JPWO2006137190A1 - 光機能性核酸及びその製造方法、並びにメチル化判定方法 - Google Patents

Abstract

グアニン連続配列が存在するＤＮＡ鎖についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を提供する。本発明の一実施形態に係る光機能性核酸は、メチル化状態の判定対象となるシトシン領域を含むｐ５３遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの１塩基がナフトキノン化合物によって置換されたものとなっている。ここで、ナフトキノン化合物は、光機能性核酸とｐ５３遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとがハイブリダイゼーションした際に、判定対象のシトシンと対向する位置に設けられている。この光機能性核酸をｐ５３遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、さらに光照射することによって、ナフトキノン化合物と対向するシトシンがメチル化されている場合にのみＤＮＡを切断する。よって、ＤＮＡの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析すれば、ＤＮＡに含まれるシトシンがメチル化されているかどうかを判定することができる。

Description

本発明は、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含有する光機能性核酸及びその製造方法、並びに、ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化の状態を判定するメチル化判定方法に関するものである。

遺伝子中のシトシンのメチル化はＤＮＡとタンパク質との相互作用を変化させ、遺伝子発現を制御していることが知られている。このため、遺伝子中の５−メチルシトシン（以下、^ｍＣともいう）部位を検出することは遺伝子解析を行う上で非常に重要であり、現在までに様々な検出法が開発されてきた。

既存のメチルシトシン塩基の検出システムとしては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法、重亜硫酸ナトリウム処理を伴うＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体と酵素処理を用いる方法などがこれまでに報告されている（文献１〜４）。

Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法では、ＤＮＡをヒドラジンで処理することにより、ＤＮＡのシトシン塩基に選択的に損傷を与える。このとき、メチル化されていないシトシンはヒドラジン処理によって切断され、一方、メチル化されたシトシン（メチルシトシン）はヒドラジン処理によって切断されない。よって、ヒドラジン処理をしたＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で解析すると、シトシンのメチル化／非メチル化を、切断によって生じるバンドの有無によって検出することができる。

しかしながら、このＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法の場合、メチルシトシンの存在は、ＰＡＧＥ上での切断バンドの欠損として検出される。このため、メチル化が部分的にでも非特異的に切断されるとバックグラウンドの切断バンドが表れてしまい、メチルシトシンの存在を判定できなくなるという問題が度々生じてしまう。

また、ＭＳＰ法は、重亜硫酸ナトリウムに対するメチルシトシンと非メチルシトシンとの反応性の違いを利用したものである。この方法では、ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理する。その結果、ＤＮＡ中の非メチルシトシンは脱アミノ化されウラシルへと変換されるが、メチルシトシンは反応性が低いため脱アミノ化されずにそのまま残る。その後、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うと、もともとシトシンであった部位はチミン（ウラシル）として増幅され、一方、メチルシトシンはシトシンとして増幅される。よって、増幅されたサンプルをシークエンシングすると、本来メチルシトシンであった部分はシトシンとして検出され、非メチルシトシンであった部分はチミンとして検出される。これにより、シトシンのメチル化／非メチル化を判定することができる。

しかしながら、この方法では、重亜硫酸ナトリウム処理に通常２０〜４０時間を要し、検出に時間がかかる点が問題となっている。

また、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を用いる方法では、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を制限酵素で処理することにより、ＤＮＡ中のメチルシトシンを検出する。しかしながら、制限酵素による処理を用いるため、制限酵素が認識する配列のみにしか適用できないという問題があった。また、メチルシトシンの検出は蛍光の消失によって検出されるため、度々バックグラウンドの問題が生じてしまう。

これらのことから、簡便で一般的な他のメチルシトシン検出法の開発が大きな研究課題になっている。

ところで、ビタミンＫ３として知られる２−メチル−１，４−ナフトキノンは光酸化剤として機能し、各種核酸塩基を一電子酸化することが報告されている（文献５）。具体的には、ナフトキノン存在下では、紫外線照射により５−メチル−２’−デオキシシチジンが５−ホルミル−２’−デオキシシチジンや５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンなどの酸化体に変換されることが報告されている。

ナフトキノンの有するこのような特性に着目し、本願発明者らは以前、ナフトキノンの光化学反応特性を応用し、メチルシトシンの検出を行うことを提唱した（文献６）。この方法によれば、上述の各検出方法が有している問題を解消することができる。

この方法では、メチルシトシンの検出対象となるＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡオリゴマーの末端部分にナフトキノンを導入し、下記の化学式

（ただし、ＸはＤＮＡオリゴマーを表す）
で表される修飾ＤＮＡオリゴマーを合成し、この修飾ＤＮＡオリゴマーを対象ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。そして、ハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡに光照射を行う。このとき、メチルシトシンはナフトキノンの光酸化によって切断され、一方、非メチルシトシンは切断されない。よって、光照射した後の２本鎖ＤＮＡをＰＡＧＥにより解析することによって、メチルシトシンの存在を、切断バンドとして検出することができる。

しかしながら、ナフトキノンを利用した従来の方法では、検出対象となるメチルシトシンの近傍にグアニン連続配列（グアニン−グアニン）が存在すると、メチルシトシン部位だけでなく、この連続配列の５’側でも切断が生じてしまうという問題が報告されている（文献６）。

一般に、遺伝子中のメチルシトシンは、Ｃ−Ｇペアが豊富に存在する配列で形成されやすいため、グアニン塩基が多数存在する遺伝子配列においても、メチルシトシンを明瞭に検出することが望まれる。
（文献１）
Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８４，８１，１９９１．
（文献２）
Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．，Ｍｉｌｌａｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｗａｔｔ，Ｆ．，Ｇｉｇｇｅ，Ｇ．Ｗ．，Ｍｏｌｌｏｙ，Ｐ．Ｌ．，Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９，１８２７．
（文献３）
Ｈｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｇｒａｆｆ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｙｏｈａｎｅｎ，Ｓ．，Ｎｅｌｋｉｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６，９３，９８２１．
（文献４）
Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｓａｔｉｏ，Ｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１０２６２．
（文献５）
Ｄｏｕｋｉ，Ｔ．，Ｃａｄｅｔ，Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９，７５，５７１．
（文献６）
Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００５，１５，６６５．

本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、グアニン連続配列が存在する配列についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を提供することにある。

本発明に係る光機能性核酸は、上記課題を解決するために、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有していることを特徴とする。

「光機能性核酸」とは、メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部から光を照射することによりナフトキノンがメチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。

また、上記光機能性核酸は、次に示す一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’ …（１）
（ただし、式中、Ａ及びＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
によって表されるものであることが好ましい。

また、上記光機能性核酸は、上記一般式（１）中のＺが、次の化学式（２）〜（６）

（ただし、上記の化学式（２）〜（６）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。）
の何れか１つによって表されることが好ましく、化学式（２）によって表されることがより好ましい。

また、上記光機能性核酸は、ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化状態を判定するために用いられるものであることが好ましい。

また、上記光機能性核酸は、上記ポリヌクレオチドの配列が、判定対象のＤＮＡ鎖の塩基配列と相補的な配列に対して、８０％以上の相同性を有するものであることが好ましい。

また、上記光機能性核酸は、上記ナフトキノンが、上記ポリヌクレオチドの鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイズした際に上記ＤＮＡ鎖のシトシン塩基と対向する位置に挿入されていることが好ましい。

また、上記光機能性核酸は、上記ナフトキノンが、上記ポリヌクレオチドの鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイズした際に上記ＤＮＡ鎖のシトシン塩基と対向する塩基から５塩基以内の塩基と結合していることが好ましい。

本発明に係る光機能性核酸の製造方法は、上記課題を解決するために、１塩基以上の直鎖状の第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させることを特徴とする。

また、上記製造方法では、上記連結部分がホルミル基を有し、上記ナフトキノンを含有する化合物が、ナフトキノンのヒドラジン誘導体であってもよい。あるいは、上記連結部分がチオール基を有し、上記ナフトキノンを含有する化合物が、マレイミド基及びチオール基の少なくとも一方を有していてもよい。

また、上記製造方法では、上記修飾ポリヌクレオチド鎖を、ホスホロアミダイト法によって合成してもよい。

本発明に係るメチル化判定方法は、ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化の状態を判定するメチル化判定方法であって、上記課題を解決するために、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、上記ハイブリダイゼーション工程によってハイブリダイゼーションした光機能性核酸及び判定対象のＤＮＡ鎖に対して光照射を行う光照射工程と、光照射工程において光照射を行った判定対象のＤＮＡ鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んでいることを特徴とする。

また、上記光機能性核酸は、判定対象のシトシンを含む領域における上記ＤＮＡ鎖の塩基配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドにおいて、上記判定対象のシトシンとハイブリダイゼーションの際に対向する塩基がナフトキノン化合物によって置換されたものであることが好ましい。

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

本発明の一実施例を示すものであり、光機能核酸の構造を示す図である。 本発明の一実施形態を示すものであり、ナフトキノンのヒドラジン誘導体の合成方法を示す図である。 本発明の光機能核酸によって、ＤＮＡ鎖中のメチル化シトシンを切断する様子を示す図である。 本発明の一実施例を示すものであり、光機能核酸の合成スキームを示す図である。 本発明の第１の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。 本発明の第２の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。 本発明の第３の実施例を示すものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図である。

本発明の一実施形態について図１〜３に基づいて説明すると以下の通りである。

〔光機能性核酸〕
本実施形態の光機能性核酸は、ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化状態を判定するために用いることができるものである。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖と、このポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖部分によって、シトシンのメチル化状態を判定したいＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションすることができる。また、ハイブリダイゼーションさせた光機能性核酸及びＤＮＡ鎖に対して光照射を行うと、ＤＮＡ鎖における、光機能性核酸の近傍のシトシンがメチル化されている場合は、ナフトキノンによってメチルシトシン部分でＤＮＡ鎖が切断され、一方、シトシンがメチル化されていない場合は切断されない。

本明細書において「光機能性」とは、上述したように、外部から光を照射することによって、ナフトキノンがメチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有していることを指す。従って、本明細書において「光機能性核酸」とは、メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部から光を照射することによりナフトキノンがメチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。

また、本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、ＤＮＡの形態の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。また、ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの結合数は２個以上であればいくつでもよい。ポリヌクレオチドは、化学合成したものであってもよいし、自然環境から抽出したものであってもよい。

また、「ポリヌクレオチド鎖内部」とは、ポリヌクレオチド鎖の５’末端及び３’末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドを指す。

本明細書において、「ナフトキノン」とは、下記の化学式

によって表されるナフトキノン構造を有する化合物を指し、本発明に係る光機能性核酸は上記何れかのナフトキノン構造を含んでいればよい。なお、光機能性核酸が含むナフトキノンとしては、１，４−ナフトキノン、１，２−ナフトキノンに限定されるものではなく、それぞれのナフトキノンに置換基が導入された誘導体であってもよい。このような誘導体としては、例えばビタミンＫ_３として知られる２−メチル−１，４−ナフトキノンや、その２位のメチル基を他のアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、又はアミノ基に置換したものなどが挙げられる。さらに、芳香環上に、各種置換基（電子供与基としてアルキル基、アミノ基、アルコキシ基、若しくはヒドロキシ基等；又は電子吸引基としてニトロ基、若しくはハロゲン基等）が導入されていてもよい。本明細書では、以下、これらの誘導体を含むナフトキノン構造を有する化合物を単にナフトキノンという。

本実施形態に係る光機能性核酸では、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。これにより、ナフトキノンをＤＮＡオリゴマーの末端に導入した引用文献６の技術に比べて、ナフトキノンの可動範囲が限定され、非特異的なグアニン連続配列の酸化的切断を抑制することができる。

なお、光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端以外のヌクレオチドにナフトキノンが付加された化合物であってもよいし、あるいは、ポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端以外のヌクレオチドがナフトキノンによって置換されたものであってもよい。後者にかかる光機能性核酸は、下記の一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’ …（１）
（ただし、一般式（１）中、Ａ及びＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
と表すことができる。

上記の一般式（１）において、ナフトキノンを含有する化合物Ｚは、ヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基及びヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基と結合していることが好ましい。ポリヌクレオチドとナフトキノンとの結合方法は特に限定されるものではないが、例えば、上記の一般式（１）におけるＺが下記の化学式（２）

で表されるものであってもよい。

ただし、上記の化学式（２）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。

上記の化学式（２）によって表されるＺを含むポリヌクレオチド鎖の一例を図１に示す。また、これ以外の化合物Ｚの例として、次の化学式（３）〜（６）

であってもよい。これらの合成方法については、後述の〔光機能核酸の合成方法〕において説明する。

なお、ポリヌクレオチドとナフトキノンとを結合するリンカー部分は、なるべく短いものが好ましい。これにより、リンカー部分の構造的自由度が限定され、ナフトキノンによる非特異的な酸化的切断をさらに抑制することができる。

また、上記のポリヌクレオチドＡ及びＢは、ＤＮＡ鎖における、判定対象のシトシンを含む塩基配列と相補的な塩基配列に近いことが好ましい。この場合、ポリヌクレオチドＡ及びＢが、判定対象のＤＮＡ鎖と選択的にハイブリダイズできることが意図される。従って、ポリヌクレオチドＡ及びＢは、判定対象となるＤＮＡ鎖と同一の長さを有している必要はなく、ＤＮＡ鎖における、少なくとも判定対象のシトシンを含む部分領域の塩基配列とほぼ相補的な塩基配列であればよい。

具体的には、上記一般式（１）の５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’を例にすると、Ｚを一つの塩基と仮定した場合、ポリヌクレオチドＡ−Ｚ−Ｂが、ＤＮＡ鎖の、判定対象のシトシンを含む部分領域に相補的な配列と８０％以上の相同性を有していればよい。この場合、ＤＮＡ鎖側の塩基配列において、Ａの５’末端よりも５’側のミスマッチは相同性の算出には考慮せず、同様に、Ｂの３’末端よりも３’側のミスマッチも考慮しない。また相同性は、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、Ｚ以外の配列が１００％一致することが最も好ましい。

また、上記一般式（１）において、Ｚの位置は、光機能性核酸と判定対象のＤＮＡ鎖とがハイブリダイゼーションした際に、判定対象のシトシンと近接できる位置であることが望まれる。よって、Ｚは、ポリヌクレオチドＡ−Ｚ−Ｂと判定対象のＤＮＡ鎖とがハイブリダイゼーションするとき、判定対象のシトシンと対向するヌクレオチドから５’側又は３’側に５塩基以内に存在するヌクレオチドと結合していることが好ましく、３塩基、２塩基、１塩基の順にさらに好ましい。また、Ｚは、ポリヌクレオチドＡ−Ｚ−Ｂと判定対象のＤＮＡ鎖とがハイブリダイゼーションするときに、判定対象のシトシンと対向する位置に挿入されていることが特に好ましい。

これにより、ハイブリダイゼーションの際に、ナフトキノンを判定対象のシトシンに近接させることができるため、判定対象のシトシン以外の塩基における酸化的切断を抑制することができる。

〔光機能性核酸の合成方法〕
光機能性核酸は、ナフトキノンを導入する位置のヌクレオチドを脱塩基したポリヌクレオチド鎖に対して、ナフトキノン誘導体を縮合させることによって合成することができる。具体的な縮合方法の一例を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではなく、公知の他の様々な方法を用いてもよい。

まず、図２に示すように、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位にカルボン酸を導入し、その後、ヒドラジンを縮合することによってナフトキノンのヒドラジン誘導体を合成する。

一方で、ホスホロアミダイト法によって、下記の一般式（７）
５’−Ａ−Ｙ−Ｂ−３’ …（７）
で表される脱塩基前駆体修飾部を含む修飾ポリヌクレオチド鎖をＤＮＡシンセサイザー上で合成する。なお、一般式（７）において、Ａ及びＢは上述した判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド鎖である。また、Ｙは脱塩基前駆体修飾部であり、例えば下記の化学式（８）

によって表される化合物とすることができる。

なお、ホスホロアミダイト法とは、５つの反応ステップを繰り返すことによってオリゴマーの鎖長を伸長させる方法である（後藤俊夫、芝哲夫、松浦輝夫監修『有機化学実験の手引き４ −合成反応ＩＩ−』化学同人）。その５つのステップとは、次の通りである。
（１）サポート上のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）の除去によって５’末端水酸基を遊離させる。
（２）アミダイト化合物をテトラゾールの導入によって活性化させる。なお、脱塩基前駆体修飾部を付加する場合は、アミダイト化合物の代わりにアバシックホスホアミド（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いる。
（３）活性化させたアミダイト化合物をカラム上の５’末端水酸基と反応させる。
（４）未反応の５’末端水酸基をアセチル化（キャップ化）する。
（５）Ｉ_２−Ｈ_２Ｏによって酸化する。

この反応を所望の鎖長になるまで繰り返した後、酸性水溶液による保護基除去反応により、目的の修飾ポリヌクレオチド鎖（一般式（７）の化合物）を得ることができる。

そして、Ｙが上記の化学式で表される場合、修飾ポリヌクレオチド鎖に含まれるＹのジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムなどでホルミル基に変換する。

そして、上述したナフトキノンのヒドラジン誘導体を修飾ポリヌクレオチド鎖のホルミル基と縮合させることによって、下記の一般式（９）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’ …（９）
（ただし、Ｚは、

である）
で表される光機能性核酸を得ることができる。

なお、ホルミル基とヒドラジンとの縮合反応は酸性条件下で行うことが好ましく、ｐＨ５以上７以下がより好ましく、ｐＨ６が特に好ましい。また、反応温度は、室温以下で行うことが好ましく、１０℃以下がより好ましく、４℃が特に好ましい。これにより、修飾ポリヌクレオチド鎖にナフトキノンを導入することができる。

また、上述の例においては、修飾ポリヌクレオチド鎖とナフトキノンとを、ホルミル基とヒドラジンとの縮合によって結合させたが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、アルキルアミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンイミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させてもよい。この反応式の一例を次の反応式（１０）に示す。

なお、上記の反応式（１０）の詳細は、“Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００４，３２，６１５４−”に記載されており、本明細書ではこれを援用する。

また、別の例として、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンイミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させた例を次の反応式（１１）に示す。

なお、上記の反応式（１１）において、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば“Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１４７３２−１４７３３，２００４”に記載されている方法を参照して合成することができる。

また、さらに別の例として、アルキルチオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基又はチオール基を導入したナフトキノンの誘導体とを縮合させてもよい。チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基を導入したナフトキノンとを縮合させる反応式の一例を次の反応式（１２）に示す。

なお、上記の反応式（１２）において、チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば“Ｓｕｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，５７０８−５７０９”に記載されている方法を参照して合成することができる。

さらには、ナフトキノンを有する修飾核酸塩基（一塩基の修飾ヌクレオチド）を合成しておき、ＤＮＡシンセサイザーによって、任意の部分にこの修飾核酸塩基が挿入された修飾ポリヌクレオチド鎖を合成してもよい。例えば、下記の式（１３）のように、修飾核酸塩基としてナフトキノン含有ウリジン誘導体を合成しておき、これを含んだポリヌクレオチド鎖をＤＮＡシンセサイザーによって合成してもよい。

なお、上記の反応式（１３）において、ナフトキノン含有ウリジン誘導体は、例えば“Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，４８２０−４８２７，２００４”に記載されている方法を参照して合成することができる。

本発明に係る光機能性核酸は、ナフトキノンを含有するポリヌクレオチド鎖であれば、上記の方法や他の公知の方法によって得られる様々な産物が含まれる。

〔光機能性核酸の使用法（メチル化判定方法）〕
本実施形態の光機能性核酸は、ＤＮＡ鎖中のシトシンのメチル化状態を判定することができる。具体的には、光機能性核酸と判定対象のＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。なお、ハイブリダイゼーションは、定法に従って行えばよい。

次に、ハイブリダイゼーションによって、２本鎖を形成している判定対象のＤＮＡ鎖（図３の上側の鎖）及び光機能核酸（図３の下側の鎖）に対して、光照射を行う。なお、光照射反応は、光機能性核酸と判定対照のＤＮＡ鎖の間の二重鎖解離温度（Ｔｍ値）以下で行わなければならない。また、照射する光は、４００ｎｍ以下の波長であることが好ましく、３５０ｎｍ以下であることがより好ましく、３３０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。これにより、ナフトキノンの酸化的切断を誘起することができる。

ここで、図３の上段に示すように、ナフトキノンの近傍のシトシンが非メチル化状態である場合、ＤＮＡ鎖の酸化的切断は起こらない。一方、ナフトキノンの近傍のシトシンがメチル化状態である場合は、図３の下段に示すように、ＤＮＡ鎖の酸化的切断が起こる。

そして、光照射を行った後のＤＮＡ鎖の断片長を検出することによって、ＤＮＡ鎖が切断されているのかどうかを知ることができる。ここで、ＤＮＡ鎖が切断されていれば、目的のシトシンがメチル化されていたことが分かる。一方、ＤＮＡ鎖が切断されていなければ、目的のシトシンがメチル化されていなかったことが分かる。

なお、ＤＮＡ鎖の断片長を検出する方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）等を用いることができる。この場合、判定対象のＤＮＡ鎖を予め放射性同位元素で標識しておくことが好ましい。これにより、オートラジオグラフィーによって、高感度で切断バンドを検出することができる。

なお、本実施形態のメチル化判定方法では、メチル化シトシンの存在を、切断バンドの出現によって検出することができる。従って、従来のＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法やＰＮＡ−ＤＮＡ複合体における問題点であったバックグラウンドの問題を解決し、明確にメチル化の状態を判定することができる。

また、本実施形態のメチル化判定方法は、全工程を１０時間程度で行うことができる。これは、３日程度を要するＭＳＰ法に比べて、充分短い時間である。このように、本実施形態のメチル化判定方法によれば、迅速にメチル化の状態を判定することができる。

また、本実施形態のメチル化判定方法では、判定対象のシトシンを、光機能性核酸に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列によってターゲッティングし、シトシンの切断を、周辺の塩基配列に左右されることなく行うことができる。従って、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体のように、シトシン塩基の周辺配列によってはシトシンのメチル化を検出できないという問題が生じることがない。

［実施例］
本発明の一実施例について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔実験方法：全般〕
融点は、ＭＩＣＲＯＭＥＬＴＩＮＧ ＰＯＩＮＴ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ（ＹＡＮＡＧＩＭＯＴＯ社）によって決定した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、２７０ＭＨｚのＪＭＮ−ＧＳＸ−２７０分光計（ＪＯＥＬ社）又は３００ＭＨｚのＪＭＮ−ＡＬ−３００分光計（ＪＯＥＬ社）を用いて周囲温度にて測定した。化学シフトは、残留クロロホルム（δ＝７．２４ ｉｎ ^１Ｈ ＮＭＲ，δ＝７７．０ ｉｎ ^１３Ｃ ＮＭＲ）及び残留脱メチルスルホキシド（δ＝２．４９ ｉｎ ^１Ｈ ＮＭＲ，δ＝３９．５ ｉｎ ^１３Ｃ ＮＭＲ）を内標準として、テトラメチルシランからのダウンフィールドｐｐｍによって表した。ＦＡＢ質量スペクトルは、ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ（ＪＯＥＬ社）において記録した。オリゴヌクレオチドに対するマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析）は、２’，３’，４’−トリヒドロキシアセトフェノンをマトリックスとして、ＪＭＳ−ＥＬＩＴＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析装置（ＪＯＥＬ社）によって行った。

シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００（Ｗａｋｏ社）を用いた。反応のモニタリングには、予めコーティングされたＴＬＣプレートであるｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４（Ｍｅｒｃｋ社）を用いた。オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。Ａ，Ｔ，Ｇ，ＣやＡｂａｓｉｃ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ等のＤＮＡ合成装置用試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ヌクレアーゼＰ１（Ｐ１）、ホスホジエステラーゼＩは、それぞれＰＲＯＭＥＧＡ社、ＹＡＭＡＳＡ社、ＩＣＮ社から購入した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、６Ａ ＨＰＬＣシステム（島津社）又はＤ−７００ ＨＰＬＣシステム（日立社）を用いて行った。試料溶液は、逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３，ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，ｆ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、又はｆ １０ｍｍ×１５０ｍｍ）に注入した。移動相としては、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）ｐＨ７．０、及び１００％アセトニトリルからなる溶媒混合物を２５℃、流量０．６ｍＬ／分または３．０ｍＬ／分で送液した。

カラム溶離剤は、２５４ｎｍ又は２６０ｎｍのＵＶの吸光度によってモニタリングした。λ_ｅｘ＝３１２ｎｍでの光照射は、ＴＦＸ−２０Ｍ トランスイルミネータ（Ｌｏｕｒｍａｔ社）を用いて行った。

ゲル電気泳動は、Ｍｏｄｅｌ Ｓ２ 装置（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）によって行った。［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位／μＬ）は、それぞれＡｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社から入手した。全ての水溶液は、ＹＡＭＡＴＯ社ＷＲ６００Ａによる精製水を用いて調製した。ナフトキノンのカルボン酸誘導体１（３−カルボキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン）は、下記の論文で報告された方法に従って合成した（Ｓａｌｍｏｎ−Ｃｈｅｍｉｎ，Ｌ．；Ｂｕｉｓｉｎｅ，Ｅ．；Ｙａｒｄｌｅｙ，Ｖ．；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｓ．；Ｄｅｂｒｅｕ，Ｍ−Ａ．；Ｌａｎｄｒｙ，Ｖ．；Ｓｅｒｇｈｅｒａｅｒｔ，Ｃ．；Ｃｒｏｆｔ，Ｓ．Ｌ．；Ｋｒａｕｔｈ−Ｓｉｅｇｅｌ，Ｌ．；Ｄａｖｉｏｕｄ−Ｃｈａｒｖｅｔ，Ｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，５４８．）。

〔３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）の合成〕
まず、２−メチル−１，４−ナフトキノン（和光純薬工業株式会社製）をコハク酸と反応させ、コハク酸の酸化的脱カルボキシル化を通じて、３−カルボキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのカルボン酸誘導体１）を得た。次に、１００ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）の３−カルボキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノンを１ｍＬのＤＭＦに溶解した溶液に対して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド１塩酸塩（１５７ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１１０ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。この反応混合物に、ヒドラジン１水和物（６４ｍｇ，２ｍｍｏｌを０．２ｍＬのＤＭＦに溶解したもの）を加え、周囲温度で２時間攪拌した。この反応混合物を水で希釈した後、エチル酢酸によって反応混合物を抽出した。得られた有機層を鹹水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。

次に、得られた粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２，５０〜１００％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）の淡黄色固体を得た。この反応スキームを図４に示す。

なお、この固体の性質は以下の通りであった：融点１８２〜１８３℃，^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ９．００（ｂｒ，１Ｈ），δ ８．０６〜７．９６（ｍ，２Ｈ），７．８９〜７．８１（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｂｒ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １８３．８，１７０．３，１４３．５，１３５．４，１３１．６，１２６．１，３２．１，２６．８，１２．４；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ）ｍ／ｚ ２５９［（Ｍ＋Ｈ）^＋］；ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ［（Ｍ＋Ｈ）^＋］２５９．１０８３，ｆｏｕｎｄ ２５９．１０８２。

〔トリオール基を含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ７）の合成〕
Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ 合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位（脱塩基前駆体修飾部）を含むオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「オリゴマー」という）を標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。合成したオリゴマーの塩基配列については後述する。自動合成の後、得られたオリゴマーを逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配及び８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

次に、乾燥させたオリゴマーを２００μＬの８０％酢酸に懸濁し、室温にて３０分インキュベーションした。３０分後、反応混合物に等量の脱イオン水を加え、ＤＭＴ及びＴＢＤＭＳ基を取り除くためにさらに４時間室温にてインキュベーションした。

続いて、完全に脱保護されたオリゴマーを、逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配及び８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）によって精製した。

得られたオリゴマーの純度及び濃度を、３７℃においてＡＰ、Ｐ１、及びホスホジエステラーゼＩで４時間消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析装置によって確かめた（ＯＤＮ７：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ ５３３１．４３，ｆｏｕｎｄ ５３３２．２６）。

〔ＤＮＡ鎖の内部に２−メチル−１，４−ナフトキノンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＮＱ−ＯＤＮ２）の合成〕
脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位をもつＯＤＮ（１００μＭ）を、０．１ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０，８０μＬ）に溶かした０．５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムとともに４℃の遮光条件下で１時間インキュベーションした。得られた反応混合物に対して、上述のナフトキノンのヒドラジン誘導体３をアセトニトリル（５ｍＭ，８０μＬ）に溶解したものを加え、周囲温度で１４時間インキュベーションした。そして、得られた反応混合物を逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配及び８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）で精製し、ＮＱ−ＯＤＮ２を得た。この反応スキームを図４に示す。

得られたＮＱ−ＯＤＮ２の純度及び濃度は、ＡＰ１、Ｐ１、ホスホジエステラーゼＩによって３７℃で一晩完全に消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析装置によって確かめた（ＮＱ−ＯＤＮ２：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ ５５４１．６４，ｆｏｕｎｄ ５５４２．５９）。

〔５’−^３２Ｐ末端ラベルＯＤＮの調製〕
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ，４００ｐｍｏｌ 鎖濃度）に対して、４μＬの［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にてリン酸化することによって、ラベルを導入した。５’末端ラベルしたオリゴヌクレオチドは、エタノール沈殿によって回収し、さらに１５％の非変性ゲル電気泳動によって精製し、粉砕浸漬法（ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ ｍｅｔｈｏｄ）によって単離した。

〔ＤＮＡ鎖内部に２−メチル−１，４−ナフトキノンを含むオリゴヌクレオチド（ＮＱ−ＯＤＮ２）の光酸化実験及びＰＡＧＥ解析〕
３２Ｐにより５’末端ラベルしたＯＤＮ（４００ｎＭ未満の鎖濃度）を、２−メチル−１，４−ナフトキノンユニットを有する相補的なＯＤＮと、２０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を含む２ｍＭカコジル酸ナトリウム溶液中でハイブリダイゼーションさせた。なお、ハイブリダイゼーションは、試料溶液を９０℃で５分間加熱した後、室温まで緩やかに冷却することによって行った。

次に、^３２Ｐにより５’末端ラベルした２重鎖に対して、トランスイルミネータを用いて０℃条件下で３１２ｎｍの光照射を行った。光照射の後、１０μＬの全反応混合物に、ニシン精子ＤＮＡ又はサケ精子ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）、３Ｍ酢酸ナトリウム、及び８００μＬのエタノールを加え、全反応混合物を沈殿させた。次に、沈殿したＤＮＡを１００μＬの冷却した８０％エタノールによって洗浄し、真空下で乾燥させた。沈殿したＤＮＡを５０μＬの１０％ピペリジン（ｖ／ｖ）に溶解し、９０℃で２０分間加熱して濃縮した。

得られた試料について、アロカ １０００ 溶液シンチレーションカウンター（アロカ社）を用いて放射能を測定し、乾燥させたＤＮＡ沈殿物を８０％ホルムアミドローディングバッファー（８０％ ホルムアミド（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ キシレンシアノール、及び０．１％ ブロモフェノールブルーの溶液）に再懸濁した。そして、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によるＧ＋Ａシーケンス用反応物を含む全ての反応物を９０℃で３分間加熱変性させ、氷中で急速に冷却した。試料（３〜５×１０^３ｃｐｍ）を１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素シーケンス用ゲルにロードし、１９００Ｖで６０〜９０分電気泳動し、電気泳動したゲルを富士フィルム製 Ｘ線フィルム（ＲＸ−Ｕ）とともにカセットに移し、−８０℃で保管した。

電気泳動したゲルは、ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（ＡＴＴＯ社）を用いたオートラジオグラフィーによって解析した。なお、ピペリジン処理によって生じたスポットの強度は、体積積分によって求めた。

〔実施例１：ｐ−５３がん抑制遺伝子配列内の^ｍＣ部位の検出〕
本検出システムの有用性を検証するために、ナフトキノンを含有するオリゴデオキシヌクレオチドによるｐ５３がん抑制遺伝子配列内の^ｍＣ部位における光酸化反応を行った。

ｐ５３がん抑制遺伝子配列には、メチル化された５’−ＣｐＧ−３’が変異のｈｏｔ ｓｐｏｔとして存在することが報告されている（Ｔｏｒｎａｌｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９５，１０，１４９３．；Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２０００，１６，１６８．；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｒｎ，Ｐ．Ｇ．，Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１，６１，３２２５．）。本検証実験では、その一つであるｃｏｄｏｎ２８２（下記のＯＤＮ５，６の配列におけるＣＧＧ）を含む塩基配列を持つＤＮＡオリゴマーを検出対象に選んだ。なお、各実験手順の詳細は上述の通りである。

検出対象となるオリゴマーのうち、メチルシトシンを有さないオリゴマーをＯＤＮ５（５’−ＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧ−３’：配列番号１）、メチルシトシンを有するオリゴマーをＯＤＮ６（５’−ＡＧＡＧＡＣ^ｍＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧ−３’：配列番号２）とした。これらのオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。

また、ナフトキノンを導入する対象となるＯＤＮ７の配列は、基本的にはＯＤＮ５と相補的な配列とし、ＯＤＮ５及びＯＤＮ６のｃｏｄｏｎ２８２のメチル化されうるシトシン塩基の相補部位のみをトリオール基を有する化合物とした。具体的には、ＯＤＮ７の配列を３’−ＴＣＴＣＴＧＹＣＣＧＣＧＴＧＴＣＴＣ−５’とし、Ｙを、

とした。

そして、このＯＤＮ７を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、トリオール基をホルミル基に変換した後、３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）と縮合させ、ナフトキノンを導入したＤＮＡオリゴマー、ＮＱ−ＯＤＮ２を得た。このＮＱ−ＯＤＮ２の配列は、３’−ＴＣＴＣＴＧＺＣＣＧＣＧＴＧＴＣＴＣ−５’であり、Ｚは、

である。ＮＱ−ＯＤＮ２の全体の化学式を図１に示す。

そして、ＮＱ−ＯＤＮ２とメチルシトシンを有さないＯＤＮ５とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を^３２Ｐでラベル化したものをＮＱ−Ｃ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩとした。

また、ＮＱ−ＯＤＮ２とメチルシトシンを有するＯＤＮ６とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を３２Ｐでラベル化したものをＮＱ−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩとした。

さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していないＯＤＮ７とメチルシトシンを有さないＯＤＮ５とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を３２Ｐでラベル化したものをＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩとした。

同様に参照実験として、ナフトキノンを導入していないＯＤＮ７とメチルシトシンを有するＯＤＮ６とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を３２Ｐでラベル化したものを^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩとした。

これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応をＰＡＧＥにより追跡した。なお、ＮＱ−Ｃ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩ及びＮＱ−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩについては、光照射時間を０，１，２時間の各条件で行い、その他の試料については、光照射時間を２時間とした。その結果を図５に示す。また、図５における各レーンの条件をまとめたものを表１に示す。

図５のレーン９から分かるように、ＮＱ−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩに紫外線を照射した場合には、メチルシトシン部位が切断され、明確なバンドとして検出できることが示された。また、このとき、グアニン連続配列は切断されないことが示された。一方、レーン１，４，６から分かるように、その他の試料の場合には、シトシン部位やメチルシトシン部位での切断がほとんど起こらないことが示された。これらの結果から、ナフトキノンを導入した光機能性核酸を用いた光酸化反応とＰＡＧＥとを組み合わせた本検出システムは、遺伝子内部のメチルシトシン部位の検出に利用可能であることが検証された。

〔実施例２：ｐ−５３がん抑制遺伝子配列内の^ｍＣとチミンの識別〕
次に、本検出システムがメチルシトシンとチミンの識別をすることができるか否かを確かめた。チミンはメチルシトシンが脱アミノ化変異することによって生成されるが、光機能性核酸がメチルシトシン部位のみを選択的に切断することができれば、本検出システムがメチルシトシンとチミンの識別が可能であることになり、一層有効であると考えられる。

本実施例では、検出対象となるオリゴマーのうち、メチルシトシンを有するオリゴマーとして、実施例１のＯＤＮ６を用い、ＯＤＮ６のメチルシトシンの代わりにチミンを有するオリゴマーとして、ＯＤＮ１６（５’−ＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧ−３’：配列番号３）を用いた。これらのオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。また、ナフトキノンを導入した光機能性核酸としては、実施例１のＮＱ−ＯＤＮ２を用いた。

そして、ＮＱ−ＯＤＮ２とメチルシトシンを有するＯＤＮ６とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を^３２Ｐでラベル化したものをＮＱ−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩＩとした。

また、ＮＱ−ＯＤＮ２とチミンを有するＯＤＮ１６とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を３２Ｐでラベル化したものをＮＱ−Ｔ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩＩとした。

さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していないＯＤＮ７とチミンを有するＯＤＮ１６とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を３２Ｐでラベル化したものをＴ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩＩとした。

これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応をＰＡＧＥにより追跡した。光酸化実験及びＰＡＧＥ解析の詳細は、上述した実施例１と同様である。その結果を図６に示す。また、図６における各レーンの条件をまとめたものを表２に示す。

図６のレーン４から分かるように、ＮＱ−Ｔ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩＩに紫外線を照射した場合には、チミン部位が切断されなかった。一方、レーン７から分かるように、ＮＱ−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＩＩに紫外線を照射した場合には、メチルシトシン部位が切断された。以上のことから、本実施例の光機能性核酸は、メチルシトシンとチミンとを識別できることが検証された。

〔実施例３：ｐ−５３がん抑制遺伝子配列内の複数の^ｍＣ部位に対する選択的な検出〕
続いて、検出対象となるポリヌクレオチド鎖内に複数のメチルシトシン部位がある場合に、本検出システムが選択的に１つのメチルシトシン部位のみを検出できるか否かを確かめた。

本実施例では、複数のメチルシトシンを有するオリゴマーとして、ＯＤＮ２５（５’−ＡＧＡＧＡＣ^ｍＣ_７ＧＧ^ｍＣ_１０ＧＣＡＣＡＧＡＧ−３’：配列番号４）を用いた。ＯＤＮ２５は、５’末端から数えて７番目及び１０番目のシトシン塩基がメチル化されている。このオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。また、ナフトキノンを導入した光機能性核酸としては、実施例１のＮＱ−ＯＤＮ２を用いた。

そして、ＮＱ−ＯＤＮ２とＯＤＮ２５とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を^３２Ｐでラベル化したものをＮＱ５−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＶとした。

さらに参照実験として、ナフトキノンを導入していないＯＤＮ７とＯＤＮ２５とをハイブリダイゼーションさせ、５’末端を^３２Ｐでラベル化したものを５−^ｍＣ−ｄｕｐｌｅｘ ＩＶとした。

これらの各試料に対して上述した方法で光照射を行い、光酸化反応をＰＡＧＥにより追跡した。光酸化実験及びＰＡＧＥ解析の詳細は、上述した実施例１と同様である。その結果を図７に示す。また、図７における各レーンの条件をまとめたものを表３に示す。

図７のレーン４，５から分かるように、ＯＤＮ２５の^ｍＣ_７の相補部位にナフトキノンを導入したＮＱ−ＯＤＮ２を用いた場合、ＯＤＮ２５の２つのメチルシトシン塩基のうち、ナフトキノンと対向する^ｍＣ_７部位のみが選択的に切断された。以上のことから、本実施例の光機能性核酸は、メチルシトシンの検出対象となるポリヌクレオチド鎖内に複数のメチルシトシンが存在する場合であっても、ナフトキノンの相補部位に存在するメチルシトシン部位のみを選択的に切断できることが明らかとなり、特定のメチルシトシンを選択的に検出できることが検証された。

本発明に係る光機能性核酸は、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有した構成となっている。これにより、ナフトキノンの可動範囲を制限し、判定対象のシトシンに対してのみナフトキノンを接近させることができる。その結果、目的のメチルシトシンに対してのみ光酸化反応を誘起することができる。よって、グアニン連続配列が存在する配列についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定することができるという効果を奏する。

また、本発明に係る光機能性核酸の製造方法は、上述したように、１塩基以上の直鎖状の第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含むヌクレオチド化合物の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる構成となっている。これにより、グアニン連続配列が存在する配列についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定できる光機能性核酸を合成できるという効果を奏する。

また、本発明に係るメチル化判定方法は、上述したように、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、上記ハイブリダイゼーション工程によってハイブリダイゼーションした光機能性核酸及び判定対象のＤＮＡ鎖に対して、光照射を行う光照射工程と、光照射工程において光照射を行った判定対象のＤＮＡ鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んだ構成となっている。これにより、グアニン連続配列が存在する配列についても、シトシンのメチル化の状態を明瞭に判定できるという効果を奏する。

なお、本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書で示した数値範囲以外であっても、本発明の趣旨に反しない合理的な範囲であれば、本発明に含まれることはいうまでもない。

本発明によれば、簡便なシトシンのメチル化判定方法を実現できる。本発明のメチル化判定方法は、任意の塩基配列を持つ遺伝子に適用可能であるため、遺伝子診断、遺伝子解析、さらには遺伝子が関与する成体分子の相互作用の解明等、医学・生物学上幅広い分野で利用することができる。

Claims (13)

1. ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有していることを特徴とする光機能性核酸。
2. 次に示す一般式（１）
   ５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’ …（１）
   （ただし、一般式（１）中、Ａ及びＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
   によって表されることを特徴とする請求項１に記載の光機能性核酸。
3. 上記一般式（１）中のＺが、次の化学式（２）〜（６）
   

   

   

   

   

   

   （ただし、上記の化学式（２）〜（６）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。）
   の何れか１つによって表されることを特徴とする請求項２に記載の光機能核酸。
4. 上記一般式（１）中のＺが、上記化学式（２）によって表されることを特徴とする請求項３に記載の光機能核酸。
5. ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化状態を判定するために用いられることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の光機能性核酸。
6. 上記ポリヌクレオチドの塩基配列が、判定対象のＤＮＡ鎖の塩基配列と相補的な塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項５に記載の光機能性核酸。
7. 上記ナフトキノンが、上記ポリヌクレオチド鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイズした際に上記ＤＮＡ鎖のシトシン塩基と対向する位置に挿入されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の光機能性核酸。
8. 上記ナフトキノンが、上記ポリヌクレオチド鎖内部において、上記ポリヌクレオチドが判定対象のＤＮＡ鎖とハイブリダイズした際に上記ＤＮＡ鎖のシトシン塩基と対向する塩基から５塩基以内の塩基と結合していることを特徴とする請求項５又は６に記載の光機能性核酸。
9. １塩基以上の直鎖状の第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる工程を含む光機能性核酸の製造方法であって、
   上記連結部分がホルミル基を有し、
   上記ナフトキノンを含有する化合物が、ナフトキノンのヒドラジン誘導体であることを特徴とする光機能性核酸の製造方法。
10. １塩基以上の直鎖状の第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドとそれらの連結部分とを含む修飾ポリヌクレオチド鎖の上記連結部分に対して、ナフトキノンを含有する化合物を縮合させる工程を含む光機能性核酸の製造方法であって、
    上記連結部分がチオール基を有し、
    上記ナフトキノンを含有する化合物が、マレイミド基及びチオール基の少なくとも一方を有することを特徴とする光機能性核酸の製造方法。
11. 上記修飾ポリヌクレオチド鎖を、ホスホロアミダイト法によって合成することを特徴とする請求項９に記載の光機能性核酸の製造方法。
12. ＤＮＡ鎖に含まれるシトシンのメチル化の状態を判定するメチル化判定方法であって、
    ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを含む光機能性核酸を、上記ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、
    上記ハイブリダイゼーション工程によってハイブリダイゼーションした光機能性核酸及びＤＮＡ鎖に対して、光照射を行う光照射工程と、
    上記光照射工程において光照射を行ったＤＮＡ鎖の断片の長さを検出する断片長検出工程とを含んでいることを特徴とするメチル化判定方法。
13. 上記光機能性核酸は、判定対象のシトシンを含む領域における上記ＤＮＡ鎖の塩基配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドにおいて、上記判定対象のシトシンとハイブリダイゼーションの際に対向する塩基がナフトキノン化合物によって置換されたものであることを特徴とする請求項１２に記載のメチル化判定方法。

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