WO2006137190A1

WO2006137190A1 - 光機能性核酸及びその製造方法、並びにメチル化判定方法

Info

Publication number: WO2006137190A1
Application number: PCT/JP2006/302332
Authority: WO
Inventors: Sei-Ichi Nishimoto; Kazuhito Tanabe; Hisatsugu Yamada
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2006-12-28
Also published as: JPWO2006137190A1

Abstract

　グアニン連続配列が存在するＤＮＡ鎖についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を提供する。本発明の一実施形態に係る光機能性核酸は、メチル化状態の判定対象となるシトシン領域を含むｐ５３遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの１塩基がナフトキノン化合物によって置換されたものとなっている。ここで、ナフトキノン化合物は、光機能性核酸とｐ５３遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとがハイブリダイゼーションした際に、判定対象のシトシンと対向する位置に設けられている。この光機能性核酸をｐ５３遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、さらに光照射することによって、ナフトキノン化合物と対向するシトシンがメチル化されている場合にのみＤＮＡを切断する。よって、ＤＮＡの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析すれば、ＤＮＡに含まれるシトシンがメチル化されているかどうかを判定することができる。

Description

明細書

光機能性核酸及びその製造方法、並びにメチル化判定方法

技術分野

[0001] 本発明は、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含有する光機能性核酸及びその製造方法、並びに、 DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕の状態を判定するメチルイ匕判定方法に関するものである。

背景技術

[0002] 遺伝子中のシトシンのメチル化は DNAとタンパク質との相互作用を変化させ、遺伝子発現を制御していることが知られている。このため、遺伝子中の 5—メチルシトシン（以下、 ^mcともいう）部位を検出することは遺伝子解析を行う上で非常に重要であり、現在までに様々な検出法が開発されてきた。

[0003] 既存のメチルシトシン塩基の検出システムとしては、 Maxam—Gilbert化学修飾法、重亜硫酸ナトリウム処理を伴う Methylation Specific PCR(MSP)法、 PNA— DNA複合体と酵素処理を用いる方法などがこれまでに報告されている（文献 1〜4)

[0004] Maxam—Gilbert化学修飾法では、 DNAをヒドラジンで処理することにより、 DNA のシトシン塩基に選択的に損傷を与える。このとき、メチルイ匕されていないシトシンはヒドラジン処理によって切断され、一方、メチルイ匕されたシトシン (メチルシトシン）はヒドラジン処理によって切断されない。よって、ヒドラジン処理をした DNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)で解析すると、シトシンのメチルイ匕 Z非メチルイ匕を、切断によって生じるバンドの有無によって検出することができる。

[0005] しかしながら、この Maxam—Gilbert化学修飾法の場合、メチルシトシンの存在は

、 PAGE上での切断バンドの欠損として検出される。このため、メチル化が部分的にでも非特異的に切断されるとバックグラウンドの切断バンドが表れてしま、、メチルシトシンの存在を判定できなくなるという問題が度々生じてしまう。

[0006] また、 MSP法は、重亜硫酸ナトリウムに対するメチルシトシンと非メチルシトシンとの反応性の違いを利用したものである。この方法では、 DN Aを重亜硫酸ナトリウムで処理する。その結果、 DNA中の非メチルシトシンは脱ァミノ化されゥラシルへと変換されるが、メチルシトシンは反応性が低いため脱ァミノ化されずにそのまま残る。その後、適切なプライマーを用いて PCRを行うと、もともとシトシンであった部位はチミン (ゥラシル）として増幅され、一方、メチルシトシンはシトシンとして増幅される。よって、増幅されたサンプルをシークェンシングすると、本来メチルシトシンであった部分はシトシンとして検出され、非メチルシトシンであった部分はチミンとして検出される。これにより、シトシンのメチルイ匕 Z非メチルイ匕を判定することができる。

[0007] し力しながら、この方法では、重亜硫酸ナトリウム処理に通常 20〜40時間を要し、検出に時間が力かる点が問題となっている。

[0008] また、 PNA—DNA複合体を用いる方法では、 PNA—DNA複合体を制限酵素で処理することにより、 DNA中のメチルシトシンを検出する。しかしながら、制限酵素による処理を用いるため、制限酵素が認識する配列のみにしか適用できないという問題があった。また、メチルシトシンの検出は蛍光の消失によって検出されるため、度々バックグラウンドの問題が生じてしまう。

[0009] これらのことから、簡便で一般的な他のメチルシトシン検出法の開発が大きな研究課題になっている。

[0010] ところで、ビタミン K3として知られる 2—メチル 1, 4 ナフトキノンは光酸化剤として機能し、各種核酸塩基を一電子酸化することが報告されている (文献 5)。具体的には、ナフトキノン存在下では、紫外線照射により 5—メチルー 2'—デォキシシチジンが 5 ホルミル—2' デォキシシチジンや 5 ヒドロキシメチルー 2'—デォキシシチジンなどの酸ィ匕体に変換されることが報告されている。

[0011] ナフトキノンの有するこのような特性に着目し、本願発明者らは以前、ナフトキノンの光化学反応特性を応用し、メチルシトシンの検出を行うことを提唱した (文献 6)。この方法によれば、上述の各検出方法が有している問題を解消することができる。

[0012] この方法では、メチルシトシンの検出対象となる DNAと相補的な配列を有する DN Aオリゴマーの末端部分にナフトキノンを導入し、下記の化学式

[0013] [化 1] O

(ただし、 Xは DNAオリゴマーを表す）

で表される修飾 DNAオリゴマーを合成し、この修飾 DNAオリゴマーを対象 DNAとハイブリダィゼーシヨンさせる。そして、ハイブリダィゼーシヨンした 2本鎖 DNAに光照射を行う。このとき、メチルシトシンはナフトキノンの光酸ィ匕によって切断され、一方、非メチルシトシンは切断されない。よって、光照射した後の 2本鎖 DNAを PAGEにより解析することによって、メチルシトシンの存在を、切断バンドとして検出することができる。

[0014] し力しながら、ナフトキノンを利用した従来の方法では、検出対象となるメチルシトシンの近傍にグァニン連続配列（グァニンーグァニン）が存在すると、メチルシトシン部位だけでなぐこの連続配列の 5 '側でも切断が生じてしまうという問題が報告されている（文献 6)。

[0015] 一般に、遺伝子中のメチルシトシンは、 C— Gペアが豊富に存在する配列で形成されやすいため、グァニン塩基が多数存在する遺伝子配列においても、メチルシトシンを明瞭に検出することが望まれる。

(文献 1)

Church, G. M., Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 1991. (文献 2)

Frommer, M., McDonald, L. E" Millar, D. S" Collis, C. M., Watt, F" Gigge, G. W" Molloy, P. L" Paul, C.し Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 1827.

(文献 3)

Herman, H. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9821.

(文献 4)

Okamoto, A., Tanabe, K., Satio, I. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10262. Douki, T" Cadet, J. Int. J. Radiat. Biol. 1999, 75, 571.

(文献 6)

Yamada, H., Tanabe, K., Nisnimoto, S. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 665.

発明の開示

[0016] 本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、グァニン連続配列が存在する配列にっ、ても、シトシンのメチルイ匕の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を提供することにある。

[0017] 本発明に係る光機能性核酸は、上記課題を解決するために、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有していることを特徴とする。

[0018] 「光機能性核酸」とは、メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部から光を照射することによりナフトキノンカチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。

[0019] また、上記光機能性核酸は、次に示す一般式（1)

5，一 A— Z— B— 3，

(ただし、式中、 A及び Bはそれぞれ 1塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、 Zはナフトキノンを含有する化合物を表す）

によって表されるものであることが好まし、。

[0020] また、上記光機能性核酸は、上記一般式（1)中の Zが、次の化学式 (2)〜（6) [0021] [化 2]

[0022] [化 3] 0024

(ただし、上記の化学式（2)〜（6)において、「5'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド A側を表し、「3'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド B側を表し、 5'末端の酸素原子はヌクレオチド Aの 3 '末端のリン酸基の酸素原子を表し、 3，末端の酸素原子はヌクレオチド Bの 5'末端のリン酸基の酸素原子を表す。 )

の何れか 1つによって表されることが好ましぐ化学式（2)によって表されることがより好ましい。

[0026] また、上記光機能性核酸は、 DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕状態を判定するために用いられるものであることが好まし！/、。

[0027] また、上記光機能性核酸は、上記ポリヌクレオチドの配列が、判定対象の DNA鎖の塩基配列と相補的な配列に対して、 80%以上の相同性を有するものであることが好ましい。

[0028] また、上記光機能性核酸は、上記ナフトキノン力上記ポリヌクレオチドの鎖内部にぉ、て、上記ポリヌクレオチドが判定対象の DNA鎖とハイブリダィズした際に上記 D NA鎖のシトシン塩基と対向する位置に挿入されて、ることが好まし、。

[0029] また、上記光機能性核酸は、上記ナフトキノン力上記ポリヌクレオチドの鎖内部にぉ、て、上記ポリヌクレオチドが判定対象の DNA鎖とハイブリダィズした際に上記 D NA鎖のシトシン塩基と対向する塩基から 5塩基以内の塩基と結合していることが好ましい。

[0030] 本発明に係る光機能性核酸の製造方法は、上記課題を解決するために、 1塩基以上の直鎖状の第 1ヌクレオチド及び第 2ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させることを特徴とする。

[0031] また、上記製造方法では、上記連結部分がホルミル基を有し、上記ナフトキノンを含有する化合物が、ナフトキノンのヒドラジン誘導体であってもよい。あるいは、上記連結部分がチオール基を有し、上記ナフトキノンを含有する化合物が、マレイミド基及びチオール基の少なくとも一方を有して、てもよ、。

[0032] また、上記製造方法では、上記修飾ポリヌクレオチド鎖を、ホスホロアミダイト法によつて合成してもよヽ。 [0033] 本発明に係るメチル化判定方法は、 DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕の状態を判定するメチルイ匕判定方法であって、上記課題を解決するために、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、判定対象の DNA鎖とハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、上記ハイブリダィゼーシヨン工程によつてノヽイブリダィゼーシヨンした光機能性核酸及び判定対象の DNA鎖に対して光照射を行う光照射工程と、光照射工程において光照射を行った判定対象の DNA鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んでいることを特徴とする。

[0034] また、上記光機能性核酸は、判定対象のシトシンを含む領域における上記 DNA鎖の塩基配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドにお、て、上記判定対象のシトシンとハイブリダィゼーシヨンの際に対向する塩基がナフトキノンィ匕合物によって置換されたものであることが好まし、。

[0035] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図面の簡単な説明

[0036] [図 1]本発明の一実施例を示すものであり、光機能核酸の構造を示す図である。

[図 2]本発明の一実施形態を示すものであり、ナフトキノンのヒドラジン誘導体の合成方法を示す図である。

[図 3]本発明の光機能核酸によって、 DNA鎖中のメチルイ匕シトシンを切断する様子を示す図である。

[図 4]本発明の一実施例を示すものであり、光機能核酸の合成スキームを示す図である。

[図 5]本発明の第 1の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。

[図 6]本発明の第 2の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。

[図 7]本発明の第 3の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0037] 本発明の一実施形態について図 1〜3に基づいて説明すると以下の通りである。

[0038] 〔光機能性核酸〕

本実施形態の光機能性核酸は、 DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕状態を判定するために用いることができるものである。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖と、このポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖部分によって、シトシンのメチルイ匕状態を判定したヽ DNA鎖とハイブリダィゼーシヨンすることができる。また、ハイブリダィゼーシヨンさせた光機能性核酸及び DN A鎖に対して光照射を行うと、 DNA鎖における、光機能性核酸の近傍のシトシンカ^ チル化されて、る場合は、ナフトキノンによってメチルシトシン部分で DNA鎖が切断され、一方、シトシンカ^チルイ匕されていない場合は切断されない。

[0039] 本明細書において「光機能性」とは、上述したように、外部から光を照射することによって、ナフトキノン力 Sメチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有して、ることを指す。従って、本明細書において「光機能性核酸」とは、メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部力光を照射することによりナフトキノン力 Sメチルシトシンに対して酸ィ匕的切断を起こす機能を有して、る核酸のことを指す。

[0040] また、本明細書にぉ、て、「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デォキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。

[0041] また、ポリヌクレオチドは、 RNAの形態、 DNAの形態の何れであってもよ!/、。さらに、 DNAの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。また、ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの結合数は 2個以上であればいくつでもよい。ポリヌクレオチドは、化学合成したものであってもよいし、自然環境力も抽出したものであってもよい。

[0042] また、「ポリヌクレオチド鎖内部」とは、ポリヌクレオチド鎖の 5，末端及び 3，末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドを指す。

[0043] 本明細書において、「ナフトキノン」とは、下記の化学式

[0044] [化 7]

によって表されるナフトキノン構造を有する化合物を指し、本発明に係る光機能性核酸は上記何れかのナフトキノン構造を含んでいればよい。なお、光機能性核酸が含むナフトキノンとしては、 1, 4 ナフトキノン、 1, 2 ナフトキノンに限定されるものではなぐそれぞれのナフトキノンに置換基が導入された誘導体であってもよい。このような誘導体としては、例えばビタミン Kとして知られる 2—メチル 1, 4 ナフトキノン

3

や、その 2位のメチル基を他のアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、又はァミノ基に置換したものなどが挙げられる。さらに、芳香環上に、各種置換基 (電子供与基としてアルキル基、アミノ基、アルコキシ基、若しくはヒドロキシ基等;又は電子吸引基として-トロ基、若しくはハロゲン基等）が導入されていてもよい。本明細書では、以下、これらの誘導体を含むナフトキノン構造を有する化合物を単にナフトキノンという。

[0045] 本実施形態に係る光機能性核酸では、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。これにより、ナフトキノンを DNAオリゴマーの末端に導入した引用文献 6の技術に比べて、ナフトキノンの可動範囲が限定され、非特異的なグァニン連続配列の酸ィ匕的切断を抑制することができる。

[0046] なお、光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖の 5，末端および 3，末端以外のヌクレオチドにナフトキノンが付加されたィ匕合物であってもよいし、あるいは、ポリヌクレオチド鎖の 5，末端および 3，末端以外のヌクレオチドがナフトキノンによって置換されたものであってもよい。後者に力かる光機能性核酸は、下記の一般式（1)

5，一 A— Z— B— 3， …ひ）

(ただし、一般式（1)中、 A及び Bはそれぞれ 1塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、 Zはナフトキノンを含有する化合物を表す）

と表すことができる。

[0047] 上記の一般式（1)において、ナフトキノンを含有する化合物 Zは、ヌクレオチド Aの 3 '末端のリン酸基及びヌクレオチド Bの 5，末端のリン酸基と結合していることが好ましい。ポリヌクレオチドとナフトキノンとの結合方法は特に限定されるものではないが、例えば、 ό 5記の一般式（1)における Zが下記の化学式（2)

[化 8]

で表されるものであってもよ、。

[0049] ただし、上記の化学式（2)において、「5'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド A側を表し、「3'」は上記一般式（1)中のヌクレオチド B側を表し、 5'末端の酸素原子はヌクレオチド Aの 3'末端のリン酸基の酸素原子を表し、 3'末端の酸素原子はヌクレオチド Bの 5'末端のリン酸基の酸素原子を表す。

[0050] 上記の化学式（2)によって表される Zを含むポリヌクレオチド鎖の一例を図 1に示す。また、これ以外の化合物 Zの例として、次の化学式（3)〜（6)

[0051] [化 9]

[0052] [化 10]

3，

であってもよい。これらの合成方法については、後述の〔光機能核酸の合成方法〕において説明する。

[0055] なお、ポリヌクレオチドとナフトキノンとを結合するリンカ一部分は、なるべく短!、ものが好ましい。これにより、リンカ一部分の構造的自由度が限定され、ナフトキノンによる非特異的な酸ィ匕的切断をさらに抑制することができる。

[0056] また、上記のポリヌクレオチド Α及び Βは、 DNA鎖における、判定対象のシトシンを含む塩基配列と相補的な塩基配列に近いことが好ましい。この場合、ポリヌクレオチド A及び B力判定対象の DNA鎖と選択的にハイブリダィズできることが意図される。従って、ポリヌクレオチド A及び Bは、判定対象となる DNA鎖と同一の長さを有している必要はなぐ DNA鎖における、少なくとも判定対象のシトシンを含む部分領域の塩基配列とほぼ相補的な塩基配列であればよい。

[0057] 具体的には、上記一般式（1)の 5'— A— Z— B— 3'を例にすると、 Zを一つの塩基と仮定した場合、ポリヌクレオチド A— Z— Bが、 DNA鎖の、判定対象のシトシンを含む部分領域に相補的な配列と 80%以上の相同性を有していればよい。この場合、 D NA鎖側の塩基配列にお、て、 Aの 5 '末端よりも 5 '側のミスマッチは相同性の算出には考慮せず、同様に、 Bの 3'末端よりも 3'側のミスマッチも考慮しない。また相同性は、 85%以上であることがより好ましぐ 90%以上であることがさらに好ましぐ 95 %以上であることが特に好ましぐ Z以外の配列が 100%—致することが最も好ましい

[0058] また、上記一般式（1)にお、て、 Zの位置は、光機能性核酸と判定対象の DNA鎖とがハイブリダィゼーシヨンした際に、判定対象のシトシンと近接できる位置であることが望まれる。よって、 Zは、ポリヌクレオチド A— Z— Bと判定対象の DNA鎖とがハイブリダィゼーシヨンするとき、判定対象のシトシンと対向するヌクレオチドから 5'側又は 3 '側に 5塩基以内に存在するヌクレオチドと結合していることが好ましぐ 3塩基、 2塩基、 1塩基の順にさらに好ましい。また、 Zは、ポリヌクレオチド A—Z— Bと判定対象の DNA鎖とがハイブリダィゼーシヨンするときに、判定対象のシトシンと対向する位置に挿入されてヽることが特に好ましヽ。

[0059] これにより、ノ、イブリダィゼーシヨンの際に、ナフトキノンを判定対象のシトシンに近接させることができるため、判定対象のシトシン以外の塩基における酸ィ匕的切断を抑 ff¾することができる。

[0060] 〔光機能性核酸の合成方法〕

光機能性核酸は、ナフトキノンを導入する位置のヌクレオチドを脱塩基したポリヌクレオチド鎖に対して、ナフトキノン誘導体を縮合させることによって合成することができる。具体的な縮合方法の一例を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではなぐ公知の他の様々な方法を用いてもよい。 [0061] まず、図 2に示すように、 2—メチルー 1, 4 ナフトキノンの 3位にカルボン酸を導入し、その後、ヒドラジンを縮合することによってナフトキノンのヒドラジン誘導体を合成する。

[0062] 一方で、ホスホロアミダイト法によって、下記の一般式（7)

5，一 A— Y— B— 3， - -- (7)

で表される脱塩基前駆体修飾部を含む修飾ポリヌクレオチド鎖を DNAシンセサイザ一上で合成する。なお、一般式（7)において、 A及び Bは上述した判定対象の DNA 鎖とハイブリダィゼーシヨンするヌクレオチド鎖である。また、 Yは脱塩基前駆体修飾部であり、例えば下記の化学式 (8)

[0063] [化 13]

5'<

Y

によって表される化合物とすることができる。

[0064] なお、ホスホロアミダイト法とは、 5つの反応ステップを繰り返すことによってオリゴマ一の鎖長を伸長させる方法である (後藤俊夫、芝哲夫、松浦輝夫監修『有機化学実験の手引き 4 合成反応 II一』化学同人)。その 5つのステップとは、次の通りである

(1)サポート上のジメトキシトリチル基 (DMTr基)の除去によって 5 '末端水酸基を遊離させる。

(2)アミダイトイ匕合物をテトラゾールの導入によって活性化させる。なお、脱塩基前駆体修飾部を付加する場合は、アミダイトイ匕合物の代わりにアバシックホスホアミド (Gle n Research社製）などを用いる。

(3)活性化させたアミダイト化合物をカラム上の 5 '末端水酸基と反応させる。

(4)未反応の 5 '末端水酸基をァセチル化 (キャップ化)する。 (5) 1— H Oによって酸ィ匕する。

2 2

[0065] この反応を所望の鎖長になるまで繰り返した後、酸性水溶液による保護基除去反応により、目的の修飾ポリヌクレオチド鎖 (一般式 (7)の化合物）を得ることができる。

[0066] そして、 Yが上記の化学式で表される場合、修飾ポリヌクレオチド鎖に含まれる Yのジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムなどでホルミル基に変換する。

[0067] そして、上述したナフトキノンのヒドラジン誘導体を修飾ポリヌクレオチド鎖のホルミル基と縮合させることによって、下記の一般式（9)

5' -Α-Ζ-Β- 3 ' - -- (9)

(ただし、 Ζは、

[0068] [化 14]

である）

で表される光機能性核酸を得ることができる。

[0069] なお、ホルミル基とヒドラジンとの縮合反応は酸性条件下で行うことが好ましぐ ρΗ5 以上 7以下がより好ましぐ ρΗ6が特に好ましい。また、反応温度は、室温以下で行うことが好ましぐ 10°C以下がより好ましぐ 4°Cが特に好ましい。これにより、修飾ポリヌクレオチド鎖にナフトキノンを導入することができる。

[0070] また、上述の例においては、修飾ポリヌクレオチド鎖とナフトキノンとを、ホルミル基とヒドラジンとの縮合によって結合させた力本発明はこれに限定されるものではなぐ例えば、アルキルアミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンィミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させてもよい。この反応式の一例を次の反応式（1 0)に示す。

[0071] [化 15]

なお、上記の反応式（10)の詳細は、 Bergeron et al., Nucleic Acids Res., 2004, 3

2, 6154-"に記載されており、本明細書ではこれを援用する。

[0072] また、別の例として、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンィミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させた例を次の反応式（ 11)に示す。

[0073] [化 16]

なお、上記の反応式（11)において、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば" Okamoto, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 126, 14732-14733, 2004"に記載されて、る方法を参照して合成することができる。

[0074] また、さらに別の例として、アルキルチオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基又はチオール基を導入したナフトキノンの誘導体とを縮合させてもよい。チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基を導入したナフトキノンとを縮合させる反応式の一例を次の反応式（12)に示す。

[0075] [化 17]

なお、上記の反応式（12)において、チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば" Sun, S. et al. J. Org. Chem. 1996, 61, 5708- 5709"に記載されている方法を参照して合成することができる。

[0076] さらには、ナフトキノンを有する修飾核酸塩基 (一塩基の修飾ヌクレオチド)を合成しておき、 DNAシンセサイザーによって、任意の部分にこの修飾核酸塩基が挿入された修飾ポリヌクレオチド鎖を合成してもよい。例えば、下記の式（13)のように、修飾核酸塩基としてナフトキノン含有ゥリジン誘導体を合成しておき、これを含んだポリヌクレォチド鎖を DNAシンセサイザーによって合成してもよ!/、。

[0077] [化 18]

なお、上記の反応式（13)において、ナフトキノン含有ゥリジン誘導体は、例えば" 0 kamoto, A. et al. J. Am. Chem. So 126, 4820-4827, 2004"に記載されている方法を参照して合成することができる。

[0078] 本発明に係る光機能性核酸は、ナフトキノンを含有するポリヌクレオチド鎖であれば

、上記の方法や他の公知の方法によって得られる様々な産物が含まれる。

[0079] 〔光機能性核酸の使用法 (メチル化判定方法)〕

本実施形態の光機能性核酸は、 DNA鎖中のシトシンのメチルイ匕状態を判定することができる。具体的には、光機能性核酸と判定対象の DNAとをノヽイブリダィゼーションさせる。なお、ハイブリダィゼーシヨンは、定法に従って行えばよい。

[0080] 次に、ハイブリダィゼーシヨンによって、 2本鎖を形成して、る判定対象の DNA鎖 ( 図 3の上側の鎖)及び光機能核酸 (図 3の下側の鎖）に対して、光照射を行う。なお、光照射反応は、光機能性核酸と判定対照の DNA鎖の間の二重鎖解離温度 (Tm値) 以下で行わなければならない。また、照射する光は、 400nm以下の波長であることが好ましぐ 350nm以下であることがより好ましぐ 330nm以下であることがさらに好ましい。これにより、ナフトキノンの酸ィ匕的切断を誘起することができる。

[0081] ここで、図 3の上段に示すように、ナフトキノンの近傍のシトシンが非メチルイ匕状態である場合、 DNA鎖の酸化的切断は起こらない。一方、ナフトキノンの近傍のシトシンカチルイ匕状態である場合は、図 3の下段に示すように、 DNA鎖の酸ィ匕的切断が起こる。

[0082] そして、光照射を行った後の DNA鎖の断片長を検出することによって、 DNA鎖が切断されているのかどうかを知ることができる。ここで、 DNA鎖が切断されていれば、目的のシトシンカ^チルイ匕されていたことが分かる。一方、 DNA鎖が切断されていなければ、目的のシトシンカ^チルイ匕されていなかったことが分かる。

[0083] なお、 DNA鎖の断片長を検出する方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ PAGE)等を用いることができる。この場合、判定対象の DNA鎖を予め放射性同位元素で標識しておくことが好ましい。これにより、オートラジオグラフィ一によつて、高感度で切断バンドを検出することができる。

[0084] なお、本実施形態のメチルイ匕判定方法では、メチルイ匕シトシンの存在を、切断バンドの出現によって検出することができる。従って、従来の Maxam— Gilbert法や PN A— DNA複合体における問題点であったバックグラウンドの問題を解決し、明確にメチルイ匕の状態を判定することができる。

[0085] また、本実施形態のメチルイ匕判定方法は、全工程を 10時間程度で行うことができる。これは、 3日程度を要する MSP法に比べて、充分短い時間である。このように、本実施形態のメチル化判定方法によれば、迅速にメチル化の状態を判定することができる。 [0086] また、本実施形態のメチルイ匕判定方法では、判定対象のシトシンを、光機能性核酸に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列によってターゲッティングし、シトシンの切断を、周辺の塩基配列に左右されることなく行うことができる。従って、 PNA—DNA複合体のように、シトシン塩基の周辺配列によってはシトシンのメチルイ匕を検出できないという問題が生じることがない。

[0087] [実施例]

本発明の一実施例について以下に説明する力 S、本発明はこれに限定されるものではない。

[0088] 〔実験方法:全般〕

融点は、 MICROMELTING POINT APPARATUS (YANAGIMOTO社）によって決定した。 NMRスペクトル及び¹³ C NMR ^ベクトルは、 270MHzの J MN— GSX- 270分光計 (JOEL社）又は 300MHzの JMN— AL— 300分光計 (JO EL社)を用いて周囲温度にて測定した。化学シフトは、残留クロ口ホルム（ δ = 7. 24 in ^XH NMR, δ = 77. 0 in ¹³C NMR)及び残留脱メチルスルホキシド（ δ = 2. 49 in ^XH NMR, δ = 39. 5 in ¹³C NMR)を内標準として、テトラメチルシランからのダウンフィールド ppmによって表した。 FAB質量スペクトルは、 JMS— SX 102A CFOEL社）において記録した。オリゴヌクレオチドに対するマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析 (MALDI—TOF MASS分析）は、 2 ' , 3 ' , 4，一トリヒドロキシァセトフエノンをマトリックスとして、 JMS— ELITE MALDI -TO F MASS分析装置 (JOEL社）によって行った。

[0089] シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、 Wakogel C— 300 (Wako社）を用いた。

反応のモニタリングには、予めコーティングされた TLCプレートである silica gel 60 F (Merck社）を用いた。オリゴヌクレオチドは Invitrogen社から購入した。 A, T

254

, G, Cや Abasic Phosphoramidite等の DNA合成装置用試薬は、 Glen Resear ch社力購入した。仔牛腸アルカリホスファターゼ (AP)、ヌクレアーゼ PI (P1)、ホスホジエステラーゼ Iは、それぞれ PROMEGA社、 YAMASA社、 ICN社から購入した。

[0090] 高速液体クロマトグラフィー（HPLC)は、 6A HPLCシステム（島津社)又は D— 7 00 HPLCシステム（日立社)を用いて行った。試料溶液は、逆相カラム (Inertsil O DS- 3, GL Sciences Inc. , f 4. 6mm X 150mm、又は f 10mm X 150mm) に注入した。移動相としては、 0. 1M酢酸トリェチルァミン (TEAA) pH7. 0、及び 10 0%ァセトニトリル力もなる溶媒混合物を 25°C、流量 0. 6mLZ分または 3. OmLZ分で送液した。

[0091] カラム溶離剤は、 254nm又は 260nmの UVの吸光度によってモニタリングした。 λ

= 312nmでの光照射は、 TFX— 20M トランスイルミネータ（Lourmat社）を用い ex

て行った。

[0092] ゲル電気泳動は、 Model S2 装置（Gibco BRL社）によって行った。 [ γ—³² P] ATP (6000Ci/mmol)、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10単位 Z μ L)は、それぞれ Amersham Biosciences社、 Nippon Gene社から入手した。全ての水溶液は、 YAMATO社 WR600Aによる精製水を用いて調製した。ナフトキノンのカルボン酸誘導体 1 (3 カルボキシ 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン）は、下記の論文で報告された方法に従って合成した（Salmon- Chemin, L.; Buisine, E.; Yardley, V.; Kohl er, S.; Debreu, M— Α·; Landry, V·; Sergheraert, C; Croft, S. L.; Krauth— Siegel, L.; Davioud- Charvet, E. J. Med. Chem. 2001, 44, 548.)。

[0093] 〔3 （ヒドラジノカルボ-ルェチル） 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体 3)の合成〕

まず、 2—メチル 1, 4 ナフトキノン (和光純薬工業株式会社製)をコハク酸と反応させ、コハク酸の酸化的脱カルボキシル化を通じて、 3 カルボキシー 2 メチル —1, 4 ナフトキノン（ナフトキノンのカルボン酸誘導体 1)を得た。次に、 100mg (0. 41mmol)の 3—カルボキシ一 2—メチル 1, 4 ナフトキノンを lmLの DMFに溶解した溶液に対して、 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル）—カルポジイミド 1 塩酸塩（157mg, 0. 82mmol)及び 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール（l lOmg, 0. 8 lmmol)を加え、 0°Cで 30分間攪拌した。この反応混合物に、ヒドラジン 1水和物（64 mg, 2mmolを 0. 2mLの DMFに溶解したもの）をカ卩え、周囲温度で 2時間攪拌した。この反応混合物を水で希釈した後、ェチル酢酸によって反応混合物を抽出した。得られた有機層を鹹水で洗浄し、無水 MgSO上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。

[0094] 次に、得られた粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（SiO , 50

2 〜100% EtOA c/へキサン）によって精製し、 3- (ヒドラジノカルボ-ルェチル）— 2—メチル— 1, 4 —ナフトキノンけフトキノンのヒドラジン誘導体 3)の淡黄色固体を得た。この反応スキ一ムを図 4に示す。

[0095] なお、この固体の性質は以下の通りであった：融点 182〜183°C, NMR(300 MHz, DMSO— d6) δ 9. 00 (br, 1H) , δ 8. 06〜7. 96 (m, 2H) , 7. 89 〜7. 81 (m, 2H) , 4. 15 (br, 2H) , 2. 79 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 2. 19 (t, J = 7. 8 Hz, 2H) , 2. l l (s, 3H) ; ¹³C NMR(75MHz, DMSO— d6) δ 183. 8, 170. 3, 143. 5, 135. 4, 131. 6, 126. 1, 32. 1, 26. 8, 12. 4 ;FABMS (NBA) m /z 259 [ (M+H) +] ;HRMS calcd. for 【（M+H) +] 259. 1083, found 259. 1082。

[0096] 〔トリオール基を含むオリゴデォキシヌクレオチド (ODN7)の合成〕

Model 392 DNA/RNA 合成装置（Applied Biosystems社）上で、脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位 (脱塩基前駆体修飾部)を含むオリゴデォキシヌクレオチド (以下、「オリゴマー」と、う）を標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。合成したオリゴマーの塩基配列については後述する。自動合成の後、得られたオリゴマーを逆相 HPLC (0. 1M TEAA, pH7. 0の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配及び 8 0分以上に亘る 30%から 100%へのァセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

[0097] 次に、乾燥させたオリゴマーを 200 μ Lの 80%酢酸に懸濁し、室温にて 30分インキュベーシヨンした。 30分後、反応混合物に等量の脱イオン水を加え、 DMT及び ΤΒ DMS基を取り除くためにさらに 4時間室温にてインキュベーションした。

[0098] 続いて、完全に脱保護されたオリゴマーを、逆相 HPLC (0. 1M TEAA, pH7. 0 の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配及び 80分以上に亘る 30%から 100%へのァセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

[0099] 得られたオリゴマーの純度及び濃度を、 37°Cにおいて AP、 Pl、及びホスホジエステラーゼ Iで 4時間消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは , MALDI-TOF MASS分析装置によって確かめた（ODN7 : calcd. for 53 31. 43, found 5332. 26)。

[0100] 〔DNA鎖の内部に 2—メチルー 1, 4 ナフトキノンを含有するオリゴデォキシヌタレォチド（NQ - ODN2)の合成〕

脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位をもつ ODN ( 100 M)を、 0. lMNa OAc (pH6. 0, 80 L)に溶力した 0. 5mM過ヨウ素酸ナトリウムとともに 4°Cの遮光条件下で 1時間インキュベーションした。得られた反応混合物に対して、上述のナフトキノンのヒドラジン誘導体 3をァセトニトリル（5mM, 80 ^ L)に溶解したものを加え、周囲温度で 14時間インキュベーションした。そして、得られた反応混合物を逆相 HP LC (0. 1M TEAA, pH7. 0の溶媒混合物による溶離、流量 3. OmLZ分での 60 分以上に亘る 0%から 30%へのァセトニトリルの一次勾配及び 80分以上に亘る 30% 力も 100%へのァセトニトリルの一次勾配）で精製し、 NQ— ODN2を得た。この反応スキームを図 4に示す。

[0101] 得られた NQ— ODN2の純度及び濃度は、 AP1、 Pl、ホスホジエステラーゼ Iによつて 37°Cで一晩完全に消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、 MALDI—TOF MASS分析装置によって確かめた（NQ— ODN2 : calc d. for 5541. 64, found 5542. 59)。

[0102] 〔5，一³² P末端ラベル ODNの調製〕

オリゴヌクレオチド（ODN, 400pmol 鎖濃度）に対して、 4 Lの [ γ— ³²P] ATP 及び T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にてリン酸ィ匕することによって、ラベルを導入した。 5'末端ラベルしたオリゴヌクレオチドは、エタノール沈殿によって回収し、さらに 15%の非変性ゲル電気泳動によって精製し、粉砕浸漬法 (crush and soak m ethod)によって単離した。

[0103] 〔DNA鎖内部に 2—メチルー 1, 4 ナフトキノンを含むオリゴヌクレオチド（NQ— O DN2)の光酸化実験及び PAGE解析〕

32Pにより 5 '末端ラベルした ODN (400nM未満の鎖濃度）を、 2—メチルー 1, 4 —ナフトキノンユニットを有する相補的な ODNと、 20mMの NaCl緩衝液（pH7. 0) を含む 2mM力コジル酸ナトリウム溶液中でハイブリダィゼーシヨンさせた。なお、ハイブリダィゼーシヨンは、試料溶液を 90°Cで 5分間加熱した後、室温まで緩やかに冷却することによって行った。

[0104] 次に、 ³²Pにより 5'末端ラベルした 2重鎖に対して、トランスイルミネータを用いて 0°C 条件下で 312nmの光照射を行った。光照射の後、 10 Lの全反応混合物に、ニシン精子 DNA又はサケ精子 DNA(lmgZmL)、 3M酢酸ナトリウム、及び 800 /z Lのエタノールをカ卩え、全反応混合物を沈殿させた。次に、沈殿した DN Aを 100 の冷却した 80%エタノールによって洗浄し、真空下で乾燥させた。沈殿した DNAを 50 μ Lの 10%ピぺリジン (νΖν)に溶解し、 90°Cで 20分間加熱して濃縮した。

[0105] 得られた試料について、ァロカ 1000 溶液シンチレーシヨンカウンター（ァロカ社）を用いて放射能を測定し、乾燥させた DNA沈殿物を 80%ホルムアミドローデイングバッファー（80% ホルムアミド（vZv)、 ImM EDTA、0. 1% キシレンシァノール、及び 0. 1% ブロモフエノールブルーの溶液）に再懸濁した。そして、 Maxam— Gi lbert法による G+Aシーケンス用反応物を含む全ての反応物を 90°Cで 3分間加熱変性させ、氷中で急速に冷却した。試料（3〜5 X 10³cpm)を 15%ポリアクリルアミド Z7M尿素シーケンス用ゲルにロードし、 1900Vで 60〜90分電気泳動し、電気泳動したゲルを富士フィルム製 X線フィルム (RX—U)とともにカセットに移し、 -80°C で保管した。

[0106] 電気泳動したゲルは、 densitograph software library version 3. 0 (ATTO 社)を用いたオートラジオグラフィ一によつて解析した。なお、ピぺリジン処理によって生じたスポットの強度は、体積積分によって求めた。

[0107] 〔実施例 1 :p— 53がん抑制遺伝子配列内の ^mC部位の検出〕

本検出システムの有用性を検証するために、ナフトキノンを含有するオリゴデォキシヌクレオチドによる P53がん抑制遺伝子配列内の ^mC部位における光酸ィ匕反応を行つた。

[0108] p53がん抑制遺伝子配列には、メチル化された 5'— CpG— 3 'が変異の hot spot として存在することが報告されている（Tornaletti, S., Pfeifer, G. P. Oncogene 1995, 1 0, 1493. ; Baylin, S. B., Herman, J. G. Trends Genet. 2000, 16, 168.； Esteller, M., Corn, P. G.， Baylin, S. B" Herman, J. G. Cancer Res. 2001, 61, 3225.)。本検証実験では、その一つである codon282 (下記の ODN5, 6の配列における CGG)を含む塩基配列を持つ DNAオリゴマーを検出対象に選んだ。なお、各実験手順の詳細は上述の通りである。

[0109] 検出対象となるオリゴマーのうち、メチルシトシンを有さないオリゴマーを ODN5 (5，

-AGAGACCGGCGCACAGAG- 3'：配列番号 1)、メチルシトシンを有するオリゴマーを ODN6 (5，一 AGAGAC^mCGGCGCACAGAG— 3，：配列番号 2)とした。これらのオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。

[0110] また、ナフトキノンを導入する対象となる ODN7の配列は、基本的には ODN5と相補的な配列とし、 ODN5及び ODN6の codon282のメチル化されうるシトシン塩基の相補部位のみをトリオール基を有する化合物とした。具体的には、 ODN7の配列を 3 '一 TCTCTGYCCGCGTGTCTC— 5，とし、 Yを、

[0111] [化 19]

Y

とした。

[0112] そして、この ODN7を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、トリオール基をホルミル基に変換した後、 3 （ヒドラジノカルボ-ルェチル） 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体 3)と縮合させ、ナフトキノンを導入した DNAオリゴマー、 N Q— ODN2を得た。この NQ— ODN2の酉己歹 IJは、 3， - TCTCTGZCCGCGTGTC TC— 5 'でぁり、 Zは、

[0113] [化 20]

である。 NQ— ODN2の全体の化学式を図 1に示す。

[0114] そして、 NQ— ODN2とメチルシトシンを有さない ODN5とをハイブリダィゼーシヨンさせ、 5，末端を³² Pでラベル化したものを NQ— C— duplex IIとした。

[0115] また、 NQ— ODN2とメチルシトシンを有する ODN6とをノヽイブリダィゼーシヨンさせ

、 5，末端を 32Pでラベル化したものを NQ— ^mC— duplex IIとした。

[0116] さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していない ODN7とメチルシトシンを有さない ODN5とをハイブリダィゼーシヨンさせ、 5'末端を 32Pでラベル化したものを C duplex IIとし 7こ。

[0117] 同様に参照実験として、ナフトキノンを導入していない ODN7とメチルシトシンを有する ODN6とをハイブリダィゼーシヨンさせ、 5，末端を 32Pでラベル化したものを ^mC — duplex IIとした。

[0118] これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応を PAGEにより追跡した。なお、 NQ— C— duplex II及び NQ—^mC— duplex IIについては、光照射時間を 0, 1, 2時間の各条件で行い、その他の試料については、光照射時間を 2時間とした。その結果を図 5に示す。また、図 5における各レーンの条件をまとめたものを表 1に示す。

[0119] [表 1] レーン番号試料名オリゴマー 1 オリゴマー 2 光照射時

間（時間）

1 C-duplex II ODNフ ODN5 2

2 NQ-C-duplex II NQ-ODN2 ODN5 0

3 NQ-C-duplex II NQ-ODN2 ODN5 1

4 NQ-C-duplex II NQ-ODN2 ODN5 2

5 マ一力一 ― ― ―

6 ^mC-duplex II ODN7 ODN6 2

7 NQ-^mC-duplex II NQ-ODN2 ODN6 0

8 NQ-^mC-duplex II NQ-ODN2 ODN6 1

9 NQ-^mC-duplex II NQ-ODN2 ODN6 2

10 マ一力一 ― ― ― 図 5のレーン 9から分力るように、 NQ-^mC- duplex IIに紫外線を照射した場合には、メチルシトシン部位が切断され、明確なバンドとして検出できることが示された。また、このとき、グァニン連続配列は切断されないことが示された。一方、レーン 1, 4, 6 から分かるように、その他の試料の場合には、シトシン部位ゃメチルシトシン部位での切断がほとんど起こらないことが示された。これらの結果から、ナフトキノンを導入した光機能性核酸を用いた光酸ィ匕反応と PAGEとを組み合わせた本検出システムは、遺伝子内部のメチルシトシン部位の検出に利用可能であることが検証された。

[0120] 〔実施例 2:p— 53がん抑制遺伝子配列内の ^mCとチミンの識別〕

次に、本検出システムカ^チルシトシンとチミンの識別をすることができるカゝ否かを確かめた。チミンはメチルシトシンが脱ァミノ化変異することによって生成される力光機能性核酸力 Sメチルシトシン部位のみを選択的に切断することができれば、本検出システム力 Sメチルシトシンとチミンの識別が可能であることになり、一層有効であると考えられる。

[0121] 本実施例では、検出対象となるオリゴマーのうち、メチルシトシンを有するオリゴマ一として、実施例 1の ODN6を用い、 ODN6のメチルシトシンの代わりにチミンを有するオリゴマーとして、 ODN16 (5， - AGAGACTGGCGCACAGAG - 3 '：配列番号 3)を用いた。これらのオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。また、ナフトキノンを導入した光機能性核酸としては、実施例 1の NQ— ODN2を用いた。

[0122] そして、 NQ— ODN2とメチルシトシンを有する ODN6とをハイブリダィゼーシヨンさせ、 5，末端を³² Pでラベル化したものを NQ—^mC— duplex IIIとした。

[0123] また、 NQ— ODN2とチミンを有する ODN16とをノヽイブリダィゼーシヨンさせ、 5，末端を 32Pでラベル化したものを NQ— T— duplex IIIとした。

[0124] さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していない ODN7とチミンを有する ODN

16とをノヽイブリダィゼーシヨンさせ、 5，末端を 32Pでラベル化したものを T duplex

ΠΙとした。

[0125] これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応を PAGEにより追跡した。光酸化実験及び PAGE解析の詳細は、上述した実施例 1と同様である。その結果を図 6に示す。また、図 6における各レーンの条件をまとめたものを表 2に示す。

[0126] [表 2]

図 6のレーン 4から分かるように、 NQ-T-duplex IIIに紫外線を照射した場合には、チミン部位が切断されな力つた。一方、レーン 7から分かるように、 NQ-^mC-du plex ΠΙに紫外線を照射した場合には、メチルシトシン部位が切断された。以上のことから、本実施例の光機能性核酸は、メチルシトシンとチミンとを識別できることが検証された。

[0127] 〔実施例 3:p— 53がん抑制遺伝子配列内の複数の ^mC部位に対する選択的な検出 ]

続いて、検出対象となるポリヌクレオチド鎖内に複数のメチルシトシン部位がある場合に、本検出システムが選択的に 1つのメチルシトシン部位のみを検出できる力否かを確かめた。

[0128] 本実施例では、複数のメチルシトシンを有するオリゴマーとして、 ODN25 (5，一 A GAGAC^mC GG^mC GCACAGAG— 3'：配列番号 4)を用いた。 ODN25は、 5，

7 10

末端力数えて 7番目及び 10番目のシトシン塩基力メチルイ匕されて、る。このオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。また、ナフトキノンを導入した光機能性核酸としては、実施例 1の NQ— ODN2を用いた。

[0129] そして、 NQ— ODN2と ODN25とをハイブリダィゼーシヨンさせ、 5'末端を³² Pでラベル化したものを NQ5— ^mC— duplex IVとした。

[0130] さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していない ODN7と ODN25とをハイブリダイゼーシヨンさせ、 5'末端を³² Pでラベルイ匕したものを 5— ^mC— duplex IVとした。

[0131] これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応を PAGEにより追跡した。光酸化実験及び PAGE解析の詳細は、上述した実施例 1と同様である。その結果を図 7に示す。また、図 7における各レーンの条件をまとめたものを表 3に示す。

[0132] [表 3] レーン番号試料名オリゴマー 1 オリゴマ一 2 光照射時

間（時間）

1 マーカ一一一 ―

2 5-duplex IV ODN7 ODN25 2

3 NQ5-^mC-duplex IV NQ-ODN2 ODN25 0

4 NQ5-^mC-duplex IV NQ-ODN2 ODN25 1

5 NQ5-^mC-duplex IV NQ-ODN2 ODN25 2 図 7のレーン 4, 5から分かるように、 ODN25の ^mCの相補部位にナフトキノンを導入した NQ— ODN2を用いた場合、 ODN25の 2つのメチルシトシン塩基のうち、ナフトキノンと対向する ^mC部位のみが選択的に切断された。以上のことから、本実施例の光機能性核酸は、メチルシトシンの検出対象となるポリヌクレオチド鎖内に複数のメチルシトシンが存在する場合であっても、ナフトキノンの相補部位に存在するメチルシトシン部位のみを選択的に切断できることが明らかとなり、特定のメチルシトシンを選択的に検出できることが検証された。

[0133] 本発明に係る光機能性核酸は、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有した構成となっている。これにより、ナフトキノンの可動範囲を制限し、判定対象のシトシンに対してのみナフトキノンを接近させることができる。その結果、目的のメチルシトシンに対してのみ光酸ィ匕反応を誘起することができる。よって、グァニン連続配列が存在する配列にっ、ても、シトシンのメチルイ匕の状態を明瞭に判定することができるという効果を奏する。

[0134] また、本発明に係る光機能性核酸の製造方法は、上述したように、 1塩基以上の直鎖状の第 1ヌクレオチド及び第 2ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含むヌクレオチド化合物の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる構成となっている。これにより、グァニン連続配列が存在する配列についても、シトシンのメチルイ匕の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を合成できるという効果を奏する。

[0135] また、本発明に係るメチルイ匕判定方法は、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、判定対象の DNA鎖とハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、上記ノ、イブリダィゼーシヨン工程によってノ、イブリダィゼーシヨンした光機能性核酸及び判定対象の DNA鎖に対して、光照射を行う光照射工程と、光照射工程において光照射を行った判定対象の DNA鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んだ構成となっている。これにより、グァニン連続配列が存在する配列にっ、ても、シトシンのメチルイ匕の状態を明瞭に判定できるという効果を奏する。

[0136] なお、本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

[0137] また、本明細書で示した数値範囲以外であっても、本発明の趣旨に反しない合理的な範囲であれば、本発明〖こ含まれることは!ヽうまでもな!/、。

産業上の利用の可能性

[0138] 本発明によれば、簡便なシトシンのメチルイ匕判定方法を実現できる。本発明のメチルイ匕判定方法は、任意の塩基配列を持つ遺伝子に適用可能であるため、遺伝子診断、遺伝子解析、さらには遺伝子が関与する成体分子の相互作用の解明等、医学' 生物学上幅広い分野で利用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有していることを特徴とする光機能性核酸。

[2] 次に示す一般式 (1)

5，一 A— Z— B— 3，

によって表されることを特徴とする請求項 1に記載の光機能性核酸。

[3] 上記一般式（1)中の Zが、次の化学式 (2)〜（6)

[化 1]

[化 3]

の何れか 1つによって表されることを特徴とする請求項 2に記載の光機能核酸。

[4] 上記一般式（1)中の Zが、上記化学式 (2)によって表されることを特徴とする請求項

3に記載の光機能核酸。

[5] DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕状態を判定するために用いられることを特徴とする請求項 1から 4の何れ力 1項に記載の光機能性核酸。

[6] 上記ポリヌクレオチドの塩基配列が、判定対象の DNA鎖の塩基配列と相補的な塩基配列に対して、 80%以上の相同性を有していることを特徴とする請求項 5に記載の光機能性核酸。

[7] 上記ナフトキノン力上記ポリヌクレオチド鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象の DNA鎖とハイブリダィズした際に上記 DNA鎖のシトシン塩基と対向する位置に挿入されていることを特徴とする請求項 5又は 6に記載の光機能性核酸。

[8] 上記ナフトキノン力上記ポリヌクレオチド鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象の DNA鎖とハイブリダィズした際に上記 DNA鎖のシトシン塩基と対向する塩基から 5塩基以内の塩基と結合していることを特徴とする請求項 5又は 6に記載の光機能性核酸。

[9] 1塩基以上の直鎖状の第 1ヌクレオチド及び第 2ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる工程を含む光機能性核酸の製造方法であって、

上記連結部分がホルミル基を有し、

上記ナフトキノンを含有する化合物力ナフトキノンのヒドラジン誘導体であることを特徴とする光機能性核酸の製造方法。

[10] 1塩基以上の直鎖状の第 1ヌクレオチド及び第 2ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる工程を含む光機能性核酸の製造方法であって、

上記連結部分がチオール基を有し、

上記ナフトキノンを含有する化合物力マレイミド基及びチオール基の少なくとも一方を有することを特徴とする光機能性核酸の製造方法。

[11] 上記修飾ポリヌクレオチド鎖を、ホスホロアミダイト法によって合成することを特徴とする請求項 9に記載の光機能性核酸の製造方法。

[12] DNA鎖に含まれるシトシンのメチルイ匕の状態を判定するメチルイ匕判定方法であつて、

ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、上記 DNA鎖とハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、

上記ノ、イブリダィゼーシヨン工程によってハイブリダィゼーシヨンした光機能性核酸及び DNA鎖に対して、光照射を行う光照射工程と、

上記光照射工程において光照射を行った DNA鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んでいることを特徴とするメチルイ匕判定方法。上記光機能性核酸は、判定対象のシトシンを含む領域における上記 DNA鎖の塩基配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドにお、て、上記判定対象のシトシンとハイブリダィゼーシヨンの際に対向する塩基がナフトキノンィ匕合物によって置換されたものであることを特徴とする請求項 12に記載のメチルイ匕判定方法。