも重要であることがさらに理解される。本明細書に開示する多数の値が存在し、そして各値が、その特定の値でそれ自身の値に加えて“約”としてまた開示されることもまた理解される。たとえば、その値“10”が開示されるならば、“約10”もまた開示される。また、値が開示されるとき、その値と“それより低いか、またはそれに等しい”、“その値よりも高いか、またはそれに等しい”および値の間の可能な範囲もまた、熟練者によって適切に理解されるように開示される。たとえば、値“10”が開示される場合、“10より低いか、またはそれに等しい”ならびに“10より高いか、またはそれに等しい”もまた開示される。また、本明細書全体で（the throughout the application）、データを多数の異なる形式（フォーマット）において提供し、およびこのデータが、終点および開始点を表し、およびデータ点の任意の組合せのために変動することは理解される。たとえば、特定のデータ点“10”および特定のデータ点15が開示されるならば、それは、10および15より高い、それより高いか、または等しい、それより低い、それより低いか、または等しい、およびそれに等しく、ならびに10および15の間が開示されると考えられることが理解される。また、2つの特定の単位の間の各単位もまた開示されるとも理解される。たとえば、10および15が開示されるならば、11、12、13、および14もまた明らかである。

本明細書で用いるように、用語“対象体（サブジェクト）”は、管理（投与）の任意の標的を意味する。対象体は、脊椎動物、たとえば、哺乳類であることができる。このように、対象体はヒトであることができる。用語は、特定の齢または性を表示しない。成体および新生仔の対象体、ならびに胎仔、雄性であるか、または雌性であるかは、範囲に入る（カバーされる）と意図される。受動体（患者）は病気または障害を患う対象体に言及する。用語“受動体”には、人間および獣医学の対象体が含まれる。

“抑制する”、“抑制性”、および“抑制”は、活性、反応、状態（条件）、病気、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、制限されないが、活性、反応、条件、または病気の完全なアブレーション（消失）が含まれる。これにはまた、たとえば、自然またはコントロールのレベルと比較して、活性、反応、条件、または病気における10%の減少が含まれうる。このように、減少は、自然またはコントロールのレベルと比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%、または特別に規定されたパーセンテージの間における任意の量の減少であることができる。

“促進する（プロモート）”、“促進”、および“促進性”は、活性、反応、条件、病気、または他の生物学的パラメータにおける増加に言及する。これには、制限されないが、活性、反応、条件、または病気の惹起が含まれる。これにはまた、たとえば、自然またはコントロールのレベルと比較して、活性、反応、条件、または病気における10%の増加が含まれうる。このように、活性、反応、条件、病気または他の生物学的パラメータにおける増加は、自然またはコントロールのレベルと比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%、またはそれよりも高いことができ、特別に規定されたパーセンテージの間での増加の任意の量が含まれる。

用語“治療上効果的な”は、用いる組成物の量が、病気または障害の1種またはそれよりも多くの原因または徴候を寛解するために十分な量のものであることを意味する。そのような寛解は、減少または変質（alteration）を、必ずしも排除ではなく、必要とするだけである。

用語“担体（キャリヤー）”は、化合物、組成物、物質、または構造で、それは、化合物または組成物との組合せにおいてのとき、その意図された使用または目的のために、調製、保管、管理、配送、有効性、選択性、または化合物または組成物の他の任意の特長も助け、または促すものを意味する。たとえば、担体は活性原材料の任意の分解をも最小にし、および対象体における任意の有害な副作用でも最小にするために選ぶことができる。

用語“調節配列”は、遺伝子座のコード領域の通常100-1000キロベース（kb）内のそれらの配列に言及するが、それらはまた、コード領域からより一層遠く離れていてよく、それは遺伝子の発現に影響を及ぼす。発現のそのような調節には、遺伝子の転写、および翻訳、スプライシング、およびメッセンジャー（伝令）RNAの安定性が包含される。

用語“操作可能に連結される”は、近位（juxtaposition、並置）に言及し、そこでは、そのように記載する構成要素が、それらに対し、それらの意図された様式において機能するのを許している関係にある。例として、プロモーターはコード配列に操作可能に連結され、それは、そのプロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合である。用語“操作可能に連結される”は、核酸発現コントロール配列（例は、転写因子結合部位のプロモーター、エンハンサー、またはアレイ）および第2の核酸配列の間の機能的な連結に言及しうるもので、そこでは、発現コントロール配列は第2の配列に対応する核酸の転写を指向する。

“分離（単離）された”は、本明細書において開示する生体分子を記載するのに用いるとき、例は、その自然環境の構成要素（コンポーネント）から識別され、および分離され、および/または回収されたペプチド、タンパク質、または核酸を意味する。その自然環境の汚染物質の構成要素は、典型的に分離された分子（群）のための診断または治療上の用途に干渉する物質であり、そして酵素、ホルモン類、および他のタンパク質性または非タンパク質性（non-proteinaceous）の物質を含みうる。本明細書に記載する生体分子の分離および精製のための方法は、この技術において既知であり、そして利用可能であり、分離または精製する物質に照らして適した分離および精製の方法を定めることができる。分離された生体分子は、それが本明細書において用いられるように、典型的に少なくとも1種の精製工程（ステップ）を用いて調製されるが、“分離される”は追加的に、たとえば、ペプチド、タンパク質、抗体、または核酸の物質の、インサイツで、組換え型細胞内でのものに言及し、それは、同種細胞のタイプにおいて発現する場合でさえである。

さらに、用語“分離される”、“実質純粋”、および“実質同種”は、モノマー（単量体の）タンパク質を記載するのに用いられ、それら互換的に本明細書において用いられる。試料の少なくとも約60から75%までが1種のポリペプチド配列を見せるとき、モノマータンパク質は実質純粋である。実質純粋なタンパク質は、典型的にタンパク質試料の約60から90%までのW/Wを構成することができ、そしてそこでは、望ましい、実質純粋なタンパク質は、約90%、約95%、または約99%を超えて純粋であることができる。タンパク質の純度または均質性（均一性）はこの技術においてよく知られた多数の手段で、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動のようなもので、次いでゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを視覚化することによって指し示すことができる。一定の目的のために、より一層高い分解能を、精製のために利用されるこの技術においてよく知られるHPLCまたは他の手段を用いて提供することができる。

この明細書の説明および特許請求の範囲の全体から、言葉“備える（comprise）”およびその言葉の変形で、“備えている（comprising）”および“備える（comprises）”のようなものは、“制限されないが含まれている”を意味し、そして、たとえば、他の添加物、構成要素、整数（integers、完全なもの）または工程を除外することを意図しない。

本明細書に用いるように、“脈管透過性”は、小分子（例は、イオン、水、栄養分）、大きな分子（例は、タンパク質および核酸（nuceic acids））または細胞全体（炎症の部位へ行く途中のリンパ球）でさえも、血管壁を通過する能力に言及する。

用語“病的”または“病的条件”は、病気、条件、事象または傷害の結果でありうる、健康な、正常の、または効果的な条件からの任意の逸脱をも言及する。

（タンパク質およびペプチド）

これらの用語が本明細書で用いられるように、“タンパク質”および“ペプチド”は単純には、ポリペプチド分子に概して言及し、そして任意の特定のサイズ（大きさ）、長さまたは分子量のポリペプチド分子に言及するためには用いられない。タンパク質の変種および誘導体は、この技術における技量の者によく理解され、そしてアミノ酸配列の修飾を包含することができる。たとえば、アミノ酸配列の修飾は典型的に、3つの部類の1種またはそれよりも多くのものに該当し、すなわち、置換の、挿入の、または欠失の変種である。挿入には、アミノおよび/またはカルボキシルの末端融合ならびに単一または多重のアミノ酸残基の配列内（intrasequence）挿入が含まれる。挿入は普通に、アミノまたはカルボキシルの末端融合の挿入よりも小さい挿入であり、たとえば、1種から4つの桁の残基の上でのものである。免疫原性融合タンパク質誘導体で、例において記載するもののようなものは、インビトロでの架橋結合（cross-linking）によって、または融合をコード化するDNAで形質転換された組換え型細胞培養によって、標的配列に免疫原性を付与するために十分に大きなポリペプチドを融合させることで作成される。欠失は、タンパク質配列から1種またはそれよりも多くのアミノ酸残基を除去することによって特徴づけられる。典型的に、約2から6までを超えない残基を、タンパク質分子の範囲内の任意の1種の部位で削除する。これらの変種は普通に、タンパク質をコード化するDNAのヌクレオチドの部位特異的変異によって調製され、それによって変種をコード化するDNAが生産され、およびその後、組換え型細胞培養においてDNAが発現される。既知の配列を持つDNAにおいて予め定められた部位での置換変異をもたらすための技術は、よく知られており、たとえば、M 13プライマー変異誘発（primer mutagenesis）およびPCR変異誘発である。アミノ酸置換は典型的に単一の残基のものであるが、同時に多数の異なる位置で起こすことができ；挿入は通常、約1から10個までのアミノ酸残基の桁でのものであり；および欠失は約1から30までの残基に及ぶ。欠失または挿入は、好ましくは、隣接した組、すなわち2つの残基の削除または2つの残基の挿入においてなされる。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せは、最終的な構築物に到達するために組合せうる。変異は、配列を読み枠（リーディングフレーム）の外に置いてはならず、そして好ましくは、二次的mRNA構造を生産することができる相補的な領域を創作しない。置換型の変種は、少なくとも1種の残基が除去され、そして異なる残基がその場所（place）において挿入されたものである。そのような置換は概して、以下の表1に従ってなされ、そして保存的な置換と称される。

機能における実質的変化または免疫学的同一性（アイデンティティ）は表1のものよりもあまり保存的でない置換を選ぶことによって作成され、すなわち、（a）置換の領域においてのポリペプチドの骨格の構造、たとえば、シートまたはらせん形のコンフォメーション（立体構造）として、（b）標的部位での分子の変化または疎水性、または（c）側鎖のかさ高さ（バルク）の維持に及ぼすそれらの効果におけるより一層有意に異なる残基を選定する。概して、タンパク質特性における最も大きな変化を生成するために予期される置換は、次のものであり、（a）親水性残基、例は、セリルまたはスレオニルで、疎水性残基のために（またはそれによって）置換され、例は、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルであり；（b）システインまたはプロリンは、任意の他の残基のために（またはそれによって）置換され；（c）陽性（electropositive）側鎖、例は、リジル、アルギニル、またはヒスチジルを持つ残基は、陰性残基のために（またはそれによって）置換され、例は、グルタミルまたはアスパルチルであり；または、（d）かさ高な側鎖を持つ残基、例は、フェニルアラニンは、側鎖を持たないもののために（またはそれによって）置換され、例は、グリシンであり、この場合、（e）硫酸化および/またはグリコシル化のための部位の数を増やすことによっている。

たとえば、生物学上および/または化学的に似た別のものによる1種のアミノ酸残基の置き換えは、保存的な置換として当業者に知られている。たとえば、保存的な置換は、1種の疎水性残基を別のものに置き換え、または1種の極性残基を別のものに置き換えることである。置換には、組合せが含まれ、たとえば、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；および、Phe、Tyrのようなものである。各々の明示的に開示される配列のそのような保存的に置換された変形物は、本明細書に提供するモザイクポリペプチドの範囲内に含まれる。

置換による、または欠失による変異誘発は、N-グリコシル化（Asn-X-Thr/Ser）またはO-グリコシル化（SerまたはThr）のための部位を挿入するために採用することができる。システインまたは他の不安定な（変化しやすい）残基の削除はまた、望ましいことがある。潜在的タンパク質分解の部位、例は、Argの欠失または置換は、たとえば、塩基性残基の1種の削除またはグルタミニルまたはヒスチジル残基による1種の置換によって成し遂げられる。

一定の翻訳後の誘導体化は、発現されたポリペプチド上での組換え型宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニルの残基は、しばしば対応するグルタミルおよびアスパルチル（asparyl）の残基に、翻訳後に脱アミド化される。代わりに、これらの残基は、弱酸性条件の下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニルの残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖のo-アミノ基のメチル化（T.E. Creighton（クレイトン）, Proteins: Structure and Molecular Properties（タンパク質：構造および分子的な特性）, W. H. Freeman & Co.（フリーマン社）, San Francisco （サンフランシスコ）、pp 79-86（1983年））、N-末端のアミンのアセチル化および、若干の例において、C-末端カルボキシルのアミド化が含まれる。

本明細書に開示するタンパク質およびペプチドの変種および誘導体を定義する1種のやり方は、変種および誘導体を、特定の既知の配列に対する相同性/同一性に関して定義することを通してのものであることが理解される。本明細書において開示するこれらの、および他のタンパク質の変種を特に開示するが、それらは、規定された（stated）配列に対し、少なくとも70%または75%または80%または85%または90%または95%の相同性を持つ。当業者は、簡単に、2つのタンパク質の相同性を定める方法を理解する。たとえば、相同性は、相同性がその最高レベルにあるように、2つの配列を整列させ（配列比較し）た後に算出することができる。

相同性を算出する別のやり方では、刊行されたアルゴリズムによって実行することができる。比較のための配列の最適な配列比較は、Smith（スミス）およびWaterman（ウォーターマン）のローカル相同性アルゴリズムAdv. Appl. Math.（アドバンシーズ・イン・アプライド・マセマティックス） 2: 482 (1981年)によって、Needlemann（ニードルマン）およびWunsch（ブンシュ）の相同性配列比較アルゴリズムJ. MoL Biol.（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー） 48: 443 (1970年)によって、Pearson（ピアソン）およびLipman（リップマン）の類似性の方法のための検索、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・U.S.A.） 85: 2444 (1988年)、これらのアルゴリズムのコンピューター化された履行（Wisconsin Genetics Software Package（ウィスコンシン・ジェネティック・ソフトウェア・パッケージ）、Genetics Computer Group（ジェネティック・コンピューター・グループ）、575のScience Dr.（科学博士）、Madison（マディソン）、WI（ウィスコンシン州）、米国におけるＧＡＰ、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または、点検（inspection）によって行いうる。

相同性の同じ種類（タイプ）を、たとえばZuker（ズーカー）M. Science（サイエンス） 244: 48-52, 1989年、Jaeger（イエガー）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989年、Jaeger et al. Methods Enzymol.（メソッヅ・イン・エンザイモロジー）183:281-306, 1989に開示されるアルゴリズムによって核酸のために得ることができ、それは、少なくとも核酸アラインメントに関連した材料のために参照することにより本明細書に組み込む。

保存的な変異および相同性の記載が一緒に、任意の組合せで、変種が保存的な変異である特定の配列に少なくとも70%の相同性を持つ具体例のようなものにおいて組み込むことができると理解されます。

この明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するように、それらのタンパク質配列をコード化することができる核酸も明らかにされるものと理解される。これには、特定のタンパク質配列、すなわち、すべての核酸で、1種の特定のタンパク質をコード化する配列を持つもの、ならびにすべての核酸で、変性核酸が含まれ、タンパク質配列の開示された変種および誘導体をコード化するものに関連したすべての変性配列が含まれる。このように、各々の特定の核酸配列が本明細書に全部書き出されないかもしれない一方で、各々のあらゆる配列も実際に明らかにされ、そして開示されたタンパク質配列を通して本明細書に記載されたものと理解される。

開示された組成物中に組み込むことができる非常に多くのアミノ酸およびペプチドの類似体が存在すると理解される。たとえば、非常に多くのDアミノ酸および異なる機能的な置換基を持つアミノ酸が存在し、それからそれらのアミノ酸を表1で示した。ペプチドの類似体の立体異性体と同様に、天然に存在するペプチドの逆の立体異性体を明らかにする。これらのアミノ酸は、一般に好まれるアミノ酸を有するtRNA分子を負荷することおよび、たとえば、類似体（アナログ）のアミノ酸をペプチド鎖に部位特異的なやり方で挿入するためにアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を操作すること（エンジニアリング）によって、ポリペプチド鎖に簡単に組み込むことができる（Thorson（ソーソン）ら、Methods in Molec. Biol.（メソッヅ・イン・モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー）77: 43-73 (1991年)、Zoller（ゾラー）、Current Opinion in Biotechnology（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）、3：348-354(1992年); Ibba（イッバ）、Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews（バイオテクノロジー・アンド・ジェネティック・エンジニアリング・レビューズ）13: 197-216 (1995年)、Cahill（ケイヒル）ら、TIBS、14(10); 400-403 (1989年); Benner（ベナー）、TIB Tech（テク）、12: 158-163 (1994年); IbbaおよびHennecke（ヘンネック）、Bio/Technology（バイオ/テクノロジー）、12: 678-682 (1994年)、それらのすべてを少なくともアミノ酸の類似体に関連した材料のために参照によって本明細書に組み込む）。

ペプチドに似ている分子を生産することができるが、しかし、それらは、自然のペプチド連結を介して接続されない。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸の類似体のための連結には、CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂--CH₂--、--CH=CH--（シスおよびトランス）、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--、および--CHH₂SO--を含むことができる（これらのおよびその他のものは、Spatola（スパトラ）, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins（アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学において）, B. Weinstein（ウェインステイン）, eds. （編）, Marcel Dekker（マルセル・デッカー）, New York（ニューヨーク）, p. 267 (1983年); Spatola, A. F., Vega Data（ベガ・データー）(March（3月）1983年), Vol. 1（第1巻）, Issue 3（第3号）, Peptide Backbone Modifications（ペプチド骨格修飾）(general review（一般評論）); Morley（モーリー）, Trends Pharm Sci（トレンヅ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシーズ）(1980年) pp. 463-468; Hudson（ハドソン）, D.ら, Int J Pept Prot Res（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ）14:177-185 (1979年)(--CH₂NH--, CH₂CH₂--); Spatola ら、Life Sci 38:1243-1249 (1986)(--CH H₂--S); Hann（ハン）J. Chem. Soc Perkin Trans. I（ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサエティ-パーキン・トランスアクションズ1）307-314 (1982年)(--CH--CH--, シスおよびトランス); Almquist（アルムクイスト）ら、J. Med. Chem.（ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー）23:1392-1398 (1980年) (--COCH₂--); Jennings（ジェニングス）- White（ホワイト）ら、Tetrahedron Lett （テトラヘドロン・レターズ）23:2533 (1982年) (--COCH₂--); Szelke（セルケ）ら、European Appln（欧州特許出願）, EP 45665 CA (1982年): 97: 39405 (1982年) (--CH(OH)CH₂--); Holladay（ホラデイ）ら、Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983年) (--C(OH)CH₂--); およびHruby（フルビー） Life Sci （ライフ・サイエンシーズ）31: 189-199 (1982年) (--CH₂--S--); それらの各々を、参照することにより本明細書に組み込む。特定の好適な非ペプチド性の連結は--CH₂NH--である。ペプチドの類似体が結合原子、b-アラニン、g-アミノ酪酸、および類似のものの間で1種の原子よりも多くを持つことができると理解される。

アミノ酸の類似体および類似物およびペプチドの類似体には、高められた、または望ましい特性、より一層経済的な生産、より一層大きな化学的安定性、高められた薬理学的特性（半減期、吸収、潜在力、有効性、その他）、変えられた特異性（例は、生物学的活性の幅広い範囲（ブロード-スペクトラム））、減らされた抗原性、および他のもの）のようなものを持つことが多い。

Dアミノ酸はより一層安定なペプチドを生成するのに用いることができ、それはDアミノ酸がペプチダーゼ等々によって認められないからである。同じ種類（例は、L-リジンの代わりにD-リジン）のDアミノ酸を有する共通配列の1種またはそれよりも多くのアミノ酸の系統的な置換は、より一層安定なペプチドを生成するのに用いることができる。システイン残基は、環化または、一緒に2つまたはそれよりも多くのペプチドを付着するために用いることができる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーション中に束縛するために有益であることができる（Rizo（リゾウ）およびGierasch（ギエラシュ）、Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992年)、参照することにより本明細書に組み込む）。

（核酸）

本明細書には明らかにされる核酸に基づく多種多様な分子が存在する。明らかにされた核酸は、たとえば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド置換で構成されている。これらのおよび他の分子の非制限的な例は、本明細書において議論される。たとえば、ベクターが細胞において発現されるとき、発現されたmRNAが典型的にA、C、GおよびUから構成されると理解される。同じく、たとえば、アンチセンス分子が細胞またはたとえば、外来性の配送を通して細胞環境に導入されるならば、アンチセンス分子が、細胞環境においてアンチセンス分子の分解を減らすヌクレオチド類似体から構成されることが有利である（advantagous）と理解される。

ヌクレオチドは、塩基の一部分（モイエティー）、糖の一部分およびリン酸塩の一部分が含まれる分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間（internucleoside）の連結を創作するそれらのリン酸塩の一部分および糖の一部分を通して一緒に連結することができる。ヌクレオチドの塩基の一部分は、アデニン-9-イル(A)、シトシン-1-イル(C)、グアニン-9-イル（G）、ウラシル-1-イル（U）およびチミン-1-イル（T）であることができる。ヌクレオチドの糖の一部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸塩の一部分は五価のリン酸塩である。ヌクレオチドの非制限的な例は、3'-AMP（3'-アデノシン一リン酸）または5'-GMP（5'-グアノシン一リン酸）である。

ヌクレオチド類似体は、いずれかの、塩基の一部分、糖の一部分、またはリン酸塩の一部分に対する若干の種類の修飾を含むヌクレオチドである。塩基の一部分への修飾には、A、C、G、およびT/Uの自然な、および合成の修飾、ならびに異なるプリンまたはピリミジンの塩基で、ウラシル-5-イル（.psi.（プサイ））、ヒポキサンチン-9-イル(I)、および2-アミノアデニン-9-イルのようなものが含まれる。修飾された塩基には、限定されないが、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキルの誘導体、、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキルの誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイド（擬）ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換されたアデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換されたウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。追加的な塩基の修飾は、たとえば、米国特許第3,687,808号、Englisch（イングリッシュ）ら、Angewandte Chemie International Edition（オンゲバンテ・ケミ・インターナショナル・エディション）、1991、30、613、およびSanghvi（サングビ）Y. S., Chapter 15（第15章）、Antisense Research and Applications（アンチセンスの研究および応用）289-302頁、Crooke（クルック）、S. T.およびLebleu（ルブロウ）、B. ed.、CRC Press（CRCプレス社）、1993年で見出すことができる。一定のヌクレオチド類似体で、5-置換されたピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換されたプリンのようなものは、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む。5-メチルシトシンは、二本鎖形成の安定性を増すことができる。増加した二本鎖安定性のような独特の特性を達成するために、しばしば時間ベースの修飾を、たとえば、糖の修飾で、2'-O-メトキシエチルのようなものと組み合わせることができる。非常に多くの米国特許第4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；および5,681,941号が存在し、それらは、塩基の修飾の範囲を詳述し、および説明する。これらの特許の各々を、参照することによって本明細書に組み込む。

ヌクレオチド類似体はまた、糖の一部分の修飾を含むことができる。糖の一部分への修飾には、リボースおよびデオキシリボースの自然な修飾ならびに合成による修飾が含まれる。糖の修飾には、制限されないが、以下の2’位置での修飾が含まれ、すなわち、OH；F；O-、S-、またはN-アルキル；O-、S-、またはN-アルケニル；O-、S-、またはN-アルキニル；または、O-アルキル-O-アルキルであり、そこでは、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、C₁からC₁₀まで、アルキルまたはC₂からC₁₀までのアルケニルおよびアルキニルに置換され、または置換されない場合がある。2’糖の修飾にはまた、制限されないが、-O[（CH₂）_nO]_mCH₃、-O(CH₂)_nOCH₃、-O(CH₂)_nNH₂、-O(CH₂)_nCH₃、-O(CH₂)_n-ONH₂、および-O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]]₂、式中、nおよびmは1から約10までである。

2’位置での他の修飾には、制限されないが（but are not limted to）、次の、すなわち、C₁からC₁₀の低アルキル、置換された低アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂、CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基（cleaving group）、リポーター基、介入物（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を持つ他の置換基が含まれる。同様の修飾はまた、糖上の他の位置で、特に、3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位置、または2’-5’の連結されたオリゴヌクレオチドおよび5’末端ヌクレオチドの5’位置においてなされうる。修飾された糖はまた、橋渡しリング酸素（bridging ring oxygen）で、CH₂およびSのようなもので修飾を含むものが含まれる。ヌクレオチド糖の類似体はまた、ペントフラノシル（pentofuranosyl）糖の代わりにシクロブチルの一部分のような糖の擬似物（sugar mimetic）を持ちうる。非常に多くの米国特許が存在し、それらは、そのような修飾された糖構造の調製を教示するもので、次の、第4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；および5,700,920号のようなもので、それらの各々を、参照することによって本明細書でその全体において組み込む。

ヌクレオチド類似体はまた、リン酸塩の一部分で修飾することができる。修飾されたリン酸塩の一部分には、制限されないが、2つのヌクレオチドの間の連結が、ホスホロチオネート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートを含むホスホロアミデートが含まれるように、修飾することができるものが含まれる。これらのリン酸塩または2つのヌクレオチド間の修飾されたリン酸塩の連結が3’-5’の連結または2’-5’の連結を通したものであり、および連結が3’-5’から5’-3’または2’-5’から5’-2’までのような逆位の極性（inverted polarity）を含むことができると理解される。種々の塩類、混合された塩類および遊離酸の形態もまた含まれる。非常に多くの米国特許は、修飾されたリン酸塩を含むヌクレオチドを作成し、および用いるために方法を教示し、そしてそれらには、制限されないが、以下のもの、第3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050号が含まれ、それらの各々を、参照することによって本明細書に組み込む。

必要なヌクレオチド類似体が単一の修飾だけを含み、しかしまた、多重の修飾をその一部分の1種内、または異なる一部分の間に含みうることは理解される。

ヌクレオチド置換は、ヌクレオチドに似た機能的な特性を持つ分子であり、しかし、それはリン酸塩の一部分で、ペプチド核酸（PNA）のようなものを含まない。ヌクレオチド置換は、Watson-Crick（ワトソン-クリック）またはHoogsteen（フーグスティーン）の様式において核酸を認識する分子であり、しかし、リン酸塩の一部分以外の一部分を通して連結される。ヌクレオチド置換は、適切な標的核酸と相互作用するとき、二重らせんのタイプの構造に適合することができる。

ヌクレオチド置換は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの類似体であり、それは取り替えられるリン酸塩の一部分および/または糖の一部分を持つ。ヌクレオチド置換は、標準的なリン原子を含まない。リン酸塩のための置換は、たとえば、短い鎖のアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間の連結、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間の連結、または1種またはそれよりも多くの短いヘテロ原子、または複素環式のヌクレオシド間の連結であることができる。これらには、モルフォリノの連結（ヌクレオシドの糖部分から1部分において形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホンの骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；骨格を含むアルケン；スルファメート（スルファミン酸塩）骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノの骨格；スルホネート（スルホン酸塩）およびスルホンアミドの骨格；アミド骨格；および混合されたN、O、SおよびCH₂の構成要素の部分を持つ他のものを持つものが含まれる。非常に多くの米国特許がこれらの種類のリン酸塩の交換（replacements）を作成し、および用いる方法を明らかにし、そしてそれらは、制限されないが、第5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；および5,677,439が含まれ、それらの各々を、参照することによって本明細書に組み込む。

また、ヌクレオチド置換において、ヌクレオチドの糖およびリン酸塩の一部分を、たとえば、アミドの種類の連結（アミノエチルグリシン）（PNA）によって交換することができることは理解されています。米国特許第5,539,082；5,714,331；および5,719,262はPNA分子を作成し、および用いる方法を教示し、それらの各々を、参照することによって本明細書において組み込む。(また、Nielsen（ニールセン）ら、Science、1991、254（1497-1500）を参照)。

他の種類の分子（複合物（conjugates））を、ヌクレオチドに、またはヌクレオチドの類似体に、たとえば、細胞の取り込みを高めるために連結することができる。複合物は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの類似体に化学的に結合することができる。そのような複合物には、制限されないが、脂質の一部分で、コレステロールの一部分（Letsinger（レットシンガー）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553-6556）、コール酸（Manoharan（マノハラン）ら、Bioorg. Med. Chem. Let.（バイオオルガニック・アンド・メディカル・ケミストリー・レターズ）, 1994, 4, 1053-1060.）、チオエーテル、例は、ヘキシル-S-トリチルチオール）（Manoharan et, al. Ann. N. Y. Acad. Sci.（アナルズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ）, 1992, 660, 306-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser（オーバーハウザー）ら、Nucl. Acids Res.（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）, 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例は、ドデカンジオールまたはウンデシルの残基（Saison（サイソン）-Behmoaras（ベーモアラス）ら、EMBO J.（EMBOジャーナル）, 1991, 10, 1111-1118；Kabanov（カバノフ）ら、FEBS Lett.（FEBSレターズ）, 1990, 259, 327-330；Svinarchuk（スビナルチャク）ら、Biochimie（バイオシミー）, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例は、ジ-ヘキサデシル-rac（ラック）-グリセロールまたはトリエチルアンモニウムl,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et. al., Tetrahedron Lett., 1995、36、3651-3654；Shea（シー）ら、Nucl. Acids Res., 1990、18、3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et. al., Nucleosides & Nucleotides（ヌクレオシド・アンド・ヌクレオチド）、1995、14、969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et. al., Tetrahedron Lett.、1995、36、3651-3654）、パルミチルの一部分（Mishra（ミシュラ）ら、Biochim. Biophys. Acta（ビオシミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ）、1995、1264、229-237）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロールの一部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.（ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラペウティックス）、1996、277、923-937のようなものが含まれる。非常に多くの米国特許はそのような複合物の調製を教示し、そしてそれらには、制限されないが、米国特許第4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928および5,688,941が含まれ、それらの各々を、参照することによって本明細書に組み込む。

Watson-Crickの相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換のWatson-Crickの面との少なくとも1種の相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換のWatson-Crickの面には、プリンを基礎とする（based、系の）ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換の、C2、N1およびC6の位置、およびピリミジン系ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換のC2、N3、C4位置が含まれる。

Hoogsteenの相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のHoogsteenの面上で起こる相互作用であり、それは二本鎖DNAの主溝（major groove）において露出する。Hoogsteenの面には、プリンヌクレオチドのC6位置での、N7位置および反応性基（NH2またはO）が含まれる。

（i.核酸配列）

www.pubmed.govのGenbank（ジャンバンク）から入手可能なこれらの配列の若干を用いて、多種多様な配列をここに提供する。この技術における技能の人々は、どのようにして、配列矛盾および違いを解消し、および他の関連した配列に対する特定の配列に関する組成および方法を調節するかを理解する。プライマーおよび/またはプローブは、本明細書に明らかにされ、およびこの技術において知られる情報を与えられる任意の配列のために設計することができる。

（ii. ハイブリダイゼーション/選択的ハイブリダイゼーション）

用語ハイブリダーゼーションは、典型的に少なくとも2つの核酸分子で、プライマーまたはプローブおよび遺伝子の間の配列により駆動される相互作用を意味する。配列による相互作用は、ヌクレオチドに特異的な様式において2つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。たとえば、Cと相互作用するGまたはTと相互作用するAは、配列により駆動される相互作用である。典型的に、配列による相互作用は、ヌクレオチドのWatson-Crickの面またはHoogsteenの面に起こる。2つの核酸のハイブリダイゼーションは、この技術における技量の人々に知られている多数の条件およびパラメータによって影響を及ぼされる。たとえば、反応の塩濃度、pH、および温度のすべては、2つの核酸分子がハイブリダイゼーションするかどうかに影響を及ぼす。

2つの核酸分子の間の選択的なハイブリダイゼーションのためのパラメータは、この技術の技量の人々によく知られる。たとえば、若干の具体例において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、厳しい（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーションの条件として定義することができる。たとえば、ハイブリダイゼーションの厳しさは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のいずれかまたは双方での、双方の温度および塩濃度によって制御される。たとえば、選択的なハイブリダイゼーションを達成するためのハイブルダイゼーションの条件には、Tmより下の約12-25℃である温度での高イオン強度の溶液（6XのSSCまたは6XのSSPE）（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションのパートナー（相手）から解離する融解温度）での、次いで洗浄温度がTmより下の約5℃から20℃までであるように選ばれる温度および塩濃度の組合せでの洗浄におけるハイブリダイゼーションが包含される。温度および塩条件は、予備的実験において実験的に簡単に定められ、そこでは、フィルタ上に固定化される参照DNAの試料が興味ある標識された（ラベルをつけられた）核酸にハイブリダイゼーションし、そして次いで異なる厳しさの条件下に洗浄される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的に、DNA-RNAおよびRNA-RNAのハイブリダイゼーションのためにより一層高い。条件は、厳しさを達成するために、上述のように、またはこの技術において知られているように用いることができる。（Sambrook（サムブルック）ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（ブンシクローニング：ラボラトリーマニュアル、第2版、コールドスプリングハーバー研究所）, Cold Spring Harbor（コールド・スプリング・ハーバー）, New York, 1989；Kunkel（キュンケル）ら、Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987、これを、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連した材料のために、参照することによって本明細書に組み込む）。DNA：DNAハイブリダイゼーションのための好ましい厳しいハイブリダイゼーション条件は、約68℃で（水溶液において）、6XのSSCまたは6XのSSPEにおいて、68℃での洗浄によって続くものであることができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳しさは、必要に応じ、望まれる相補性の程度が減少するのに従い、およびさらに、可変性が捜索される任意のエリアのG-CまたはA-Tの豊かさに依存して減少することがある。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳しさは、必要に応じ、望まれる相同性が増えるのに従い、およびさらに、高い相同性が望まれる任意のエリアのG-CまたはA-Tの豊かさに依存して、全体でこの技術において知られているように増加することがある。

選択的なハイブリダイゼーションを定義する別のやり方は、他の核酸に結合する1種の核酸の量（パーセンテージ）を見ることによる。たとえば、若干の具体例において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントの制限性の核酸（limiting nucleic acid）が非制限的な核酸に結合するときのものである。典型的に、非制限性のプライマーは、たとえば、10または100または1000の倍数の過剰にある。この種のアッセイは、双方の制限性および非制限性のプライマーが、たとえば、それらのk_dより下の10倍または100倍または1000倍である場合、または核酸分子のわずか1種が10倍または100倍または1000倍である場合、または1種または双方の核酸分子がそれらのk_dより上である場合の条件下に実行することができる。

選択的なハイブリダイゼーションを定義する別のやり方は、ハイブリダイゼーションが望ましい酵素の操作を促すのに要求される条件下に酵素によって操作されるプライマーのパーセンテージを見ることによる。たとえば、若干の具体例において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100のプライマーのパーセントが酵素の操作を促す条件の下で酵素によって操作されるときであり、たとえば、酵素の操作がDNA伸張（DNA extension）である場合、次いで選択的ハイブリダイゼーションの条件は、約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100のプライマー分子のパーセントが伸張されるときである。好適な条件はまた、製造者によって提案され、または操作を実行する酵素のために適切であるようなこの技術において指し示されるものが含まれる。

ちょうど相同性と同様に、2つの核酸分子の間でハイブリダイゼーションのレベルを測定するために本明細書に明らかにされた多種多様な方法があるものと理解される。これらの方法および条件が2つの核酸分子の間でハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを提供しうるものであるが、しかし、他に示さない限り、任意の方法のパラメータ満足させることは十分である。たとえば、80%のハイブリダイゼーションが必要であるならば、そしてハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれか1種で必要なパラメータの範囲内で起こる限り、それは本明細書に明らかにされると考えられる。

この技術における技量の人々は、組成物または方法が、集合的に、または単独でのいずれかでハイブリダイゼーションを定めるためのこれらの基準の任意の1種を満たす場合、それは本明細書に明らかにされる組成物または方法であると理解するものと理解されます。
（iii. 機能的な核酸）

機能的な核酸は、特定の機能で、標的分子を結合し、または特定の反応を触媒するようなものを持つ核酸分子である。機能的な核酸分子は、以下の範疇（カテゴリー）に分けることができ、それは制限されることを意図しない。たとえば、機能的な核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、3重鎖形成性分子、RNAi、および外部ガイドシーケンスが含まれる。機能的な核酸分子は、標的分子によって所有される特定の活性の影響因子（affectors）、インヒビター（抑制物質）、モジュレータ（修飾因子）、および刺激物質（stimulator）として働くことができ、または機能的な核酸分子は任意の他の分子から独立してデノボ（あらたな）活性を所有することができる。

機能的な核酸分子は、任意の高分子で、DNA、RNA、ポリペプチド、または糖鎖のようなものと相互作用することができる。このように、機能的な核酸は、mRNA、ゲノムＤＮＡ、またはポリペプチドのようなものと、任意の本明細書に明らかにされたガイダンスキューまたはそのための受容体のために相互作用することができる。機能的な核酸は、標的分子および機能的な核酸分子の間で配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計されることが多い。他の状況においては、機能的な核酸分子および標的分子の間の特定の認識は、機能的な核酸分子および標的分子の間で配列相同性に基づかないが、むしろ、特定の認識が起こるのを許す第三構造の形成に基づく。

アンチセンス分子は、規範的または非規範的な（non-canonical）塩基対のいずれかを通して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、終わりまで標的分子の、たとえば、RNAseHによって媒介されるRNA-DNAハイブリッド分解（destruction）を通した破壊を促すように設計される。あるいはまた、アンチセンス分子は、標的分子上で通常起こる処理機能で、転写または複製のようなものを中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子で最も接近しやすい領域を見つけることによるアンチセンス効率の最適化のための非常に多くの方法が存在する。模範的な方法はインビトロの選択実験およびDNA修飾調査であり、それはDMSおよびDEPCを用いる。アンチセンス分子が標的分子と10^-6、10^-8、10^-10、または10^-12より低いか、または等しい解離定数（k_d）とともに結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用において支援する方法および技術の代表するサンプルは、米国特許の以下の非制限的なリストにおいて見出すことができ、すなわち、第5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319および6,057,437号である。

望ましくは特定の方法では、アプタマーは標的分子と相互作用する分子である。典型的に、アプタマーは定義された二次および三次構造で、ステム（基部）-ループまたはG-カルテット（G-四分子）のようなものに折り重なる長さにおいて15-50個の塩基に及ぶ小さな核酸である。アプタマーは、ATP（米国特許第5,631,146号）およびテオフィリン（theophiline、theophylline）（米国特許第5,580,737号）のような小分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第5,786,462号）およびトロンビン（米国特許第5,543,293号）のような大きな分子に結合することができる。アプタマーは、10^-12Mより少ない標的分子からのk_dsと非常にきつく結合することができる。好ましくは、アプタマーは10^-6、10^-8、10^-10、または10^-12より少ないあるk_dを有する標的分子と結合する。アプタマーは、標的分子を特異性の非常に高い程度とともに結合することができる。たとえば、アプタマーは分離され、それは、標的分子およびその分子上の単一の位置だけが異なる別の分子の間の結合性アフィニティ（結合親和性）において1000倍よりも高い相違を持つ（米国特許第5,543,293号）。好ましくは、アプタマーは、背景の結合分子が有するk_dよりも少なくとも10、100、1000、10,000または100,000倍低い、標的分子のあるk_dを持つ。好ましくは、たとえば、ポリペプチドのために比較をするとき、背景分子は異なるポリペプチドである。多種多様な異なる標的分子を結合するためにアプタマーを作成し、および使用する方法の代表例は、米国特許の以下の非制限的なリストにおいて見出すことができ、すなわち、第5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776および6,051,698号である。

リボザイムは、分子内に、または分子間的のいずれかに、化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。リボザイムはこのように、触媒の核酸である。好ましくは、リボザイムは分子間反応を触媒する。ヌクレアーゼまたは自然のシステムで、ハンマーヘッド型のリボザイム、（たとえば、制限されないが、以下の米国特許、すなわち、第5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig（ルートヴィヒ）およびSproat（スプロート）によるWO（国際公開）9858058、LudwigおよびSproatによるWO 9858057、およびLudwigおよびSproatによるWO 9718312）、ヘアピンリボザイム（たとえば、制限されないが、以下の米国特許、すなわち、第5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339および6,022,962号）、およびテトラヒメナリボザイム（たとえば、制限されないが、以下の米国特許、すなわち、第5,595,873および5,652,107号）のようなものにおいて見出されるリボザイムに基づく核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する多数の異なる種類のリボザイムがある。また、自然のシステムにおいて見出されないが、しかし、新たに特定の反応を触媒するために設計された多数のリボザイムがある（たとえば、制限されないが、以下の米国特許、すなわち、第5,580,967、5,688,670、5,807,718、および5,910,408号）。好適なリボザイムはRNAまたはDNA基質を開裂し、およびより一層好ましくはRNA基質を開裂させる。リボザイムは、典型的に、核酸基質を、以後の開裂を有する標的基質の認識およびの結合を通して開裂させる。この認識は、大部分は規範的または非規範的な塩基対相互作用に基づくことが多い。この特性は、リボザイムを特に核酸の標的特異的開裂のためのよい候補にし、それは、標的基質の認識が標的基質の配列に基づくからである。多種多様な異なる反応を触媒するためにリボザイムを作成し、および使用する方法の代表例は、米国特許の以下の非制限的なリストにおいって見出すことができ、すなわち、第5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906および6,017,756号である。

3重で形成される（Triplex forming）機能的な核酸分子は、二本鎖または一本鎖の核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。3重の分子が標的領域と相互作用するとき、3重と称される構造が形成され、そこにおいて、Watson-CrickおよびHoogsteenの塩基対形成の双方上で複雑な依存物（dependant）を形成するDNAの3つの鎖がある。3重の分子が好ましく、それらが標的領域を高い親和性および特異性とともに結合することができるからである。好ましくは、3重で形成される分子は、標的分子を10^-6、10^-8、10^-10、または10^-12より少ないあるk_dで結合する。多種多様な異なる標的分子を結合するためにどのようにして3重で形成される分子を作成し、および使用するかの代表例は、米国特許の以下の非制限的なリストにおいて見出され、すなわち、第5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566および5,962,426号である。

外部ガイド配列（EGSs）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合する分子であり、そしてこの複合体はRNase Pによって認識され、それは標的分子を開裂させる。EGSsは、特に一般に好まれるRNA分子を標的にするように設計することができる。RNAse Pは、細胞内での加工（プロセシング）の転移RNA（tRNA）を支援する。細菌のRNAse Pは、標的RNA、すなわち、自然なtRNA基質にまねるためのEGS複合体を引き起こすEGSを用いることによって、事実上任意のRNA配列を開裂させるために補充されることができる。（Yale（エール）によるWO 92/03566、および、Forster（フォースター）およびAltaian（アルタイアン）、Science 238: 407-409 (1990年)）。

同様に、RNAの真核生物のEGS/RNAse Pに指向された開裂は、真核生物の（eukarotic）細胞内で望ましい標的を開裂するために利用することができる。（Yuan（ユアン）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1992)；Yale（エール）によるWO 93/22434；YaleによるWO 95/24489；YuanおよびAltaian、EMBO J 14: 159-168 (1995)、およびCarrara（カララ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)）。いろいろな異なる標的分子の開裂を促進するためにEGS分子を作成し、および使用する方法の代表例は、米国特許の以下の非制限的なリストにおいて見出され、すなわち、第5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248および5,877,162号である。

遺伝子発現はまた、RNA干渉（RNAi）を通して、高度に特異的な様式において効果的に沈黙させることができる。このサイレンシングは、当初に2本鎖RNA（dsRNA）の添加を用いて観察された（Fire（ファイア）, A.ら、(1998年) Nature（ネイチャー）、391、806 811）（Napoli（ナポリ）, C, ほか（1990年）Plant Cell （プラント・セル）2、279 289）（Hannon（ハノン）、GJ. (2002年) Nature、418、244 251）。一旦dsRNAが細胞に入ると、それは、RNase III様の酵素、Dicer（ダイサー）によって、3’端上での2つのヌクレオチドのオーバーハング（突出）を含む長さの2本鎖の小さな干渉性RNA（siRNA）の21-23のヌクレオチドへ開裂される（Elbashir（エルバシャー）、S.M.ら(2001年) Genes Dev.（ジーンズ・アンド・デベロップメント）15: 188-200）（Bernstein（バーンスタイン）、E.ら、(2001年) Nature、409、363 366）（Hammond（ハモンド）、S.M.ら、(2000年) Nature 404: 293-296）。ATPに依存するステップで、siRNAsはマルチサブユニットタンパク質複合体中に統合され、それは一般にRNAiによって誘発されるサイレンシング複合体（RISC）として知られ、それはsiRNAsを標的RNA配列に導く（Nykanen（ニカネン）, A.ら（2001年）Cell（セル）、107:309 321）。若干の点でsiRNA二本鎖は巻き戻され、そしてアンチセンス鎖がRISCに結合したままであり、そしてエンドおよびエキソのヌクレアーゼの組合せによって補完的なmRNA配列の分解（degradation）が指向されるように見える（Martinez（マーティネス）, J.ら、（2002年）Cell、110:563-574）。しかし、siRNAまたはsiRNAまたは彼らの使用の効果は、機構（メカニズム）の任意のタイプ（anytype）に限られない。

また、核酸が明らかにされ、RNAiまたはRNA干渉のために用いることができる。RNAiがRNA干渉（RNAi）のためにツーステップ（2段階）メカニズムに関与すると思われ、すなわち、開始ステップおよびエフェクター（効果器）ステップである。たとえば、第1ステップにおいて、入力された2本鎖（ds）RNA（siRNA）は小さな断片、21-23-のヌクレオチド‘ガイド配列’のようなものに加工される。RNA増幅は、動物全体に起こる可能性があるように見える。典型的にはそれから、ガイドRNAは、タンパク質RNA複合体に組み込むことができ、その複合体はRNA、ヌクレアーゼ複合体を分解することが可能であり、その複合体はRNAによって誘導されるサイレンシング複合体（RISC）と呼ばれた。このRISC複合体は、塩基対形成の相互作用を通したガイドRNAによって認識されるmRNAを破壊するために、第2の効果器ステップにおいて作用する。RNAiは、標的RNAの分解を引き起こす事象の引き金を引く細胞中に、2本鎖RNAの任意の手段による導入に関与する。RNAiは、転写後遺伝子サイレンシングの形態である。RNAiにおいて作用することができるRNAヘアピンを明らかにする。RNAiの作成および使用の説明のために、以下を参照し、例は、Hammond et al., Nature Rev Gen 2: 110-1 19 (2001); Sharp（シャープ）, Genes Dev 15: 485-490 (2001), Waterhouse（ウォーターハウス）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23): 13959-13964 (1998)であり、それらのすべてを、それらの全体において、および少なくともRNAi分子の配送および作成に関連する形式材料（form material）を参照することによって本明細書に組み込む。

RNAiは、哺乳類の細胞を含む、多数の細胞で働くことが示された。哺乳類の細胞での働きのために、好ましくは、RISC複合体内で標的にされる配列として用いられるRNA分子はより一層短い。たとえば、長さで、50または40または30または29、28、27、26、25、24、23 ,22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10よりも短い、または等しいヌクレオチドである。これらのRNA分子はまた、開裂される標的RNAと比較して、3’または5’の端の上に突出を持つことができる。これらの突出は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、15、または、20個のヌクレオチド、またはそれより短い、またはそれに等しい長さであることができる。RNAiは、哺乳類の幹細胞、マウスES細胞のようなものにおいて働く。

短い干渉性RNA（siRNA）は2本鎖RNAであり、それは、配列特異性の転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、それによって遺伝子発現が減少し、またはそれが抑制されさえする。1種の例では、siRNAは、相同性のRNA分子で、mRNAsのようなものの、siRNAおよび標的RNAの双方の間での配列アイデンティティ（同一性）の領域内での特異的な分解の引き金を引く。たとえば、WO 02/44321は、標的mRNAｓの配列特異的分解が、3’突出端と塩基対形成されるときに可能であるsiRNAsを明らかにし、本明細書では、これらのsiRNAsを作成する方法のために、それを参照することによって組み込む。配列特異的な遺伝子サイレンシングは、哺乳類細胞において、酵素ダイサーによって精製されるsiRNAをまねる合成の、短い2本鎖RNAsを用いて達成することができる（Elbashir, S.M., et al. (2001) Nature, 411 ;494 498) (Ui-Tei（ウィ-テイ）, K., et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82）。siRNAは、化学的に、またはインビトロで合成することができ、または二本鎖ヘアピンのようなRNA（shRNAs）の結果であることができ、それらは細胞の内側でsiRNAs中に処理される。合成siRNAsは、概してアルゴリズムおよび慣習的なDNA/RNA合成機（シンセサイザー）を使って設計される。供給元には、Ambion（アンビオン）（Austin（オースティン）、Texas（テキサス））、ChemGenes（ケム・ジーンズ）（Ashland（アシュランド）、Massachusetts（マサチューセッツ））、Dharmacon（ダーマコム）（Lafayette（ラファイエット）、Colorado（コロラド））、Glen Research（グレン・リサーチ）（Sterling（スターリング）、Virginia（ヴァージニア））、MWB Biotech（バイオテク）（Esbersberg（エスバースベルグ）、Germany（ドイツ））、Proligo（ポリゴ）（Boulder（ボールダー）、Colorado（コロラド））、およびQiagen（キアゲン）（Vento（ベント）、The Netherlands（オランダ））が含まれる。siRNAはまた、Ambion（アンビオン）のSILENCER（サイレンサー）siRNA Construction Kit（コンストラクション・キット）のようなキットを使用して、インビトロで合成することができる。本明細書に開示するものは、上述のように、本明細書で明らかにする炎症性媒介物のための配列に基づき設計される任意のsiRNAである。

ベクターからのsiRNAの生産は、shRNAの転写を通して、より一層普通に行われる。shRNAを含むベクターの生産のためのキットは利用可能であり、たとえば、Imgenex（イムジェニックス）のGeneSuppressor Construction Kits（ジーンサプレッサー・コンストラクション・キット）およびInvitrogen（インビトロゲン）のBLOCK-iTの誘導可能なRNAiプラスミドおよびレンチウイルスベクターのようなものが入手可能である。本明細書に開示するものは、上述のように、本明細書で開示する炎症性媒介物のための配列に基づいて設計される任意のshRNAである。

（iv. ベクター）

トランスファー（転移）ベクターは、細胞中に遺伝子を配送するために用いる任意のヌクレオチド構築物であることができ（例は、プラスミド）、または遺伝子を配送するために一般的な戦略の一部分として、例は、組換え型レトロウイルスまたはアデノウイルスの一部分としてのものである（Ram（ラム）et al. Cancer Res.（キャンサー・リサーチ）53:83-88, (1993)）。

本明細書で用いるように、プラスミドまたはウイルスのベクターは、明らかにされた核酸を輸送する薬剤で、分解を伴わずに細胞中にscFvsをコード化するようなものであり、そしてそれが配送される細胞において遺伝子の発現を産生させるプロモーター（promoter yielding）を含む。ウイルスベクターは、たとえば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、ニューロン栄養性ウイルス（neuronal trophic virus）、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルスであり、HIVのバックボーン（骨格）を有するこれらのウイルスが含まれる。また、好ましくは、これらのウイルスの特性を共有し、それらをベクターとしての用いるのに適したものにする任意のウイルスの系統である。レトロウイルスには、ネズミのマロニー白血病ウイルス（Murine Maloney Leukemia virus）、MMLV、およびベクターとしてMMLVの望ましい特性を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスのベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子のペイロード（負荷量）、すなわち、導入遺伝子またはマーカー（目印）遺伝子を運ぶことが可能であり、そしてこの理由のために、一般的に用いられるベクターである。しかし、それらは非増殖性の細胞において有用なものではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定で、そしてそれが働くのは簡単であり、高いタイター（力価）を持ち、およびエアゾール調剤物において配送することができ、そして非分裂性細胞をトランスフェクション（形質移入）させることができる。ポックス（水痘）ウイルスベクターは大きく、そして遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を持ち、それらは熱安定性であり、そして室温に保存することができる。好適な具体例は、宿主の有機体の免疫反応を抑制するために設計され、ウイルス抗原によって引き出されたウイルスベクターである。この種類の好適なベクターは、インターロイキン8または10のためのコード領域を運ぶ。

ウイルスベクターは、遺伝子を細胞中に導入するために化学的または物理的な方法よりも高いトランスアクション（取引）（遺伝子を導入する能力）能力を持つことができる。典型的に、ウイルスベクターは、非構造的な初期遺伝子、構造的な後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成のために必要な逆位末端配列、およびウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計されるとき、ウイルスは典型的に初期遺伝子の1種またはそれよりも多くを除去され、そして遺伝子または遺伝子/プロモーターのカセットを除去されたウイルスDNAの代わりにウイルスゲノム中に挿入する。この種類の構築物は、最高で約8kbの外来の遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は典型的に、トランスにおいて初期遺伝子の遺伝子生産物を発現するように設計された細胞系によって供給される。

（v. レトロウイルスのベクター）

レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー（亜科）、属、またはトローピズム（向性）を含むレトロウイルス科のウイルス系統に属している動物のウイルスである。レトロウイルスのベクターは、概して、Verma（ヴェルマ）, I. M., Retroviral vectors for gene transfer（遺伝子トランスファー（遺伝子移入）のためのレトロウイルスベクター）、Microbiology（マイクロバイオロジー）-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington（ワシントン）, (1985)によって記載され、それを参照することによって本明細書において組み込む。遺伝子治療のためにレトロウイルスのベクターを使用する方法の例は、米国特許第4,868,116および4,980,286号；PCT出願WO 90/02806およびWO 89/07136；およびMulligan（マリガン）（Science 260: 926-932 (1993)）で記述され、それらの教示を参照することによって本明細書に組み込む。

レトロウイルスは、基本的に、それを核酸カーゴ（積荷）中に詰めたパッケージ（包装）である。核酸カーゴはそれとともにパッケージシグナル（包装信号）を運び、それは、複製された娘分子がパッケージコートの範囲内で効率的に包装されるのを確実にする。パッケージ信号に加え、複製の、および複製されたウイルスの包装のために、シスにおいて必要な多数の分子が存在する。典型的に、レトロウイルスのゲノムは、gag（ギャグ）、pol（ポリ、DNAポリメラーゼ）、およびタンパク質コート（被膜）の作成において関与するenv（エンベ、外被）遺伝子を含む。それは、典型的に外来のDNAによって取り替えられるgag、pol、およびenvの遺伝子であり、それが標的細胞へ移送される。レトロウイルスベクターは、典型的に、パッケージコート中への組込みのためのパッケージ信号、gag転写単位の始まりを合図する配列で、逆転写のために必要な要素、逆転写のtRNAプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含むもの、DNA合成の間のRNA鎖のスイッチを案内する末端反復配列、DNA合成の第2の鎖の合成のためのプライミング部位として役立つ5’から3’までのプリン豊富配列LTR、および宿主ゲノム中に挿入するためのレトロウイルスのDNA状態の挿入を可能にするLTRsの端部の近くの特定の配列を含む。gag、pol、およびenvの遺伝子の除去は、約8kbの外来の配列がウイルスゲノム中に挿入され、逆転写されるようになり、そして複製により、新しいレトロウイルスの粒子にパッケージされるのを許す。核酸のこの量は、各々の転写物の大きさ（サイズ）に応じて、1対多数の遺伝子の配送のために十分である。挿入物において他の遺伝子に加えて陽性または陰性の選定可能なマーカーを含むことが好ましい。

大部分のレトロウイルスのベクターの複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されるので（gag、pol、およびenv）、ベクターはそれらをパッケージング細胞系中に置くことによって典型的に生成される。パッケージング細胞系は、レトロウイルスを用いて形質移入または形質転換された細胞系であり、そのレトロウイルスは複製およびパッケージング機構を含むが、任意のパッケージング信号は欠く。一般に好まれるDNAを運ぶベクターがこれらの細胞系に形質移入されるとき、ヘルパー細胞によってシスにおいて提供される機構により、興味のある遺伝子を含むベクターは、複製され、そして新しいレトロウイルスの粒子中にパッケージされる。その機構のためのゲノムは、それらが必要な信号を欠くので、パッケージされない。

（vi.アデノウイルスベクター）

複製欠陥のアデノウイルスの構築は記述されている（Berkner（バークナー）et al., J. Virology 61 :1213-1220 (1987); Massie（マッシー）et al., MoI. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad（ハイ-アフマド）et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson（デビッドソン）et al., J. Virology 61 :1226-1239 (1987); Zhang（チャン）"Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis（組換えアデノウイルスのリポソーム媒介形質移入による生成および識別）" BioTechniques 15:868-872 (1993)）。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利益は、それらが、それらの他の細胞種類にまで広がることができる範囲において制限されるということであり、それは、それらが初期の感染した細胞内で複製することができるが、新しい感染性のウイルス粒子を形成することができないからである。組換え型アデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、脈管内皮、CNS実質（parenchyma）および多数の他の組織部位への直接の、インビボ配送の後、高効率遺伝子移入を達成することを示した(Morsy（モーシー）, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum（カシンバーム）, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler（レッセラー）, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier（モールリエル）, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle（ラ・サール）, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix（ゴメス-フォア）, J. Biol. Chem. 267:25129- 25134 (1992); Rich（リーチ）, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman（グスマン）, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout（バウト）, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner（ザブナー）, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud（カイヨラウト）, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); およびRagot（ラゴット）, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993))。組換え型アデノウイルスは特定の細胞表面受容体に結合することによって遺伝子形質導入を達成し、そしてその後、ウイルスは受容体媒介エンドサイトーシス（飲食細胞運動）によって、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ方法において、内在化（内部移行）する（Chardonnet（シャルドネ）およびDales（ダレス）, Virology 40:462-477 (1970); Brown（ブラウン）およびBurlingham（バーリンガム）, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson（スウェソン）およびPersson（ペーション）, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth（セス）, et al., J. Virol. 51 :650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga（バーガ）et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham（ウィッカム）et al., Cell 73:309-319 (1993)）。

ウイルスベクターはE1遺伝子を除去されたアデノウイルスに基づくものであることができ、そしてこれらのヴァイロンズ（virons）はヒトの293細胞系のような細胞系において生成される。別の好適な具体例において、双方のE1およびE3遺伝子はアデノウイルスゲノムから除去される。

（vii.アデノ随伴ウイルスベクター）

別の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づく。この不完全なパルボウイルスは好ましいベクターであり、それが多くの細胞種類に感染することができ、そしてヒトに非病原性だからである。AAVタイプのベクターは、約4から5kbまでを運搬することができ、そして野生型AAVは安定して染色体19に挿入されることが知られている。

アデノ随伴ウイルス（AAV）はパルボウイルス科のメンバー（一員）であり、ウイルス系統が1本鎖の線形DNAゲノムおよび直径で約20nmと測定される小さな二十面体の成形されたキップシドによって特徴づけられる。AAVは、組織培養で増殖されたサルウイルス15、サルアデノウイルスの汚染として最初に記載され、そして測定可能な複製のためにアデノウイルスに依存して見出された。これは、ディペンドウイルス属におけるその名前、アデノ随伴ウイルス、およびその分類へと導いた（Hoggan（ホガン）, M.D. Prog Med Virol 12 (1970) 211-39)。AAVはアデノウイルス試料の共通の汚染物質であり、そしてヒトのウイルス試料から（AA V2、AAV3、AAV5）、サルのウイルス-15の感染した試料から（AAV1、AA V4）、ならびにトリの保存品（stocks）から（AAAV）（Bossis（ボッシス）, I.およびChiorini（キオリニ）, J. A. J Virol 77 (2003) 6799-810）、ウシ、イヌ、およびヒツジのアデノウイルスおよびラボラトリー（実験室）アデノウイルスタイプ5の保存品から（AAV6）分離された。AAV7およびAAV8の全てのrep-cap（レパートリーキャップ）ORFsにわたるDNAは、アカゲザルの心臓組織からPCRによって増幅された（Gao（ガオ）, G.P., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (2002) 11854-9）。AAVs 1および6を除いては、すべてのクローン化AAV分離株は、血清学的に明瞭に見える。9つの分離株はクローン化され、そして組換え型ウイルス保存株（stocks）は各々の分離したウイルスから生成された。

AA V2は、最も特徴づけられたアデノ随伴ウイルスであり、そしてAAVプロトタイプ（原型）として議論される。AA V2ゲノムは、4,780個のヌクレオチドの線形1本鎖DNAからなる。DNAの双方の極性は、等しい効率を有するAAVによってカプセルに包まれる（被包される）。AAV2ゲノムは、repおよびcapと呼ばれる2つの読み枠（オープンリーディングフレーム）（ORF）を含む。rep ORFは、ウイルスDNA複製、パッケージングおよびAAV統合のために不可欠である非構造的タンパク質をコード化する。cap ORFは、キップシドタンパク質をコード化する。rep ORFは、マップ（地図）ユニット（単位）P5およびP 19でプロモーターから転写される。rep 転写物は、rep ORFの3’端の近くにイントロンを含み、そして代わりにスプライシングされることができる。rep ORFは、したがって、4つの部分的に重なるタンパク質として発現され、それはそれらの分子量によってRep78、68、52および40と呼ばれた。cap ORFは、P40で単一のプロモーターから発現される。代わりのスプライシングおよび代わりのACGスタート（開始）コドンの利用によって、capは65-86kDaから大きさにおいて変動するキップシドタンパク質VP 1-3中に発現される。VP3は最も大量のキップシドタンパク質であり、およびAA V2キップシドの80%を構成する。すべてのウイルス転写物は、マップ単位96でのpolyA信号で停止する。

生産的なAA V2感染の間、Rep78をコード化するp5プロモーターからのスプライシングのないmRNAsは、最初の検出可能なウイルスの転写物である。感染の経過において、P5、P19およびP40からの表現は、1：3：18のレベルまでそれぞれ増加する。P5、P19の生成物のための50％、およびP40の90%まで増やされるスプライシングされた転写物のレベルは、RNAを発現した（Mouw（ムーウ）, M.B. and Pintel, DJ. J Virol 74 (2000) 9878-88）。

AA V2ゲノムは、145のヌクレオチド（nt）の逆位末端配列（ITRs）によって、双方の側上で停止される。ITRの125 ntは、それぞれ21 ntの2つの内部のパリンドローム（回文構造）を含むパリンドロームを構成する。ITRは、7つの非対形成塩基だけでＴ字状のヘアピンを生成するために、それ自体の上で後ろに折ることができる。ITRの基部はRep結合部位（RBS）、および部位および特にRepによって開裂された鎖である配列-ターミナル-リソリューション（末端-分解）部位（TRS）を含む。ITRは、AAV2ゲノム複製、統合のために不可欠であり、そしてパックケージング信号を含む。

1本鎖AA V2ゲノムは、約20-25 nmの直径の非外被の（non-enveloped）二十面体に成形されたキップシド中にパッケージングされる。ビリオン（ウイルス粒子）は26%のDNAおよび74%のタンパク質からなり、および1.41g/cm³の密度を持つ。AA V2粒子はきわめて安定であり、そして1時間、極端なph、および有機溶媒での抽出のための60℃への加熱に耐えることができる。

Repタンパク質は、AA V2ゲノム複製、統合、およびパッケージングを含む、AA V2複製のほとんどあらゆるステップにおいて関与する。Rep78およびRep68は、ATPアーゼ、3’-5’ヘリカーゼおよびニッキング（切り目）活性を所有し、そして特にDNAと結合する。Rep52およびRep40は、キャプシド形成（encapsidation）のプロセスに関与し、そしてATPアーゼおよび3’-5’のヘリカーゼ活性をコード化するように見える。変異の分析は、Rep78のためのドメイン構造を提案する。N末端の225のaaは、DNA結合、DNAニッキングおよび連結に関係する。Rep78およびRep68は、ITRで、ならびに同様の効率を有するITR（Chiorini（チオリニ）, J. A., et al. J Virol 68 (1994)）の線状切断型（linear truncated form）において、GCTC繰返しのモチーフを認識する。Rep78およびRep68はエンドヌクレアーゼ活性に特有の配列および鎖を所有し、それはターミナルリソリューション部位（TRS）でITRを開裂する。Repエンドヌクレアーゼ活性は、ヌクレオシド三リン酸塩加水分解および金属陽イオンの存在に依存する。Rep78および68はまた、NTP非依存状況において1本鎖DNAと結合し、および開列することができる。そのうえ、Rep78は複製のAA V2起点から始まる1本鎖DNA基質-すなわち、rep結合およびターミナルリソリューションの要素を含む配列の再結合を触媒する。

AAV2 Rep78の中心領域、それはRep52およびRep40のＮ末端を表し、ATPアーゼおよび3’-5’のヘリカーゼ活性ならびに核内移行シグナルを含む。ヘリカーゼ活性は、DNA-DNAおよびDNA-RNAの二重鎖（デュプレックス）を、RNA-RNAではなく、巻き戻す。ATPアーゼ活性は構成され、そしてDNA基質に非依存である。Rep78のC-終端は、潜在的な亜鉛フィンガードメインを含み、そして偽基質抑制によってPKAの細胞性のセリン/スレオニンキナーゼ活性ならびにその相同体PRKXを抑制することができる。Rep68は、スプライシングされたmRNAから翻訳され、そのRNAはRep78のN-末端の529のアミノ酸（aa）にRep68のための独特な7のaaが融合したものをコード化し、PKAまたはPRKXのいずれも抑制しない。これらの生化学活性に加え、Repはタンパク質-タンパク質の相互作用によって細胞内条件に影響を及ぼすことができる。Rep78は、SPI、高い-移動性-グループの非ヒストンタンパク質1（HMG-1）および腫瘍抑圧因子（oncosuppressor）p53のような転写因子を含む多種多様な細胞タンパク質と結合する。Repの過剰発現は、多指向性の効果を招く。Rep78は細胞周期進行を崩壊させ、そして細胞性およびウイルスの発がん遺伝子による形質転換を抑制する。感受性細胞系において、Repの過剰発現は、アポトーシス（予定死）および細胞死を招く。Rep78活性のいくつかは、その構成性のATPアーゼ活性、細胞性遺伝子の発現およびタンパク質相互作用での干渉を含む、細胞傷害性に寄与する。

AAV感染の第一ステップは、細胞表面への結合である。AA V2のための受容体および共受容体は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、線維芽細胞増殖因子受容体-1およびαvβ5インテグリンを含み、一方、N-連結された2,3-連結されたシアル酸はAAV5結合および形質導入のために必要である（Walters（ウォルターズ）, R. W., et al. J Biol Chem 276 (2001) 20610-6）。Hela（ヒーラー）細胞において、蛍光的にラベルをつけたAA V2粒子は、クラスリンでコート（被覆）されたピット（窪み）において受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを介して細胞に入るように見える。結合したウイルスの60%よりも多くは、感染の後、10分以内に内在化された。核に入る前に、おそらく核の孔の複合体（NPC）を介して、ラベルをつけられたAAV粒子は、エンドソームから逃げ、細胞核に細胞質を通してトラフィック（取引）され、核周囲に蓄積したのが観察される。AA V2粒子は核において検出され、被覆されないこと（uncoating）が核で起こることを示唆された（Bartlett（バートレット）, et al. J Virol 74 (2000) 2777-85; Sanlioglu（サンリオグル）et al. J Virol 74 (2000) 9184-96）。また、非被覆のピットにおけるより一層少ない程度にとって以外で、AAV5はクラスリンにより被覆された小嚢（ベシクル）によって主にヒーラー細胞において内在化される。AAV粒子はまた、ゴルジ体（装置）を介して細胞間によりトラフィックされることができる（Bantel-Schaal（バンテル-シャール）, U., et al. J Virol 76 (2002) 2340-9）。AAV5が少なくとも部分的に被覆されないことは、核に入る前に起こることが示唆され、それは、無傷のAAV5粒子が核において検出されなかったからである（Bantel-Schaal et al., 2002）。被覆されないと、1本鎖ゲノムは、リーディング鎖合成または反対の極性の入力DNAのアニーリングによってのどちらでも二重鎖DNAに転換する。AAV複製が、核の範囲内で起こる。

アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはサイトメガロウイルスのようなヘルパーウイルスでの共感染（同時感染）の間、AAVは効率的な生産的な複製が可能である。アデノウイルスによって提供されるヘルパー機能は、とても詳しく調査されている。ヒト胚腎臓293細胞は、構成的にアデノウイルスE1AおよびE1B遺伝子を発現し、それにおいて、E2A、E4およびVAの初期のアデノウイルス遺伝子生産物は、組換え型AAVの複製を許すのに十分であると見出された。Allen（アレン）らは、rAAVの効果的な生産がE4orf6発現プラスミドだけでトランスフェクションする293細胞において可能であることを報告した（Allen, J. M., et al. MoI Ther 1 (2000) 88- 95）。E1AはＳ相のエントリーを刺激し、そしてE2Fの放出を招くpRB系統タンパク質での相互作用によってG1/S境界でのpRBチェックポイントを不活化することによって予定外のDNA合成を誘導する（(Ben-Israel（ベン-イスラエル）, H.およびKleinberger（クラインバーガー）, T. Front Biosci 7 (2002) Dl 369-95においてレビュー（再調査）される）。これは、ヌクレオチド合成およびDNA複製において関係する酵素の誘導または活性化のいずれにも導く。予定外のDNA合成が強いアポトーシスの信号であるので、抗アポトーシスの機能は必要である。E1B-19kはBcl-2相同体であり、そしてE1B-55kはp53アンタゴニスト（拮抗物質）である。双方のタンパク質は、抗アポトーシスの機能を持つ。E4orf6はE1B-55kと複合体を形成し、そしてp53の分解を招く。また、Ｓ相静止（アレスト）が引き起こされることが報告される（Ben-Israel およびKleinberger, 2002）。E2Aは1本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質をコード化し、それはDNA複製のために必須ではないが、遺伝子発現を生じさせると思われる（Chang（チャン）およびShenk（シェンク）. J Virol 64 (1990) 2103-9）。VA転写単位は、AAV2 RNA安定性および翻訳に影響を及ぼす（Janik（ジャニク）et al., Virology 168 (1989) 320-9）。E1Aは、AA V2遺伝子発現に、より一層直接的な影響を及ぼす。細胞転写因子YY-1は、ウイルスP5プロモーターを結合し、そして抑制する。E1Aは、この転写ブロックを解放する。後期のAd遺伝子生産物のどれも、AAV2複製にとって不可欠であるとは見出されなかった。ヘルパーウイルスの主要な機能は、活性なDNA複製機構での細胞環境の生成であるように見え、そしてAAV複製での直接的な関係よりもむしろ高レベルのAAV複製を許すプロアポトーシス（アポトーシス促進性）の機能をブロックした。

（viii.大きなペイロードのウイルスベクター）

大きなヒトヘルペスウイルスでの分子遺伝学的な実験は、ある手段を提供し、それによって大きな異種DNA断片がクローン化され、増やされ（propagated）、およびヘルペスウイルスでの感染のために許容的な細胞において確立することができる（Sun（サン）et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter（コッタ）およびRobertson（ロバートソン）, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999）。これらの大きなDNAウイルス（単純ヘルペスウイルス（HSV）およびエプスタインバーウイルス（EBV）は、ヒト異種DNAの断片> 150kbを特定の細胞へ配送するための可能性を持つ。EBV組換え体は、エピソームの（遺伝子副体の）DNAとして感染したＢ細胞においてDNAの大きな小片（ピース）を維持することができる。330kbまでのヒトゲノム挿入物を運ぶ個々のクローンは、遺伝的に安定に見えた。これらのエピソームのメンテナンス（維持）は、EBVでの感染の間に構成的に発現される、特定のEBV核タンパク質、EBNA1を必要とする。その上、これらのベクターはトランスフェクションのために用いることができ、そこでは、大量のタンパク質をインビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウイルスのアンプリコン（単位複製配列）系はまた、DNAの小片> 220kbをパッケージングし、そしてエピソームとしてDNAを安定して維持することができる細胞を汚染するのに用いられる。

他の有用なシステムには、たとえば、ワクシニアウイルスベクターの複製および宿主制限非複製（host-restricted non-replicating）が含まれる。

（ix.非核酸系システム）

明らかにされた組成物は、多種多様なやり方において標的細胞に配送することができる。たとえば、組成物はエレクトロポレーション（電気穿孔）によって、またはリポフェクションを通して、またはリン酸カルシウム沈殿を通して配送することができる。選ばれる配送メカニズムは標的とされる細胞の種類において部分的に、そして配送が、たとえば、インビボまたはインビトロで起こるかどうかに依存する。

このように、たとえば、組成物は、陽イオンリポソーム（例は、DOTMA、DOPE、DCコレステロール）または陰イオンリポソームのような、リポソームのような、脂質を備えることができる。リポソームはさらに、必要に応じ、特定の細胞を標的にするのを容易にするために、タンパク質を含むことができる。化合物および陽イオンリポソームを備える組成物の管理（投与）は、標的器官に血液求心路に施すか、または気道の標的細胞への気道に吸入させることができる。リポソームに関して、Brigham（ブリガム）et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1 :95-100 (1989); Feigner（フェイナー）et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987); U.S. Pat.（米国特許）No.4,897,355参照。さらにまた、化合物は特定の細胞タイプ、大食細胞のようなものに対して標的とすることができるマイクロカプセルの構成要素として投与することができ、またはそこでは、化合物の拡散またはマイクロカプセルからの化合物の配送は、特定の速度または投薬量のために設計される。

上記する方法では、それは、対象体の細胞への外因性のDNAの投与および取り込みと取り込み（すなわち、遺伝子の形質導入またはトランスフェクション）が含まれ、細胞への組成物の配送は、多種多様なメカニズムを介して行うことができる。1種の例として、配送はリポソームを介して、LIPOFECTIN（商品名、リポフェクチン）、LIPOFECTAMINE（リポフェクタミン）（GIBCO-BRL, Inc.（ギブコ-RBL社）、Gaithersburg（ゲイサーズバーグ）、MD（メリーランド州））、SUPERFECT（スーパーエフェクト）（Qiagen, Inc. Hilden, Germany）およびTRANSFECTAM（トランスフェクタム）（Promega Biotec, Ins. （プロメガ・バイオテク社）, Madison（マディソン）、WI（ウィスコンシン州））、ならびにこの技術において標準の手法によって開発される他のリポソームのような市販のリポソーム調製物を使用して行うことができる。その上、明らかにされた核酸またはベクターは、エレクトロポーレーション、Genetronics, Inc.（ジェネトロニックス社）（San Diego（サンディエゴ）, CA（カリフォルニア州））から入手可能なそのための技術によって、ならびにSONOPORATION（ソノポレーション）機械（ImaRx Pharmaceutical Corp.（アイマレックス・ファーマシューティカル社）, Tucson（トゥーソン）、AZ（アリゾナ州））によってインビボに配送することができる。

材料は、溶液、懸濁物（たとえば、微粒子、リポソーム、または細胞中に組み込まれる）におけるものでよい。これらは、抗体、受容体、または受容体のリガンドを介して特定の細胞タイプに対して標的にされうる。以下の参照は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするこの技術の使用の例である（Senter（センター）, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe（バグスハウェ）, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli（バッテリー）, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz（ピエテルツ）およびMcKenzie（マッケンジー）, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); およびRoffler（ロフラー）, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。これらの技術は、いろいろな他の特定の細胞タイプのために用いることができる。“ステルス（秘密）”および他の抗体のようなビークル（媒介物）は、リポソーム（結腸癌への脂質によって媒介される薬物ターゲティングを含む）、細胞特異的リガンドを介するDNAの受容体によって媒介されるターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、およびインビボでのネズミ神経膠腫（グリオーマ）細胞の高度に特異的な治療上のレトロウイルスのターゲティングを共役した。次の参照は腫瘍組織に対する特異的なタンパク質のターゲティングのためのこの技術の使用の例である（Hughes（ヒューズ）et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); およびLitzinger（リッツィンガー）およびHuang（ホワン）, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)）。概して、受容体はエンドサイトーシスの経路に関係し、構成的であるか、またはリガンドを誘導する。これらの受容体はクラスリンで被覆されたピットにおいて集まるか、クラスリンで被覆された小胞（ベシクル）を介して細胞に入り、受容体が分類される酸性化されたエンドソームを通過し、および次いで細胞表面にリサイクル（再循環）し、細胞内に保存されることになるか、またはリソソームにおいて分解するかのいずれかである。内部移行経路は、多種多様な機能で、栄養の取込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子のクリアランス（排除）、ウイルスおよび毒素の日和見性のエントリ、リガンドの解離および分解、および受容体-レベルの規則のようなものに役立つ。細胞タイプ、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの結合価（valency）、およびリガンド濃度に従い、多くの受容体は1種よりも多くの細胞内経路をたどる。受容体によって媒介されるエンドサイトーシスの分子上および細胞上のメカニズムはレビューされた（Brown（ブラウン）およびGreene（グリーン）, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。

宿主細胞ゲノムに統合される細胞に配送される核酸は、典型的に統合配列を含む。これらの配列は特にウイルス系のシステムが使われるとき、ウイルス関連配列であることが多い。これらのウイルス統合（intergration）システムはまた、配送の非核酸系のシステムで、リポソームのようなものを用いて配送される核酸中に組み込むことができ、その結果、配送システムにおいて含まれる核酸は宿主ゲノム中に統合されてくる。

宿主ゲノムへの統合の他の一般的な技術には、たとえば、宿主ゲノムとの相同組換えを促すよう設計されるシステムが含まれる。これらのシステムは典型的に、発現される核酸のフランキング（側面に位置する）配列に依存し、それは、ベクターの核酸および標的の核酸の間の組換えが起こる宿主細胞ゲノムの範囲内で、標的配列との十分な相同性を持ち、宿主ゲノム中に統合される配送された核酸を生じさせる。相同組換えを促すのに必要なこれらのシステムおよび方法は、この技術の技量の人々に知られている。

（x.インビボ/エキソビボ）

上記のように、組成物は薬学的に許容できる担体において投与することができ、および対象体の細胞にインビボで、および/またはエキソビボで、この技術においてよく知られた多種多様なメカニズム（例は、ネイキッド（裸の）DNAの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介するDNAの筋肉内注射（注入）、エンドサイトーシスおよび同様のもの）によって配送することができる。

エキソビボの方法が採用される場合、細胞または組織はこの技術においてよく知られる標準的なプロトコルに従って本体の外に取り出され、および維持することができる。組成物は、任意の遺伝子移入メカニズムで、リン酸カルシウムによって媒介される遺伝子配送、エレクトロポーレーション、顕微鏡下注射またはプロテオ（タンパク質）リポソームを介して、細胞中に導入することができる。形質導入された細胞は次いで、インフュージョン（注入）し（例は、薬学的に許容可能な担体において）、または細胞または組織のタイプのための標準的な方法につき、対象体へ同位に（homotopically）移植する（transplanted）ことができる。標準的な方法は、対象体への移植または種々の細胞の注入のために既知である。

（xi.発現システム）

典型的に細胞に配送される核酸は、発現制御のシステムを含む。たとえば、ウイルスおよびレトロウイルスのシステムでの挿入された遺伝子は通常、プロモーター、および/または、望ましい遺伝子生産物の発現を制御するのに役立つようなエンハンサーを含む。プロモーターは、概して、転写開始部位に関して比較的固定された場所におけるときに機能するDNAの配列または配列群である。プロモーターはRNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要な中心的な要素を含み、および上流の要素および反応要素を含みうる。

（a.ウイルスプロモーターおよびエンハンサー）

哺乳類の宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好適なプロモーターは、種々の供給源から得られうるもので、たとえば、ウイルスのゲノムで、次のようなものであり、すなわち、ポリオーマ、サルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルス、または異種哺乳類のプロモーターから、例は、ベータアクチンプロモーターである。SV40ウイルスの初期および後期のプロモーターは、また、複製のSV40ウイルス起点を含むSV40制限酵素断片（restriction fragment）として便利に得られる（Fiers（フィエルズ）et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期のプロモーターは、HindIII E制限酵素断片として便利に得られる（Greenway（グリーンウェー）, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。もちろん、宿主細胞または関連した種からのもプロモーターも本明細書において有用である。

エンハンサーは概して、転写開始部位から固定されない距離で機能するDNAの配列に言及し、そして転写単位に対する5’（Laimins（ライミンス）, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)）または3’（Lusky（ラスキー）, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)）のいずれかでも可能である。さらにまた、エンハンサーは、イントロンの範囲内（Banerji（バナージ）, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)）ならびにコード配列自体の範囲内（Osborne（オズボーン）, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)）にあることができる。それらは通常、長さで10および300bpの間にあり、そしてそれらはcisにおいて機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターから転写を増やすために機能する。エンハンサーはまた、転写の規制を媒介する反応要素を含むことが多い。プロモーターはまた、転写の規制を媒介する反応要素を含むこともできる。エンハンサーは、遺伝子の発現の規制を定めることが多い。多くのエンハンサー配列が目下、哺乳類の遺伝子から既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、-フェトプロテインおよびインシュリン）一方、典型的に、あるものは一般的な発現のための真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。好適例は、複製起点（bp 100-270）の後期側上のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。

プロモーターおよび/またはエンハンサーは、特にそれらの機能の引き金を引く光または特定の化学的事象のいずれかによって活性化されうる。システムは、試薬で、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンのようなものによって規制することができる。また、照射で、ガンマ線照射、またはアルキル化の化学療法薬物のようなものの曝露によってウイルスベクター遺伝子の発現を増強するやり方もある。

一定の具体例において、プロモーターおよび/またはエンハンサーの領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大にするために構成的なプロモーターおよび/またはエンハンサーとして働くことができる。一定の構築物において、プロモーターおよび/またはエンハンサーの領域はすべての真核生物細胞タイプにおいて、たとえそれが特定の時に特定の種類の細胞において発現されるだけであるとしても、活性である。この種類の好適なプロモーターは、CMVプロモーター（650塩基）である。他の好適なプロモーターは、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターLTRである。

すべての特定の調節要素がクローン化され、そして発現ベクターを構築するのに用いることができ、それは黒色腫細胞のような特定の細胞タイプにおいて選択的に発現されるベクターである。グリア線維酸性タンパク質（glial fibrillary acetic protein）（GFAP）プロモーターは、グリア（膠）起源の細胞において遺伝子を選択的に発現させるのに用いられた。

真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト（人間）または有核細胞）において用いられる発現ベクターは、mRNAの発現に影響を及ぼしうる転写の終了のために必要な配列も含みうる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコード化するmRNAの翻訳されない部分におけるポリアデニル化された部分として転写される。3’の翻訳されない領域はまた、転写終結部位を含む。好ましくは、転写単位はまた、ポリアデニル化の領域を含む。この領域の1種の利益は、それが、転写された単位を、mRNAのように処理し、そして輸送される見込みを増やすことである。ポリアデニル化信号の発現構築物における識別および使用は十分に確立されている。好ましくは、相同的なポリアデニル化信号が導入遺伝子構築物において用いられる。一定の転写単位において、ポリアデニル化の領域は、SV40の初期ポリアデニル化信号から導き出され、そして約400の塩基からなる。また、好ましくは、転写された単位は、他の標準的配列を、単独で含み、または、上記配列との組合せにおいて、構築物からの発現、またはその安定性を改善する。

（b.マーカー）

ウイルスベクターは、マーカー生産物をコード化する核酸配列を含むことができる。このマーカー生産物は、遺伝子が細胞に配送されたかどうか定めるのに用いられ、そして配送されれば発現される。好適なマーカー遺伝子は、E. Coli（大腸菌）lacZ遺伝子であり、それはβ-ガラクトシダーゼをコード化し、および緑色蛍光タンパク質である。

若干の具体例において、マーカーは選択可能なマーカーでありうる。哺乳類の細胞の適した選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンの類似体G418、ヒドロマイシン（hydromycin）、およびピューロマイシンである。そのような選択可能なマーカーが、哺乳類の宿主細胞中に首尾よく移すとき、選択的な圧力の下に置かれるならば、形質転換した哺乳類の宿主細胞は生存することができる。選抜レジメン（selective regime）の別々の2つの広く用いられるカテゴリー（範疇）がある。最初のカテゴリーは、細胞の代謝および補われたメディア（培地）から独立して増殖するための能力が欠如している変種（ミュータント）細胞系の使用に基づく。2つの例は以下の通りであり、すなわち、CHO DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養分の添加なしで増殖する能力が欠如している。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路のために必要な一定の遺伝子を欠いているので、なくなったヌクレオチドが補われた培地において提供されない限り、それらは生存することができない。培地を補うことに代わるものは、無傷のDHFRまたはTK遺伝子をそれぞれの遺伝子が不足している細胞中に導入することであり、このようにして、それらの増殖の要求が変えられる。DHFRまたはTKの遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することが不可能である。

第2のカテゴリーは、任意の細胞タイプにおいても用いられる選択スキーム（計画）に言及し、変種細胞系の使用を必要としない優性選択である。これらの計画は典型的に、宿主細胞の成長を抑えるために薬物を使う。新規の遺伝子を持つそれらの細胞は、薬物耐性を伝える（conveying）タンパク質を発現し、そして選択を生き残る。そのような優性選択の例は、薬物のネオマイシン、（Southern（サザーン）P.およびBerg（バーグ）, P., J. Molec. Appl. Genet. 1 : 327 (1982)）、ミコフェノール酸、（Mulligan（マリガン）, R.C.およびBerg, P. Science 209: 1422 (1980)）またはハイグロマイシン、（Sugden（サグデン）, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)）を用いる。3つの例は、それぞれ、適切な薬物G418またはネオマイシン（geneticin、ジェネテシン（商品名））に対する耐性、xgpt（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンを伝えるために、真核生物の制御下に細菌の遺伝子を用いる。他には、ネオマイシンの類似体G418およびピューロマイシン（puramycin）が含まれる。

（ガイダンスキュー）

細胞移動は、脈管で神経ネットワーク（Lauffenburger（ラウフェンブルガー）およびHorwitz（ホーウィッツ）, 1996, Ridley（リドリー）et al., 2003）のパターンニングを含む別種の（diverse）形態形成プログラムに関係している。これらの発達上のプログラムを果たす（execute）ために、移動性の細胞は、細胞外の状況（milieu）において存在する陽性および陰性のガイダンスキュー（誘導合図）に対応して、そのアクチン細胞骨格を再編成しなければならない。細胞移動上のこれらのキューの影響は、細胞の表面上の貫膜受容体の補完物（complement）、および特定のキューによって活性化される別種の細胞内信号形質導入カスケード（シグナル伝達カスケード）によって指図される。

神経および脈管ネットワークの形成は、細胞外環境においてこれらの特定のキューに基づく一連の短いセグメント（区分）を操縦すること（navigating）でのより一層単純な課題に対して長距離を突出すること（projecting）での複雑な課題を減らす共通の分子キューを共有する。ガイダンスキューは、4つの多様性に入り、すなわち、アトラクタント（attractants、誘引物）およびリペラント（repellents、反発）であり、短い範囲（細胞-またはマトリックス-関連の）またはより一層長い範囲（広がる）のいずれかで働きうる。中間の標的は、軸索を誘う長い範囲（long-range）の魅力的な信号の、および標的に入った軸索を放出する短い-または長い-範囲の反発の信号の供給源であることが多く、またはそれらのエントリを全体で防ぐ。中間の標的の間において、軸索および管は、コリダー（通路）に沿っての細胞によって、およびそれらが周囲の組織に入るのを防ぐリパルシブ（反発的）な信号によって作成されるアトラクティブ（誘引的）なキューによって、組織コリダーを通ってガイド（誘導）されることが多い。

ここに用いるように、“ガイダンスキュー”はニューロン（神経単位）または血管のナビゲーションまたは形成を引きつけるか、または撃退するために働くことができる分子である。ガイダンスキューで、軸索のガイダンスキューのようなものは、しばしば“アトラクティブ”または“リパルシブ”に分類される。しかし、これは簡略化のものであり、異なる軸索が所定のキューに違って反応する。さらにまた、同じ軸索の成長円錐は、タイミングに基づく所定のキュー、同じであるか他のキューとの以前の経験、およびキューが見出される前後関係へのその反応を変えることができる。このように、1種の局面では、ガイダンスキューは、特定の細胞のための魅力的なガイダンスキューであることができる。別の局面では、ガイダンスキューは、特定の細胞のための反発的なガイダンスキューであることができる。ここに明らかにされるように、“ガイダンスキュー”は細胞外で細胞受容体上に働くタンパク質であることができる。しかし、また、神経単位または血管のナビゲーション（操縦）を引きつけるか、または撃退するために細胞外で、または細胞内でのいずれかでも働くことができる核酸および小分子を含む分子が、明らかにされる。このように、例として、ガイダンスキューの受容体のリガンドがここに明らかにされる場合、また、前記受容体の活性または発現を調整（モジュレート）することができる分子が明らかにされる。このように、たとえば、組成物で、機能的な核酸のようなものが明らかにされ、それはここに明らかにされるガイダンスキューの受容体、またはそのシグナリング分子の遺伝子発現を変えることができる。1局面において、これらの分子は、ここに明らかにされる伝統的なタンパク質ガイダンスキューとして、同じ細胞受容体および細胞内シグナリング経路に影響を及ぼす。別の局面では、これらの分子は、ここに明らかにされる選別方法によって識別することができる。

ガイダンスキューは、軸索を誘導する能力に基づいて識別することができる。増殖する軸索は、成長円錐と言われる増殖する先端（tip）での高度に運動性の構造を持ち、それは是増殖する方向に軸索を指図する（instruct）信号のための細胞外環境を“探り出す（sniffs out）”する。これらの信号は、ガイダンスキューと呼ばれ、定位置に、または広がって固定されることができ、それらは軸索を引きつけ、または撃退することができる。軸索に関して、成長円錐は、これらのガイダンスキューを認識し、そして信号を化学向性（屈性）反応に解釈させる受容体を含む。概して、理論的なフレームワーク（枠組み）は、成長円錐がガイダンスキューを“感知する”とき、受容体は、結局細胞骨格に影響を及ぼす成長円錐において種々のシグナリング分子を活性化するというものである。軸索の成長円錐がガイダンスキューの勾配を感じるならば、成長円錐における細胞内シグナリングは非対称に起こり、その結果細胞骨格の変化は非対称に起こり、そして成長円錐はガイダンスキューの方へ、またはそれから離れて回転する。

遺伝子のおよび生化学な方法の組合せは、ガイダンス分子およびそれらの受容体のいくつかの重要なクラスの発掘に導いた。ネトリン（Netrins）およびそれらの受容体、DCCおよびUNC5は、軸索を引きつけ、または撃退するために働くことができる分泌された分子である。Slits（スリット）は、魅力のある（engaging）Robo（ラウンドアバウト、迂回）クラスの受容体によって神経成長円錐を、通常ははね返す分泌されたタンパク質である。エフリン（Ephrins）は、他の細胞の表面上のEph受容体を活性化させる細胞表面分子である。この相互作用は魅力的であり、または反発的であることができる。場合によって、エフリンはまた、信号を発現している細胞中に形質導入することにより、受容体として働くことができ、一方、Ephsはリガンドとして働く。双方のエフリン-およびEph-関連（bearing）細胞へのシグナリングは、“双方向性シグナリング”と呼ばれる。セマフォリンの多くの種類は、主に軸索のリペラントで、プレキシンおよびニューロピリンと呼ばれている細胞表面マーカーの複合体を活性化する。そのうえ、細胞外分子の多くの他の種類は、適宜に操縦されように成長円錐によって使われ、それは、発生上のモルフォゲン（developmental morphogens）で、BMPs、Wnts、Hedgehogs（ヘッジホッグ）、およびFGFsのようなもの、細胞外基質および接着分子で、NCAM、L1、およびラミニンのようなもの、NGFのような増殖因子、および神経伝達物質およびGABAのようなモジュレータが含まれる。このように、ここに明らかにされるように、リパルシブキューは、たとえば、ラウンドアバウト受容体のリガンドまたはネトリン受容体のリガンドであることができる。

（xii.Unc5およびネトリン）

ネトリンは、DCC（deleted in colorectal carcinoma、結腸直腸癌で削除される）系統の受容体を結合することによって軸索を正中（midline、正中線）へ導く化学誘引物質として識別された。ネトリンはまた、軸索リパルション（撃退）、単独またはDCC受容体とともに働くUnc5系統の受容体によって媒介される効果にも関係した。そのうえ、DCC-Unc5のヘテロ二量体は、単独で、Unc5受容体よりも長い範囲で、リパルションを媒介することができる。ネトリンおよびUnc5bは、4つの哺乳類のUnc5受容体の1種であり、また、血管ガイダンスを規制する。Unc5bは、内皮の先端細胞において発現される。マウスにおけるUnc5bの損失は、先端細胞のフィロポディア（糸状仮足）の異常な伸張および多くの管の過度の分枝を招く。ネトリンを用いるインビボでの培養された内皮細胞または増殖する管の処置は、フィロポディアの退縮を誘発する。内皮細胞リパルションを媒介することでのUnc5bについての役割は、ゼブラフィッシュの胚での発達するセグメント間の管（体節間管）（ISV）での分析によって確かめられた。

ネトリンは、細胞外基質分子ラミニンに関連したガイダンスキューの系統学的に保存された系統から構成される。4つの分泌されたネトリンは、脊椎動物で確認され、すなわち、ニワトリ、マウス、ゼブラフィッシュおよびヒトのネトリン-1；ニワトリのネトリン-2；マウスおよびヒトのネトリン-3；およびマウスおよびヒトのネトリン-4である。すべてのネトリンは、ラミニンの短いアームに構造的に関連し、ラミニンVIおよびVのドメインを含む。すべてのネトリンはまた、正に荷電するC末端ドメイン、NTRモジュールと呼ばれるものを含む。ネトリン-1、-2、および-3は、ラミニンのガンマ鎖により一層密接に関連する。対照的に、ネトリン-4は、ラミニンのベータ鎖により一層密接に関連する。

ネトリン受容体の2つの系統は、移動の方向を指図することが識別された。双方の系統は、受容体の免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリー（上科）に属する。脊椎動物において、結腸直腸がんでの欠失（Deleted in Colorectal Cancer）（DCC）系統は、2つのメンバー、DCCおよびネオゲニンを持ち、それは、6つの、細胞外フィブロネクチンのタイプIIIの繰り返しを、4つのIgドメインに加え、および細胞内相同性（p1、P2およびP3）の3つの領域を含み、その領域は他の受容体で、UNC5b（p1）およびRobo1（P3）との相互作用を媒介する。UNC5系統は4つのメンバーを持ち、UNC5a（UNC5H1）、UNC5b（UNC5H2）、UNC5c（UNC5H3）であり、それらは2つのIgおよび細胞外に（extracellularlly）2つのトロンボスポンジンのタイプI（TspI）ドメインおよびZU-5を、細胞内にDCC結合およびC末端デスドメインを含む。機能的に、DCC系統はネトリン-1に対するアトラクションを媒介し、一方、UNC5系統は、DCCでネトリン-1依存性複合体を形成することによってリパルションを媒介する。双方の系統のメンバーは、依存受容体として働き、そしてリガンドの不存在および存在でなくてアポトーシスを誘発することが示された。

（xiii.セマフォリンおよびニューロピリン/プレキシン）

ここに明らかにしたように、若干のセマフォリンは脈管透過性を増やすためにプレキシンを通して働くことができる。このように、明らかにされた組成物および方法の若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、セマフォリンではない。明らかにされた組成物および方法の若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、プレキシンまたはニューロピリンのリガンドではない。

しかし、ここに明らかにされるように、セマフォリン3Eは、脈管透過性を抑制するためにプレキシンD1を通して働く。このように、若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、セマフォリン3Eであることができる。若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、プレキシンD1のリガンドであることができる。

セマフォリンは、分泌され、そして長い範囲で拡散することが可能なガイダンス信号である（クラス3）が、若干の前後関係では、制限された拡散を持ち、または短い範囲でのガイダンスキューとして膜に結合し、そして機能することができる。セマフォリンは、リペラントとして最も良好に知られ、しかし、セマフォリン3A（Sema3A）はまた、周期的ヌクレオチドの細胞内レベルに応じて、化学誘引物質として機能することもできる。セマフォリンは、多量体受容体複合体（multimeric receptor complexes）、すなわち、膜に結合したセマフォリン結合プレキシンを介して信号を送り、ところが、分泌されたクラス3のセマフォリンはニューロピリンを結合し、それはプレキシンとともに非シグナリング共受容体として機能する。この役割に対する例外は分泌されたSema3Eであり、それは直接プレキシンD1（Plxnd1）を結合する。さらにまた、膜に定着された（membrane-anchored）Sema7Aは、インテグリンを活性化することによって軸索伸張を刺激する。セマフォリンおよびおれらの受容体はまた、管のガイダンスおよび分枝することを規制する。内皮細胞は、種々のニューロピリンおよびプレキシンの受容体を発現する。Sema3Aは、内皮の葉状仮足および管の形成を抑制する。ニューロピリン2は、静脈およびリンパ管において発現され、そしてニューロピリン1は発達する脈管構造において広く発現される。ニューロピリンはまた、管のパターンニングにおいても関係し、しかし、これはセマフォリンのシグナリングよりもむしろVEGFを調整することにおいてのそれらの役割を反映することができ、それは、ニューロピリンがまた、特定のVEGFアイソフォーム（VEGF 165）のためのレセプターであり、そしてVEGF受容体の活性を調整するからである。さらに、VEGF 165はニューロピリンと結合するためのSema3Aと競争する。

ここに明らかにされるように、セマフォリン3Eは、脈管透過性を抑制するためにプレキシンD1を通して働く。このように、若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、セマフォリン3Eであることができる。若干の局面では、リパルシブなガイダンスキューは、プレキシンD1のリガンドであることができる。

（xiv.エフリンおよびEphs）

別の基本的なクラスの短い範囲の軸索のガイダンス分子は、Eph受容体チロシンキナーゼおよびそれらのエフリンリガンドである。哺乳類における13のEph受容体は、A（EphA1-8）およびB（EphB1-4およびEphB6）のサブファミリー（亜科）に分類される。8つのエフリンリガンドはエフリンA1-5から構成され、それらはグリコシル-ホスファチジルイノシトールアンカーおよびエフリンB1-3を介して膜に繋ぎ止められ（tethered）、それらは貫膜および細胞質の領域を含む。エフリンAリガンドは、EphA受容体を結合し、そしてエフリンBリガンドはEphB受容体を結合し；ファミリーの間の交差反応性の適度の程度だけが観察され；たとえば、EphA4は若干のBクラスのエフリンを結合する。Eph受容体およびエフリンは、Eph受容体（前方（フォワード）のシグナリング）またはephrinBリガンド（逆行（リバース）のシグナリング）を発現する細胞において、双方向性シグナリングを惹起する。エフリンはトポグラフィー（位置特異的）の網膜視蓋の投射（topographic retinotectal projections）上の調査を通してリペラントな軸索ガイダンス分子として最初に識別され、そして次いで他の配線プロセス（wiring processes）における両方の負および正のキューとして意味づけられた（implicated）。Eph-エフリン信号はまた、脈管発達を制御する。これらのガイダンス分子の若干は、動脈または静脈のどちらででも選択的に発現されることが見出された最初の因子のうちの１種であった。歴史的に、血行動態の圧力違いは、動脈への高圧管および静脈への低圧管の分化を規制するために推定された。しかし、マウスにおける発現分析および機能喪失の調査は、EphB4およびエフリンB2がそれぞれ、発達する静脈および動脈において発現し、そしてそれらのメンテナンスのために重要であることを指し示した。これらの調査は、リパルシブなエフリンB2-EphB4シグナリングを指し示し-双方の前方および逆行で-静脈および動脈の内皮細胞の混在（intermixing）を防ぐことができ、内皮細胞‘ライク（様）’のアセンブリー（組み立て体）を確保し、そして動脈-静脈の細胞境界を画定する（demarcate）ことができる。リパルシブなエフリン-Eph信号は、短い範囲のガイダンスキューを、管のために組織境界を通して操縦するために提供する。たとえば、エピフリンB2は、EphB3/EphB4-発現性ISVが体節に入ることを撃退する。しかし、エフリン-Eph相互作用はまた、アトラクティブなキューを提供し、そして他の前後関係において毛細管出芽（sprouting）を誘発することもできる。たとえば、エフリンBリガンドおよび同じ管における隣接した内皮細胞または平滑筋細胞上のEphBsのジャクスタクライン（接触分泌）の発現は、双方向性の信号を接触に依存するコミュニケーション（情報交換）を確立するために提供しうるものであり、そして管のアッセンブリー、出芽および成熟を促す。たとえば、エフリンAリガンドはまた、脈管形態形成のポジティブな規制として機能しうる。

EphA2/エフリンA1シグナリングはVEGFによって誘発された網膜脈管透過性を抑制することが示され、そして糖尿病性網膜症において、新血管新生および血管透過性の処置に意味づけられた（Ojima（オジマ）et al, 2006）。このように、脈管透過性を抑制する明らかにされた組成物および方法の若干の局面において、リパルシブなキューは、Ephのリガンドまたはエフリン受容体ではない。他の局面では、明らかにされた組成物は、Ephまたはエフリン受容体のリガンドに加えて、少なくとも1種のガイダンスキューを構成する。

（xv. Slitsおよびラウンドアバウト）

リパルシブなガイダンスキューのよく知られた例は、細胞外基質タンパク質のSlit（スリット）ファミリーである。Slitは当初、Drosophila（キイロショウジョウバエ）胚の正中線（midline）で、軸索ガイダンス欠損のための遺伝子スクリーンにおいて識別された（Seeger（シーガー）et al., 1993; Kidd（キッド）et al, 1998; Battye（バッティ）et al., 1999; Kidd et al., 1999）。その後、3つの進化的に保存されたSlit遺伝子は脊椎動物においてクローン化され、そしてそれらのコード化されたタンパク質は、軸索を撃退し（Brose（ブローズ）et al., 1999; Li（リー）et al., 1999）、そして感覚軸索樹枝状分枝を促す（sensory axon arborization）（Wang（ワング）et al., 1999）。

遺伝子での、および生化学での調査は、貫膜タンパク質のRoboファミリーがSlitタンパク質のための受容体として機能することを実証した。Slitの様に、roboがDrosophilaにおいて、不完全な軸索ガイダンスのために遺伝子のスクリーンで発見された（Seeger（シーガー）et al., 1993）。4つのRobosは脊椎動物において識別され、そしてRobo 1-3は神経系において主に発現された（Marillat（マリラント）et al., 2002）。対照的に、Robo4は、マジックラウンドアバウト（Magic Roundabout）としても知られ、排他的に胚性のマウスの脈管構造（Park（パーク）et al., 2003）、胎盤の動脈（Huminiecki（ヒュームイニエキ）et al., 2002）において、および多種多様なヒトの悪性病変（malignancies）の腫瘍内皮（Huminiecki et al., 2002; Seth（セス）et al., 2005）において発現される。Robo4はさらに、その多岐にわたる（divergent）配列によってRobo1-3から区別され、すなわち、神経のRobosの外部ドメインは5つの免疫グロブリン（Ig）ドメインおよび3つのフィブロネクチンのタイプIII（FNIII）の繰返しを含み、その一方、Robo4は2つのIg領域および2つのFNIIIの繰返しを含む（Huminiecki et al., 2002; Park et al., 2003）。そのうえ、Robo 1-3は4つの保存された細胞質の（CC）モチーフ、CC0、CC1、CC2およびCC3を所有し（Kidd（キッド）et al., 1998; Zallen（ザーレン）et al., 1998）、そのCC0およびCC2だけが、Robo4において存在する（Huminiecki et al., 2002; Park et al., 2003）。

神経系においてガイダンス決定を容易にするRoboの能力は、Slit-刺激された受容体の下流に、特定の生化学的プログラムの活性化に依存する。Drosophila、C. elegans（シノラブディス・エレガンス、線虫）、および哺乳類においてSlitに依存するリパルションの分析は、神経系においてRoboシグナリングのキーとなる（重要な）媒介物を識別した。Drosophilaにおいて、アベルソン（AbI）チロシンキナーゼおよびアクチン結合タンパク質Enabled（エンエーブルド）（Ena）は、Roboのリパルシブな活性を規制することに関与する（Bashaw（バショー）et al., 2000）。Drosophilaのさらなる研究は、気管の細胞および軸索のRobo-によって媒介されるリパルションに関係するタンパク質（GAP）を活性化するRac GTPaseを識別した（Lundstrom（ランドストレム）et al., 2004; Hu（フー）et al., 2005）。C. elegansにおいて、SlitシグナリングにおけるEnaのための直接的な役割は、遺伝子分析から出てきた（Yu et al., 2002）。哺乳類の神経単位において、Robo 1により相互作用されるタンパク質srGAP1は、前側脳室下ゾーン（帯）からの移動性の前駆体細胞のSlitに依存するリパルジョンにとって不可欠である（Wong（ウォン）et al., 2001）。これらの機械論の調査が、神経のRobosの下流のシグナリング経路を解明することを始めるだけでなく、そのような調査は受容体のリパルシブな活性のための説明を提供した。

神経系と対照的に、ほとんど何も脈管構造におけるSlit-Robo信号形質導入について、そしてSlit-Roboシグナリングが、神経性の、および非神経性の細胞タイプの双方の、および内皮細胞を含み、それらの移動を抑制するという証拠の優勢にもかかわらず、知られておらず（Wu（ウー）et al., 1999; Zhu（チュー）et al., 1999; Wu et al., 2001; Park et al., 2003; Seth（セス）et al., 2005）、いくつかの最近の報告はRobosが、双方のSlit依存およびSlit非依存のやり方において血管形成を促すことができると提案した。たとえば、Robo1のSlit2刺激がインビトロでの移動および管形成を誘発し、そしてインビボで腫瘍血管形成を促すと報告された（Feng（フォン）et al., 2004）。さらに、最近の調査は可溶性Robo4外部ドメインでのRobo4活性の抑制がインビトロでの移動および管形成を抑制し、血管形成の間、Robo4のためにポジティブな（積極的な）役割と一致することを示した。さらに、この調査は、Slitタンパク質がRobo4と結合せず、それによって、受容体のための未知のリガンドが関係すると報告した（Suchting（サッチング）et al., 2004）。Robo4が血管新生促進性（proangiogenic）であるという概念はまた、Robo4の過剰発現が内皮細胞接着および移動を無関係に増大させることを示している最近のデータも出現させた（Kaur（カウル）et al., 2006）。これらの一見調和しない（incongruous）観察結果は、内皮細胞におけるSlit-Roboシグナリングの機能的な重要性およびメカニズムを双方とも定める必要性を強調する。

ここに明らかにされるように、Slit2はRobo4のリガンドであり、そしてSlit2-Robo4シグナリングは否定的に細胞運動性を規制し、そして脈管透過性を抑制する。とりわけ、ここに提供する教示は、Slit2がRobo4の活性化を介して内皮においてリパルシブなキューを引き出すこと確立し、そのような活性に関与する新しいシグナル伝達カスケードが定められる。ここに記載するように、Robo4のSlit2の活性化はRacの活性を抑制し、そして、それゆえに、Racは、細胞運動性および細胞の伝播を惹起、または媒介した。さらにここに提供する教示は、Robo4およびアダプタータンパク質パキシリンの間のSlit2に依存する関係を確立し、そこでは、実験データをここに詳述して、生化学の、および細胞生物学的な証拠を提供し、それは、この相互作用が、細胞移動、伝播およびRac活性化のRobo4に依存する抑制のために重要である。とりわけ、ここに教示するように、Robo4活性化は、GIT1のパキシリンの活性化、および次に、ARF（アルフ、ADPリボシル化因子）6のGIT1抑制を惹起する。Robo4活性化は、内皮バリア機能を保ち、VEGF受容体の下流のVEGFシグナリングを阻止し、そして脈管リークおよび病的血管形成を減らす。重要な、Robo4活性化はVEGFシグナリングだけを阻止するだけでなく、トロンビンおよびbFGFを含む、多重の血管形成、透過性および炎症性因子からのシグナリングを抑制する。また、ここに明らかにするように、Robo4-パキシリンのシグナリングはゼブラフィッシュの適宜の胚性脈管発達にとって不可欠である。

ここに議論するように、Robo4活性化と関係するこれらの明らかにされた関係および結果は、モジュレーション（調整）のため、および細胞マニピュレーション（操作）のための新しい標的のために考慮される。“モジュレーション”には、ここで用いるように標的の活性の変化が含まれ、および“マニピュレーション”には、ここで用いるように細胞の状態における変化が含まれる。

（脈管透過性）

望ましくない脈管透過性によって特徴づけられる病気および障害には、たとえば、脳腫瘍と関係する浮腫、悪性病変に関係する腹水症、メイグスの症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留（pericardial effusion）および胸水（pleural effusion）が含まれる。このように、脈管透過性または浮腫の増加と関連したこれらまたは任意の他の病気も処置、または予防する方法を提供する。たとえば、2、3の例を挙げれば、浮腫形成を抑制することは、全体的な患者予後に対し、以下の状況で、すなわち、炎症、アレルギー疾患、ガン、脳卒中、心筋梗塞、肺および心臓での機能不全、腎不全、および網膜症のようなもので、有益でなければならない。さらに、浮腫は、組織低酸素の一般的な成り行き（consequence）であるので、脈管漏出の抑制が組織低酸素の処置への潜在的アプローチを表示すると結論することができる。たとえば、病的条件（血栓形成のようなもの）または医療行為（medical intervention）（心筋保護、臓器移植、および血管形成術）による血流の中断は、脈管漏出の抑制物質を使って、急性的に、そして予防的にの双方で処置することができた。

虚血/再灌流傷害に次ぐ脳卒中および心筋梗塞はまた、脈管透過性および浮腫によって特徴づけられる。組織灌流における欠乏（deficit）は、持続性の虚血後の血管原性浮腫に導かれ、それは増加した脈管透過性の結果として発達する。組織灌流は、動脈の開存性および動脈での血の流れにより、所定の組織に達する酸素を負荷したある程度の血である。組織血管新生は、妨害物（blockage）のために破壊されうるか、あるいは代わりに、それは影響を受けた部位の上流で血管漏出または出血から招かれる血流の欠乏から生じうる。急性心筋梗塞、脳卒中、外科的血行再建手法、および他の条件で、そこでは組織血管新生が崩壊したものの間の組織灌流における欠乏は、患者の条件の予後における重要な因子である。浮腫は、管崩壊（collapse）および障害のある電気的機能、特に心臓を含む、種々の種類の損害（damage）を引き起こすことができる。以降の再灌流はまた、しかし、若干の患者において似た損害を引き起こすことができ、処置パラドックス（逆説）を導く。それが必要な間、閉鎖された（occluded）血管から障害物を取り除く（アンブロックする）ため、または損害を受けた血管を修復または取り替えるために、次の（ensuing）再灌流は、場合によっては、更なる損害を引き起こすことがある。同様に、バイパス手術の間に、心臓が打つのを止められ、そして患者を心臓のポンプにつなぐことが必要である。たとえば、バイパス手術を受ける若干の患者は、条件が悪化することを経験するかもしれず（“ポストポンプ症候群”）、それは、手術の間の心機能の停止の間の虚血の結果であるかもしれない。動脈の妨害物は、血の流れの減少を引き起こしうるもので、しかし、妨害物が取り除かれ、そして動脈が切開された後でさえ、組織の再灌流が起こることができないなら、更なる組織の損傷は招かれうる。たとえば、血餅（clot）の破壊は、組織灌流の損失を、灌流の獲得よりもむしろ導く事象の連鎖の引き金を引きうる。

望ましくない脈管透過性によって特徴づけられる更なる病気および障害には、たとえば、サイトカインストーム（サイトカイン急増）を招きうる、感染性および非感染性の病気が含まれる。サイトカインストームは、多数の感染性および非感染性の病気で、たとえば、移植片対宿主病（GVHD）、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、敗血症、トリインフルエンザ、天然痘、および全身性（systemmic）炎症性反応症候群（SIRS）を含むものによって誘起される（増悪する）ことがある。

（病的血管形成）

血管形成および血管形成関連の病気は、細胞増殖によって密接に影響を受ける。ここに使うように、用語“血管形成”は組織または器官中への新しい血管の生成を意味する。通常の生理的条件の下で、人間または動物は、非常に特定の制限された状況だけで血管形成を経る。たとえば、血管形成は通常、創傷治癒、胎児性および胚性の発達および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。用語“内皮”は、扁平細胞の薄層としてここに規定され、それは、漿膜腔（serous cavities）、リンパ管、および血管を裏打ちする。これらの細胞は、“内皮細胞”としてここに定義されます。用語“内皮抑制活性”は、概して血管形成を抑制する分子の能力を意味する。内皮細胞増殖（繁殖）の抑制はまた、血管形成の抑制を招く。

制御された、および抑制されてない血管形成は双方とも、同様の様式において進行することが考えられる。内皮細胞およびペリサイト（周皮細胞）は、基底膜によって囲まれ、毛管の血管を形成する。血管形成は、内皮細胞および白血球によって放出される酵素により基底膜の浸食から始める。内皮細胞は、それは血管のルーメン（管腔）を裏打ちし、ついで基底膜を通して突き出る。血管形成の刺激物質には、侵食された基底膜を通して移動するために、内皮細胞を誘導する。移動性の細胞は、親のような血管からはなれて“出芽”を形成し、そこで内皮細胞は有糸分裂を経、そして増殖する。内皮出芽は毛管のループ（輪）を形成するために互いで合併し、新しい血管が創作される。

新しい血管はまた、脈管形成によっても部分的には形成されうる。脈管形成は、内皮細胞の供給源によって血管形成から区別される。脈管形成は、血管芽細胞（アンジオブラスト）として知られる内皮前駆（祖先）細胞の漸増を含む。これらの血管芽細胞は、循環から、または組織からくることができる。脈管形成は、血管形成として似たシグナリング経路によって規制される。このように、用語“血管形成”は、血管形成をモジュレートする方法が脈管形成（vasculogenesis）をモジュレートすることもできるように、ここで脈管形成と互換的に使われる。

病的血管形成は、それは持続的であるか、または調節不全にされた（dysregulated）か、または未規制の血管形成として特徴づけられうるもので、多重度の病気の状態、腫瘍転移および内皮細胞によっての異常な増殖において起こり、これらの条件において見られる病理学的損害を支える。病的血管形成が存在する多様な病気の状態は、血管形成に依存し、血管形成に関係し、または血管形成に関連した病気として一緒にグループ化された。これらの病気は、異常であるか、または望ましくない細胞増殖、特に内皮細胞増殖の結果である。

病気およびプロセスは、異常または望ましくない内皮細胞増殖で、制限されないが、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、毛細管拡張症乾癬強皮症（telangiectasia psoriasis scleroderma）、化膿性肉芽腫、心筋血管形成、プラーク（班）新血管新生、冠状管の側枝（coronary collaterals）、虚血性肢血管形成（ischemic limb angiogenesis）、角膜疾患、ルペオーシス、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症（DR）、後水晶体線維増殖症、非増殖性糖尿病性黄斑浮腫（DME）、関節炎、糖尿病性新血管新生、加齢黄斑変性（AMD）、未熟児網膜症（ROP）、虚血性網膜静脈閉塞症（IRVO）、傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血発生（hematopoiesis）、排卵、月経、および胎盤形成が含まれものによって媒介された。

（組成物）

組織において脈管透過性および病的血管形成を抑制するための組成物が、ここに提供される。

1種の具体例において、そのような組成物は、Unc5のリガンドまたはDeleted in Colorectal Cancer（結腸直腸がんでの欠失）（DCC）受容体を備える。１種のそのような具体例において、Unc5またはDCCのリガンドは、VEGFによってRac活性化を抑制するために、Unc5またはDCC受容体を通して働くことができる任意の組成物または分子であることができる。それがここに用いるように、用語である受容体を“通して働く（act through）”は、受容体によって活性が促される受容体に対する組成物の結合に言及する。たとえば、組成物はUnc5またはDCCのリガンドを備えうるもので、それはARF6のGit1抑制を活性化するために、Unc5またはDCCの受容体を通して働く。別の例では、組成物はUnc5またはDCCのリガンドを備えうるもので、それはGit1のパキシリン活性化を活性化するために、Unc5またはDCCの受容体を通して働く。さらに別の例では、ここに記載する組成物は、Git1のパキシリン活性化を活性化するために、Unc5またはDCCの受容体を擬態する組成物または分子を備えうる。

1種の具体例において、ここに記載する組成物は、Unc5のリガンドを含み、そこでは、リガンドは、ネトリンで、ヒトのネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2および齧歯動物（例は、マウスまたはラット）のネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2、またはそれらの断片または変種で、それはARF6のUnc5b抑制を結合し、そして活性化させるもののようなものである。たとえば、ネトリンのリガンド（ligan）は、次のものから選定されるアミノ酸配列を備えることができ、それは、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25またはUnc5bと結合するそのようなアミノ酸配列の変種または断片である。そのようなアミノ酸配列の断片は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100個のアミノ酸の長さであることができる。別の具体例において、Unc5bのネトリンのリガンドは、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%の配列同一性を、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25、またはUnc5bと結合するその断片から選ばれるアミノ酸配列に対して持つアミノ酸配列を備えることができる。

別の具体例で、組成物はここに記載するように、Ephのリガンドを含みうる。1種のそのような具体例において、組成物はVEGFによってRac活性化を抑制するために、Eph受容体を通して働くことができるEphのリガンドを備える。別のそのような具体例において、組成物は、ARF6のGit1抑制を活性化するために、Eph受容体を通して働くことができるEphのリガンドを備える。さらに別の具体例において、本明細書に従う組成物は、Git1のEph活性化を活性化するために、Eph受容体を通して働くことができる任意の組成物または分子を備えうる。また更なる具体例で、組成物はここに記載するように、Git1のパキシリン活性化を活性化するために、Eph受容体を擬態する任意の組成物または分子を含みうる。

別の具体例において、ここに提供される組成物は、Robo4受容体のリガンドを備える。１種のそのような具体例において、Robo4のリガンドは、否定的に細胞運動性を規制するために、Robo4を通して働くことができる任意の組成物または分子であることができる。別のそのような具体例において、Robo4のリガンドは、脈管透過性を抑制するために、Robo4を通して働くことができる任意の組成物または分子であることができる。また別のそのような具体例において、Robo4のリガンドは、VEGFによってRac活性化を抑制するためにRobo4を通して働くことができる任意の組成物または分子であることができる。また更なる具体例において、組成物は、ここに記載するように、Robo4受容体のリガンドを含み、そこでは、リガンドがGIT1のパキシリン活性化を惹起するために、Robo4を通して働くことができる。別の具体例では、組成物は、ここに記述するように、Robo4受容体のリガンドを含み、そこではリガンドはARF6のGit1抑制を活性化するために、Robo4を通して働くことができる。更なる具体例で、組成物はここに記述するように、Robo4受容体のリガンドを含み、そこでは、リガンドは、次のもの、内皮バリア機能、VEGF受容体の下流のＶＥＧＦシグナリングのブロッキング、血液漏出の抑制、病的血管形成の抑制、多重血管形成の信号抑制、透過性および炎症性因子の予防の1種またはそれよりも多くを招く様式においてRobo4を通して働くことができる。

本発明の組成物がRobo4のリガンドを含む場合、リガンドはRobo4の細胞外ドメインを結合する任意の組成物または分子である。あるいは、Robo4のリガンドは、VEGFによってRac活性化を抑制するために、Robo4レセプターを通して働く任意の組成または分子であることができる。さらにまた、Robo4のリガンドは、ARF6のGit1抑制を活性化するために、Robo4レセプターを通して働く任意の組成または分子であることができる。またさらに、Robo4のリガンドは、Git1のパキシリン活性化を活性化するために、Robo4レセプターを通して働く任意の組成または分子であることができる。別の局面では、Robo4のリガンドは、Git1のパキシリン活性化を活性化するために、Robo4レセプターを擬態する任意の組成または分子であることができる。1種の具体例において、本明細書に従う組成において含まれるRobo4のリガンドは、約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400のアミノ酸の長さの分離したポリペプチドを備える。

ここに記述するような組成にはRobo4のリガンドが含まれ、そのようなリガンドはSlitで、Slit2のようなもの、またはRobo4を結合し、および活性化するその断片または変種であることができる。特定の具体例において、Slitリガンドまたはその断片または変種は、以下の1種またはそれよりも多くのものを招く様式においてRobo4を結合し、および活性化させ、すなわち、ARF6の抑制；内皮バリア機能の保存；VEGFレセプターの下流のＶＥＧＦシグナリングのブロッキング；血液漏出の抑制；病的血管形成の抑制；および血管形成、透過性および炎症の因子の抑制である。たとえば、Robo4のリガンドは、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、および配列番号：36から配列番号：47を通して、またはRobo4と結合するその断片から選ばれるアミノ酸配列を備えることができる。たとえば、そのようなアミノ酸配列の断片は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、または100のアミノ酸の長さであることができる。Robo4のリガンドは、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%の配列同一性を、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、および任意の配列番号：36から配列番号：47を通して、またはRobo4と結合するその断片から選ばれるアミノ酸配列に対して持つアミノ酸配列および、それらの配列を備えることができる。Slitの断片は、SlitのＮ末端領域を備えることができる。たとえば、Robo4のリガンドは、Slit1のアミノ酸1-1132（配列番号：36）、Slit2のアミノ酸1-1121（配列番号：37）、Slit3のアミノ酸1-1118（配列番号：38）、または図23および詳細な配列番号：39から配列番号：47を通して例証されるn-末端断片の任意のものを備えることができる。特定の具体例において、Robo4のリガンドは、基本的に、配列番号：36から配列番号：47を通しての任意のアミノ酸配列から選ばれるものから構成されるポリペプチドを備えることができる。若干の具体例において、アミノ酸配列の配列番号：39から配列番号：47を通して反映されているように、本発明の組成において含まれるSlit断片は、ほとんどN末端のアミノ酸（N-teminal most amino acides）を備えないでよい。たとえば、アミノ酸配列は、自然なSlitの約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、または100のＮ末端アミノ酸を欠きうる。他の具体例において、Slit断片は、自然なSlitの約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、または100のアミノ酸のほとんどC末端を備えないでよい。

たとえば、Robo4のリガンドは、基本的に、Slit1のアミノ酸281-511（配列番号15）、またはSlit2のアミノ酸271-504（配列番号：16）から構成されるポリペプチドを備えることができる。このように、Robo4のリガンドは、配列番号：15または配列番号：16またはRobo4と結合するその断片を備えることができる。Robo4のリガンドは、配列番号：15または配列番号：16またはRobo4と結合するその断片に対し、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%の配列同一性を持つアミノ酸配列を備えることができる。

さらに別の具体例において、本発明に従う組成は、Git1のパキシリン活性化を活性化することができるRobo4の断片を含みうる。このように、Robo4のパキシリン結合性配列を備える分離したポリペプチドをここに提供し、そこでは、ポリペプチドは全長Robo4を備えない。1種のそのような具体例において、パキシリン結合性配列は、アミノ酸配列の配列番号：27またはパキシリンと結合するその断片または変種を備えうる。たとえば、断片は長く少なくとも約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、または100のアミノ酸の長さであることができる。配列番号：27のアミノ酸配列の断片または変種は、配列番号：27またはパキシリンと結合するその断片に対し、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約100%の配列同一性を持つアミノ酸配列を備えることができる。

まだ更なる具体例で、組成はここに記述するように、分離されたポリペプチドを備え、およびそれはRobo4のパキシリン結合性配列（PBS）を備え、そこでは、ポリペプチドは次の式、すなわち
R¹-PBS-R²
式中、R¹およびR²は無関係に、H、アシル、NH₂、アミノ酸またはペプチドであり、そこでは、ポリペプチドは、全長Robo4を備えない。PBSは、配列番号：27または少なくとも10個の残基の長さの断片に対し、少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列から構成することができる。

また、ここに明らかにするポリペプチドの任意のものをコード化する分離された核酸をここで提供する。このように、Robo4のパキシリン結合性配列を備えるポリペプチドをコード化する分離された核酸を提供し、そこでは、ポリペプチドは全長Robo4を備えない。また、配列番号：2または少なくとも30の残基の長さのその断片を備える分離された核酸を提供し、そこでは、核酸は全長Robo4をコード化しない。

（製薬上の組成物）

ここに明らかにする組成では、例は、リガンド、タンパク質およびペプチドがここに明らかにされ、製薬上の組成において調剤することができる。たとえば、そのような組成は、治療上の管理に適する調剤物を提供するために、薬学的に許容可能な担体（キャリヤー）と組み合わせることができる。ここに使うように、“薬学的に許容可能”は、生物学的に、またはその他で望ましくない物質でないこと言及し、すなわち、その物質は、対象体に、望ましい組成（例は、望ましいリガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、治療上の小分子（small molecule therapeutic）、など）とともに、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またはそれが含まれる製薬上の組成物の他の構成要素の任意のものと有害な様式で相互作用することなく投与しうる。キャリヤーは当然、活性原材料の任意の分解も最小にし、および対象体において任意の有害な副作用も最小にするために選ばれ、そのことはこの技術の熟練者によく知られている。

物質は、溶液、懸濁物、（たとえば、微粒子、リポソーム、または細胞（セル）組み込まれる）にあってよい。これらは、抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞タイプを標的としうる。以下の参照は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするために、この技術の使用の例である（Senter（センター）, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe（バグシャベ）, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli（バッテリー）, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz（ピエターズ）およびMcKenzie（マッケンジー）, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); およびRoffler（ロッフラー）, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062- 2065, (1991)）。“ステルス”のようなビークルおよび他の抗体は、リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介薬物ターゲティングを含む）、細胞特定のリガンドを通してのDNAのレセプター媒介ターゲティング、リンパ球定方向（lymphocyte directed）腫瘍ターゲティング、インビボのネズミ神経膠腫細胞の高度に特異的な治療上のレトロウイルスのターゲティングを接合した。以下の参照は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするための、この技術の使用の例である（Hughes（ヒューズ）et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989);およびLitzinger（リッツインガー）およびHuang（ファン）, Biochimica et Biophysica Acta, 1 104:179-187, (1992)）。概して、レセプターはエンドサイトーシスの経路に関係し、構成上、あるいはいずれかでリガンドが誘発される。これらのレセプターはクラスリンコートされたピットにおいて集まり、クラスリンコートされた小嚢を介して細胞に入り、レセプターがソートされる酸性化されたエンドソームを通過し、そして次いで細胞表面リサイクルし、細胞内に保存され、またはリソソームにおいて分解されるかのいずれかである。内部移行の経路は、多種多様な機能で、栄養の取込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性エントリー、リガンドの解離および分解、およびレセプターレベルの規制のようなものに役立つ。細胞タイプ、レセプター濃度、リガンドのタイプ、リガンド結合価、およびリガンド濃度に依存し、多くのレセプターは、1種よりも多くの細胞内経路に従う。レセプター媒介エンドサイトーシスの分子上および細胞上のメカニズムがレビューされている（Brown（ブラウン）およびGreene（グリーン）, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。

適したキャリヤーおよびそれらの調剤物は、Reminton（レミントン）で記述され、すなわち、The Science and Practice of Pharmacy（ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファーマシー）(19th ed.（第19版）) ed.（編集）A.R. Gennaro（ジェンナーロ）, Mack Publishing Company（マック出版社）, Easton（イーストン）, PA（米国ペンシルベニア州）1995。典型的に、薬学的に許容できる塩の適切な量が、調剤において用いられ、調剤物が等張性にされる。薬学的に許容できるキャリヤーの例には、制限されないが、サリン（塩類溶液）、リンガー溶液およびブドウ糖（デキストロース）溶液が含まれる。溶液のpHは、好ましくは約5から約8まで、そしてより一層好ましくは約7から約7.5までである。更なるキャリヤーには、徐放性製剤で、抗体を含む固形の疎水性ポリマーの半透性のマトリクスのようなものが含まれ、そのマトリクスは成形された形態において、例は、フィルム（薄膜）、リポソームまたは微粒子である。例として、一定のキャリヤーが管理のルートおよび管理される組成の濃度に応じてより一層好ましいことがありうるのは、その技術において熟練する者にとって明らかである。

薬学的なキャリヤーは、当業者に既知である。これらは、最も典型的に、溶液で、生理的pHで、無菌の水、食塩水、および緩衝剤溶液のようなものを含め、ヒトに対する薬物の投与のための標準的なキャリヤーである。組成物は、筋肉内に、または皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって用いられる標準的な手法に従い投与される。

製薬上の組成物には、一般に好まれる分子に加え、キャリヤー、増粘剤、希釈剤、バッファ（緩衝剤）、保存剤、表面活性化薬剤および同様のものが含まれうる。製薬上の組成物はまた、1種またはそれよりも多くの活性な原材料で、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬、および同様のもののようなものも含みうる。

非経口管理のための調製物には、無菌（滅菌）の水性または非水性の溶液、懸濁物、およびエマルジョン類（乳濁物）が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル類である。水溶性担体には、水、アルコール性/水性の溶液、エマルジョン類または懸濁物が、塩類溶液および緩衝化された媒体を含めて含まれる。非経口媒介物には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲルのもの、または不揮発性油（固定油）が含まれる。静脈内媒介物には、流体および栄養補給物（nutrient replenishers）、電解質補給物（リンゲルのブドウ糖に基づくもののようなもの）、および同様のものが含まれる。保存剤（防腐剤）および他の添加物はまた、たとえば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート薬剤、および不活性ガスおよび同様のもののようなものが存在しうる。

局所的な管理のための調剤物（製剤）は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル類、ドロップ類、坐薬、スプレー、液体および粉体が含まれうる。慣習的な製薬上のキャリヤー、水性物、粉体または油性基剤、増粘剤および同様のものは、必要または望ましいかもしれない。

経口投与のための組成物は、粉体または顆粒、懸濁物または溶液を、水または非水性媒体、カプセル、小袋（sachets）、またはタブレット（錠剤）において含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤（dispersing aids）またはバインダー（結合剤）が望ましいかもしれない。

組成物の若干は薬学的に許容できる酸-または塩基-付加塩として潜在的に管理されうるもので、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ-、ジ-、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換されたエタノールアミンのような有機塩基との反応によって作成される。

（方法）

脈管透過性または病的血管形成を抑制する薬剤のための選別（ふるい分け）、またはその評価のための方法をここに提供する。1種の具体例において、この方法はGit1のRobo4媒介活性化に影響を及ぼすための前記薬剤の能力を定めることを具える。たとえば、Git1のRobo4媒介活性化は、次のことを含む工程（ステップ）によって定めることができ、すなわち、Robo4を発現する第1の細胞を候補薬剤と接触すること、基本的に第1の細胞と同じであるが、Robo4を実質欠く第2の細胞を候補薬剤と接触すること、およびGit1活性化について、第1および第2の細胞においてアッセイすることであり、そこで、第1の細胞において第2の細胞に比べて検出可能な程度により一層高いGit1活性化が前記薬剤によるRobo4媒介Git1活性化を指し示す。

ここに明らかにするように、Robo4媒介Git1活性化はARF6不活化を招く。ARF6は、RacのVEGF媒介活性化に関与し、それはPak（パック、p21活性化）を活性化させ、それはMEK（メック、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ）を活性化させ、それはERK（エルク、細胞外シグナル制御キナーゼ）を活性化させ、それは脈管透過性を促す。このように、ここに明らかにするように、Git1活性化は、活性化され、または不活化されるかのいずれかで、シグナリング経路の構成要素の任意のものを検出することによってアッセイすることができる。このように、Robo4媒介Git1活性化は、ARF6不活化、Rac不活化、Pak不活化、MEK不活化、またはERK不活化を検出することによってアッセイすることができる。このシグナリング経路を監視する任意の他の既知な、または新しく発見された方法は、この明らかにされた方法において使うことができるものと理解される。

また、薬剤についてスクリーニングし、または評価する方法を提供し、その薬剤は、脈管透過性を抑制するものであり、ARF6、Rac、Pak、MEK、またはERKを抑制する前記薬剤の能力を定めることを具える。たとえば、ARF6、Rac、Pak、MEK、またはErkのRobo4媒介抑制は、次のことを含むステップによって定められ、すなわち、Robo4を発現する第1の細胞を候補薬剤と接触させること、第1の細胞と基本的に同じであるが、Robo4を実質欠く第2の細胞を候補薬剤と接触させること、第1および第2の細胞において、ARF6、Rac、Pak、MEK、ERK、またはそれらの組合せの抑制についてアッセイすることであり、そこで、第2の細胞と比較した第1の細胞の検出可能的な程度により一層低いARF6、Rac、Pak、MEK、またはERK活性化が、前記薬剤によってRobo4媒介ARF6、Rac、Pak、MEK、またはERK抑制を指し示す。

Rac、Pak、MEK、ERKのようなシグナリングタンパク質の活性化は、前記タンパク質のリン酸化を検出することによってアッセイすることができる。タンパク質のリン酸化を検出するための細胞系および無細胞のアッセイはこの技術においてよく知られており、そして抗体の使用が含まれ、たとえば、抗ホスホセリン（Chemicon(R)（ケミコン(商標)）1603）（Chemicon（ケミコン社）、Temecula（テミキュラ）、CA（米国カリフォルニア州））、抗ホスホスレオニン（Chemicon(R) 1607）および抗ホスホチロシン（Chemicon(R) 1599）が含まれる。部位特異的な抗体はまた、DDX-3のリン酸化された形態について特異的に発生することができる。前記抗体を生成し、そして使う方法は、この技術でよく知られている。

ここに明らかにしたアッセイ方法は、VEGF、TNF、トロンビン、またはヒスタミンの実質不存在下に実行することができる。あるいは、明らかにしたアッセイ方法は、VEGF、TNF、トロンビン、またはヒスタミンの生物学上活性な量の存在下で実行することができる。

タンパク質の“活性”には、たとえば、転写、翻訳、細胞内転位置（intracellular translocation）、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる開裂、他のタンパク質へのホモフィリック（同種親和性）およびヘテロフィリック（異種親和性）な結合、ユビキチン化が含まれる。

1種の具体例において、ここに記述するスクリーニングの方法は、高処理の（high-throughput）スクリーニングアッセイのような、選別アッセイである。このように、接触ステップは、細胞系の、または無細胞のアッセイにおいて行うことができる。たとえば、脈管内皮細胞は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロでのいずれかで、候補薬剤と接触することができる。これらの細胞は、モノレイヤー（単分子層）培養において行うことができるが、好ましくは、上皮を構成する。細胞はインビトロで、またはインサイツ（原位置）でアッセイすることができ、または前記細胞のタンパク質抽出物は、活性化された（例は、リン酸化された）Rac、Pak、MEK、ERXの検出のために試験管内でアッセイすることができる。内皮細胞はまた、リポーター構築物を発現するために操作することもでき、そこでは、細胞を候補薬剤と接触させ、そしてリポーター発現のために評価する。他のそのような細胞系および無細胞の分析法が、ここで使用するために考慮される。

たとえば、脈管透過性または病的血管形成に関する小分子、アミノ酸または核酸の擬態の影響は、Robo4を発現する内皮細胞において評価することができ、そしてRobo4を欠く内皮細胞と比較することができる。

概して、候補薬剤は、この技術で知られる方法に従い自然な、または合成の（または半合成の）抽出物または化学的ライブラリーの大きなライブラリーから識別することができる。薬物発見および発達の分野において熟練した人々は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング手法（群）にあまり重大でないことを理解する。したがって、事実上、任意の多くの化学的抽出物または化合物は、ここに記述する模範的な方法を使用して選別することができる。そのような抽出物の例または化合物には、制限されないが、以下が含まれ、植物-、菌類（fungal）-、原核生物-または動物-ベースの抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、ならびに既存の化合物の修飾である。非常に多くの方法もまた、任意の多くの化学的合成物のランダムまたは定方向の合成の生成のために（例は、半合成または全合成）利用可能であり、制限されないが、糖類-、脂質-、ペプチド-、ポリペプチド-および核酸-ベースの化合物が含まれる。合成化合物のライブラリーは商業上利用可能であり、例は、Brandon Associates（ブランドン・アソシエーツ）(Merrimack（メリマック）, NH（ニューハンプシャー州）)およびAldrich Chemical（アルドリッチ・ケミカル）(Milwaukee（ミルウォーキー）, WI（ウィスコンシン州）)である。あるいは、細菌、菌類、植物、および動物の抽出物の形態においての自然な化合物のライブラリーは、多数の供給源から商業上入手可能であり、以下のものが含まれ、Biotics（バイオティクス）(Sussex, UK), Xenova（ゼノバ）(Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute（ハーバー・ブランチ・オセアングラフィックス・インスティチュート）(Ft. Pierce, FIa.),およびPharmaMar（ファルマメア）, U.S.A. (Cambridge, Mass.)である。そのうえ、自然な、および合成的に生産されたライブラリーは、必要により、この技術で知られる方法に従って、例は、標準的な抽出および分画の方法によって生産される。さらにまた、必要により、任意のライブラリーまたは化合物でも、標準的な化学的、物理的、または生化学的な方法を用いて、容易に修飾される。そのうえ、薬物の発見および発達の技術における熟練者は、可能な場合はいつでも、デレプリケーション（dereplication）（例は、分類学のデレプリケーション、生物学的デレプリケーション、および化学的デレプリケーション、または任意のそれらの組合せ）またはそれらの効果について既に知られた物質の複製または繰り返しの排除のための方法が採用されなければならないことを容易に理解する。

粗抽出物が望ましい活性を持つことが見出されるとき、ポジティブな（正の）リード抽出物の更なる画分は、観察された効果の原因である化学成分を分離することが必要である。このように、抽出、分画、および精製のプロセスのゴールは、脈管透過性を刺激または抑制する活性を持つ粗抽出物の範囲内の化学的実体の慎重な特徴づけおよび識別である。化合物の混合物における活性の検出のためにここに記述する同じアッセイは、活性な構成要素を精製し、そしてその誘導体を試験するのに用いられることができる。分画とそのような不均一な抽出物の精製の方法は、この技術において知られている。必要に応じ、処置のための役に立つ薬剤であることが示される化合物は、この技術で知られている方法によって、化学的に修飾される。治療上の価値があると確認される化合物は、それが脈管透過性を規制するのを望まれる病気または条件のための動物モデルを使ってその後分析しうる。

対象体において脈管透過性を抑制する方法もここに提供する。ここに詳述するように、Robo4の活性化は脈管透過性を抑制し、VEGFによってRac活性化を抑制し、内皮細胞バリア機能を保って、VEGFレセプターの下流のＶＥＧＦシグナリングをブロックし、血液漏出を抑制し、および多重血管形成、透過性および炎症性の因子を抑制する。ここに定めるように、Robo4シグナリングの活性化はGIT1のパキシリンの活性化の惹起を通してそのような効果を達成し、それは、次に、ARF6のGIT1抑制を導く。したがって、1種の具体例において、ここに提供される脈管透過性を抑制ための方法は、Robo4のリガンドの治療上効果的な量を投与することを具え、そこでは、そのようなリガンドがARF6のGIT1抑制を招く。別の具体例において、ここに説明するように、投与されるリガンドはSlitタンパク質である。特定の具体例において、対象体によって経験され、そしてRobo4のリガンドの治療上効果的な量の投与によって処置される脈管透過性は、サイトカインストームを招きうる感染性および非感染性の病気から選ばれる病気の状態と関係し、それは、たとえば、移植片対宿主病（GVHD）、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、敗血症、トリインフルエンザ、天然痘および全身性（systemmic）炎症性反応症候群（SIRS）、虚血/再灌流傷害に次ぐ脳卒中または心筋梗塞、脳腫瘍と関係する浮腫、悪性病変と関係する腹水症、メイグスの症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心嚢貯留液および胸水、炎症、アレルギー疾患、ガン、脳卒中発作（cerebral stroke）、心筋梗塞、肺でのおよび心臓での機能不全、腎不全、および網膜症が含まれる。

対象体で病的血管形成を抑制する方法をここに提供する。ここに詳述するように、Robo4の活性化は多重炎症、透過性および血管形成の因子の効果を抑制する。再びまた、ここに定めるように、Robo4シグナリングの活性化はGIT1のパキシリン活性化を惹起し、それは次に、ARF6のGIT1抑制を招く。したがって、1種の具体例において、ここに提供する病的血管形成を抑制するための方法は、Robo4のリガンドの治療上効果的な量を投与することを具え、そこでは、そのようなリガンドはARF6のGIT1抑制を招く。別の具体例において、ここに解説するように、投与されるリガンドはSlitタンパク質である。特定の具体例において、対象体によって経験され、Robo4のリガンドの治療上効果的な量の投与によって処置される病的血管形成は、次のものから選ばれる病気状態と関係し、それは、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、毛細管拡張症乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管形成、プラーク新血管新生、冠血管側枝、虚血性肢血管形成、角膜病気、ルペオーシス、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症（DR）、後水晶体線維増殖症、非増殖性糖尿病性黄斑浮腫（DME）、関節炎、糖尿病性新血管新生、加齢黄斑変性（AMD）、未熟児網膜症（ROP）、虚血性網膜静脈閉塞症（IRVO）、傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血発生、排卵、月経、および胎盤形成からである。

別の具体例において、トリインフルエンザを処置または予防する方法が提供され、そこでは、その方法は、前記トリインフルエンザを持つ、または持つ危険がある対象体を識別すること、および対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例で、成人呼吸促迫症候群（ARDS）を処置または予防する方法が提供され、そこで、方法は前記ARDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、および対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例では、全身性炎症反応症候群（SIRS）を処置または防止する方法が提供され、そこで、その方法は前記SIRSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、およし対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例で、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記RDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、および対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例で、腫瘍形成または増殖を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記腫瘍形成または増殖を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、および対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、呼吸促迫症候群（RDS）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記RDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、および対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例で、対象体において虚血性網膜静脈閉塞（IRVO）を処置または予防する（preventin）方法が提供され、そこで、その方法は前記IRVOを持つ、または持つ危険がある対象体を確認すること、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、対象体で非増殖性糖尿病性黄斑浮腫（DME）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記DMEを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、未熟児網膜症（ROP）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記ROPを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、対象体で糖尿病性網膜症（DR）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記DRを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、対象体で湿性（wet）黄斑変性症（AMD）を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記AMDを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例化において、対象体で虚血を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記虚血を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例で、対象体で出血性卒中を処置または予防する方法が提供され、そこでその方法は、前記出血性卒中を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例では、対象体において、再灌流傷害で、心筋梗塞および脳卒中において観察されるようなものを処置または防ぐ方法が提供され、そこでその方法は、前記再灌流傷害を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体例において、対象体で真皮脈管傷（ブレミッシュ）または形成異常を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記傷を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体の皮膚にラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、トリインフルエンザを処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記トリインフルエンザを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、成人呼吸促迫症候群（ARDS）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記ARDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、全身性炎症反応症候群（SIRS）を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記SIRSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、移植片対宿主病（GVHD）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記RDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化で、腫瘍形成または増殖を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記腫瘍形成または増殖を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、呼吸促迫症候群（RDS、呼吸窮迫症候群）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記RDSを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化で、対象体で虚血性網膜静脈閉塞症（IRVO）を処置または防ぐ（preventin）方法が提供され、そこでは、その方法は前記IRVOを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、対象体で非増殖性糖尿病性黄斑浮腫（DME）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記DMEを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、未熟児網膜症（ROP）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記ROPを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、対象体で糖尿病性網膜症（DR）を処置または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記DRを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、対象体で湿性黄斑変性症（AMD）を処置または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記AMDを持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、対象体で虚血を治療または防ぐ方法が提供され、そこで、その方法は前記虚血を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化で、対象体で出血性卒中を治療または予防する方法が提供され、そこでその方法は、前記出血性卒中を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化では、対象体において、再灌流傷害で、心筋梗塞および脳卒中において観察されるようなものの治療または予防する方法が提供され、そこではその方法は、前記再灌流傷害を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

別の具体化において、対象体で真皮脈管傷または形成異常を治療または予防する方法が提供され、そこで、その方法は前記傷を持つ、または持つ危険がある対象体を確認し、そして対象体の皮膚にリパルシブなガイダンスキューで、ラウンドアバウト-4（Robo4）レセプターのリガンドのようなものの治療上効果的な量を施すことを具える。

ここに記述する方法と併用した使用に適するリガンドには、たとえば、ここに記述するそれらのリガンドが含まれる。たとえば、特定の具体化において、Robo4レセプターを含むRoboレセプターに関して、そしてUnc5またはDeleted in Colorectal Cancer（DCC）レセプターのDeletedに関して、ここに記述する組成物は、本発明の方法のリガンドとして使いうる。より一層具体的には、たとえば、ここに記述するslit組成物を、Robo4を活性化し、そしてここに記述する方法の治療上の利益を達成するためのリガンドとして用いうる。

若干の局面では、対象体は医学的診断によって確認される。たとえば、糖尿病性網膜症および黄斑変性症を有する対象体は、眼において過剰な血管の視覚化によって確認することができる。急性肺傷害は、うっ血性心不全（congetive heart failure）の不存在において肺水腫によって診断することができる。虚血性発作（脳卒中）は、神経性の症状およびイメージング（MRIおよびCT）によって診断することができる。他の既知または新しく発見される医学上の決定は、明らかにされた方法における使用のために対象体を確認するのに用いることができる。

そのうえ、対象体は遺伝的素因（genetic predisposition）によって確認することができる。たとえば、患者の加齢黄斑変性の素因になる遺伝子は特定された（Klein（クライン）RJ, et al, 2005; Yang（ヤン）Z, et al. 2006; Dewan（デューアン）A, et al. 2006）。同様に、脳において患者の脈管形成異常の素因になる遺伝子変異は確認された（Plummer（プラマー）NW, et al., 2005）。他の既知または新しく発見される遺伝子の決定は、明らかにされた方法における使用のために対象体を確認するのに用いることができる。

ここに明らかにする核酸およびポリペプチド分子、ならびに明らかにした方法を実行するのに必要な任意の組成物は、ほかに特に断りのない限り、その特定の試薬または化合物のためのこの技術における技量の人々に知られる任意の方法で使用されることができる。

たとえば、核酸で、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのようなものは、標準的な化学合成法を用いて使うことができ、または酵素による方法または他の任意の既知の方法も使用して生産することができる。そのような方法は、ヌクレオチド断片分離が続く標準的な酵素による消化から多岐にわたることができ（たとえば、Sambrook（サムブルック）et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6）、純粋に合成的な方法に対するもので、たとえば、Milligen（マイリゲン）またはBeckman System 1Plus DNA synthesizer（ベックマン・システム・１プラス・DNA・シンセサイザー）(たとえば、Model 8700自動化シンセサイザー、Milligen-Biosearch, Burlington, MAまたはABI Model 380B)を用いるシアノエチルホスホラミダイト法による。オリゴヌクレオチドを作成するのに役立つ合成方法はまた、Ikuta（イクタ）et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (ホスホトリエステルおよび亜リン酸塩トリエステル法)、およびNarang（ナラング）et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (ホスホトリエステル法)によって記述される。タンパク質核酸分子は、Nielsen（ニールセン）et al., Biocoηjug. Chem. 5:3-7 (1994)によって記述されるもののような既知の方法を用いるようにすることができる。

ここに記述する明らかにしたタンパク質を生産する1種の方法は、タンパク質化学技術によって2またはそれよりも多くのペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドは、Fmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはBoc（タート-ブチルオキシカルボニル（butyloxycarbonoyl））化学を使う目下利用可能な研究所設備を用いて化学的に合成することができる。(Applied Biosystems, Inc.（アプライド・バイオシステム社）Foster City（フォスターシティー）, CA（米国カリフォルニア州）)。この技術において熟練する者は、たとえば、明らかにしたタンパク質と対応するペプチドまたはポリペプチドが標準的な化学反応によって合成されることができるとすぐに認めることができる。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドは合成することができ、そしてその合成樹脂から開裂させることができず、ところが、ペプチドまたはタンパク質の他の断片は合成することができ、そしてその後に樹脂から開裂させることができ、それによって、他の断片上で機能的にブロックされる末端基を露出させる。ペプチド縮合（peptide condensation）反応によって、これらの2つの断片は、それぞれ、抗体またはその断片を形成するために、それらのカルボキシルおよびアミノの終点でペプチド結合を介して共有結合的にジョイン（結合）することができる。(Grant（グラント）GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co.（フリーマン商会）, N.Y. (1992); Bodansky（ボダンスキー）MおよびTrost（トロスト）B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer- Verlag Inc.（シュプリンガー出版社）, NY（それは、ここに少なくとも、ペプチド合成に関連した材料のために参照することによって組み込む）。あるいは、ここに記載するように、ペプチドまたはポリペプチドをインビボで無関係に合成する。一旦分離すれば、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、似たペプチド縮合反応を介してそのペプチドまたは断片を形成するために連結されうる。

たとえば、クローン化したか、または合成のペプチドセグメントの酵素による連結は、比較的短いペプチド断片が、より一層大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全体のタンパク質ドメインに結合することを許す（Abrahmsen（アブラハムセン）L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)）。あるいは、合成ペプチドの自然な化学的連結は、総合的により一層短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを構築するために利用することができる。この方法は2ステップ化学反応から構成される（Dawson（ドーソン）et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)）。第1ステップは、保護されていない合成ペプチド-チオエステルの、チオエステル連結された初期共有結合生産物としての中間体を与えるための、アミノ末端Cys残基を含む他の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的な反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は、連結部位での自然なペプチド結合を形成するために、自発的に迅速な分子内反応を経験する（Baggiolini（バッジオリーニ）M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101 ; Clark-Lewis（クラーク-ルイス）I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam（ラジャラテナム）K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)）。

あるいは、保護されていないペプイチドセグメントは、化学的に連結され、そこでは化学的連結の結果としてのペプチドセグメントの間で形成される結合は不自然な（非ペプチド性）結合である（Schnolzer（シュノルツァー）, M et al. Science, 256:221 (1992)。この技術はタンパク質ドメインの類似物、ならびに十分な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するのに用いられた（deLisle Milton（ド・ライル・ミルトン）RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)）。

ここに記述する核酸を作成し、ならびにここに記述するタンパク質およびペプチド分子（moledules）を発現させるのに役立つ核酸を作成するためにプロセスをここに明らかにする。これらの組成物を作成するために用いることができる多種多様な方法があり、それは合成の化学的方法および標準的な分子生物学的方法のようなものである。これらの、および他の明らかにした組成物を作成する方法が具体的に明らかにされていることが理解される。

核酸分子を操作的方向（operative way）で連結することを具えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表される配列を備え、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：24、配列番号：26、または配列番号： 28および核酸の発現を制御する配列である。

また、核酸分子を操作的方向で連結することを具えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表される配列に対し80%の同一性を持ち、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：24、配列番号：26、または配列番号：28、および核酸の発現を制御する配列である。

核酸分子を操作的方向で連結することを具えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表される配列に厳しい（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーションの条件下にハイブリダイゼーションする配列を備え、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：24、配列番号：26、または配列番号：28、および核酸の発現を制御する配列である。

核酸分子を操作的方向で連結することを具えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表されるペプチドをコード化する配列を備え、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27、または配列番号：36から配列番号：47を通しての任意のものおよび核酸分子の発現を制御する配列である。

核酸分子を操作的方向で連結することを具えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表されるペプチドに対して80%の同一性を持つペプチドをコード化する配列を備え、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27、または配列番号：36から配列番号：47を通しての任意のものおよび核酸分子の発現を制御する配列である。

核酸分子を操作的方向で連結することを備えるプロセスによって生産される核酸分子を明らかにし、核酸は次のもので表されるペプチドに対して80%の同一性を持つペプチドをコード化する配列を備え、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27、または配列番号：36から配列番号：47を通しての任意のものであり、そこでは、任意の変化は保存的な変化であり、および配列が核酸分子の発現を制御する。

（治療上の管理）

ここに明らかにする組成物は、製薬上の組成物を含み、局所または全身的な処置が望まれかどうか、および処置するエリア（面積）に応じ、多数のやり方において管理しうる。たとえば、明らかにされる組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、キャビティ内（腔内）、経皮的に、経口的に、非経口的に（例は、静脈内に）、気管内に、眼科学的に（ophthalmically）、経膣（鞘）的に、直腸性に、鼻腔内に、局所的、または同様のもので投与することができ、局所的な（外用の）鼻腔内投与または吸入剤による投与が含まれる。

使われる場合、組成物の非経口投与は概して、注入（注射）によって特徴づけられます。注射剤（Injectables）は、慣習的な形態において、液体の溶液または懸濁物としてのいずれか、注射に先立つ液体において懸濁物の溶液のために適する固体の形態として、またはエマルジョン類として、調製することができる。恒常的な投薬量が維持されるように、非経口投与のための修正されたアプローチは、遅い放出または徐放システムの使用を包含する。例は、米国特許第3,610,795号を参照し、それをここに参照することによって組み込む。

ここに明らかにされる組成物は、患者または対象体に予防的に施されるかもしれず、その者は、脈管透過性または病的血管形成についての危険がある。このように、方法はさらに投与の前に脈管透過性または病的血管形成の危険がある対象体を確認することを含むことができる。

必要な組成物の正確な量は、対象体に毎に、対象体の種、齢、重さおよび一般的な条件、治療されるアレルギー性障害のひどさ、特定の核酸または使われるベクター、管理のそのモードおよび同様のものに応じて、変動する。このように、すべての組成についての正確な量を指定することは可能ではない。たとえば、組成物を管理するための効果的な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定されうるもので、そしてそのような決定をすることは、この技術における技量の範囲内である。組成物の管理のための投薬量の範囲は、徴候の混乱（symptoms disorder）が発効する望ましい影響を生じるのに十分大きなものである。投薬量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくてはならず、それらは不必要な交差反応、アナフィラキシー性の反応、および同様のもののようなものである。概して、投薬量は、患者における齢、条件、性および病気の範囲、投与のルート、または他の薬物がレジメン（療法）において含まれるかどうかで変動し、およびこの技術における技量の者により定めることができる。投薬量は、任意の反徴候（counterindications）の場合においてでも個々の医者によって調節することができる。1または数日間、投薬量を変化させることができ、そして毎日、1またはそれよりも多くの用量において投与することができる。ガイダンスは、製薬上の生産物の所定のクラスのための適切な投薬量のための刊行物（literature）において見出すことができる。たとえば、抗体のための適切な用量を選ぶことでのガイダンスが、抗体の治療上の使用についての刊行物において見出すことができ、例は、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone（フェローン）et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ. , (1985) ch. 22およびpp. 303-357; Smith（スミス）et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber（ハーバー）et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389である。上記の因子に応じ、治療的なペプチドまたはタンパク質の典型的な１日の投薬量は、単独で使われて、日につき、約1μg/kgから最高で100mg/kgの体重またはそれよりも多くである。例えば、ここに明らかにされるリガンド、タンパク質、ペプチドおよびガイダンスキューの濃度は、約1pMから100μMまでの範囲であることができ、それには約1pM, 2pM, 3pM, 4pM, 5pM, 6pM, 7pM, 8pM, 9pM, 約10pM, 約20nM, 約30nM, 約40nM, 約50nM, 約60nM, 約70nM, 約80nM, 約90nM, または約100nM, 約1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 約10μM, 約20μM, 約30μM, 約40μM, 約50μM, 約60μM, 約70μM, 約80μM, 約90μM, or 約100μMが含まれ、対象体の体におけるものである。

(例)
あとに続く例は、例証（実例）の目的だけに対して供され、そしてどんな形であれ、ここに記述する組成物および方法の範囲を制限することを意図しない。それぞれの例では、特に明記しない限り、標準的な材料および方法が、提供される例において記述される仕事を実行する際に用いられた。本明細書におけるすべての特許および引用する刊行物の参照は、その全体において参照することによってここに組み込む。

本発明の実践は、特に明記しない限り、化学、分子生物学、細菌学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の慣習的な技術を採用するもので、それはこの技術の技量の範囲内である（例は、Maniatis, T., et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.); Ausubel, F. M., et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, (J. Wiley and Sons, NY); Glover, D. (1985) DNA Cloning, I and II (Oxford Press); Anand, R. (1992) Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press); Guthrie, G. and Fink, G. R. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.); Jakoby, W. B. and Pastan, I. H. (eds.) (1979) Cell Culture. Methods in Enzymology, Vol. 58 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich (NY); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Hogan et al. (eds) (1994) Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, 2n Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. A general discussion of techniques and materials for human gene mapping, including mapping of human chromosome 1, is provided, e.g., in White and Lalouel (1988) Ann. Rev. Genet. 22:259 279参照。本発明の実践は、特に明記しない限り、化学、分子生物学、細菌学、組換えDNA、遺伝学、および免疫学の慣習的な技術を採用する。（例は、Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991参照）。

ここでは何も、本発明が先の発明によってそのような開示に先だつ権利がないというアドミッション（認識）として解釈されることはない。いかなる参照も先行技術を構成するというアドミッションは行われない。参照文献の議論は、それらの著者が断言するものを述べ、そして出願人は引用された文書の正確さ、および妥当性に疑問を呈する権利を保有する。多数の出版物がここに参照されるが、そのような参照がこの技術における共通の技術常識の1部分を形成するというアドミッションを構成しないということは明らかに理解される。

（例１）

Robo4がインビボで血管のガイダンスのために必要である：過去の10年間に、ゼブラフィッシュは脈管の発達の分析のための魅力的なモデルになって（Weinstein（ウェインスタイン）, 2002）、そしてインビボでRobo4の生物学的重要性を研究するために選ばれた。Robo4遺伝子発現を抑えるために、Robo4プレmRNAのエキソン10-イントロン10バウンダリ（境界線）を標的とする以前に述べたスプライス-ブロッキングモルフォリノ（Bedell（ベデル）et al., 2005）が、使われた。Robo4モルフォリノの有効性を確かめるために、RNAを、注入されない（un-injected）、およびモルフォリノ注入された胚から分離し、および標的化されたエクソン（図8A）の側面に位置するプライマーを用いて、RT-PCRによって分析した。注入されないコントロールと比較するとき、Robo4モルフォリノの注入は野生型のRNAの完全な損失を招き、モルファントのゼブラフィッシュがRobo4のために機能的にヌル（無効）なことを示した（図8B）。

TG（fli1：egfp）^y1ゼブラフィッシュ胚は、内皮特異的な（endothelialspecific）flilのプロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質を発言し、および生体内で発達する内皮の詳細な視覚化が許容され、それは脈管の発達に関してRobo4のモルフォリノ-媒介ノックダウンのコンセンサス（成り行き）を評価するために利用した（図1A;Lawson（ローソン）およびWeinstein（ウェインスタイン）, 2002）。48hpfで、Robo4 MO-注射の胚は、主軸の血管の野生型の形成（背部大動脈および後主静脈）、ならびに背側縦方向吻合血管（dorsal longitudinal anastomotic vessel）およびパラコルダル（parachordal、パラ腱の）血管を見せ、脈管形成および血管形成が、それぞれ、Robo4レベルの減少により影響を受けないことが指し示された（図1B、右側パネル）。しかし、異常性の著明な程度は、Robo4モルフォラントにおいてセグメント（体節）間血管のアーキテクチャー（建築物）で観察された。野生型の胚において、体節間血管は背部大動脈から起こり、そして胚の背面の方へ増殖し、体節の境界線にきつく並べて置かれる。それは、体節間血管の特徴的な山形形状を定める体節の間のこの正確な軌道である（図1A、右側パネル）。このステレオタイプの（常同的）パターンの適合よりはむしろ、Robo4のモルファントの胚の体節間血管は間違った方向を成長させた（図1B、右側パネル：白色矢は、異常な血管を指し示す）。48hpfで、野生型の胚の5%と比較して、Robo MOを注射される60%の胚は、この欠陥を見せた。重要なことに、Robo4モルファントは位相差顕微鏡法によってコントロール胚から見分けがつかず、観察された脈管パターニング障害は著しい形態的な混乱の結果ではなかったことを指し示した。一緒に、これらのデータはゼブラフィッシュの脈管の発達の間、Robo4のための要件を実証し、そしてレセプターからの機能的な出力がリパルシブなガイダンスキューを引き出すことを示唆する。

（例２）

Robo4の細胞質テイル（Tail）は、生体内で脈管ガイダンスのために要求される：Robo4モルファントにおいて観察された脈管欠陥がrobo4の再構成によって抑制されうるかどうかが次に定められた。robo4 MOおよび野生型のネズミRobo4 RNAは、モルフォリノに不応性であり、それらはTG（flil：egfp）^yl胚に注射され、そして脈管パターニングが48hpfで分析された。Robo4 RNAは、トランク（躯幹）血管の常同的なパターニングを、約60%のモルファントな胚において回復させ、遺伝子ノックダウン特異性が確かめられた（図1BおよびC、右側パネル）。

脈管の発達を規制するためのrobo4の能力は、たぶん細胞質の信号を送るその能力の成り行きである。この概念を立証するために、Robo4 MOおよび細胞質の構成要素（robo4Δテイル）と相互作用するレセプターの部分を欠くネズミRobo4の変種形態を、コインジェクト（同時注入）し、そして管の建築物の評価を48hpfでした。野生型のRobo4 RNAとは異なり、robo4Δテイルはモルファントな胚におけるパターニング欠陥を救うことができなかった（図1BおよびD、右側パネル）。これらのデータは、Robo4の細胞質のテイル（尾部）に含まれる情報がゼブラフィッシュの胚形成の間、脈管ガイダンスのために重要であることを実証する。全体で、これらの生体内分析は、Robo4活性が、脊椎動物の脈管の発達の間に体節間血管の軌跡を正確に定めるために必要であることを指し示す（図1E）。

（例3）

Robo4の細胞質テイルは走触性の抑制のために要求される：Slit2-Robo4シグナリングは、VEGFの勾配の方への一次内皮細胞（primary endothelial cell）の、および血清の方へのRobo4を異所性に発現するHEK 293細胞の移動を抑制する（Park et al., 2003; Seth et al., 2005）。可溶性増殖因子に加え、フィブロネクチンのような固定化細胞外基質タンパク質は、細胞の運動性において重要な役割を演じ（Ridley（リドリー）et al., 2003）、そしてフィブロネクチンの勾配は走触性（haptotaxis）と呼ばれるプロセスにおいて移動を指示することができる。実際に、フィブロネクチンがゼブラフィッシュの初期胚において移動性の内皮細胞に隣接して沈澱することが最近示された（Jin（ジン）et al., 2005）。Robo4が生体内でふさわしい内皮細胞移動のために必要であるという観察結果（図1）は、フィブロネクチン誘発走触性を調整するためのSlit2-Robo4シグナリングの能力を指し示した。HEK293セルはRobo4またはRobo4ΔTailでトランスフェクションされ（図2A）、そしてフィブロネクチンおよびSlit2の混合物を用いてコートされた膜上で走触性の移動アッセイを受けた。Slit2は、Robo4ΔTailでなく、Robo4を発現する細胞のフィブロネクチン誘発移動を抑制し、Robo4細胞質テイルがレセプターのリパルシブな活性のために重要であることを実証した（図2B）。

細胞移動の抑制のために必要であるRobo4細胞質テイルの領域が次に定められた。HEK293細胞は、Robo4欠失構築物でトランスフェクションし（図2A）、そして走触性の移動アッセイを受けた。Robo4-NH2を発現する細胞のフィブロネクチン依存移動はRobo4-COOH以外で、Slit2によって抑制され（図2C）、そしてRobo4細胞質テイルのN末端半分が細胞運動性の調節（modulation）に必要であり、そして十分なことが実証された。

（例4）

パキシリンファミリーのメンバーは、Robo4相互作用性タンパク質である：機能的な活性を与えるRobo4細胞質テイルの領域の識別は、Robo4のシグナル伝達を規制するかもしれない細胞質の構成要素のための検索を許した。ベイト（餌）としてRobo4テイルのＮ末端半分を用いて、ヒト大動脈cDNAライブラリーの酵母（イースト）2-ハイブリッドスクリーニング法を実行し、それはアダプタータンパク質、Hic-5のパキシリンファミリーのメンバーを、潜在的なRobo4相互作用性タンパク質として確認した（図8）。この相互作用を確かめるために、Hic-5プラスミドを分離し、そして酵母中に、Robo4またはエンプティ（空）のベクターを再形質移入した。Robo4およびHic-5を同時発現する株だけは、栄養分欠損媒体上で増殖し、そして頑強なベータガラクトシダーゼ活性を誘発する資格があった（図8B）。さらにこの相互作用を確かめるために、免疫共沈降実験を、Hic-5およびRobo4細胞質テイルで同時トランスフェクションさせた哺乳類の細胞を使って実行した。Hic-5は、Hic-5だけでなく、Robo4およびHic-5を発現するHEK293細胞の抗Robo4免疫沈降において見出された（図3A）。まとめると、これらのデータは、Hic-5が特に、酵母および哺乳類の細胞においてRobo4細胞質テイルと相互作用することを実証する。

Hic-5およびそのパラログ（paralog）、パラキシリンは、細胞タイプ特異的発現を見せることができる（Turner（ターナー）, 2000; Yuminamochi（ユミナモチ）et al., 2003）。この理由から、これらのタンパク質のものがHEK293細胞において発現したことが定められ、細胞系が走触性移動アッセイにおいて使われた。CHO-K1、HEK 293およびHic-5またはパキシリンに対する抗体を有するNIH3T3細胞からの細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、すべての細胞系でパキシリンを見出し、ところが、Hic-5はCHO-K1およびNIH3T3細胞で見出されるだけだった（図3B）。これはHic-5およびパキシリンが細胞移動を規制するためにRobo4と相互作用することができることだけでなく、パキシリンが、HEK293細胞の有望な結合パートナー（相手）であることを示唆した。この後者の考えを考慮して、免疫共沈降実験は、パキシリンおよびRobo4細胞質テイルを発現する哺乳類の細胞を使って実行した。Hic-5で観察されたように、パキシリンは、パキシリンだけでなく、パキシリンおよびRobo4を発現するHEK293細胞の抗Robo4免疫沈降において確認された（図3C）。

Slit2がRobo4の生理的リガンドであるので（Park et al., 2003; Hohenester（ホーエンエスター）et al., 2006）、Slit2刺激がRobo4およびパキシリンの間の相互作用を規制したかどうかは決定した。Robo4を発現するHEK 293細胞を、Slit2の有無においてインキュベーションした。Slit2の存在下、内因性パキシリンは、Robo4免疫沈降において検出された。著しく対照的に、Slit2が不存在である場合、パキシリンは免疫沈降において何も検出されなかった（図3E）。このように、Slit2によるRobo4の関わりは、パキシリンとのその関連を刺激した。

(例5)

Robo4のパキシリン相互作用モチーフの識別：パキシリンとの相互作用に必要であるRobo4の領域を正確に規定するために、細胞質テイルのすべての長さにわたる一連のGST-Robo4融合タンパク質を創作した（図4A）。精製した組換え型パキシリンでの試験管内の結合アッセイは、Robo4テイル（494-731）のアミノ末端半分がパキシリンとの直接的な相互作用に必要であり、および十分であることを実証した（図4B）。細胞質テイルのアミノ末端半分の約70個のアミノ酸断片を包含する4つの付加的なGST-Robo4融合タンパク質は、それから生成した（図4C）。試験管内での結合アッセイは、パキシリンが選択的に、CC0およびCC2のモチーフの間で備わるRobo4テイルの断片と相互作用することを明らかにした（604-674;図4D）。Robo4のこの領域がパキシリンと相互作用するために必要であったかどうか決定するために、アミノ酸604-674を、細胞質テイルから削除し、そしてこの変種GST-Robo4融合タンパク質を試験管内での結合アッセイにかけた。パキシリンとの相互作用が弱められる間、それは、既知のRobo4-結合タンパク質、メナ（Mena）と相互作用し、アミノ酸604-674の排除がRobo4テイルのコンフォメーション（立体構造）に影響を及ぼすことが指し示された。この問題を回避するために、より一層小さな欠失を、この70個のアミノ酸ストレッチ（伸展）の範囲内で創作され、そして追加的な試験管内での結合アッセイが実行された。このアプローチを用いて、変種GST-Robo4融合タンパク質は、36個のアミノ酸を欠くとして識別され（604-639;図9）、それはパキシリンへの結合を失うが、メナへの結合は保持された（図4E）。Robo4のこの領域は、パキシリン相互作用のモチーフ（PIM）としてこれまでに呼ばれる。

（例6）

パキシリン相互作用のモチーフは走触性のRobo4依存抑制のために必要である：Robo4のパキシリン相互作用のモチーフがレセプターの機能的な活性にとって重要かどうかが次に決定された。アミノ酸604-639（Robo4ΔPIM）を欠く全長Robo4の変種の形態を、部位特異的変異誘発によって生成し、走触性の移動のアッセイにおいて使った。Robo4ΔPIMはフィブロネクチンの勾配の方への移動のSlit2誘導抑制を媒介しないで（図4F）、パキシリン結合のために必要なRobo4テイルの領域が同様に細胞移動のRobo4依存抑制のために必要であることが実証された。

（例7）

Slit2-Robo4シグナリングは、細胞拡散および付着依存性（Adhesion-dependent）Rac活性化を抑制する：フィブロネクチン上でRobo4を発現する細胞の移動を抑制する固定されたSlit2の能力は、このECMタンパク質上での付着および／または拡散の否定的な規制から潜在的に生じることがありえた。Slit2-Robo4シグナリングがこれらのプロセスに影響するかどうか決定するために、HEK 293細胞を、Robo4または空ベクター（pcDNA3）でトランスフェクションし、そしてフィブロネクチン上で付着および拡散のアッセイを受けさせた。Robo4を発現する細胞は通常、フィブロネクチンおよびSlit2でコートしたカバーグラスに付着したが、それらはpcDNA3でトランスフェクションする細胞よりあまり拡散しなかった（図5A）。これらのデータは、Slit2-Robo4シグナリングが拡散する細胞を制御する細胞内経路を調整することを指し示す。

ECMタンパク質で、フィブロネクチンのようなものの上に拡がる細胞の能力は、小さなGTPasesのRhoファミリーの活性化によって規制され、それにはRho、Cdc42およびRacの移動が含まれる（Nobes（ノウブズ）およびHall（ホール）, 1995; NobesおよびHall, 1998）。これらのタンパク質のうち、Racは、細胞を拡散および移動に導くアクチン重合を促すことで重要な役割を演じる（(NobesおよびHall, 1995; NobesおよびHall, 1998）。Racおよび細胞拡散の間のこの確立した関係は、Slit2-Robo4シグナリングがRacの付着依存活性化を抑制するかもしれないことを指し示した。この可能性を評価するために、HEK 293細胞を、Robo4またはpcDNA3でトランスフェクションし、フィブロネクチンでコートされるディッシュ上へ板状培養し、そしてSlit2およびRac-GTPのレベルをGST-PBDのプルダウン（引き下ろし）アッセイを使ってアッセイした。Robo4を発現する細胞は、pcDNA3でトランスフェクションする細胞と比較するとき、著しく少ない付着-刺激化Rac活性化を示した（図5BおよびC）。この影響の特異性を確かめるために、Cdc42活性化はまた、Robo4を発現する細胞において検討し、それはSlit2への曝露によって変化しなかった（図11A）。この結果は、Robo4がRobo1結合タンパク質srGAP1、Cdc42のための既知のGTPase活性化タンパク質と相互作用しないという観察によって支持される（図11B）。全体として、これらのデータは、Slit2-Robo4シグナリングが特異的にRacの付着誘発活性化を抑制することを実証する。

（例8）

パキシリン相互作用モチーフは細胞拡散およびRac活性化のRobo4依存抑制のために必要である：Robo4ΔPIMが、フィブロネクチン誘発細胞拡散およびRac活性化を抑制するのに有能であったかどうかが次に評価された。HEK 293細胞を、Robo4ΔPIMでトランスフェクションし、フィブロネクチンおよびSlit2をコートした表面上に板状培養し、そして拡散またはRacのアッセイを受けさせた。レセプターのこの変種の形態は、細胞拡散および付着依存Rac活性化を抑制することが不可能であり（図5D、EおよびF）、パキシリン相互作用のモチーフは、試験管内でRobo4の機能的な活性にとって不可欠なことが実証された。

細胞拡散のRobo4依存抑制が主にRac活性化の抑制によることを確認するために、HEK 293細胞を、Robo4およびRacの支配的な活性型、Rac（G12V）で同時トランスフェクションし、そして拡散アッセイを受けさせた。Rac（G12V）を発現する細胞は、細胞拡散のRobo4依存抑制に抵抗性であり（図5G）、Slit2-Robo4 シグナリングは、Rac活性を抑制することによって拡散をブロックすることが実証された。

（例9）

Slit2は、一次ヒト内皮細胞においてVEGF誘発Rac活性化を抑制する：Slit2はいくつかの一次ヒト内皮細胞系のVEGF刺激された移動を抑制し（Park et al., 2003）、およびRacはVEGF誘発細胞運動性におけるそののための重要な役割を演じる（Soga（ソガ）et al., 2001a; Soga et al., 2001b）。したがって、Slit2-Robo4シグナリングが内因性セッティングにおいてRac活性化を抑制することができたかどうかを決定した。ヒトの臍帯静脈内皮細胞（Umbilcal Vein Endothelial Cells）（HUVEC）はSlit2の存在および不存在でVEGFで刺激され、そしてGTP-RacレベルがGST-PBDプルダウンアッセイを使ってアッセイされた。Slit2処置は完全にVEGF刺激されたRac活性化を抑圧し（図5HおよびI）、内因性Slit2-Robo4シグナリングはRac活性化を調整することが実証された。

（例10）

パキシリンのLim4は、Robo4との相互作用および細胞拡散のRobo4依存抑制のために必要である：Robo4ΔPIMがMenaとのその相互作用を維持するが（図4E）、この変異がパキシリン以外のタンパク質とのRobo4の相互作用を撹乱させたかもしれない。決定的にこの問題に対処するために、パキシリンの変種が生成され、それはRobo4との関連を崩壊させた。パキシリンは、N末端ロイシン/アスパラギン酸（LD）の繰返し、およびC末端Limドメインから構成されるモジュラータンパク質（調節タンパク質）である（図6A）。イースト2-ハイブリッドスクリーニング法から回収されるクローンの分析（図9A参照）は、Limドメイン、特にLim3およびLim4がRobo4との相互作用のために重要であることを指し示した。この概念を検証（バリデート）するために、免疫共沈降実験を、Robo4テイルおよびパキシリン-LDまたはパキシリン-Limのいずれかでもで同時トランスフェクションさせたHEK 293細胞を用いて実行した。パキシリン-Limは、パキシリン-LDではなく、Robo4免疫沈降において見出された（図6B）、パキシリンのLimドメインがRobo4との相互作用のために必要で、そして十分であることが実証された。どのLimドメインが、Robo4への結合のために必要かを明らかにするために、連続的削除をパキシリンのカルボキシ末端から行い、HEK 293細胞中にRobo4テイルで同時トランスフェクションし、そして免疫共沈降実験を実行した。パキシリンのLim4ドメインの削除はRobo4への結合を完全に無効にし（図6C）、パキシリンのこの領域がRobo4と相互作用するその能力のために重要であることが実証された。

パキシリン上のRobo4結合部位の描写は、細胞拡散のRobo4依存抑制において、パキシリンの役割の直接的な評価を許した。内因性パキシリンは、HEK 293細胞において、siRNAを使ってノックダウンされ、そして野生型チキンのパキシリン（Ch-パキシリン）またはCh-パキシリンΔLim4で再構成された（図6D）。これらの細胞は次いで、フィブロネクチンおよびSlit2でコートされたカバーグラス上で拡散アッセイを受けさせられた。Ch-パキシリンΔLim4を発現する細胞は、細胞拡散のRobo4依存抑制に抵抗性であり、一方、Ch-パキシリンを発現する細胞は細胞エリアの特徴のある減少をしめした（図6E）。これらのデータは、Robo4とのパキシリンの相互作用はSlit2-Robo4シグナリングが細胞拡散を抑圧するのを可能にすることを確認する。

（例11）

パキシリン相互作用モチーフは、生体内で脈管ガイダンスのために必要である：ゼブラフィッシュの脈管発達の間のRobo4のパキシリン相互作用のモチーフの要件をアッセイした。以前に記述するように、TG（fli1：egfp）^y1胚へのrobo4 MOの注入は、体節間管の混乱を引き起こした（図1B参照）。robo4ΔPIM RNAの同時注入はrobo4 MOによって起因する欠陥を増悪させ、一方、野生型robo4 RNAがこれらの欠陥を抑圧した（7A図）。モルファントな胚の脈管パターニングの欠陥を救うためのrobo4Δテイルおよびrobo4ΔPlM RNAの双方の無能力は、36個のアミノ酸のパキシリン相互作用のモチーフがRobo4細胞質テイルにおける重要なシグナル伝達モジュールであることを実証する。さらに、これらのデータは、パキシリンおよびRobo4の間の相互作用がゼブラフィッシュの脈管構造のふさわしいパターニングにとって不可欠であることを指し示す。

（例12）

Robo4がパキシリンと相互作用し、そして突き出た活性を抑制するという本発明者らの決定は、本発明者らをRobo4がArf6経路を侵害するかどうか決定するように促した。αIIb-Robo4を発現する細胞：β3はフィブロネクチン単独、またはフィブロネクチンおよびフィブリノゲン上で板状培養し、そしてArf6-GTPレベルを、GST-GGA3アフィニティ（親和性）沈降技術を使用して分析した。フィブロネクチンがArf6の活性化を刺激する一方、フィブリノゲンはαIIb-Robo4：β3を発現する細胞においてArf6-GTPレベルを減らした（図16A）。この結果はRobo4シグナリングがArf6活性化を抑制することを実証し、そしてRac活性をブロックするRobo4の能力がArf6のその規制から発せられることを示唆した。

次に、本発明者らは突き出た活性のRobo4依存抑制において、パキシリン-GIT1複合体の要件を分析した。GIT1上のパキシリン結合性配列（PBS）は、タンパク質のカルボキシ末端で見出され、GIT1およびパキシリンの相互作用を防ぐことが示された（Uemura（ウエムラ）et al., 2006）。細胞は、αIIb-Robo4：β3および空のベクトルまたはGIT1-PBSのどちらかでトランスフェクションし、そしてフィブロネクチンまたはフィブロネクチンおよびフィブリノーゲン上で拡散アッセイを受けさせた。以前に解説するように、αIIb-Robo4：β3を発現する細胞は、フィブリノゲン上で板状培養するとき、細胞エリア（面積）の減少を表示し、しかし、これはGIT1-PBSとともにトランスフェクションする細胞において失われた（図16B）。本発明者らは、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンおよびSlit2の上で板状培養された全長Robo4を発現する細胞においてこの実験を繰り返し、そしてキメラのレセプターの実験と類似して、GIT1-PBSは、細胞エリアでのSlit2依存減少を防いだ（図16C）。これらのデータは、機能的なパキシリン-GIT1複合体がSlit2-Robo4シグナリングのために必要なことを実証する。

Slit2-Robo4シグナリングがArf6を不活性化することによって突き出た活性を抑制するかどうか決定するために、本発明者らはRobo4でArf6グアニンヌクレオチド交換因子ARNOを同時発現させ、そして拡散アッセイを実行した。ARNOの過剰発現は細胞エリアを減らすSlit2の能力をブロックし、Slit2-Robo4シグナリングの主要な影響がArf6のGTP-負荷を防ぐことであることが指し示された（図16C）。Robo4を発現する細胞のSlit2上に拡がる能力をARNOが元に戻すならば、本発明者らはそれが同様にフィブロネクチンに反応してRac活性化を再確立しなければならないと判断した。実際に、ARNOの過剰発現は、フィブロネクチンおよびSlit2上で板状培養される細胞において、GTP-Racの正常なレベルを導いた（図16D）。全体として、これらの実験はSlit2-Robo4シグナリングがArf6を不活性化することを実証し、それは細胞の拡散および移動のために、Rac活性化のローカル（局所的）遮断（local blockade）および必要な膜突起のその後の抑制を導く。

（例13）

免疫沈降は、SlitリガンドおよびRobo4レセプターの間の相互作用を実証する：トランスフェクションされないヒト胚腎臓細胞（HEK）、Slitにmycエピトープをタグ付けしてトランスフェクションしたHEK細胞（Slit-myc）、Robo4にHAエピトープをタグ付けしてトランスフェクションしたHEK細胞（Robo4-HA）およびコントロールベクターでトランスフェクションしたHEK細胞（コントロール-HEK）からの細胞溶解物を、免疫沈降させた（immunopreciptated）。Slit-mycタンパク質は、Slit-mycおよびRobo4-HA細胞溶解物を組み合せ、そして抗HA抗体とともに免疫沈降させた後、抗myc抗体でウエスタンブロットによって検出した（図17A、レーン6）。この相互作用の特異性は、溶解物の他の全ての組合せで検出可能なSlitタンパク質の不存在によって確かめた（図17A、レーン2-5）。溶解物の同じ量を、各々の実験で使った。Slit-myc細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、コントロールとして役立ち、そしてSlitタンパク質が以前の報告に従っておよそ210kDの質量を持つことを実証した（図17 A、レーン1）。図17Aのレーン2-6で示される下側バンドは、免疫グロブリン重鎖に対応する。

トレンスフェクションされてないHEK細胞（HEK CM）、Slitにmycエピトープをタグ付けしてトランスフェクションしたHEK細胞（Slit-myc CM）、Robo4のN末端可溶性外部ドメインにHAエピトープをタグ付けしてトランスフェクションしたHEK細胞（NRobo4-HA CM）およびコントロールベクターでトランスフェクションしたHEK細胞（コントロールHEK CM）からの条件培地もまた、免疫沈降させた。全長のSlit-mycタンパク質（210KD）およびそのC末端タンパク質分解断片（70KD）を、抗myc抗体によって、Slit-myc CMにおいて検出した（図17B、レーン1）。Slit-mycタンパク質はまた、Slit-mycおよびRobo4-HA条件培地を組み合せ、そして抗HA抗体とともに免疫沈降した後、ウエスタンブロットによって検出した（図17B、レーン6）。この相互作用の特異性は、条件培地の他の全ての組合せで、Slitタンパク質の不存在によって確かめられた。

図17Cから図17Fを通して示されるように、Slitタンパク質はRobo4を発現する細胞の原形質膜と結合する。Slit-mycタンパク質の結合は、抗myc抗体を使って検出され、そしてAlexa（アレクサ）594は抗マウス抗体を接合した。図17Dおよび図17Fにおいて分かるように、結合はコントロールHEK細胞（図17D）ではなく、Robo4-HEK細胞（図17F）の表面上で検出された。

（例14）

Robo4ノックアウトマウス：生体内でRobo4の機能的な重要性を解明するために、ノックアウトマウスを、標準的な技術を使用して生産した。ノックアウトマウスを生産するために、Robo4を発現する遺伝子のうちの5つを通しての1つのエクソンを、相同組換えを使ってアルカリホスファターゼ（AP）リポーター遺伝子と入れ替えた。この対立遺伝子、Robo4^APは、Robo4外部ドメインの免疫グロブリン（IgG）繰返しをコード化するエクソンを欠き、それはSlitタンパク質との相互作用のために必要であると予測される。Robo4^{+ AP}動物は、標的にされた対立遺伝子のためにホモ接合性だったマウスを生成するために交雑受精させた。マウスのゲノム構造の例証は、図25に提供する。Robo4^AP/AP動物は生存可能で、そして繁殖性で、および脈管系の正常なパターニングを見せた。これらのデータはRobo4が発育中のマウスにおいて血管形成を出芽させるために必要でないことを指し示し、哺乳類の内皮においてRobo4シグナリングのために、代わりの機能を指摘する。アルカリホスファターゼ活性は発育中の胚のすべての脈管床の内皮を通してこれらの動物において、そして成体マウスにおいて検出され、それはRobo4^AP対立遺伝子がRobo4発現の有効なマーカーであることを確認した。

（例15）

Robo4活性化は成熟した管を安定化させる：ネズミ網膜脈管叢の中央領域（central region）は、特に柄細胞（stalk cell）から構成され、成熟した、ルーメナイズされた（lumenized）脈管チューブに特有の分化型/標準化された表現型の例である。したがって、本発明者らは柄におけるRobo4発現が、血管新生促進の因子で、VEGF-Aのようなものによって刺激されるプロセスを抑制することによってこの表現型を維持するかもしれないと判断した。VEGF-Aによって刺激されるプロセス上でRobo4シグナリングの影響は、VEGF-A内皮細胞移動アッセイおよびVEGF-A管形成アッセイを使って評価された。双方のそのようなアッセイは、試験管内での血管形成を研究するのに日常的に用いられる。

内皮細胞移動およびチューブ（管）形成のアッセイを行うために、Robo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスの肺からの内皮細胞は分離し、そしてそれらの同一性は免疫細胞化学およびフローサイトメトリーを使うことで確かめた。これらの細胞は次いで、VEGF-A依存内皮細胞移動およびチューブ形成のアッセイにおいて利用した。これらのアッセイにおいて使うSlit2分子は、Slit2Nであった（配列番号39）。図19Aおよび図19Bに示すように、Slit2はRobo4^+/+内皮細胞の移動およびチューブ形成を抑制した。しかし、Slit2の抑制活性は、Robo4^AP/AP内皮細胞において失われた。これらの結果はSlit2がRobo4依存様式において内皮細胞移動およびチューブ形成を抑制することを実証し、およびSlit2によるRobo4の活性化が成熟した管の脈管内皮を安定化させるのに役立つことを指し示す。

（例16）

Robo4活性化は内皮バリア機能を保つ：成熟した脈管床において、内皮細胞は互いに独立してふるまわず；むしろ、それらは周囲の組織中に、内皮ルーメンからのタンパク質、流体および細胞の動きを妨げるモノレイヤー（単分子層）を形成する。このバリア機能は、西洋ワサビ（ホースラディッシュ）ペルオキシダーゼ（HRP）の輸送を分析するためのTranswell（トランスウェル）アッセイを使って、Robo4^+/+とRobo4^AP/APマウスの肺から採取した内皮細胞の集密的な細胞モノレイヤーを横切って、試験管内でモデル化された。Robo4^+/+およびRobo4^AP/AP内皮細胞のVEGF-A、既知の透過性誘発因子での刺激は、Transwellの下側チャンバー（室）において、HRPの蓄積を高めた。図19Cに示すように、しかし、Slit2タンパク質による細胞モノレイヤーの前処理は（Slit2N（配列番号39））、Robo4^AP/AP内皮細胞ではなく、Robo4^+/+でのこの影響を防いだ。

次に、生体内での内皮バリア機能のSlit2の影響を評価した。マイルスアッセイは、Robo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスの尾部静脈中にエバンスブルーを注入することによって実行した。Slit2タンパク質の不存在および存在におけるVEGF-A（Slit2N（配列番号39））は、真皮中にその後注入された。試験管内のアッセイに類似して、真皮へのエバンスブルーのVEGF-Aを刺激された漏出は、Robo4^AP/APマウスにおいてではなく、Robo4^+/+でのSlit2タンパク質の付随する投与によって防ぐことができた（図19Dに示される）。これらの観察結果は、網膜内皮のVEGF-A誘発された透過性亢進を抑圧するSlit2の能力を評価することによって延長された。とりわけ、Robo4^+/+マウスでの硝子体内注射VEGF-Aが網膜血管からエバンスブルーの漏出を誘発することが見出された。しかし、網膜血管からのエバンスブルーのそのようなVEGF-A誘発された漏出は、Slit2タンパク質Slit2Nの同時注射によって、Robo4^+/+マウスにおいて抑圧された（配列番号39）(図19E)。この実験はRobo4^AP/APマウスの網膜で繰り返され、そしてRobo4^AP/APがSlit2Nで処置に抵抗性であることが見出された（配列番号39）。これらのデータは、Robo4が試験管内で、および生体内でVEGF-A誘発された内皮透過性亢進のSlit2依存抑制を媒介することを実証する。

（例17）

Robo4 はVEGFレセプターの下流のVEGFシグナリングをブロックする：血管形成および透過性を促すVEGF-Aの能力はVEGFR2の活性化に依存し、それは自己リン酸化次いでリガンド結合によって起こる。その後、多数の非受容体チロシンキナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼおよび小さなGTPasesは、空間的に、および時間的に特定の様式においてVEGF-Aシグナリングを遂行するために活性化される。Slit2-Robo4シグナリングがどこでVEGF-A-VEGFR2経路と交差する（intersects）かについて決定するために、VEGFR2リン酸化それに次いでVEGF-AおよびSlit2による刺激を、Slit2Nを使って分析した（配列番号39）。Slit2N（配列番号39）はVEGF-A誘発VEGFR2リン酸化に対する影響を持たず（図19F）、Slit2-Robo4経路がレセプターの下流のVEGF-Aシグナリングと交差しなければならないことが指し示された。注意はそれから、VEGF-A誘発血管形成および透過性を媒介することにおいてのそれらの文書で十分に裏付けられた役割のため、非受容体チロシンキナーゼ、Fyn（フューン）YesおよびSrcのSrcファミリー上に集中した（Eliceiri（エリセイリ）et al., 2002; Eliceiri et al., 1999）。Slit2Nによる内皮細胞の処置（配列番号39）は、c-SrcのVEGF-A-刺激されたリン酸化を減らした（図19G）。近年は、いくつかの報告は、Rhoファミリーの小さなGTPase、Rac1のSrc依存活性化がVEGF-A-誘発内皮細胞移動および透過性にとって不可欠であることを示した（Gavard（ガバルド）et al., 2006; Garrett（ギャレット）et al., 2007）。Slit2Nによる内皮細胞モノレイヤーの処置（配列番号39）は、VEGF-A-依存Rac1活性化を防いだ（図19H）。これらの生化学実験は、Slit2-Robo4経路がSrc-Rac1シグナリング軸の抑制を介するVEGF-A誘発内皮移動および透過性亢進を抑圧することを指し示す。

（例18）

Robo4の活性化は、CNVおよびOIRのモデルにおいて脈管漏出および病的血管形成を減少させる：酸素誘発された網膜症（OIR）のネズミモデルは、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症の双方において観察される虚血誘発された血管形成を擬態し、網膜血管病に関してRobo4シグナリングの影響を研究するのに用いた。このモデルにおいて、P7マウスは、5日間の75%の酸素環境で維持され、そして次いで追加の5日間25%の酸素に戻した。気付かれた酸素欠乏（oxygen deficit）は網膜でのVEGF-A発現の急速な増加を惹起し、病理学的血管形成を導く（Ozaki（オザキ）et al., 2000; Werdich（ウェルディヒ）et al., 2004。Robo4^+/+マウスおよびRobo4^AP/APマウスは、このモデルを使って評価した。Slit2Nの硝子体内投与（配列番号39）は。Robo4^AP/APマウスのでなく、Robo4^+/+マウスにおいて血管形成を著しく減らした（図20A-図20E、そこでは矢印は病理学的血管形成のエリアを指し示す）。さらにまた、Robo4^AP/APマウスは、Robo4^+/+マウスそれに次いで過酸素条件への曝露よりより積極的な血管形成を指し示した（例は、図20Aおよび図20C参照）。

記述されたOIRモデルに加え、レーザーによって誘発された脈絡叢の新血管新生は、加齢関連黄斑変性症を擬態し、マウスにおいて病理学的血管形成を調査するために普通に用いられる（Lima（リマ）et al., 2005）。このモデルにおいて、レーザーを、Bruch's membrane（ブルッフ膜）を崩壊させるのに用い、それは下にある脈絡叢の脈管構造が網膜下の色素上皮中に透過するのを許す。この病理学的プロセスでのRobo4シグナリングの影響を見分けるために、8-12週齢のRobo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスがSlit2Nの硝子体内注射が続くレーザー誘発脈絡叢新血管新生を受けた（配列番号39）。類似する結果が、Robo4^AP/APマウスではなく、Robo4^+/+マウスでの酸素誘発網膜症、Slit2Nを減らした血管形成の硝子体内投与のマウスモデルにおいて達成された（図20F-図20J参照）。全体として、酸素誘発網膜症および脈絡叢の新血管新生モデルは、区別できる特徴を有する2つの脈管床、きつい血液脳関門（tight blood-brain barrier）の1種および他は有窓内皮（fenestrated endothelium）が、Slit2-Robo4シグナリングの活性化による病理学的損傷（pathological insult）から保護されることを指し示す。

（例19）

Robo4は、成熟した管を不安定にする多重因子からのシグナリングを抑制する：bFGF、および血管形成因子、およびトロンビン、内皮透過性因子の活性上のSlit2分子によって、Robo4活性化の影響を評価した。図21で示すように、Slit2N（配列番号39）は、bFGF誘発内皮チューブ形成およびトロンビン誘発透過性をブロックした。これらの調査はSlit-Robo4シグナリングが、多重の血管形成および透過性の因子によって誘発されるシグナリングを妨げることができることを実証し、そしてSlit-Robo4経路が、成熟した脈管床を、多重血管形成、透過性およびサイトカインの因子から保護する概念を支持する。

Robo4シグナリングが脈管構造を、多重血管形成、透過性およびサイトカインの要因から保護することを強化するために、Slit2Nによる（配列番号39）Robo4活性化の影響を、急性肺傷害のマウスモデルにおいて評価した。このモデルにおいて、細菌のエンドトキシンLPSは、気管内投与を介してマウスに投薬された。細菌のエンドトキシンへの曝露は、肺脈管床の破滅的な不安定化を引き起こすサイトカインストームを導き、非心原性肺水腫を招く（Matthay（マッテイ）et al., 2005）。LPSの気管内投与の後、マウスをSlit2N（配列番号39）またはMock（モック）調製物で処置し、モックは見せかけのタンパク質抽出物で、コントロールとして役立つ。図22で示すように、Slit2Nで処置した（配列番号39）マウスからの気管支肺胞洗浄（BAL）の炎症性細胞およびタンパク質の濃度は、モック調製物で処置されるマウスのものよりも十分に低かった。これらの結果は、これらの状況の下でのRobo4の活性化が、有力な脈管安定化を提供することを実証し、そしてSlit2-Robo4が成熟した内皮の健全性を保存し、そしてサイトカインストームの極端な形態に対して脈管ホメオスタシスを維持するために作動する有力な脈管安定化経路であることを示唆する。

（例20）

Slit2タンパク質の投与は、トリインフルエンザ（Avian Flu）のマウスモデルにおいて、死亡率を減少させる：次の例では、トリインフルエンザウイルス（Avian Flu Virus）に感染したマウスの生存に関するSlitタンパク質の影響を分析した。合計での120匹の雌性のBALB/cマウスを、鼻腔内にトリインフルエンザウイルス、株H5N1/Duck（アヒル）/Mn/1525/81）の1:400希釈の50μlを接種した。この例で用いるマウスは、Charles River（チャールズ・リバー）から得られ、そして18-20グラムから変動する平均体重を持った。表2に関して、マウスは各々20匹のマウスの6つのケージにランダムに分け、そして各々のグループを5日の間毎日の処置を受けさせた。生存率（生存者権）（死）および体重を、処置の間およびその後に観察した。

手短には、表2に示すように、グループ1を生理的塩類溶液（PSS）の陰性コントロールで処置した。グループ2および3を、モック調製物で処置した。グループ4および5を、Slitタンパク質の異なる濃度で処置した（Slit2N（配列番号39））。陽性コントロールとして、グループ6の20匹のマウスを、0.1mLのPSSの総容量において提示する（brought up）75mg/kg/日のリバビリンでの腹腔内で処置した。

分析の結果は、図24に例証し、そして表3で詳述する。23日後に、グループ4および5でSlitタンパク質により処置したマウスは、グループ1、2および3でSlitタンパク質を受け取らなかったそれらのマウスよりも低い死亡率を持った。グループ4のマウスは、用量につきSlitの12.5μgで処置し、それは、25%の生存性の率を持った。グループ5のマウスは、用量につきSlitの1.25μgで処置し、それは、50%の生存性の率を持った。グループ4および5の生存率と対照的に、グループ1、PSSで処置されるものの陰性コントロールのマウスのわずか5%（1/20）が過去23日を生き残った。

表3は、接種後14日に、グループ4および5においてSlit処置されたサーバイバー（生存物）よりも、グループ1、2、および3の生存物の平均体重がかなり低かったことを示す。さらに、グループ5での10/20マウスは、それはSlit処置濃度がより一層低いものであったが、21日に、17.7グラムの開始される平均体重とほとんど同じくらい高い平均17.6グラムの体重を有して生き残った。したがって、Slitタンパク質で処置されるそれらの感染したマウスは、それらの体重を未処置のマウスより良好に保つことができた。

（例21）

Slitタンパク質の断片は、Robo4を活性化するために作動する：図23は、Slit2タンパク質の種々の構築物を例証する。ここにすでに解説したように、150kDのタンパク質Slit2N（配列番号39）は、試験管内で、および生体内でのモデルにおいて、Miles assays（マイルスアッセイ）、網膜透過性、チューブ形成および内皮細胞移動のためのアッセイを含めて、そしてOIRおよび眼疾患のCNVのモデルにおいて効果的であることが見出された。そのうえ、図23に示されるように、（40kD）タンパク質SlitD1（配列番号42）およびSlit2N（配列番号39）構築物は、VEGF誘発内皮細胞移動のアッセイにおいて、全長Slit2（配列番号40）に似た活性を見せる。

（材料および方法）

試薬：HEK 293およびCOS-7細胞、およびすべてのIMAGE（イメージ）クローンは、ATCCからのものであった。SP6およびT7のMessage Machine（メッセージ・マシーン）キットは、Ambion（アンビオン）からであった。HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、EBM-2およびブレット（弾丸）キットは、Cambrex（カンブレックス）からであった。イースト2-ハイブリッドプラスミドおよび試薬は、Clontech（クローンテック）からであった。FBSは、Hyclone（ハイクローン）からであった。抗HAアフィニティマトリックス、Fugene（フュージーン）βおよびプロテアーゼインヒビターカクテルは、Roche（ロシュ）からであった。Goat Anti-Mouse（ヤギ抗マウス）HRPおよびGoat Anti-Rabbit（ラビット）-HRP二次抗体は、Jackson immunoResearch（ジャクソン・イムノリサーチ）からであった。抗V5抗体、DAPI、DMEM、リポフェクタミン（Lipofectamine）2000、ペニシリン-ストレプトマイシン、Superscript（スーパースクリプト）IIIキット、Trizol（トリゾール、商品名）およびTrypLE Express（トリプレ・エクスプレス）は、Invitrogenからであった。抗Flag（フラグ）M2、ホスファターゼインヒビターカクテルズ（Phosphatase Inhibitor Cocktails）、ソイビーントリプシンインヒビター（Soybean Trypsin Inhibitor）および脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）（BSA）は、Sigma（シグマ）からであった。ヒトフィブロネクチンは、Biomedical Technologies（バイオケミカル・テクノロジー）およびInvitorogenからであった。Coster Transwells（コスター・トランスウェルズ）およびAmicon Ultra（アミコン・ウルトラ）-15 Concentrator Columns（コンセントレータ・カラム）は、Fisher（フィッシャー）からであった。Rosetta（ロゼッタ）2のE. coli（大腸菌）は、Novagen（ノバゲン）からであった。Glutathion-Sepharose（グルタチオンセファロース）4B、パレンタル（親の）pGEX-4T1およびECL PLUSは、Amersham-Pharmacia（アマシャム-ファルマシア）からであった。Coomassie Blue（クーマシーブルー）およびPVDFは、BioRad（バイオラド）からであった。Quick change site-directed mutagenesis kit（クイック・チェンジ・サイト-ディレクテッド・ミュータジェネシス・キット）は、Stratagene（ストラタジーン）からであった。通常のRat IgGagarose接合体は、Santa Cruz（サンタクルス）からであった。Robo4モルフォリノは、Gene Tools（ジーン・ツールズ）からであった。PCRのためのオリゴヌクレオチドは、University of Utah Core Facility（ユタ大学コアファシリティー）からであった。Alexa564-ファロイジン、抗GFPおよびヤギ抗ウサギAlex488は、Molecular Probes（モレキュラー・プローブ）からであった。低融点アガロースは、NuSieve（ヌシーブ）からであった。T7試験管内転写/翻訳キットは、form Promega（プロメガから）であった。

分子生物学：Robo4-HA、Slit2-Myc-Hisおよびチキンパキシリンプラスミドは、以前に述べた（Park et al., 2003; Nishiya（ニシヤ）et al., 2005）。Robo4-NH2はRobo4-HAから増幅され、pcDNA3-HAのEcoRV/Not1中にクローン化された。Robo4-COOHはオーパーラップ（重複）-エクステンション（伸張）PCRによってRobo4-HAから増幅され、そしてpcDNA3-HAのEcoRV/Not1中にクローン化された。ヒトのRobo4細胞質テイル（AA 465-723）のアミノ末端半分は、PCRによって増幅され、そしてpGBKT7の（EcoRI/BamHI）中にクローン化された。ネズミRobo4断片はPCRによって増幅され、そしてpGEX-4T1のBamHI/EcoRI中にクローン化された。ネズミHic-5、メナおよびパキシリン（欠失を含む）は、PCRによってIMAGEクローンから増幅され、そしてpcDNA3-V5のEcoRV/NotＩ中にクローン化された。GST-Robo4ΔPIMおよび全長Robo4ΔPIMは、Quick Changeを使って関連した野生型の構築物の部位特異的変異誘発によって生成された。すべての構築物の完全性は、ユタ大学Core Facilityで配列決定によって確かめた。

胚培養およびゼブラフィッシュ保存株：ゼブラフィッシュ、Danio rerio（ダニオ・レリオ）は、標準的な方法によって維持した（Westerfield（ウェスターフィールド）, 2000）。発達段階（Developmental staging）は、28.5℃で生じる胚の標準的な形態学上の特長を用いて遂行した（Kimmel（キンメル）et al., 1995）。Tg（fli.EGFP）^y1トランスジェニックゼブラフィッシュ系は、この調査に用い、Lawson（ローソン）およびWeinstein（ウェインスタイン）, 2002に記述された。撮像された胚は、色素形成を防ぐために、24hpfの後、0.2mMの1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）で処置された。

robo4のアンチセンス欠乏：アンチセンスのモルフォリノオリゴヌクレオチド（MO）は、robo4のエクソン10/イントロン10のスプライス部位に指向し（5'-tttttagcgtacctatgagcagtt-3、配列番号28）、それぞれ、5ng/nlの濃度で、IX Danieau’s Buffer（ダニエウバッファー）において溶解した。注入の前に、モルフォリノは注射効率を監視するために、色素の無視できる小量を混ぜ合わせられ、5分間、短く冷やされ、65℃で加熱され、そしておよそ1nlを1-2の細胞期のストリーミングヨーク（流動卵黄）に注入した。

逆転写（RT）PCR：RNAを、注入してない20匹から、およびトリゾール、および試薬を使ってrobo4 MOを注入した20匹の胚から抽出し、その後、cDNAを、ランダムな六量体およびオリゴdTプライマーの双方の混合物によってプライムされたSuperscript IIIを使って実行した。robo4は、エクソン8（5'-caacaccagacacttacgagtgcc-3’）、配列番号29）での前方のプライマー、およびエクソン12（5'-ttcgaaggccagaattctcctggc-3’）、配列番号30）での逆行のプライマーとともに、以下のパラメータを使うことで、PCRによってcDNAから増幅し、すなわち、（4’のための94℃、30”のための94℃、30”のための58℃、45”のための68℃、1’のための68℃）である。PCR反応の線形範囲を確認するために、cDNAを23、25、27および30サイクル増幅し、β-アクチンを、cDNA入力について制御するために、すべての試料からの前方のプライマー（5'-cccaaggccaacagggaaaa、配列番号31）および逆行のプライマー（5'-ggtgcccatctcctgctcaa-3’、配列番号32）を用いて増幅した。

ホールマウントの間接的な免疫蛍光法：手短には、同齢の24および48hpfの胚は、デクロリオネートされ（dechorionated）、そして4℃で4%のPFA/4%のショ糖/PBSにおいて一昼夜固定した。胚を次いで、PBS/0.1%のTween（ツイーン）-20において洗浄し、無水メタノールに対して脱水し、PBS-Tween 20へ再水和させ、さらにPBS/1%のTriton（トリトン）-Xにおいて透過処理し、PBS/1%のTriton-X/2%のBSAですすぎ、室温でPBS/1%のTriton-X/2%のBSA/10%のシープ血清（Sheep Serum）/1%のDMSOでブロックし、それからIgG精製された抗GFP（1：400）、4℃で一昼夜ブロッキング溶液においてインキュベートした。以下の日数の胚を、活発にPBS/1%のTriton-X/2%のBSAにおいて洗浄し、次いでヤギ-抗-ラビットAlexa 488の接合した二次抗体（1：200）において4℃で一昼夜ブロッキング溶液にてインキュベートした。次の日数で、胚を広範囲にPBS/1%のTriton-X/2%のBSAで洗浄し、それからPBS中1%の低融点アガロースに埋め、そしてLeica（ライカ）共焦点顕微鏡上で写真を撮り、そしてAdobe Photoshop（アドビ・フォトショップ）ソフトウェアを使用して処理した。

細胞培養：HEK 293およびCOS-7細胞を、10%のFBSおよび1%のペニシリン/ストレプトマイシンで補われるDMEMにおいて培養した。ヒトの臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、10%のFBSで補われるEGM-2において培養した。HUVECを継代2および5の間で日常的に用いた。

形質移入（トランスフェクション）：HEK293およびCOS-7細胞を、製造者のプロトコルに従ってFugene6またはLipofectamine 2000でトランスフェクションした。

濃縮Slit2タンパク質の調製：COS-7細胞は、空のpSECTAG2またはpSECTAG2：：hSlit2で一過性にトランスフェクションした。48時間後に、細胞をPBSで二回洗浄し、そして6mlの塩抽出緩衝剤（10mM HEPES、pH7.5、1M NaClおよびIXプロテアーゼインヒビター）で15分間25℃でインキュベートした。塩抽出を繰り返し、そして試料を、細胞片がペレット化するように、10,000rpmで20分の間遠心分離した。上澄みをAmicon Ultra（アミコン・ウルトラ）-15コンセントレータカラム/100kDaのカットオフ上に負荷し、そして12mlの塩抽出がおよそ500μlに減るまで、遠心分離した。濃縮されたタンパク質調製物をクーマシーブルー染色によって分析し、そして最高で1週間4℃で保存した。このプロトコルを使って、20-50μg/mlのSlit2濃縮物を日常的に入手した。Slit2プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの濃縮されたタンパク質を調製することに加え、同じプロトコルを、空のベクター（pSECTAG2）でトランスフェクションされた細胞上で実行した。この結果として生じる調製物は、“モック”の調製物と称し、そしてそれがSlit2の影響を分析するすべての実験においてコントロールとして用いた。

走触性移動アッセイ：トランスフェクションされたHEK 293細胞を、TrypLE Expressとともに組織培養ディッシュから取り除き、0.1%のトリプシンインヒビター、DMEMまたはEBM-2での0.2%の脂肪酸フリーのBSAで1回、および0.2%のBSAが関連した媒体中にあるもので二回洗浄した。洗った細胞を計数し、そして0.3×10⁵細胞/mlで再懸濁した。1.5×10⁵を、5μg/mlのフィブロネクチンで下側表面をプレコートされた12μmのCostar トランスウェルの上側チャンバー中に負荷した。走触性上のSlit2の影響を、0.5μg/mlのSlit2またはモック調製物の等量での同時コーティングによって分析した。細胞移動は、6時間進行するのを許され、そしてその後、トランスウェルの上側表面上の細胞を、コットンスワブで除去した。下側表面上の細胞を、5分間4%のホルムアルデヒドで固定し、PBSを用いて3回洗浄した。HEK 293細胞のために、下側表面上のGFP陽性細胞（HEK 293）の数を、インバーター蛍光顕微鏡上で6つの10×視野を計数することによって数え上げた。フィブロンエクチン/モック-コート膜上の遊走された（migrated）細胞の数は、データプレゼンテーションおよび以降の統計分析のために100%考慮した。少なくとも2つの独立した実験を2通りに実行した。

イースト2ハイブリッドアッセイ：pGBKT7：：hRobo4 465-723を、イースト株PJ694A中に形質転換させ、PJ694A-Robo4を創作した。ヒト大動脈cDNAライブラリーを、プレイ（犠牲）プラスミドpACT2中にクローン化し、そして次いでPJ694A-Robo4中に形質転換された。同時形質転換イースト株は、形質転換効率を分析するために、SD-Leu-Trp（-LT）上に、推定上の相互作用性タンパク質を識別するために、SD-Leu-Trp-His-Ade（-LTHA）上に板状培養した。SD-LTHA上で育つ能力がある酵母株は、それからフィルターリフトアッセイによってβ-ガラクトシダーゼの発現用に試験した。犠牲プラスミドはSD-LTHA上で増殖し、β-ガラクトシダーゼを発現することができる酵母株から分離され、そしてユタ大学のコアファシリティで配列決定した。

免疫沈降：細胞溶解物を、50mMのトリス-Cl、pH7.4、50mMのNaCl、1mMのDTT、0.5%のTriton X-100、ホスファターゼおよびプロテアーゼインヒビターにおいて調製し、不溶性物質をペレット化するために、20分間14Kで遠心分離し、60分間正常なIgGをアガロースビーズに接合させたものを用いてきれいにし、そしてアガロースビーズに接合した関連した抗体をとともに、4℃で2時間インキュベートした。沈殿物を広範囲に、溶解緩衝剤において洗浄し、そして2×試料緩衝剤（125mMのトリス-Cl、pH6.8、4%のSDS、20%のグリセロール、0.04%のブロモフェノールブルーおよび1.4Mの2-メルカプトエタノール）において再懸濁させた。

GSTプルダウンアッセイ：pGEX-4Tlを抱えるRosetta2 E. coli：：mRobo4を、0.6のOD600にまで増殖させ、そして0.3mMのIPTGで誘発した。30℃、220rpmでの3-4時間後に、細胞を20mMトリス-ClのpH7.4、1%のTriton X-100、1μg/mlリゾチーム、1mMのDTTおよびプロテアーゼインヒビターにおいて超音波処理によって溶解した。GST-融合タンパク質はグルタチオンセファロース4B上で捕獲され、リゾチームを伴わない溶解緩衝剤で1回洗浄し、および次いで結合/洗浄緩衝剤（50mMトリス-Cl、pH7.4、150mMのNaCl、1mMのDTT、1%のTriton X-100、0.1%のBSAおよびプロテアーゼインヒビター）を用いて2回洗浄した。GST-融合タンパク質は、4℃で一昼夜60nMの精製された組換え型パキシリンとともにインキュベートし、広範囲に結合/洗浄緩衝剤において洗浄し、そして2×試料緩衝剤において再懸濁した。

ウェスタンブロット法：免疫沈降およびGST-融合タンパク質を、100℃で2分間インキュベートし、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離し、ポリビニルジフルオライド（PVDF）膜に移した。PVDF膜は、25℃で60分、PBS中に5%の脱脂粉乳を有する+ 0.1%のTween20（PBST）（PBST-M）を用いてインキュベートした。ブロックされた膜は、一次抗体とともに（抗Flag M2の1：2000；抗HAの1：10,000；抗Hic-5の1:500；抗パキシリンの1：10,000；抗Racの1：1,000および抗Cdc42の1：500）、PBST-Mにおいて、60分間、25℃で、または一昼夜4℃でインキュベートした。膜は3×10分、PBSTで洗浄し、次いで二次抗体とともに（ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ラビット西洋ワサビペルオキシダーゼで、1：10,000）、60分間、25℃でインキュベートした。膜は3×10分、PBSTにおいて洗浄し、そしてECL PLUSで視覚化した。

試験管内での転写/翻訳：メナ-V5は、製造者のプロトコルに従ってT7クイックカップルド（Quick Coupled）インビトロ転写/翻訳システムを用いて合成された。

拡散アッセイ：トランスフェクションされたHEK 293細胞を、5μg/mlのフィブロネクチンでコートされるカバーグラス上へ板状培養した。5%のCO₂および37℃の30分のインキュベーションの後、細胞を氷冷のPBSで3回洗浄し、室温で10分間3.7%のホルムアルデヒドで固定した。細胞を、それから3分間0.2%のトリトンX-100で透過性にし（peremabilized）、PBS+0.1%のTween20（PBST）で3回洗浄し、そして室温で1時間10μg/mlのローダミン-ファロイジンでインキュベーションした。PBS-Tでの3回の洗浄の後、カバーグラスをプロ-ロング・ゴールドに装着し、そして共焦点顕微鏡法によって分析された。3つの独立した実験において150の細胞の総面積は、イメージJを使って測定した。

パキシリンのsiRNA媒介ノックダウン：HEK 293細胞を、100nMのsiRNA二本鎖、（5'-CCCUGACGAAAGAGAAGCCUAUU-3’、配列番号33および5'-UAGGCUUCUCUUUCGUCAGGGUU-3’、配列番号34）を用い、リポフェクタミン（LipofectAMINE）2000を使って、製造者の指示に従い、トランスフェクションした。トランスフェクションの48h後、細胞を生化学的分析または細胞拡散アッセイのために加工した。パキシリンの再構成はチキンのパキシリンをコード化する発現ベクターでのトランスフェクションによって達成し、それはヌクレオチド配列5'-CCCCTACAAAAGAAAAACCAA-3’（配列番号35）をsiRNAの標的部位内に持つ。ノックダウンおよび再構成は、パキシリン抗体でウェスタンブロッティングによって視覚化され、デンシトメトリーによって定量化した。

RacおよびCdc42活性化アッセイ：トランスフェクションされたHEK 293細胞を、細胞培養ディッシュから剥離し、DMEM+0.2%のBSAにおいて1時間の懸濁において保ち、そして5分間5μg/mlのフィブロネクチンでコートされた細菌のペトリディッシュ上へ板状培養した。細胞をそれから、氷冷のPBSで2回洗浄し、そして50mMのトリスpH7.0、500mMのNaCl、1mMのMgCl2、1mMのEGTA、1mMのDTT、0.5%のNP-40、1Xプロテアーゼインヒビター、1Xホスファターゼインヒビターおよび20μg/mlのGST-PBDにおいて溶解した。溶解物を、14,000rpmで5分間遠心分離し、そして上澄みを4℃30分間グルタチオンアガロースの30μlとともにインキュベーションした。次いで3回の溶解緩衝剤で洗浄し、結合したタンパク質を2×試料緩衝剤で抽出した。RacおよびCdc42は、各々のタンパク質に特異的抗体でのウェスタンブロッティングによって検出した。Rac活性化レベルを合計のRacに対し正常化し、そして各々の実験において最も高い値を1の値を割り当てた。

Robo4 ^AP/APマウスおよび遺伝子型同定：Robo4ターゲティングベクターを、胚性幹（ES）細胞に電気穿孔した。標的とされた対立遺伝子のためのヘテロ接合性のES細胞は、胚盤胞に注入され、そしてそれから偽妊娠の雌性に移された。キメラの雄性はアグーチカラーの存在によって識別され、そしてそれからES細胞誘導子孫を生産するために、C57BL/6雌性に交配された。遺伝子型は、テイルDNAのサザンブロット分析によって確かめられた。耳パンチまたは尾部の試料からのゲノムDNAを、以下の条件の下でPCR遺伝子型同定のために使われ、30秒間の94℃の変性、30秒間の60℃のアニーリング、および60秒の40サイクル間の72℃の伸張である。以下の2つのプライマーが、Robo4の遺伝子型同定のために使われ、すなわち、5’cccttcacagacagactctcgtatttcc3’（前方）および5'cccagacctacattaccttttgccg3’（逆行）、およびAPのための、すなわち5'ggcaacttccagaccattggcttg3’（前方）および5’ggttaccactcccactgacttccctg3’（逆行）である。

胚および発現分析：胚の病期診断、インサイツ（原位置）ハイブリダイゼーション、パラフィン切片化（paraffin sectioning）および全載PECAM-1免疫組織化学を、以前に記載¹のように、実行した。ノーザンブロット分析のために、合計のRNAの20μgを、TRIZOL（トリゾール）を用いて分離した後、レーンにつき負荷した。³²Pのラベル化したプローブを、プライムIt II Random-Primer（ランダム-プライマー）ラベリング（標識化）キット（Stratagene（ストラタジーン））を使用して生成させた。肺溶解物を、溶解緩衝剤［1%のNP-40、150mMのNaCl、50mMのトリス-Cl（pH7.5）、1mMのEDTAおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche（ロシュ））］で調製した。肺溶解物からのRobo4タンパク質を、前述のとおり、多クローン性抗Robo4抗体を使うウェスタンブロット分析によって検出した。

アルカリホスファターゼ（AP）染色：胚または組織を、4%のパラホルムアルデヒドおよび2mMのMgCl₂のPBS中、一昼夜4℃で振盪しながら固定した。試料を、15分間3回、PBST（PBS、0.5%のTween 20）で洗浄した。内在性アルカリホスファターゼを、2mMのMgCl₂を有するPBSにおいて90分間65℃で不活性化し、それからAP緩衝剤（100mMトリス-Cl、pH9.5、100mM NaCl、50mMのMgCl₂、0.1%のTween 20、2mMのレバミソール）で、15分間2回洗浄した。染色は、胚のため（Boehringer Mannheim）BMパープルサブストレート（基材）（Boehringer Mannheim（ベーリンガーマンハイム））または成体の組織のためにNBT/BCIPにおいてのために実行した。5mMのEDTAで、染色をPBSにおいて止めた。

AP染色の後の全載免疫組織化学：固定され、および解剖した網膜のアルカリホスファターゼ（AP）染色は、上述のように実行した。染色は、PBS-5mMのEDTAにおいて止めた。網膜は2回PBSで洗浄し、5分、4%のパラホルムアルデヒド、リン酸塩緩衝化塩類溶液においてRTでポスト（後）固定し、そして2回PBSにおいて洗浄した。PBlec（PBS、pH6.8、1%トリトン-X100、0.1mMのCaCl、0.1mMのMgCl、0.1mMのMnCl）において2hの時間のインキュベーションの後、網膜を一昼夜、４℃で抗体とともにインキュベーションした。周皮細胞（ペリサイト）に、ラビット抗NG2抗体を使ってラベルをつけ（1：200；Chemicon（ケミコン））、そして内皮細胞をラット抗エンドムシン（endomucin）を使ってラベルをつけた（クローンV.7C7はDietmar Vestweber（ディートマー・ベストウェバー）によって快く提供された; 1 :20希釈）。PBS-T（PBS、pH7.4、1%トリトン-X100）で3回洗浄した後、試料を適切な蛍光色素を接合させた二次抗体とともに-アレクサ（Alexa）フルーア（Fluor）488または568（Molecular Probes（モレキュラー・プローブ）; Invitrogen（インビトロゲン））のPBSでインキュベーションした。洗浄および4%のPFAでの短いポスト固定（postfixation）の後、網膜をフラットマウントし、そしてMowiol（モウイオル）/DABCO（Sigma-Aldrich（シグマ-オールドリッチ））を用いカバーガラス上に置いた（coversliped）。試料は、Zeiss（ツァイス）Axiocam（アキシオカム）HRcデジタルカメラを備えるZeiss Stereomicroscope Stemi（ステレオミクロスコープ・ステミ）SV 11 Bioquad（バイオクアド）を用いる観衆的な光学式および蛍光顕微鏡により、そしてZeiss LSM Meta（メタ）510を用いる共焦点レーザー走査顕微鏡によって分析した。AP染色は、633nmのHeNeレーザーおよび反射セッティングを使って視覚化した。デジタル画像をボロシティー（Volocity）（4.0 Improvision（インプロビジョン））を用いて処理し、そしてAdobe Photoshop（アドビ・フォトショップ）CS2において編集した。

免疫組織化学：以前に記載³のように、全載トリプル免疫蛍光共焦点顕微鏡法を実行した。手短には、PECAM、NP1、CX40、2H3、BFABPおよびαSMAに対する抗体を、Robo4 ^+/+またはRobo4-/-の胚の肢の皮膚にE 15.5にてラベルをつけるために用いた。

組換え型Slit断片のための発現ベクターの構築物：提案した発現ベクターを、図23において描く。すべての断片をコード化するDNAを、pSECTAG2ベクター（Invitrogen（インビトロゲン））中にクローン化され、および以下の特長を共有し、すなわち、CMVプロモーター、Kozak（コザック）共通配列、myc/hisタグインフレーム融合およびウシ増殖ホルモンポリA配列である。Fc融合は、myc/hisエピトープを、ヒトのIgG1のFcドメインの組換え型形態と入れ替えることによって生成させ、そこでは、補足物（complement）活性化およびエフェクター細胞（効果器細胞）の相互作用ドメインはIgG4およびIgG2の配列とそれぞれ入れ替えられた（Katoh（カトウ）et al., 2005; Armour（アーマー）et al., 1999）。組換え型Slit断片およびSlit断片-Fc融合タンパク質を、一過性にトランスフェクションされた細胞から分離した。望ましい構築物を、ゼオシン（Zeocin）抵抗性のための選定によってCHO細胞中に安定的にトランスフェクションした。

Robo4発現HEK細胞上のRobo4アアゴニスト（作用薬）の結合および活性：Robo4-HA（Robo4-HEK）またはpcDNA3ベクター（コントロールHEK）だけを発現する安定した細胞系を、100μg/mlのポリL-リジンでプレコートされた6ウェルの培養ディッシュにおいて播種した。細胞を、HEK CMまたはSlit-myc CM、37℃でインキュベーションした。 1時間条件培地とともにインキュベーションした後、PBSにおいて3回の洗浄が続き、細胞を20分間4%のパラホルムアルデヒドにおいて固定した。細胞を、次いでPBSで3回洗浄し、そしてマウス抗myc抗体（Santa Cruz Biotech（サンタクルス・バイオテク））および抗マウスアレクサ（Alexa）594接合二次抗体（Molecular Probes）とともにインキュベーションとした。それらの作用薬の能力は、移動を抑制するためにRobo4と結合し、それはPark（パーク）KW, Morrison（モリソン）CM, Sorensen（ソレンセン）LK, et al., "Robo4 is a vascular-specific receptor that inhibits endothelial migration（Robo4は内皮の移動を抑制する脈管特異受容体である）," Dev Biol 2003;261(l):251-67に従って実行された。

ネズミ肺内皮細胞の分離：ネズミ内皮細胞の分離は、以前記載⁴した。ヒツジ抗ラットIgGのDynal（ダイナル）ビーズ（Dynal Biotech（ダイナル・バイオテク））は、ビーズの100μLにつき、抗体の5μgで、抗-PECAM-1または抗-ICAM-2のモノクローナル抗体（BD Pharmingen（ファルミンゲン））のいずれかと接合された。ビーズは、プレコートされ、2週間まで、4℃で保存された（0.1%のBSAを有するPBSの4×10⁸ビーズ/mL）。3匹の成体マウスからの肺を収集した。肺葉は、可視的な気管支および縦隔結合組織から解剖された。肺は赤血球を除去するために50mL冷えた分離培地（20%のFBS-DMEM）において洗浄し、はさみで細かく切り刻み、そして穏やかな動揺とともに45分間37℃で25mLの予め暖められた（pre-warmed）コラゲナーゼ（2mg/mL、Worthington（ワージントン））において消化した。消化された組織を、14ゲージ金属カニューレに付着させた60ccのシリンジ（注射筒）を通して12時間粉砕すること（triturating）によって解離させ、そしてそれから無菌の70μm使い捨ての細胞ストレーナー（Falcon（ファルコン））を介してろ過した。懸濁物を4℃で10分間400×gで遠心分離した。細胞ペレットを2mlの冷えたPBSで再懸濁し、そしてそれから、10分間室温でPECAMIコートしたビーズとともにインキュベーションした（15μL/mL細胞）。磁気セパレーターを、ビーズに結合した細胞を回収するのに用い、それを分離培地において洗い、そしてそれから、完全培地（EGM-2 MV、Lonza（ロンザ））において再懸濁した。細胞を単一のフィブロネクチンコートした75-cm²の組織培養フラスコにおいて板状培養し、そして非接着性細胞を一昼夜でのインキュベーションの後、除去した。接着細胞を、PBSで洗い、そして15mlの完全培地を加えた。培養細胞に、完全培地を交互の日に供給した。培養物が70〜80%の集密度に達したとき、それらをトリプシン-EDTAで分離し、2mlのPBSにおいて再懸濁させ、そしてICAM-2（アイカム2、細胞接着分子）接合ビーズを用い（15μL/mL細胞）、第2の時間について分類した。細胞を、上記のように洗い、板状培養した。継代2〜5を、機能的なアッセイのために使った。

細胞培養：ヒト真皮微小血管内皮細胞（HMVEC、Cambrex）を、EGM-2 MVにおいて増殖させ、および継代3および6の間で使った。

免疫細胞化学：8つのウェルのチャンバースライド（Lab-Tek（ラブ-テク））を、細胞の板状培養に先立ち、2時間 1.5μg/cm²のフィブロネクチンでコートした。ネズミ肺内皮細胞を、完全培地、EGM-2MVにおいて、37℃で一昼夜板状培養した（100,000の細胞/ウェル）。細胞を次いで、3回PBSにおいて洗浄し、そして室温で10分間4%のパラホルムアルデヒドで固定した。さらに3回PBSにおいて洗ったあと、細胞を室温で15分間PBSにおける1%のトリトンX-100で洗い、次いでPBST（PBSにおいて0.1%のトリトンX-100）で3回の洗浄が続いた。細胞を、それから室温で20分間PBSにおいて2%のBSAでブロックし、そして2%のBSAにおいて一次抗体：ラット抗-PEC AMI（Pharmigen（ファルミゲン））、ウサギ抗-Von Willebrand Factor（フォン・ウィルブランド・ファクター）（vWF）（DAKO（ダコー））とともに室温で1時間インキュベーションした。一次抗体でのインキュベーションの後、細胞をPBSTで洗い、そして2%のBSAにおいて二次抗体：Alexa Fluor（フルーア）488ロバ抗ラットIgGおよびAlexa Fluor 594ロバ抗ウサギIgG（Molecular Probe）とともに室温で1時間インキュベーションした。細胞を１回PBSTで、1回PBSで洗い、Vectashield mounting media（ベクタシールド・マウンティング・メディア）（Vector Laboratories（ベクター・ラボラトリーズ））においてマウントし、そして共焦点顕微鏡法によって写真を撮影した。

蛍光活性化細胞ソート（FACS）：ネズミ肺内皮細胞を、培養ディッシュから、37℃で、短いトリプシン処理（2分以下）によって剥離した。タンパク質分解を、EBM-2+0.1%のBSAにおいて、トリプシンインヒビターの添加によって抑止した。細胞を2回FACS緩衝剤（Ca2+およびMg2+を伴わない+0.1%BSAのPBS）で洗い、そしてそれから1mLのFACS緩衝剤で再懸濁した。細胞表面マーカーの発現の分析を、ツーステップ免疫蛍光染色で実行した。細胞を、精製したモノクローナル抗体：ラット抗PECAM-1、ウサギ抗vWFとともに4℃で30分間インキュベーションした。細胞を、それから2回FACS緩衝剤で洗い、1mLのFACS緩衝剤において再懸濁した。細胞を、それから蛍光二次抗体：Alexa Fluor488ロバ抗ラットIgGおよびAlexa Fluor 594ロバ抗ウサギIgG（Molecular Probe）とともに4℃で30分間インキュベーションした。細胞を、再び2回洗い、1mLのFACS緩衝剤において再懸濁し、そしてFACSで分析した。

細胞移動アッセイ：細胞を1時間、CellTracker Green CMFDA（セルトラッカー・グリーンCMFDA）（Molecular Probe）でラベルを付け、洗浄し、そしてそれから、0.1%のBSAで補われたEBM-2において、一昼夜飢餓させた。細胞を、トリプシン処理し、洗い、300,000細胞/mLまで再懸濁した。細胞懸濁物の100μL（30,000の細胞）を、予め5μg/mLのヒトフィブロネクチンで双方の側をコートされた8μm HTS FluoroBlock（フルオロブロック）フィルタ（BD Falcon）上に負荷した。試験因子を、EBM2/0.1%のBSAにおいて希釈し、そして下側チャンバーに置いた。3時間の37℃でのインキュベーションの後、各々のウェルからの2つの5×視野を、倒立蛍光顕微鏡（Axiovert（アキシオバート）200）上で、写真を撮った。移動した細胞の数を、蛍光細胞を計数することによって数え上げた。Robo4^+/+細胞の基礎の移動は1に設定した。データを、三組の3つの独立した実験の平均±S. E.として提示する。

チューブ形成アッセイ：以前に記載⁵のように、チューブ形成を実行した。手短には、Robo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスから分離される肺内皮細胞を、48ウェルディッシュのマトリゲルコートしたウェルの上へ板状培養し、そして0.5%の血清において一昼夜飢餓させた。細胞を、それから3.5時間、Slit2の不存在または存在下に0.48nMのVEGF-Aで刺激し、そしてそれから、写真を撮った。平均チューブ長を、イメージJソフトウェアを使用して測定した。データは、二つ組の3つの独立した実験の平均±S.E.として提示する。

試験管内の透過性アッセイ：Robo4^+/+およびRobo4^AP/APマウスから分離される肺内皮細胞（ECs）を、1.5μg/cm²のヒトフィブロネクチンでプレコートした3.0μm Costar transwells上に板状培養し、そして集密度に増殖させた。細胞を一昼夜飢餓させ、30-60分間0.3nMのSlit2で予め処理し、そしてそれから3.5時間2.4nMのVEGF-Aで刺激した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を、100μg/mlの最終濃度で一番上のチャンバーに加え、そして30分後に、培地を下側チャンバーから除去した。アリコート（分割量）を0.5mMのグアヤコール、50mMのNa₂HPO₄と0.6mMのH₂O₂とともにインキュベーションし、そしてO-フェニレンジアミンの形成を、470nmでの吸光度の測定によって定めた。モノレイヤーの基礎の透過性は、100%で設定した。データは、三つ組の3つの独立した実験の平均±S.E.として提示する。

VEGFは網膜透過性を誘発した：網膜透過性は、in⁵³に記述されたように評定した。手短には、8-10週齢のマウスを、アバーティン（Avertin）で麻酔した（2-2-2トリブロムエタノイール、0.4mg/g;Acros Organics（アクロス・オルガニクス）、Morris Plains（モリスプレーンズ）、NJ（米国ニュージャージー州））。マウスに、50ngのSlit2N（配列番号39）を有する1.4uLの35.7ug/mLのVEGF-A（R&D Systems（R&Dシステムズ）Inc. Minneapolis（ミネアポリス）、MN（ミネソタ州））の眼内注入を与えた。モック調製物の等量による注射は、反対側の目で与えられた。指示するように、1.4uLの塩類溶液、モックの調製物、またはslitを投与した。6時間後、マウスに、60mg/mL 50uLのEvans Blue（エバンスブルー）の尾部静脈を介してのLV.注射を与えた。2時間後、マウスを犠牲にし、そして静脈内エバンスブルーを除去するために、クエン酸塩-緩衝化パラホルムアルデヒドをかん流させた。眼を摘出し、そして網膜を解剖した。エバンスブルー色素を、70℃で、18時間0.3mLのホルムアミドにおいて溶出した。抽出物を2時間、5kDフィルターを通して超遠心分離機にかけた。吸光度を、620nmで測定した。バックグラウンド吸光度を740nmで測定し、そして外へ引いた。

Robo4のアデノウイルス発現：Robo4を、以前に記述のとおり、アデノウイルスを介して発現した。

マイルアッセイ：エバンスブルーを、6-8週齢のマウスの尾部静脈中に注射し、そして30分後に、塩類溶液、またはVEGF-Aの10ngを、100ngのSlit2の不存在および存在において真皮中に注射した。さらに30分後に、パンチ生検をプリフォーム（予め形成）し、そしてエバンスブルーを60℃で18時間ホルムアミドにおいて真皮組織から溶出させた。遠心分離に次いで、吸光度を620nmで測定した。塩類溶液を注射された動物で観察される真皮透過性の量を1で設定した。データを、二つ組で各々の処置を有する5匹の個々のマウスの平均±S. E.として提示する（動物につき6つの合計の注射）。

網膜透過性：網膜透過性を、以前記述のとおり評定した。手短には、8-10週齢のマウスを、アベルチンで麻酔した（2-2-2トリブロモエタノール、0.4mg/g;Acros Organics、モリスプレーンズ、NJ）。マウスに、50ngのSlit2を有する1.4μLの35.7μg/mLのVEGF-A（R&D Systems Inc. ミネアポリス、MN）の眼内注入を与えた。等量のモックを、反対側の眼に注入した。指示するように、他の条件を管理した。6時間後、50μLの60mg/mLのエバンスブルー溶液を、大腿動脈を介して投与した。2時間後、マウスを犠牲にし、そして静脈内エバンスブルーを除去するために、クエン酸塩緩衝化ホルムアルデヒドをかん流した。眼を摘出し、そして網膜を解剖した。エバンスブルー色素を、70℃で18時間0.4mLのホルムアミドにおいて溶出した。抽出物を、2時間、5kDフィルターによって超遠心分離機にかけた。吸光度を620nmで測定した。バックグラウンド吸光度を740nmで測定し、そして外へ引いた。データを遺伝子型につき、5匹の個々のマウスの平均±S. E.として提示する。

生化学的アッセイ：HMVECを、フィブロネクチンコートされたディッシュ上に集密度にまで増殖させ、そしてEBM-2+0.2%のBSAにおいて一昼夜飢餓させた。その翌日、細胞を5分間50ng/mLのVEGF-Aで刺激し、そして氷冷のPBSで2回洗い、50mMのトリスpH7.4、150mMのNaCl、10mMのMgCl₂、1mMのDTT、10%のグリセロール、1%のNP-40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、1Xプロテアーゼインヒビター、1Xホスファターゼインヒビターでにおいて溶解した。溶解物を2X試料緩衝剤と組み合わせ、SDS-PAGEによって分け、そしてホスホVEGFR2、ホスホ-p42/44およびホスホSrc（Cell Signaling（セル・シグナリング））に対する抗体で1：1000で精査した（probed with）。Rac活性化アッセイのため、粗製の膜プレップ（preps）を生成し⁹、そしてGTP-Racを20μg/mlのGST-PBDにより沈殿させた。溶解緩衝剤による3回の洗浄後、結合したタンパク質を、2X試料緩衝剤で溶出させた。Rac1を、モノクローナル抗体（BD Biosciences）でのウェスタンブロッティングによって検出した。

酸素は網膜症を誘発した：手短には、P7パップを育てる母体（nursing mother）と一緒に、75%の酸素において置き、それをプロ-OX酸素コントローラ（BioSpherix（バイオスフェリックス）、Redfield（レッドフィールド）、NY）によって維持した。パップはP12上で取り出され、そしてSlit2N（配列番号39）作動薬またはモック調製物の眼内注射を与えられ、それはコントロール条件として役立つ。マウスを、P17上で犠牲にし、そして1mlの50mg/mlのFITC-デキストラン（Sigma、セントルイス、MO）を用いて左室を介してかん流させた。眼を摘出し、4%のパラホルムアルデヒド中に30分間固定し、そして網膜フィアトマウント（fiatmounts）が生成した。画像を、Axiovert（アキシオベルト）200蛍光顕微鏡法（Carl Zeiss（カール・ツァィス）、Thornwood（トルンウッド）、NY）を使用して撮影した。新血管新生はAxioVision（アキシオビジョン）ソフトウェアを使用して定量化し、それはエリアにつき脈管新生の量を算出する（Carl Zeiss、Thornwood、NY）。データを、遺伝子型につき5匹の個々のマウスの平均±S. E.として提示する。

レーザーは脈絡叢新血管真性を誘発した：2-3月齢のマウスを、アベルチンで麻酔した（2-2-2トリブロモエタノール、0.4mg/g;Acros Organics、モリスプレーンズ、NJ）、そしてピューピル（ひとみ）を、1%のトロピカミド（Alcon（アルコン）、Fort Worth（フォートワース）、TX）により広げた。Slitランプ配送システムを有するIridex OcuLight（イリデックス・オクライト）GL532nmのレーザー光凝固装置（Iridex、Mountain View（マウンテンビュー）、CA）を、以下のパラメータを有する3、6、および9時での視神経円板から3つのバーンズ（火傷）3ディスク直径を創作するために用い、すなわち、150mW出力、75umスポットサイズ、および0.1秒の期間である。ブルッフの膜のレーザーを指示する断裂の時点での泡の生産は、CNVを得ることにおいて重要な因子であり、したがって、泡が生産されるバーンズだけがこの調査において含まれた。レーザー処置の直後および3日後、マウスに、50ngのSlit2N（配列番号39）の硝子体内注射を与えた。モックの調製物の等しい量を、他の眼において硝子体内注射によって与えた。レーザー処置の1週間後、マウスを犠牲にし、そして脈絡叢のフラットマウントが生成する。ビオチンはイソレクチン（Sigma、セントルイス、MO）を接合し、そして、ストレプトアビジンが接合されたTexas red（テキサス・レッド）（Sigma、セントルイス、MO）は、CNVを染色するために用いた。フラットマウントを、Zeiss LSM 510の共焦点顕微鏡を用いて（Zeiss、Thornwood、NY）試験し、そしてCNVがImageJソフトウェア（NIH、Bethesda（ベセズダ）、MD）を使用して定量化された。

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Claims

組織における脈管透過性を抑制する方法であって、組織に対してアクソン、血管、またはその組合せのリパルシブガイダンスキューを施すことを具える、方法。
リパルシブガイダンスキューは、ラウンドアバウト受容体またはUnc（アンク）5受容体のリガンドである、請求項1の方法。
リパルシブガイダンスキューはラウンドアバウト-4（Robo（ロボ）4）受容体のリガンドである、請求項2の方法。
リパルシブガイダンスキューは、slit（スリット）2またはRobo4と結合するその断片である、請求項3の方法。
リパルシブガイダンスキューはUnc5b受容体のリガンドである、請求項2の方法。
リパルシブガイダンスキューはnetrin（ネトリン）-1またはUnc5b受容体と結合するその断片である、請求項5の方法。
脈管透過性を抑制する薬剤のための選別または評価の方法であって、Git（ギット）1のRobo4媒介活性化に影響をおよぼす前記薬剤の能力を定めることを具える、方法。
Git 1のRobo 4媒介活性化は、次の工程、すなわち
(a) Robo 4を発現する第1細胞を、候補薬剤と接触させる工程、
(b)第1細胞と基本的に同じであるがRobo 4を実質欠く第2細胞を、候補薬剤と接触させる工程、
(c)第一および第二の細胞において、Git1活性化についてアッセイする工程
を具え、
(d)第1細胞において第2細胞に比べて検出可能な程度により一層高いGit1活性化は前記薬剤によるRobo4媒介Git1活性化を指し示す、方法。
Git1活性化はARF（アルフ）6不活化を検出することによってアッセイされる、請求項8の方法。
ARF6不活化はRac（ラック）不活化を検出することによってアッセイされる、請求項9の方法。
脈管透過性を抑制する薬剤のための選別または評価の方法であって、前記薬剤の、ARF6、Rac、Pak（パック）、Mek（メック）、またはErk（エルク）を抑制する能力を定める工程を具える、方法。
ARF6、Rac、Pak、Mek、またはErkのRobo4媒介抑制は、次の工程、すなわち
(a)Robo4を発現する第1細胞を候補薬剤と接触させる工程、
(b)第1細胞と基本的に同じであるがRobo4を実質欠く第2細胞を、候補薬剤と接触させる工程、
(c)第1および第2の細胞において、ARF6、Rac、Pak、Mek、Erk、またはその組合せの抑制についてアッセイする工程
を具え、
(d)第1細胞において第2細胞に比べて検出可能な程度により一層低いARF6、Rac、Pak、Mek、またはErkの活性化は前記薬剤によるRobo4媒介のARF6、Rac、Pak、Mek、またはErkの抑制を指し示す、請求項１１の方法。
方法は、VEGF、TNF、トロンビン、またはヒスタミンの実質不存在下に実行される、請求項7または11の方法。
アッセイは、VEGF、TNF、トロンビン、またはヒスタミンの生物学的に活性な量の存在下に実行される、請求項7または11の方法。
呼吸促迫症候群（RDS）を対象体において処置または防止する方法であって、次の、すなわち
(a)前記RDSを持つか、またはそれを持つ危険性のある対象体を識別する工程、および
(b)対象体の肺に対し、ニューロン受容体および内皮細胞と結合するリパルシブガイダンスキューを施す工程
を具える、方法。
未熟児網膜症（ROP）を対象体において処置または防止する方法であって、
(a)前記ROPを持つか、またはそれを持つ危険のある対象体を識別する工程、および
(b)対象体の網膜に対し、ニューロン受容体および内皮細胞と結合するリパルシブガイダンスキューを施す工程
を具える、方法。
糖尿病性網膜症を対象体において処置または防止する方法であって、
(a)前記糖尿病性網膜症を持つか、またはそれを持つ危険のある対象体を識別する工程、および
(b)対象体の網膜に対し、ニューロン受容体および内皮細胞と結合するリパルシブガイダンスキューを施す工程
を具える、方法。
ウェット（湿性）黄斑変性症を対象体において処置または防止する方法であって、
(a)前記ウェット黄斑変性症を持つか、またはそれを持つ危険のある対象体を識別する工程、および
(b)対象体の網膜に対し、ニューロン受容体および内皮細胞と結合するリパルシブガイダンスキューを施す工程
を具える、方法。
対象体を、リパルシブキューまたは擬似物で対象体において処置するための方法であって、
(a)VEGFブロッカー、TNFブロッカー、ヒスタミンブロッカー、またはトロンビンブロッカーでの処置のための指示を持つ対象体を識別する工程、および
(b)対象体に対し、ニューロン受容体および内皮細胞と結合するリパルシブガイダンスキューを施す工程
を具える、方法。
リパルシブガイダンスキューは、ラウンドアバウト受容体、Unc5受容体、DCC（ネトリン受容体）受容体、ネオゲニン受容体、DSCAM受容体、またはICAM-2（アイカム2）受容体のリガンドである、請求項15、16、17、18、または19の方法。
リガンドがSlit2である、請求項20の方法。
分離されたポリペプチドであって、ラウンドアバウト４（Robo４）のパキシリン結合性配列を備え、ポリペプチドは全長Robo4を備えない、ポリペプチド。
パキシリン結合性配列は、配列番号27または長さで少なくとも10個の残基のその断片からなる、請求項22の分離されたポリペプチド。
10から400個までのアミノ酸の分離されたポリペプチドであって、配列番号27または長さで少なくとも10個の残基のその断片を備える、ポリペプチド。
10から400個までのアミノ酸の分離されたポリペプチドであって、配列番号27と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列または長さで少なくとも10個の残基のその断片を備える、ポリペプチド。
分離されたポリペプチドであって、ラウンドアバウト4（Robo4）のパキシリン結合性配列（PBS）を備え、ポリペプチドは次の式、すなわち
Ｒ^１−ＰＢＳ−Ｒ^２
式中、R¹およびR²は、無関係に、H、アシル、NH₂、アミノ酸またはペプチドであり、ポリペプチドは全長Robo4を備えない、ポリペプチド。
PBSは、配列番号27と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列または長さで少なくとも10個の残基のその断片からなる、請求項26の分離されたポリペプチド。
分離されたポリペプチドであって、配列番号27と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ配列または長さで少なくとも10個の残基のその断片から基本的に構成される、ポリペプチド。
分離された核酸であって、請求項22、24、26、または28のポリペプチドをコード化する、核酸。
ポリペプチドをコード化する分離された核酸であって、ポリペプチドはラウンドアバウト4（Robo4）のパキシリン結合性配列を備え、ポリペプチドは全長Robo4を備えない、核酸
分離された核酸であって、配列番号2または長さで少なくとも30個の残基のその断片からなり、核酸は全長ラウンドアバウト4（Robo4）をコード化しない、核酸。
ベクターであって、請求項29、30、または31の分離された核酸を備えるベクター。
血管形成を組織において促す方法であって、組織の内皮細胞中に、請求項22、24、26、または28のポリペプチドを備える組成物を配送する工程を具える、方法。
血管形成を組織において促す方法であって、組織の内皮細胞中に、請求項29、30、または31の核酸を備える組成物を配送する工程を具える、方法。
血管形成を組織において促す方法であって、組織に対し、請求項32のベクターを備える組成物を施す工程を具え、ベクターは内皮細胞を形質導入する、方法。