RU2781299C2 - Присоединение полимеразы к проводящему каналу - Google Patents
Присоединение полимеразы к проводящему каналу Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781299C2 RU2781299C2 RU2020142080A RU2020142080A RU2781299C2 RU 2781299 C2 RU2781299 C2 RU 2781299C2 RU 2020142080 A RU2020142080 A RU 2020142080A RU 2020142080 A RU2020142080 A RU 2020142080A RU 2781299 C2 RU2781299 C2 RU 2781299C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymerase
- nickel
- channel
- nitrilotriacetic acid
- nucleotide
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 110
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 100
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- ZTDCFXVUXBPHCE-UHFFFAOYSA-L 2-[bis(carboxylatomethyl)amino]acetate;hydron;nickel(3+) Chemical compound [H+].[Ni+3].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CC([O-])=O ZTDCFXVUXBPHCE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 15
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 31
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical class [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 10
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 48
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 14
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 12
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-Aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- -1 nanofilament Substances 0.000 description 11
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 9
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 9
- URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N trans-cyclooctene Chemical compound C1CCC\C=C\CC1 URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 9
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 8
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-Directed DNA Polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-Directed DNA Polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 7
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N Isoniazid Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N Carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 5
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 4
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 4
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 4
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 4
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 4
- 239000002074 nanoribbon Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002109 single walled nanotube Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N tetrazine Chemical compound C1=CN=NN=N1 DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 3
- OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N Bitoscanate Chemical compound S=C=NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Carbodicyclohexylimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 2
- DHFNCWQATZVOGB-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropyl(triethoxy)silane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN=[N+]=[N-] DHFNCWQATZVOGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 2
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- CJNBYAVZURUTKZ-UHFFFAOYSA-N Hafnium(IV) oxide Chemical compound O=[Hf]=O CJNBYAVZURUTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N N,N'-Diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100012460 POLM Human genes 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N Succinic anhydride Chemical compound O=C1CCC(=O)O1 RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 2
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 2
- JNFRPHKXOCFXJF-UHFFFAOYSA-N [N-]=[N+]=[N-].[N-]=[N+]=[N-] Chemical compound [N-]=[N+]=[N-].[N-]=[N+]=[N-] JNFRPHKXOCFXJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052803 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 2
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- XCCANNJCMHMXBZ-UHFFFAOYSA-N hydroxyiminosilicon Chemical compound ON=[Si] XCCANNJCMHMXBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 2
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N oxane-2,6-dione Chemical compound O=C1CCCC(=O)O1 VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical group 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N ({[({[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy}(hydroxy)phosphoryl)oxy](hydroxy)phosphoryl}oxy)phosphonic acid Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- ACSJXAKDVNDMME-UHFFFAOYSA-N 11-azidoundecyl(trimethoxy)silane Chemical group CO[Si](OC)(OC)CCCCCCCCCCCN=[N+]=[N-] ACSJXAKDVNDMME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 4-amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl]-1,2-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N Adenosine monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 Adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 210000001233 CDP Anatomy 0.000 description 1
- 210000003996 CFU-GM Anatomy 0.000 description 1
- 210000003229 CMP Anatomy 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N CMP group Chemical group P(=O)(O)(O)OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(=O)N=C(N)C=C1)O)O IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N Carbohydrazide Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N Cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N Cytidine diphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 108010014080 DNA Polymerase gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000016903 DNA Polymerase gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010076551 DNA polymerase C Proteins 0.000 description 1
- 101000255093 DNA polymerase eta Proteins 0.000 description 1
- 108010025600 DNA polymerase iota Proteins 0.000 description 1
- 108010061914 DNA polymerase mu Proteins 0.000 description 1
- DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-N Deoxyadenosine diphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine diphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N Deoxyribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N Guanosine diphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N Guanosine monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004140 HfO Inorganic materials 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N Inosine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229910015800 MoS Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- RUFLMLWJRZAWLJ-UHFFFAOYSA-N Nickel silicide Chemical compound [Ni]=[Si]=[Ni] RUFLMLWJRZAWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 102100019167 POLH Human genes 0.000 description 1
- 229920002224 Peptide nucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920001609 Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N Thymidine diphosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N Uridine monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N Uridine triphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N [N-]=C=O Chemical compound [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N [N-]=C=S Chemical compound [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N [O--].[Zn++].[In+3] Chemical compound [O--].[Zn++].[In+3] YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H [oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-G [oxido-[oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-G 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric Effects 0.000 description 1
- 108010013829 alpha subunit DNA polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminum Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 1
- LNENVNGQOUBOIX-UHFFFAOYSA-N azidosilane Chemical compound [SiH3]N=[N+]=[N-] LNENVNGQOUBOIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003152 bacteriophage T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- VQPFDLRNOCQMSN-UHFFFAOYSA-N bromosilane Chemical compound Br[SiH3] VQPFDLRNOCQMSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K dCDP(3-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 1
- UZXHZRFWCCZBDW-UHFFFAOYSA-N hydrazine;azide Chemical compound NN.[N-]=[N+]=[N-] UZXHZRFWCCZBDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002048 multi walled nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021334 nickel silicide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- PCECOBNFTOWLGE-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2,5-dione;azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-].O=C1NC(=O)C=C1 PCECOBNFTOWLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDMQPBFQKHOTOS-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2,5-dione;tetrazine Chemical compound C1=CN=NN=N1.O=C1NC(=O)C=C1 BDMQPBFQKHOTOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021428 silicene Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021332 silicide Inorganic materials 0.000 description 1
- FVBUAEGBCNSCDD-UHFFFAOYSA-N silicide(4-) Chemical compound [Si-4] FVBUAEGBCNSCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Substances [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000021037 unidirectional conjugation Effects 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлено устройство для обнаружения нуклеотидов, содержащее проводящий канал и от одной до пяти молекул полимеразы, присоединенных к проводящему каналу. Поверхность проводящего канала модифицирована множеством модификаторов поверхности. При этом проводящий канал содержит нанонить, а также множество линкеров, присоединяющих модификаторы поверхности к множеству комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Каждая из упомянутых одной или более молекул полимеразы содержит полигистидиновую метку, которая связана с одним или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Также предложены способы обнаружения встраивания нуклеотида в образующуюся нуклеотидную цепь. Изобретение позволяет обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Эта заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/862,767, поданной 18 июня 2019 года, полное содержание которой включено сюда по ссылке.
Предпосылки изобретения
[0002] Большинство существующих методов секвенирования, генотипирования и относящихся к ним платформ используют технологию "секвенирования посредством синтеза" (SBS) и основанные на флуоресценции способы обнаружения. В качестве дополнений к SBS желательны альтернативные способы секвенирования, которые предоставляют возможность более экономически эффективного, быстрого и удобного секвенирования и обнаружения нуклеиновых кислот. Секвенирование на основе заряда является привлекательным подходом. Что касается родственных способов и систем, то может быть полезной способность управляемым образом связывать полимеразу с подложкой и высвобождать полимеразу от связывания с подложкой, такой как подложка для обнаружения встраивания нуклеотида.
Сущность изобретения
[0003] В одном аспекте предложено устройство, включающее в себя проводящий канал и число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, причем это число составляет от одного до пяти, а проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы, и каждая из одной или более молекул полимеразы включают в себя гистидиновую метку, проводящий канал включает в себя комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты, и гистидиновая метка связана с комплексом никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0004] В одном примере число молекул полимеразы, связанных с упомянутым проводящим каналом, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
[0005] В другом аспекте предложен способ, включающий в себя присоединение от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты к проводящему каналу и присоединение полимеразы, включающей в себя гистидиновую метку, к одному или более комплексам никеля-нитрилотриуксусной кислоты, при этом проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы.
[0006] В одном примере число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере способ дополнительно включает в себя элюирование полимеразы из упомянутых от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриускусной кислоты, причем это элюирование включает в себя хелатирование никеля этилендиаминтетрауксусной кислотой или имидазолом. В еще одном примере способ дополнительно включает в себя перезагрузку фрагментов нитрилотриуксусной кислоты никелем с повторным образованием комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты и связывание полимеразы с повторно образовавшимися комплексами никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0007] В еще одном аспекте предложен способ, включающий в себя обнаружение встраивания, с помощью некоторого числа полимераз, одного или более нуклеотидов в одну или более образующихся полинуклеотидных цепей, комплементарных одной или более матричным полинуклеотидным цепям, причем каждая из одной или более полимераз присоединена к проводящему каналу, один или более из упомянутых одного или более нуклеотидов содержит зарядовую метку, а проводящий канал предназначен обнаруживать зарядовую метку во время встраивания, при этом каждая из упомянутых одной или более полимераз включает в себя гистидиновую метку, проводящий канал включает в себя комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты, и гистидиновая метка связана с комплексом никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0008] В одном примере число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
Краткое описание чертежей
[0009] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут лучше понятными при прочтении последующего подробного описания со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых:
[0010] Фиг. 1 показывает полимеразу, присоединенную к датчику заряда.
[0011] Фиг. 2 показывает Ni-NTA, присоединенную к полигистидиновой метке.
[0012] Фиг. 3 показывает пример присоединения NTA-группы к поверхности.
[0013] Фиг. 4 показывает пример процесса присоединения NTA-группы к поверхности.
[0014] Фиг. 5A и фиг. 5B показывают примеры последовательностей операций способов в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0015] Фиг. 6 - это график, представляющий результаты измерений, полученные для снабженного гистидиновой меткой белка, присоединенного к поверхности с помощью комплексов Ni-NTA в качестве присоединяющих фрагментов.
Подробное описание изобретения
[0016] В настоящее время существует необходимость в улучшенных устройствах, системах и способах для обнаружения в реальном времени нуклеотидов, встраиваемых посредством полимераз в таких способах. Привлекательным вариантом является обнаружение опосредованного полимеразами встраивания нуклеотидов с использованием проводящего канала, при этом полимераза привязывается к проводящему каналу, а нуклеотид включает в себя несущую заряд метку. Во время спаривания нуклеотида с комплементарным матричным нуклеотидом во время опосредованного полимеразой встраивания проводящий канал обнаруживает присутствие несущей заряд метки встраиваемого нуклеотида и, тем самым, идентичность встраиваемого нуклеотида.
[0017] В данном документе раскрыт способ управления числом молекул полимеразы, привязанных к данному проводящему каналу. Раскрытие предусматривает контролируемое привязывание достаточно малого числа полимераз к проводящему каналу, чтобы избежать обнаружения слишком многочисленных событий встраивания нуклеотидов, включая многократные, несопоставимые. Также предусмотрено привязывание полимеразы к проводящему каналу с достаточной прочностью связи, так что полимераза может оставаться связанной с проводящим каналом, причем столь долго, насколько это желательно.
[0018] Это раскрытие предоставляет примеры иммобилизации или присоединения нуклеотидной полимеразы к поверхности устройства для обнаружения встраивания нуклеотида в образующуюся нуклеотидную цепь или праймер, комплементарный матрице, для определения идентичности одного или более нуклеотидов в матрице. В одном примере присоединение является достаточно прочным или долговечным для того, чтобы предотвращать нежелательное отсоединение полимеразы от подложки, например, во время одного или более процессов, которые являются частью секвенирования, генотипирования или родственного способа идентификации одного или более нуклеотидов в матрице. Присоединение может также быть обратимым. Например, если достоверность, избирательность, эффективность, активность полимеразы или другие признаки полимеразы ухудшаются или имеют риск ухудшения, то полимераза может, как раскрыто здесь, быть контролируемым образом высвобождена с подложки, а новая полимераза присоединена к подложке.
[0019] Как также раскрыто здесь, можно управлять числом полинуклеотидов, иммобилизованных или присоединенных к подложке. В некоторых способах секвенирования посредством синтеза или родственных способах заранее заданное, низкое или иным образом в целом регулируемое число молекул полимеразы, прикрепленных или присоединенных к подложке, получается так, как раскрыто здесь. Например, в некоторых способах секвенирования посредством синтеза или родственных способах идентичность нуклеотида в молекуле-шаблоне, или молекуле-матрице (например, включает ли она в себя аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил в качестве своего азотистого основания), определяется посредством идентификации комплементарного с ним нуклеотида, встраиваемого в образующуюся полинуклеотидную цепь или праймер, гибридизируемую(ый) в матрицу, посредством полимеразы. В свою очередь, нуклеотиды для добавления в образующуюся нуклеотидную цепь или матрицу посредством полимеразы могут нести или включать в себя маркер или метку, обозначающий(ую) их идентичность. Обнаружение нуклеотида, встроенного посредством полимеразы таким образом, косвенно указывает на идентичность комплементарного нуклеотида матрицы.
[0020] Например, встраиваемые посредством полимеразы нуклеотиды могут содержать или включать в себя метку, которая несет заряд, или зарядовую метку. Когда такой помеченный зарядом нуклеотид сводится вместе с комплементарным ему основанием в матрице посредством полимеразы во время полимеризации, зарядовая метка может быть воспринята («почувствована») подложкой, к которой присоединена или иммобилизована полимераза, при этом подложка включает в себя проводящий канал. Проводящий канал для обнаружения модифицированного нуклеотида, включающего в себя заряд, может реагировать на окружающее электрическое поле. Это поле модулируется позиционированием модифицированного нуклеотида с зарядом в непосредственной близости к поверхности проводящего канала. Непосредственная близость зарядовых меток к поверхности может быть важной в некоторых случаях, например, если соль или другие ионы в растворе могут экранировать заряд от обнаружения проводящим каналом. Характерный радиус экранирования называется дебаевским радиусом, за пределами которого проводящий канал может быть неспособным обнаруживать заряд.
[0021] Например, проводящий канал может быть наноструктурированным транзистором, таким как нанонить или другая наномасштабная, стробируемая зарядом, электрически полупроводящая наноструктура. Нанонить может иметь диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. Например, нанонить может иметь диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм, такую как примерно 130 нм. В других примерах нанонить может быть от примерно 50 нм до 5 мкм длиной, такой как от примерно 50 нм до примерно 100 нм, примерно 50 нм, примерно 60 нм, примерно 70 нм, примерно 80 нм, примерно 90 нм длиной, или примерно 100 нм длиной, или примерно 100-150 нм, примерно 100 нм, примерно 110 нм, примерно 120 нм, примерно 130 нм, примерно 140 нм длинной или примерно 150 нм длиной, или примерно 150-200 нм, примерно 150 нм, примерно 160 нм, примерно 170 нм, примерно 180 нм, примерно 190 нм длиной, или примерно 200 нм длинной, или примерно 200-250 нм, примерно 200 нм, примерно 210 нм, примерно 220 нм, примерно 230 нм, примерно 240 нм длиной или примерно 250 нм длиной, или примерно 250-300 нм, примерно 250 нм, примерно 260 нм, примерно 270 нм, примерно 280 нм, примерно 290 нм длиной, или примерно 300 нм длиной, или примерно 300-350 нм, примерно 300 нм, примерно 310 нм, примерно 320 нм, примерно 330 нм, примерно 340 нм длиной, или примерно 350 нм длиной, или от примерно 350 нм до примерно 400 нм, примерно 350 нм, примерно 360 нм, примерно 370 нм, примерно 380 нм, примерно 390 нм длиной или примерно 400 нм длиной, или от примерно 400 нм до примерно 500 нм, примерно 400 нм, примерно 410 нм, примерно 420 нм, примерно 430 нм, примерно 440 нм длиной или примерно 450 нм длиной, или от примерно 500 нм до примерно 750 нм, примерно 500 нм, примерно 550 нм, примерно 600 нм, примерно 650 нм, примерно 700 нм длиной или примерно 750 нм длиной, или от примерно 750 нм до примерно 1 мкм, примерно 750 нм, примерно 800 нм, примерно 850 нм, примерно 900 нм, примерно 950 нм длиной, или примерно 1 мкм длиной, или от примерно 1 мкм до примерно 1,5 мкм, примерно 1 мкм, примерно 1,1 мкм, примерно 1,2 мкм, примерно 1,3 мкм, примерно 1,4 мкм длиной, или примерно 1,5 мкм длиной, или от примерно 1,5 мкм до примерно 2 мкм, примерно 1,5 мкм, примерно 1,6 мкм, примерно 1,7 мкм, примерно 1,8 мкм, примерно 1,9 мкм длиной, или примерно 2,0 мкм длиной, или от примерно 2,0 мкм до примерно 2,5 мкм, примерно 2,0 мкм, примерно 2,1 мкм, примерно 2,2 мкм, примерно 2,3 мкм, примерно 2,4 мкм длиной, или примерно 2,5 мкм длиной, или от примерно 2,5 мкм до примерно 3 мкм, примерно 2,5 мкм, примерно 2,6 мкм, примерно 2,7 мкм, примерно 2,8 мкм, примерно 2,9 мкм или примерно 3,0 мкм длиной, или от примерно 3,0 мкм до примерно 3,5 мкм, примерно 3,0 мкм, примерно 3,1 мкм, примерно 3,2 мкм, примерно 3,3 мкм, примерно 3,4 мкм или примерно 3,5 мкм длиной, или от примерно 3,5 мкм до примерно 4,0 мкм, примерно 3,5 мкм, примерно 3,6 мкм, примерно 3,7 мкм, примерно 3,8 мкм, примерно 3,9 мкм или примерно 4,0 мкм длиной, или от примерно 4 мкм до примерно 5 мкм, примерно 4,0 мкм, примерно 4,2 мкм, примерно 4,4 мкм, примерно 4,6 мкм, примерно 4,8 мкм или примерно 5,0 мкм длиной, или длиннее или короче, или любой длины в пределах этих диапазонов или между этими диапазонами.
[0022] Временное присутствие зарядовой метки во время полимеризации посредством полимеразы может быть обнаружено проводящим каналом, регулируя протекание тока через него. В некоторых примерах различные нуклеотиды, включающие в себя отличающиеся друг от друга азотистые основания, могут включать в себя зарядовые метки, чей заряд отличается друг от друга, так что проводящий канал может реагировать по-разному на присутствие нуклеотидов, содержащих азотистые основания, которые отличаются друг от друга.
[0023] Используемый в данном документе термин "присоединен" или "связан" относится к состоянию двух сущностей, являющихся объединенными, скрепленными, сцепившимися или соединенными друг с другом. Например, компонент реакции, такой как полимераза, может быть присоединен к или связан с твердофазным компонентом, таким как проводящий канал, ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется совместным использованием атомами пар электронов. Нековалентная связь является химической связью, которая не подразумевает совместное использование пар электронов и может включать в себя, например, водородные связи, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. Две сущности могут быть присоединены друг к другу или связаны друг с другом обратимо, что означает, что присоединение или связь между ними может быть образована, затем впоследствии разорвана или разрушена, затем, необязательно, образована повторно, возможно после замены одной из двух сущностей на другую сущность. В случае нековалентного присоединения, в некоторых примерах связывание двух сущностей друг с другом может требовать наличия другого фактора, такого как один или более металл или другой ион, чтобы предоставить возможность связывания двух сущностей вместе. В таких примерах присоединение или связь могут быть обратимыми в том, что удаление или хелатирование упомянутого одного или более металла или другого иона может приводить в результате к отсоединению двух сущностей друг от друга. Впоследствии, когда присутствие одного или более металла или другого иона возобновляется, две сущности могут снова становиться присоединенными или привязываются друг к другу.
[0024] Используемый в данном документе термин "электропроводящий канал" предполагается означающим участок устройства обнаружения, который преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Проводящий канал может быть электропроводящим каналом.
[0025] Неограничивающий пример полимеразы, присоединенной к датчику заряда, показан на фиг. 1. Вкратце, полимераза 1 может быть иммобилизована на затворе 5 полевого транзистора (FET) 2 с кремниевой нанонитью с помощью привязи 3. Необязательно, нанонить может быть выполнена из материала, отличного от кремния, или нанонить может быть заменена нанотрубкой. Примером матрицы является подлежащая секвенированию однонитевая ДНК (ssDNA) 4, которая связана с полимеразой 1 после ее введения в растворе вместе с нуклеотидами и другими реагентами. По мере того как комплементарная цепь синтезируется, создаются возмущения в распределении заряда поблизости от FET 2, либо в результате конформационных изменений полимеразы 1, либо вследствие присутствия нуклеотидов, возможно модифицированных электрически активной меткой, поблизости от FET 2. Такие модификации в распределении заряда воспринимаются FET 2 с нанонитью и обнаруживаются как модуляция в токе активной межэлектродной проводимости FET. Электропроводящий канал 5 может быть каналом проводящего канала 2. Проводящий канал 2 может включать в себя выводы S, D истока и стока и канал 5, соединяющий выводы S, D. Канал может иметь любые подходящие геометрические формы, например, форму трубки, нити, пластины и т.д.
[0026] Используемый в данном документе термин "проводящий канал" предполагается означающим устройство обнаружения, которое преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Например, проводящий канал может преобразовывать поступление или выбытие компонента реакции в электрический сигнал. Проводящий канал может также преобразовывать взаимодействия между компонентами реакции, или конформационные изменения в единственном компоненте реакции, в электрический сигнал. Проводящий канал может иметь любые подходящие геометрические формы. Например, канал может быть нанотрубкой, нанонитью, нанолентой и т.д. Проводящий канал может содержать любой подходящий электропроводящий материал. Этот проводящий материал может содержать органический материал, неорганический материал или тот и другой. Например, канал может содержать полупроводник. В одном примере канал содержит углерод. В другом примере канал содержит кремний. Примерный проводящий канал является полевым транзистором (FET), таким как FET на основе углеродной нанотрубки (CNT), одностенной углеродной нанотрубки (SWNT), FET с кремниевой нанонитью (SiNW), FET с графеновой нанолентой (и родственные FET с нанолентой, изготовленные из двумерных (2D) материалов, таких как MoS2, силицен и т.д.), туннельный FET (TFET) и устройства с резкой допороговой крутизной характеристики (см., например, Swaminathan et al., Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on Design Automation Conference, pg 1-6, ISBN: 978-1-4503-2730-5 (2014) и Ionescu et al., Nature 479, 329-337 (2011), каждая из которых включена сюда по ссылке во всей своей полноте). Примеры FET и SWNT-проводящих каналов, которые могут быть использованы в способах и приборах по настоящему изобретению, изложены в публикации заявки на патент США № 2013/0078622 A1, которая включена сюда по ссылке во всей своей полноте.
[0027] Выводы S, D на фиг. 1 могут содержать любой подходящий электропроводящий материал. Примеры подходящих материалов истока и стока включают кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия-олова (ITO), оксид индия-цинка, золото, платину, углерод и т.д.
[0028] Проводящий канал 5 может включать в себя любой проводящий или полупроводящий материал, который может окислять или восстанавливать редокс-активную зарядовую метку. Этот материал может содержать органический материал, неорганический материал или тот и другой. Некоторые примеры подходящих материалов канала включают кремний, углерод (например, стеклоуглерод, графен и т.д.), полимеры, такие как проводящие полимеры (например, полипиррол, полианилин, политиофен, поли(3,4-этилендиокситиофен), легированный поли(4-стиролсульфанатом) (PEDOT-PSS) и т.д.), металлы, биомолекулы и т.д. Электропроводящий канал 5 может преобразовывать поступление или выбытие компонента реакции (например, помеченного нуклеотида) в электрический сигнал. В раскрытых здесь примерах электропроводящий канал 5 может также преобразовывать взаимодействия между двумя компонентами реакции (матричной нуклеиновой кислотой и нуклеотидом помеченного нуклеотида) в обнаруживаемый сигнал посредством своего взаимодействия с редокс-активной зарядовой меткой помеченного нуклеотида.
[0029] В некоторых примерах проводящий канал 5 может также быть наноструктурой, которая имеет по меньшей мере один размер на наношкале (в диапазоне от 1 нм до менее чем 1 мкм). В одном примере этот размер относится к наибольшему размеру. В качестве примеров, электропроводящий канал 5 может быть полупроводящей наноструктурой, графеновой наноструктурой, металлической наноструктурой и наноструктурой из проводящего полимера. Наноструктура может быть много- или одностенной нанотрубкой, нанонитью, нанолентой и т.д.
[0030] В конкретных примерах прибор или способ по настоящему изобретению могут использовать глубоко масштабированные FinFET-транзисторы в качестве мономолекулярных проводящих каналов. Проводящие каналы FinFET получают выгоду от технологии уже на стадии разработки производителями самых современных полупроводников. Кроме того, могут быть использованы ранее опубликованные компоненты, включая, но не ограничиваясь ими, (1) компоненты, используемые для иммобилизации лизоцима на CNT, чтобы наблюдать процессивность фермента в реальном времени, как описано в Choi et al, Science, 335, 319 (2012), (2) компоненты, используемые для иммобилизации Pol 1 фрагмента Кленова на CNT и наблюдения процессивности ДНК в реальном времени, как описано в Olsen et al, J. Amer. Chem. Soc., 135, 7885 (2013), (3) компоненты, используемые для объяснения механизма трансдукции как движущихся заряженных остатков вследствие аллостерического движения белка, как описано в Chi et al, NanoLett 13, 625 (2013). Предложенные способы могут также применять прибор, компоненты прибора и способы, изложенные в публикации заявки на патент США № 2013/0078622 A1. Каждая из вышеупомянутых ссылок включена сюда по ссылке во всей своей полноте.
[0031] Используемый в данном документе термин "каждый", когда используется в указании на совокупность элементов, предназначен идентифицировать отдельный элемент в совокупности, но не обязательно ссылается на каждый элемент в совокупности. Исключения могут возникать, если явное раскрытие или контекст четко диктуют иное.
[0032] Используемый в данном документе термин "примерно", когда используется в указании на число, размер или результат измерения, включает в себя значение, которое может изменяться относительно указанного вслед за ним числового значения на величину вплоть до 5%, так что, например, "примерно 100" будет означать "от 95 до 105".
[0033] Используемый в данном документе термин "маркер", когда используется в указании на компонент реакции, предназначен означать обнаруживаемый компонент реакции или обнаруживаемый фрагмент компонента реакции. Полезным маркером является маркер заряда (также называемый зарядовой меткой), который(ая) может быть обнаружен(а) посредством проводящего канала. Маркер может быть присущим компоненту реакции, который должен обнаруживаться (например, заряженная аминокислота полимеразы), или маркер может быть неприсущим компоненту реакции (например, не встречающаяся в природе модификация аминокислоты). В некоторых примерах маркер может включать в себя множественные фрагменты, имеющие отдельные функции. Например, маркер может включать в себя связующий компонент, или линкер (такой как нуклеиновая кислота), и компонент зарядовой метки.
[0034] Используемый в данном документе термин "нуклеиновая кислота" подразумевается согласующимся с его использованием на данной области техники и включает в себя встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты или их функциональные аналоги. Особенно полезные функциональные аналоги способны гибридизоваться в нуклеиновую кислоту последовательным специфическим образом или пригодны для их использования в качестве матрицы для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, как правило, имеют скелет, содержащий фосфодиэфирные связи. Аналогичная структура может иметь чередующееся скелетное сцепление, включая любое из множества известных в данной области техники, такое как пептид-нуклеиновая кислота (ПНК или PNA) или закрытая нуклеиновая кислота (ЗНК или LNA). Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты обычно имеют дизоксирибозный сахар (например, обнаруживаемый в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)) или рибозный сахар (например, обнаруживаемый в рибонуклеиновой кислоте (РНК)).
[0035] Нуклеиновая кислота может содержать любой из множества разнообразных аналогов этих фрагментов сахара, которые известны в данной области техники. Нуклеиновая кислота может включать в себя нативные или ненативные основания. В этом отношении, нативная дезоксирибонуклеиновая кислота может иметь одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из аденина, тимина, цитозина или гуанина, а рибонуклеиновая кислота может иметь одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из урацила, аденина, цитозина или гуанина. Полезные ненативные основания, которые могут быть включены в состав нуклеиновой кислоты, известны в данной области техники.
[0036] Используемый в данном документе термин "нуклеотид" предназначен включать в себя природные нуклеотиды, их аналоги, рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды и другие молекулы, известные как нуклеотиды. Этот термин может быть использован для указания на мономерное звено, которое присутствует в полимере, например, чтобы идентифицировать субзвено, присутствующее в цепи ДНК или РНК. Термин может также использоваться для указания на молекулу, которая не присутствует в полимере в обязательном порядке, например, молекулу, которая способна встраиваться в полинуклеотид зависимым от матрицы образом посредством полимеразы. Термин может относиться к нуклеозидному звену, имеющему, например, 0, 1, 2, 3 или более фосфатов на 5'-углероде. Например, тетрафосфатные нуклеотиды, пентафосфатные нуклеотиды и гексафосфатные нуклеотиды могут быть особенно полезными, как и нуклеотиды с более чем 6 фосфатами, такие как с 7, 8, 9, 10 или более фосфатами, на 5'-углероде. Примерные природные нуклеотиды включают в себя, без ограничения, ATP, UTP, CTP и GTP (совокупно NTP), и ADP, UDP, CDP и GDP (совокупно NDP), или AMP, UMP, CMP или GMP (совокупно NMP), или dATP, dTTP, dCTP и dGTP (совокупно dNTP), и dADP, dTDP, dCDP и dGDP (совокупно dNDP), и dAMP, dTMP, dCMP и dGMP (dNMP). Примерные нуклеотиды могут включать в себя, без исключения, любой NMP, dNMP, NDP, dNDP, NTP, dNTP и другой NXp и dNXP, где X представляет собой число от 2 до 10 (совокупно NPP).
[0037] Неприродные нуклеотиды, также упоминаемые в данном документе как аналоги нуклеотидов, включают в себя те, которые не присутствуют в природной биологической системе или практически не встраиваются в полинуклеотиды посредством полимеразы в своей естественной среде, например, в нерекомбинантной клетке, которая экспрессирует полимеразу. Особенно полезные неприродные нуклеотиды включают в себя те, которые встраиваются в полинуклеотидную цепь посредством полимеразы со скоростью, которая является значительно более быстрой или более медленной по сравнению со скоростью, с которой другой нуклеотид, такой как природный нуклеотид, который спаривает основание с одним и тем же комплементарным основанием Уотсона-Крика, встраивается в цепь посредством полимеразы. В качестве примеров таких значительно более быстрых или более медленных скоростей, неприродный нуклеотид может быть встроен со скоростью, которая по меньшей мере примерно в 2 раза отличается, например, по меньшей мере примерно в 5 раз отличается, примерно в 10 раз отличается, примерно в 25 раз отличается, примерно в 50 раз отличается, примерно в 100 раз отличается, примерно в 1000 раз отличается, примерно в 10000 раз или более отличается по сравнению со скоростью встраивания природного нуклеотида. Неприродный нуклеотид может быть способен далее удлиняться после его встраивания в полинуклеотид. Примеры включают в себя аналоги нуклеотида, имеющие 3'-гидроксил, или аналоги нуклеотида, имеющие обратимый терминаторный фрагмент в 3'-позиции, который может быть удален, чтобы предоставить возможность дальнейшего удлинения полинуклеотида, который имеет встроенный аналог нуклеотида. Примеры обратимых терминаторных фрагментов, которые могут быть использованы, описаны, например, в патентах США №№ 7,427,673; 7,414,116; и 7,057,026 и PCT-публикациях WO 91/06678 и WO 07/123744, каждый(ая) из которых включен(а) сюда по ссылке во всей своей полноте. Будет понятно, что в некоторых примерах аналог нуклеотида, имеющий 3'-терминаторный фрагмент или лишенный 3'-гидроксила (такой как дидезоксинуклеотидный аналог), может быть использован в условиях, где полинуклеотид, который имеет встроенный аналог нуклеотида, далее не удлиняется. В некоторых примерах нуклеотид(ы) могут не включать в себя обратимый терминаторный фрагмент, или нуклеотид(ы) не будут включать в себя необратимый терминаторный фрагмент, или нуклеотид(ы) не будут включать в себя какой либо терминаторный фрагмент вообще. Аналоги нуклеотидов с модификациями в 5'-позиции также являются полезными.
[0038] Используемый в данном документе термин "компонент реакции" предназначен означать молекулу, которая принимает участие в реакции. Примеры включают в себя реагенты, которые расходуются в реакции, продукты, которые создаются в ходе реакции, катализаторы, такие как энзимы, которые облегчают реакцию, растворители, соли, буферы и другие молекулы.
[0039] Используемый в данном документе термин "терминаторный фрагмент", когда используется в указании на нуклеотид, означает ту часть нуклеотида, которая ингибирует или предотвращает образование нуклеотидом ковалентной связи со вторым нуклеотидом. Например, в случае нуклеотидов, имеющих пентозный фрагмент, терминаторный фрагмент может предотвращать образование фосфодиэфирной связи между 3'-кислородом нуклеотида и 5'-фосфатом второго нуклеотида. Терминаторный фрагмент может быть частью нуклеотида, который является мономерным звеном, присутствующим в полимере нуклеиновой кислоты, или терминаторный фрагмент может быть частью свободного нуклеотида (например, трифосфат нуклеотида). Терминаторный фрагмент, который является частью нуклеотида, может быть обратимым, так что терминаторный фрагмент может быть модифицирован, чтобы сделать нуклеотид способным формировать ковалентную связь со вторым нуклеотидом. В конкретных примерах терминаторный фрагмент, такой как обратимый терминаторный фрагмент, может быть присоединен к 3'-позиции или 2'-позиции пентозного фрагмента аналога нуклеотида.
[0040] Любая из множества разнообразных полимераз может быть использована в способе или составе, изложенном в данном документе, включая, например, белковые энзимы, изолированные из биологических систем, и их функциональные варианты. Ссылка на конкретную полимеразу, такую как приведенные в качестве примера ниже, будет пониматься как включающая ее функциональные варианты, пока не указано иное. Особенной полезной функцией полимеразы является катализ полимеризации цепи нуклеиновой кислоты с помощью существующей нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Другие функции, которые являются полезными, описываются где-либо еще в данном документе. Примеры полезных полимераз включают ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы, их функциональные фрагменты и рекомбинантные пептиды слияния, включающие их. Примерные ДНК-полимеразы включают полимеразы, которые были классифицированы по структурной гомологии на семейства, идентифицированные как A, B, C, D, X, Y и RT. ДНК-полимеразы в семействе A включают в себя, например, T7 ДНК-полимеразу, эукариотическую митохондриальную ДНК-полимеразу гамма, E. coli ДНК Pol I (включая фрагмент Кленова), Thermus aquaticus Pol I и Bacillus stearothermophilus Pol I. ДНК-полимеразы в семействе B включают в себя, например, эукариотические ДНК-полимеразы a, 6 и E; ДНК-полимеразу C; T4 ДНК-полимеразу, Phi29 ДНК-полимеразу, 9°N™ и RB69-бактериофаг ДНК-полимеразу. Семейство C включает в себя, например, E. coli ДНК-полимераза III альфа-субзвено. Семейство D включает в себя, например, полимеразы, полученные из подобласти эуриархеота для археи. ДНК-полимеразы в семействе X включают в себя, например, эукариотические полимеразы Pol beta, Pol simga, Pol lamda и Pol mu и S.cereviasiae Pol4. ДНК-полимеразы в семействе Y включают в себя, например, Pol eta, Pol iota, Pol kappa, E. coli Pol IV (DINB) и E. coli Pol V (UmuD'2C). Семейство RT (обратная транскриптаза) ДНК-полимераз включает в себя, например, ретровирусные обратные транскриптазы и эукариотические телемеразы. Примерные РНК-полимеразы включают в себя, но не ограничены ими, вирусные РНК-полимеразы, такие как T7 РНК-полимераза; эукариотические РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза I, РНК-полимераза II, РНК-полимераза III, РНК-полимераза IV и РНК-полимераза V; и архейская РНК-полимераза. Другие полимеразы, описанные в патенте США № 8,460,910, который включен сюда во всей своей полноте, также входят в число полимераз, которые упомянуты в данном документе, как и любые другие функциональные полимеразы, включая полимеразы, имеющие последовательности, модифицированные по сравнению с какими-либо из вышеупомянутых энзимов полимеразы, которые приведены просто в качестве перечня неограничивающих примеров.
[0041] Может быть желательным формировать присоединение между полимеразой и проводящим каналом, которое является достаточно прочным, чтобы выдерживать многократные этапы промывки или обработки во время секвенирования или другой реакции, например, во время проводимых в последовательности введения и удаления растворов, содержащих различные реагенты реакции. Различные применения SBS и родственных технологий используют перемещение твердотельной подложки и переносящего реагенты раствора и/или микрожидкостного, имеющего положительное или отрицательное давление потока, пассивного потока или другие текучие перемещения реагентов в растворе для того, чтобы поддерживать связывание реагентов с соответствующими участками (сайтами), тщательное распределение или удаление буфера, компонентов реакции, реагентов и других соединений во время этапов применения реагента и промывки. Присоединение полимеразы к проводящему каналу может преимущественно быть достаточно устойчивым, чтобы противостоять такому перемещению проводящего канала относительно реакционного раствора, или просто прохождению времени, без отсоединения полимеразы от проводящего канала.
[0042] Как раскрыто здесь, полимераза может быть модифицирована посредством добавления связующего фрагмента, а присоединяющий фрагмент может быть связан с проводящим каналом, так что полимераза может становиться присоединенной к проводящему каналу или связанной с ним. Присоединение между связующим фрагментом и присоединяющим фрагментом может быть достаточно прочным, чтобы противостоять потенциальным разрушениям, как описано выше. В некоторых примерах связующий фрагмент может включать в себя полимер или другой повтор одного или более субзвеньев, причем этот полимер связывается более прочно или эффективно с присоединяющим фрагментом, чем это делает мономер. В дополнительных примерах полимераза может включать в себя множественные полимеры, образующие комплекс связывающего фрагмента. Аналогично, присоединяющий фрагмент может иметь химический состав, способный образовывать присоединение со связывающим фрагментом полимеразы. Химический состав может включать в себя совокупность функциональных групп, которые вместе могут присоединяться к связывающему фрагменту или связываться с ним. В некоторых примерах проводящий канал может включать в себя комплекс множественных присоединяющих фрагментов, таких как множественные копии единственного присоединяющего фрагмента, чтобы усилить или улучшить связывание со связывающим фрагментом полимеразы.
[0043] В некоторых примерах присоединение или связывание между одним или более присоединяющими фрагментами проводящего канала и одним или более связывающими фрагментами полимеразы может быть улучшено с помощью или требовать наличия иона металла или другого иона или связывающего кофактора, без которого полимераза и проводящий канал присоединялись бы друг к другу или связывались бы друг с другом лишь слабо или вообще не связывались. В таких примерах такой связывающий кофактор может быть добавлен к проводящему каналу и полимеразе, так что их присоединяющие фрагменты и связывающие фрагменты могут присоединяться друг к другу. Затем, если желательно удаление полимеразы с проводящего канала, ион металла или другой ион или связывающий кофактор могут быть удалены, тем самым разрывая или разъединяя присоединение между проводящим каналом и полимеразой. Например, может быть введен хелатообразователь, причем этот хелатообразователь блокирует ион металла или другой ион или связывающий кофактор, препятствуя его связыванию с присоединяющим фрагментом и связывающим фрагментом.
[0044] В другом примере, если желательно удаление полимеразы с проводящего канала, может быть добавлена молекула, которая конкурирует с присоединяющим фрагментом проводящего канала за связывание со связывающим фрагментом полимеразы, или конкурирует со связывающим фрагментом полимеразы за связывание с присоединяющим фрагментом проводящего канала, с тем чтобы разрушить связывание между присоединяющим фрагментом и связывающим фрагментом. Таким образом, в том случае, когда проводящий канал включает в себя присоединяющий фрагмент A, который связывается со связывающим фрагментом B, включенным в состав полимеразы, излишек добавленных свободных молекул A, не связанных с проводящим каналом, может победить в конкурентной борьбе A-фрагменты присоединяющего фрагмента проводящего канала за связывание со связывающим B-фрагментом полимеразы. Связывающие B-фрагменты полимеразы будут тогда связываться со свободным A-фрагментам вместо A-фрагментов присоединяющего фрагмента проводящего канала, отсоединяясь от проводящего канала. Или же излишек добавленных свободных молекул B, не связанных с полимеразой, может победить в конкурентной борьбе B-фрагменты связывающего фрагмента полимеразы за связывание с присоединяющим A-фрагментом проводящего канала. Присоединяющий A-фрагмент проводящего канала тогда связывался бы со свободным B-фрагментом вместо B-фрагмента связывающего фрагмента полимеразы, так что полимераза отсоединяется от проводящего канала.
[0045] После отсоединения полимеразы от проводящего канала, будь то за счет удаления или хелатирования иона металла или другого иона или другого связывающего кофактора, либо за счет введения излишка свободных молекул присоединяющего фрагмента или связывающего фрагмента, полимераза может впоследствии быть повторно присоединена к проводящему каналу. Например, ион металла или другой ион или другой связывающий кофактор может быть заменен, или хелатирующий его агент удален, или свободный присоединяющий фрагмент или свободные молекулы связывающего фрагмента могут быть удалены, так что при повторном введении полимераза, включающая в себя связывающий фрагмент, может присоединяться к присоединяющему фрагменту проводящего канала.
[0046] Неограничивающий пример присоединяющего фрагмента и связывающего фрагмента показан на фиг. 2. В этом примере присоединяющий фрагмент включает в себя нитролотриуксусную кислоту (NTA), также называемую N,N-бис(карбоксиметил)глицином:
NTA, в присутствии ионов никеля, образует присоединение к полигистидину, такому как гексапептидная метка, содержащая шесть последовательных гексидиновых аминокислот (6-His). Другие примеры могут содержать больше или меньше остатков гистидина в качестве связывающего фрагмента. Фиг. 2 показывает опору (такую как проводящий канал), включающую в себя присоединяющий фрагмент NTA, образующий комплексное соединение с ионом никеля (Ni-NTA), связанным со связывающим фрагментом 6-His. В соответствии с таким примером, проводящий канал может включать в себя один или более NTA-фрагментов, а молекулы полимеразы могут включать в себя гистидиновую метку, такую как 6-His-метка. Как описано здесь, один или более присоединяющих фрагментов, таких как NTA-фрагменты, могут быть связаны с проводящим каналом, ковалентно или нековалентно, для связывания с одним или более связывающими фрагментами, такими как остатки гистидина, связанные, ковалентно или нековалентно, с полимеразой.
[0047] В этом примере связывание Ni-NTA с 6-His-меткой может быть разорвано в присутствии хелатирующего никель агента (комплексона никеля), такого как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Хелатирование никеля посредством добавления EDTA разрывает присоединение NTA к 6-His, приводя к отсоединению полимеразы от проводящего канала. В другом примере может быть добавлен излишек свободного имидазола или свободных соединений, включающих группу имидазола. Гистидин включает в себя группу имидазола, которая связывается с Ni-NTA, как показано на фиг. 2. Излишек свободного имидазола может победить в конкурентной борьбе имидазольные группы гистидина за связывание с Ni-NTA проводящего канала, отсоединяя полимеразу от проводящего канала.
[0048] В некоторых применениях увеличенное число связей присоединяющий фрагмент-связывающий фрагмент в расчете на одну полимеразу может быть желательным с тем, чтобы упрочнять связывание полимеразы с проводящим каналом. Увеличенное число присоединяющих фрагментов в расчете на один проводящий канал может обеспечить возможность более прочного присоединения полимеразы к проводящему каналу, так что вероятность непреднамеренного или нежелательного отсоединения минимизируется. Одним способом добиться этого может быть беспорядочное увеличение числа присоединяющих фрагментов, индивидуально присоединенных к проводящему каналу. В одном примере, когда присоединяющие фрагменты, такие как NTA-фрагменты, индивидуально связываются с проводящим каналом, просто увеличение плотности NTA-фрагментов, связанных с проводящим каналом, могло бы привести в результате к большему количеству точек присоединения для связывающего фрагмента, такого как полигистидиновая метка, к проводящему каналу.
[0049] Однако, у такого способа может быть несколько неблагоприятных недостатков. Одним недостатком может быть то, что независимое связывание отдельных присоединяющих фрагментов, таких как NTA, с поверхностью проводящего канала может приводить в результате к NTA-фрагментам, пространственно отделенным друг от друга настолько, что они не способствуют увеличению прочности связывания гистидиновой метки. NTA-фрагменты, которые пространственно отделены друг от друга таким образом, могут, каждый, связываться с гистидиновой меткой полимеразы, но не делают возможным связывание множественных NTA-фрагментов в расчете на проводящий канал, чтобы связываться с данной гистидиновой меткой полимеразы. Как следствие, подразумеваемая выгода упрочнения связи между полимеразой и проводящим каналом не будет достигнута или не будет максимизирована просто посредством увеличения числа отдельно связанных присоединяющих фрагментов, таких как NTA, в расчете на проводящий канал.
[0050] Другим возможным недостатком попытки увеличить прочность связывания полимеразы с проводящим каналом посредством простого увеличения числа индивидуально связанных присоединяющих фрагментов в расчете на проводящий канал, может быть потеря контроля над числом молекул полимеразы, которые могут быть связаны в расчете на проводящий канал. В некоторых примерах может быть желательным иметь только одну связанную молекулу полимеразы на проводящий канал. Определение идентичности одной или более матричных молекул посредством проводящего канала, как объяснено выше, может происходить в результате ассоциирования полимеразой нуклеотида с матрицей и присоединения нуклеотида к образующейся цепи. Зарядовая метка на нуклеотиде может быть воспринята проводящим каналом, модифицируя протекание тока по каналу. В некоторых примерах различные типы нуклеотидов могут иметь зарядовые метки, которые отличаются друг от друга, так что проводящий канал реагирует по-разному в зависимости от того, какой тип нуклеотида встраивается в образующуюся растущую цепь посредством полимеразы. Посредством экстраполяции обнаружение типа встраиваемого таким образом нуклеотида предоставляет возможность идентификации комплементарного нуклеотида матрицы.
[0051] При таком способе, если в расчете на проводящий канал связано более одной активной полимеразы, может быть повышенный шум в обнаружении встраивания нуклеотида. Если имеются две или более связанных активных полимеразы на проводящий канал, каждая может связывать молекулу матрицы и катализировать формирование комплементарной образующейся цепи. В таком примере одна полимераза может встраивать один тип нуклеотида, комплементарный одному нуклеотиду матрицы, в то время как другая полимераза встраивает другой тип нуклеотида, комплементарный другому нуклеотиду другой матричной молекулы. Проводящий канал может обнаруживать оба нуклеотида, или зарядовые метки нуклеотидов могут мешать друг другу и приводить к неточному считыванию или конфликтующим считываниям проводящим каналом. Во избежание такого результата может быть желательным предотвращать связывание более чем одной полимеразы в расчете на проводящий канал. Если множественные присоединяющие фрагменты, такие как NTA, независимо связываются с проводящим каналом, некоторые могут связываться с отличными друг от друга молекулами полимеразы, вместо того, чтобы все такие связанные на проводящий канал присоединяющие фрагменты связывались с одной и той же полимеразой. Поэтому в расчете на проводящий канал может связываться более одной полимеразы вместо этого, тогда как подразумеваемое упрочнение связи между полимеразой и проводящим каналом может не быть достигнуто или может быть минимизировано.
[0052] В данном документе раскрыты проводящий канал и способ создания и применения такого проводящего канала, причем этот проводящий канал включает в себя множественные присоединяющие фрагменты, связанные с ним в комплекс. Комплекс присоединяющих фрагментов, присоединенный на проводящий канал, может преодолевать недостатки множественных присоединяющих фрагментов, индивидуально присоединенных к раскрытому выше проводящему каналу. В одном примере в расчете на проводящий канал может быть связан единственный комплекс множественных присоединяющих фрагментов. Таким образом, множественные присоединяющие фрагменты в комплексе присоединяющих фрагментов могут присутствовать в достаточной близости друг к другу, так что они будут совместно связываться со связывающим фрагментом или связывающими фрагментами одной и той же полимеразы как одно с другим. Связывание комплекса присоединяющих фрагментов с проводящим каналом может тем самым позволить добиться выгоды упрочнения связи полимеразы с проводящим каналом. Кроме того, контролирование числа комплексов присоединяющих фрагментов, связанных в расчете на проводящий канал, может минимизировать, или в одном случае полностью предотвратить, нежелательное связывание слишком многих полимераз или большего чем желательное количества полимераз с проводящим каналом.
[0053] Хотя одна активная полимераза на проводящий канал может быть желательной в некоторых примерах, в других примерах может быть желательной более чем одна предназначенная для связывания полимераза на проводящий канал. Например, в условиях, когда в расчете на проводящий канал доступна только одна матричная молекула для реакции полимеразы, риск мешающего воздействия от реакций множественных полимераз на проводящий канал, с которым связывается более чем одна молекула полимеразы, может быть минимизирован или устранен. И, в некоторых примерах, может быть желательным иметь более одной связанной полимеразы на каждый проводящий канал. Например, когда только одна матричная молекула доступна для реакции полимеразы на каждом проводящем канале, может быть желательным иметь более одной связанной активной полимеразы на проводящий канал, чтобы увеличить вероятность связывания матричной молекулы с полимеразой для того, чтобы произошла реакция полимеразы. В других примерах может быть желательным связывание более одной полимеразы с проводящим каналом, например, в том случае, когда существует пул полимераз, и некая доля полимераз может быть неактивной или иметь низкую эффективность или процессивность. В таких случаях связывание более одной полимеразы на проводящий канал может быть желательным для достижения желаемого уровня процессивности на проводящий канал без жертвования соотношением сигнал-шум. Как будет ясно из последующего, управление числом комплексов присоединяющих фрагментов на проводящий канал с более чем одной полимеразой на проводящий канал в соответствии с настоящим изобретением может предоставлять возможность связывания одной или более чем одной полимеразы на проводящий канал, что может быть желательным при данном обстоятельстве. Например, одна, две, три, четыре, пять или более молекул полимеразы могут быть связаны с проводящим каналом в соответствии с настоящим изобретением, контролируемым образом, но контролируя число связанных кластеров присоединяющих фрагментов на проводящий канал, тогда как каждый кластер может приводить в результате к увеличенной прочности связывания в расчете на полимеразу по своей природе, включающей некоторое число присоединяющих фрагментов в достаточно тесной близости друг с другом, что каждый из них, или большинство из них, связываются со связывающим фрагментом или связывающими фрагментами одной и той же полимеразы, как и друг с другом.
[0054] Комплекс присоединяющих фрагментов может быть связан с проводящим каналом за счет построения разветвленной древо- или дендримеровидной структуры. В одном примере NTA-фрагмент может быть связан с проводящим каналом как первое поколение NTA. Второе поколение NTA-фрагментов может быть присоединено к карбоксильным группам первого поколения NTA. Из единственной точки присоединения первого поколения NTA добавление второго поколения NTA приводит к трем потенциальным участкам присоединения Ni-NTA для гистидиновой метки. Третье поколение NTA-фрагментов может затем быть присоединено к карбоксильным группам второго поколения NTA. Из единственной точки присоединения первого поколения NTA добавление второго, затем третьего поколения NTA приводит к девяти потенциальным участкам присоединения Ni-NTA для гистидиновой метки. Дальнейшие поколения NTA могут затем быть добавлены к последнему поколению, тем самым поступательно увеличивая число присоединяющих фрагментов на проводящий канал, в кластере, для улучшения прочности связывания полимеразы. Четыре, пять или более поколений NTA могут быть добавлены, давая в результате 27, 81 или дополнительное утроение NTA-фрагментов в расчете на комплекс присоединяющих фрагментов.
[0055] Может быть использован любой подходящий способ присоединения первого поколения NTA к проводящему каналу. Иллюстративный пример присоединяющего фрагмента, присоединенного к твердотельной подложке 300, такой как поверхность проводящего канала, изображен на фиг. 3. Подложка 310 может быть поверхностью проводящего канала или модифицированной поверхностью проводящего канала. Множество разнообразных материалов могут быть включены в состав поверхности проводящего канала, к которому может быть присоединена полимераза, включая возможные компоненты поверхностного канала, как перечислено и описано выше. Примеры могут включать оксинитрид кремния (SiON), диоксид кремния (SiO2) или диоксид гафния (HfO2).
[0056] Поверхность подложки 310 может быть модифицирована модификатором 320 поверхности, который обеспечивает возможность присоединения линкера 330 к поверхности 310. Линкер 320 может иметь реакционноспособную функциональную группу на каждом своем конце, например, на проксимальном конце X, близком к подложке 310, и дистальном конце Y, дальнем по отношению к подложке. Реакционноспособная группа X линкера 330 может быть выбрана так, чтобы быть реагирующей с модификатором 320 поверхности. Присоединяющий фрагмент 340 может затем быть присоединен к линкеру 330. Присоединяющий фрагмент 340 может иметь реакционноспособную группу Z, которая может реагировать с дальней реакционноспособной группой Y линкера. Модифицировав поверхность 310 модификатором 320 поверхности, к ней можно присоединить линкер 330, и присоединяющий фрагмент 340, присоединяемый к линкеру 330, создавая мостик от присоединяющего фрагмента 340 к поверхности 310. В некоторых примерах может не быть линкера 330, и реакционноспособная группа Z, присоединенная к присоединяющему фрагменту 340, может вместо этого непосредственно связываться со линкером 320 проводящего канала 310. Может быть использовано много подходящих пар модификатора 320 поверхности и проксимальной реакционноспособной группы X линкера 330 и дистальной реакционноспособной группы Y линкера 330 и реакционноспособной группы Z, присоединенной к присоединяющему фрагменту 340,. Неисключительный перечень возможных пар приведен в таблице 1.
[0057] Таблица 1: Неограничивающие примеры пар реакционноспособных групп для присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу
Модификатор поверхности | Линкер | Реакционноспособная группа присоединяющего фрагмента | ||
Концевая функциональная группа | Примеры | Проксимальная реакционноспособная группа X | Дистальная реакционноспособная группа Y | Z |
Амин | APTMS или APTE | NHS | Малеимид | тиол |
Азидосилан + фосфин (восстановление азида Штаудингера) | альдегид | Тиол | малеимид | |
Алкин | азид | |||
Азид | Алкин, DBCO | |||
DBCO | азид | |||
Тетразин | TCO | |||
TCO | тетразин | |||
Азид | C3- или C11-азидосилан | Алкин | NHS | амин |
Азидолиз эпокси- или бромосилана посредством NaN3 | DBCO | альдегид | Амин, гидразин, гидразид | |
APTMS или APTES+NHS-азид | Амин, гидразин, гидразид | альдегид | ||
малеимид | тиол | |||
тиол | малеимид | |||
тетразин | TCO | |||
TCO | тетразин | |||
Тетразин | APTMS или APTES + NHS-тетразин | TCO | NHS | амин |
малеимид | тиол | |||
альдегид | Амин, гидразин, гидразид | |||
Амин, гидразин, гидразид | альдегид | |||
тиол | малеимид | |||
азид | Алкин, DBCO | |||
DBCO | азид | |||
Гидразин или гидразид | ATPMS или APTES + цианурхлорид + гидразин | альдегид | NHS | амин |
APTMS или APTES + NHS-гидразид | Малеимид | тиол | ||
C3- или C11-азидосилан + алкин-гидразид | Тиол | малеимид | ||
APTMS или APTES + янтарный ангидрид или глутаровый ангидрид + карбогидразид + EDC | Алкин | азид | ||
Азид | Алкин, DBCO | |||
DBCO | азид | |||
Тетразин | TCO | |||
TCO | тетразин | |||
NHS | APTMS или APTES + янтарный ангидрид или глутаровый ангидрид + DCC/NHS или EDC/NHS | нет | нет | амин |
Эпокси | Эпоксисилан | |||
Альдегид | Альдегид силан | |||
Изотиоцианат | APTMS или APTES + PDITC | |||
Изоцианат | (3-изоцианатопропил)триетоксилан |
APTMS = (3-аминопропил)триметоксисилан; APTES = (3-аминопропил)триэтоксисилан; C3-азидосилан = 3-азидопропилтриэтоксисилан; C11-азидосилан = 11-азидоундецилтриметоксисилан; PDITC = p-фенилендиизотиоцианат; DBCO = дибензоциклооктин; TCO = транс-циклооктен.
[0058] В некоторых примерах линкер 330 может быть связан с модификатором 320 поверхности на одном этапе, за которым следует присоединение присоединяющего фрагмента 340 к линкеру 330 на другом этапе. В другом примере линкер 330 может быть связан с присоединяющим фрагментом 340 на одном этапе, затем линкер может быть связан с модификатором 320 поверхности на другом этапе. В еще одном примере линкер 330 может быть связан с модификаторам 320 поверхности и с присоединяющим фрагментом 340 на одном и том же этапе.
[0059] В одном примере аминогруппа может быть добавлена на поверхность проводящего канала в качестве модификатора поверхности посредством газофазной силанизации (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTMS). Затем может быть инкубирован бифункциональный N-гидроксисукцинимид-полиэтиленгликоль-малеимидный (NHS-PEGn-малеимидный) линкер, чтобы позволить NHS реагировать с и образовывать связь с аминогруппой на поверхности проводящего канала, что приводит к присоединению малеимидной группы NHS-PEGn-малеимидного линкера к поверхности проводящего канала. Тогда последующая инкубация тиола-NTA приведет к реакции тиол-малеимид, ведущей к ковалентному присоединению NTA-группы к NHS-PEGn-малеимидному линкеру в качестве первого поколения NTA. В некоторых примерах может быть выполнена совместная инкубация амидированной поверхности проводящего канала с NHS-PEGn-малеимидным линкером и тиолом-NTA, чтобы уменьшать число этапов обработки.
[0060] Второе поколение NTA может затем быть добавлено к первому поколению NTA посредством активации карбоксильных групп NTA карбонилдиимидидазолом (CDI), приводящей к присоединению трех имидазольных групп на NTA. Последующая инкубация с NTA-амином приводит к нуклеофильному замещению имидазольных групп и занятию каждого участка имидазола другой NTA. Таким образом, из первого поколения NTA может быть сформировано второе поколение NTA, включающее в себя комплекс трех присоединяющих фрагментов NTA. Примерные схемы, представляющие вышеупомянутые этапы, показаны ниже.
[0061] В этом примере, как описано выше, газообразная силанизация (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTMS) добавляет аминогруппу к гидроксигруппам на поверхности проводящего канала. Однокамерная инкубация с NHS-PEGn-малеимидным линкером и тиолом-NTA приводит к присоединению первого поколения NTA к поверхности проводящего канала.
[0062] Добавление второго поколения NTA может затем быть выполнено так, как описано выше и проиллюстрировано ниже.
[0063] На вышеприведенном этапе 1) карбоксильные группы первого поколения NTA активируют путем инкубации всю ночь с CDI в DMSO при комнатной температуре, высвобождения имидазольной группы и диоксида углерода и присоединения имидазольной группы на каждую карбоксильную группу первого поколения NTA. На втором этапе 2) осуществляют реакцию NTA-амина в присутствии NaCO3 при pH 8,5 при комнатной температуре всю ночь, приводящую к замещению имидазольной группы амином из NTA-амина и приводящую к присоединению трех групп второго поколения NTA к группе первого поколения NTA. В этом примере повторение вышеупомянутых этапов 1) и 2) приводит к образованию второго поколения NTA, давая в результате комплекс девяти присоединяющих фрагментов NTA.
[0064] Формирование второго, третьего и последующих поколений NTA может также быть осуществлено с помощью химизма образования перекрестных связей карбодиимидов. Например, карбоксильная группа на первом поколении NTA может быть активирована с использованием дициклогексилкарбодиимида (DCC), N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC) или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), в присутствии NHS или сульфо-NHS, образуя слабоустойчивый амин-реагирующий сложный эфир NHS, который может затем прореагировать с амином-NTA, образуя второе поколение NTA. Такой процесс может быть повторен с образованием многих поколений NTA, как раскрыто здесь для образования комплекса присоединяющих фрагментов. Могут быть использованы различные сочетания вышеупомянутых химических процессов добавления поколений NTA, например, в том случае, когда один тип химического процесса используется для добавления одного поколения NTA к предыдущему поколению NTA, а другой химический процесс может быть использован, чтобы сформировать последующее поколение NTA.
[0065] Модификация числа комплексов присоединяющих фрагментов в расчете на проводящий канал может быть осуществлена посредством модификации числа добавленных групп первого поколения NTA. Например, в вышеприведенных схемах, число добавленных малеимидных групп может быть модифицировано посредством инкубации с NHS-PEGn монофункциональным линкером, обогащенным переменными количествами NHS-PEGn-малеимидного бифункционального линкера. При более низких концентрациях NHS-PEGn-малеимидного бифункционального линкера больше аминогрупп будут реагировать с и связываться с молекулами PEG, лишенными малеимидных групп, которые, следовательно, не будут противодействовать связыванию с тиольной группой во время последующей инкубации с тиолом-NTA, приводя к более низким числам комплексов присоединяющих фрагментов NTA, становящихся присоединенными в расчете на твердофазную подложку или проводящий канал. Наоборот, увеличение концентрации NHS-PEGn-малеимидного бифункционального линкера относительно NHS-PEGn монофункционального линкера приводит к большему количеству аминогрупп, занятых молекулами PEG, связанными с малеимидными группами, и, следовательно, более высоким числам комплексов присоединяющих фрагментов NTA в расчете на твердофазную подложку или проводящий канал, следом за последующей инкубацией с тиолом-NTA.
[0066] Процесс присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу 400 показан на фиг. 4. Поверхность подложки 410, такую как твердофазная поверхность проводящего канала, силанизируют и добавляют реакционноспособную группу в качестве модификатора 420 поверхности. Модификатор 420 поверхности может затем реагировать со смесью молекул монофункционального линкера 430 и молекул бифункционального линкера 440. Монофункциональный линкер 430 и бифункциональный линкер 440 могут, каждый, иметь проксимальную функциональную группу, которая может реагировать с модификатором 420 поверхности, образуя связь и присоединение к подложке 410. Бифункциональный линкер 440 может дополнительно иметь дистальную функциональную группу, которая может реагировать с реакционноспособной группой молекулы присоединяющего фрагмента 450, образуя связь и присоединение к ней, причем эта дистальная функциональная группа может отсутствовать в монофункциональном линкере 430. Изменяя относительные концентрации монофункционального линкера 430 и бифункционального линкера 440, задействованных в реакции с модификатором 420 поверхности, можно получить различные концентрации и количества первоначальных присоединений присоединяющего фрагмента к поверхности 410 проводящего канала, на которых далее развивать комплексы присоединяющих фрагментов.
[0067] Пример последовательности операций способа в соответствии с аспектами настоящего изобретения представлен на фиг. 5A. В этом примере от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты присоединяют к проводящему каналу. Проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы. Этот пример дополнительно включает в себя присоединение содержащей гистидиновую метку полимеразы к одному или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Другой пример показан на фиг. 5B. В этом примере от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты присоединяют к проводящему каналу. Проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы. Этот пример дополнительно включает в себя присоединение содержащей гистидиновую метку полимеразы к одному или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Пример дополнительно включает в себя элюирование полимеразы из упомянутых от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Элюирование может включать в себя хелатирование никеля этилендиаминтетрауксусной кислотой или имидазолом.
[0068] В некоторых примерах, где NHS-PEGn монофункциональный линкер вводится в этап реакции с NHS-PEGn-малеимидным бифункциональным линкером, соотношение NHS-PEGn-малеимидного бифункционального линкера с NHS-PEGn монофункциональным линкером может быть где-то между 1:5 и 1:100000.
[0069] Как дополнительно раскрыто здесь, можно преимущественно добиться линкеров различных длин между присоединяющим фрагментом и поверхностью проводящего канала. В качестве неограничивающего репрезентативного примера, NHS-PEGn-малеимидный бифункциональный линкер может включать в себя большее число остатков PEG, чтобы удлинять расстояние между присоединяющим фрагментом, таким как NTA, и поверхностью проводящего канала, тогда как меньшее количество остатков PEG может быть включено, чтобы сокращать расстояние между присоединяющим фрагментом и поверхностью проводящего канала. Например, для NHS-PEGn-малеимида, n может быть любым числом между 0 и примерно 200, включая от 0 до примерно 24, или примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 11, примерно 12, примерно 13, примерно 14, примерно 15, примерно 16, примерно 17, примерно 18, примерно 19, примерно 20, примерно 21, примерно 22, примерно 23, примерно 24, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95, примерно 100, примерно 110, примерно 120, примерно 130, примерно 140, примерно 150, примерно 160, примерно 170, примерно 180, примерно 190 или примерно 200. Длина PEG в NHS-PEGn-малеимидном бифункциональном линкере и NHS-PEGn монофункциональном линкере может быть различной. Расстояние между полимеразой и проводящим каналом может быть выбрано на основе ряда признаков, включая желаемую мобильность присоединенной полимеразы или желаемое расстояние реакции полимеразы от проводящего канала. Что касается последнего, то длина или расстояние, на которое простирается зарядовая метка от нуклеотида для встраивания в образующуюся цепь посредством полимеразы, может быть соотнесена с предпочтительным расстоянием полимеразы от проводящего канала, например. Расстояние полимеразы от проводящего канала может составлять между примерно 1 нм и примерно 20 нм, включая от примерно 3 до примерно 10 нм, или примерно 1 нм, примерно 2 нм, примерно 3 нм, примерно 4 нм, примерно 5 нм, примерно 6 нм, примерно 7 нм, примерно 8 нм, примерно 9 нм, примерно 10 нм, примерно 11 нм, примерно 12 нм, примерно 13 нм, примерно 14 нм, примерно 15 нм, примерно 16 нм, примерно 17 нм, примерно 18 нм, примерно 19 нм или примерно 20 нм.
[0070] В других примерах сцепление между проводящим каналом и присоединяющим фрагментом может включать химические признаки, которые улучшают или стимулируют ближнее ассоциирование зарядовой метки нуклеотида с проводящим каналом во время полимеризации, усиливая или улучшая ее обнаружение проводящим каналом. В некоторых примерах зарядовая метка присоединяется к нуклеотиду для встраивания в образующуюся цепь посредством полимеразы, исходя из комплементарности к матричной цепи, посредством сцепления. Кроме того, присоединение между присоединяющим фрагментом и проводящим каналом может быть, включать или называться привязью. Чтобы увеличивать, улучшать или стимулировать ближнее ассоциирование зарядовой метки с проводящим каналом, например, улучшать обнаружение зарядовой метки проводящим каналом, сцепление нуклеотида и привязи может включать химические признаки, которые имеют электростатическое притяжение друг к другу.
[0071] Например, привязь может включать в себя полинуклеотидную последовательность, называемую акцепторной областью, а сцепление между зарядовой меткой и нуклеотидом может включать в себя полинуклеотидную последовательность, называемую областью специфичности. Акцепторная область может дополнительно быть комплементарной или отчасти комплементарной к области специфичности, например, посредством включения нуклеотидов в последовательность, которая может гибридизоваться. В таком примере, во время встраивания помеченного зарядом нуклеотида в образующуюся цепь во время секвенирования или другого процесса, электростатическое притяжение между областью специфичности и акцепторной областью может служить для приведения зарядовой метки в непосредственную близость с проводящим каналом, чтобы улучшить, усилить обнаружение зарядовой метки проводящим каналом, или способствовать или иным образом помочь такому обнаружению. Примеры спаривающихся химических составов для включения в область специфичности и акцепторную область, включая комплементарные нуклеотиды (например, последовательности A, T, G или C, или инозина, универсального основания, которое может спариваться со всеми четырьмя природными нуклеотидами ДНК), раскрыты где-либо еще, например, в Международной патентной заявке PCT/US/2019/018565, полное содержание которой включено сюда по ссылке.
[0072] Как будет понятно, имеются другие присоединяющие химические вещества для присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу. Приведенные выше примеры амина-NHS и малеимида-тиола являются лишь репрезентативными примерами, и могут быть использованы другие известные присоединяющие химические вещества, такие как, например, описанные в таблице 1 выше, или другие. Любое из этих или других, в равной степени подходящих присоединяющих химических веществ может быть использовано для присоединения присоединяющих фрагментов к поверхности проводящего канала.
[0073] Числом точек крепления к поверхности можно управлять посредством обогащения NHS-PEG, который лишен малеимидной группы, чтобы создать NTA. Это дает поверхность первого поколения Ni-NTA с контролируемыми функциональными группами NTA (фиг. 3). Поверхность 2-го поколения NTA создается посредством сначала активации карбонилдиимидазолом (CDI) карбоксильных групп из NTA 1-го поколения, за которой следует реакция с амином-NTA (фиг. 4). Это можно повторять, чтобы создавать поверхность с 3-им или даже более высоким поколением дендримерной NTA.
[0074] Примеры, изложенные ниже и указанные в формуле изобретения, могут быть поняты с учетом вышеприведенных определений.
Примеры
[0075] Последующее иллюстрирует конкретные неограничивающие примеры в соответствии с аспектами настоящего изобретения, но никоим образом не предназначено ограничивать его объем.
[0076] В одном примере одно, два или три поколения NTA сформировали на подложке в качестве тестовых комплексов присоединяющих фрагментов, как раскрыто здесь, затем связанных с флюоресцирующим зеленым белком (GFP), содержащим 6-His в качестве связывающего фрагмента, как раскрыто здесь (с линкером, включающим в себя PEG2). Затем количественно определили флуоресценцию после различных длительностей хранения при комнатной температуре вплоть до одной недели. Чтобы присоединять 6-His-помеченный GFP, поверхность с NTA кратковременно промыли с помощью 40 мМ NaOH или 100 мМ NaHCO3, затем водой, обеспечив депротонированный COOH. Для загрузки Ni поверхность инкубировали в 1% NiSO4 при комнатной температуре в течение 30 мин или 1 ч, после чего следовала 3-хкратная промывка водой, затем 2-хкратная промывка буферным раствором для иммобилизации белка (HEPES-буфером: 50 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,05% твин-20). Высокая концентрация соли и детергента помогает уменьшать неспецифичное связывание его белка-метки. Поверхность затем инкубировали с 6-His-GFP при желаемой концентрации (например, 1 или 10 мкг/мл) в буферном растворе для иммобилизации в течение 1 ч, с последующей 5-кратной промывкой буферным раствором.
[0077] Флуоресценцию в GFP снимали при сканирования Typhoon с помощью канала изотиоцианата флуоресцеина (ФИТЦ или FITC). Концентрацию GFP количественно определяли путем сначала элюирования GFP с поверхности с помощью имидазола (100-500 мМ) или EDTA (100-500 мМ), затем измерения интенсивности флуоресценции элюированного GFP в планшете с использованием считывателя планшета, с кривой калибровки, выполненной с известной концентрацией GFP.
[0078] Результаты показаны на фиг. 6. Уровни GFP были измерены после присоединения к одному поколению NTA (слева), двум поколениям NTA (посередине) или трем поколениям NTA (справа). В каждом наборе флуоресценция была измерена после варьирующихся длительностей времени, следующих за промывкой буферным раствором для иммобилизации, которые были следующими (представлены слева направо для каждого набора столбцов в гистограммах, представленных на фиг. 6): 0 ч, 1 ч, 3,5 ч, 5 ч, 1 день, 2 дня, 5 дней и 7 дней. Комплекс присоединяющих фрагментов, включающий третье поколение Ni-NTA, привел в результате к наивысшему связыванию 6His-GFP, которое также было наиболее устойчивым в течение периода в 7 дней. Немедленное падение между 0 ч и 1 ч происходило, вероятно, вследствие небольшого процента неустойчиво связанного GFP, с уровнями, присутствующими от 2 ч до 7 дней, представляющими устойчивое, специфичное связывание.
[0079] Хотя выше были изображены и подробно описаны примеры, специалистам в соответствующей области техники будет понятно, что могут быть выполнены различные модификации, добавления, замены и т.п. без отступления от сути настоящего изобретения, и поэтому они рассматриваются попадающими в рамки объема настоящего изобретения, которые определены в нижеследующей формуле изобретения.
[0080] Следует принимать во внимание, что все комбинации вышеприведенных принципов и дополнительных принципов, обсужденных более подробно в данном документе (при условии, что такие принципы не являются взаимно несовместимыми), предусмотрены являющимися частью объекта изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце этого раскрытия, предусмотрены являющимися частью объекта изобретения, раскрытого в данном документе.
Claims (36)
1. Устройство для обнаружения в реальном времени нуклеотидов, содержащее:
проводящий канал и от одной до пяти молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, при этом проводящий канал содержит нанонить, имеющую диаметр от 10 нм до 100 нм и длину от 50 нм до 300 нм, и при этом проводящий канал выполнен с возможностью обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы, а поверхность проводящего канала модифицирована множеством модификаторов поверхности,
множество линкеров, присоединяющих модификаторы поверхности к множеству комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты,
каждая из упомянутых одной или более молекул полимеразы содержит полигистидиновую метку, и полигистидиновая метка связана с одним или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
2. Устройство по п. 1, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет менее пяти.
3. Устройство по п. 1, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет менее четырех.
4. Устройство по п. 1, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет менее трех.
5. Устройство по п. 1, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, равно одной.
6. Устройство по любому из пп. 1-5, при этом комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты содержит девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
7. Устройство по любому из пп. 1-6, при этом нанонить имеет диаметр 30 нм и длину между 100 нм и 150 нм.
8. Устройство по любому из пп. 1-7, при этом линкер содержит множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
9. Способ обнаружения встраивания нуклеотида в образующуюся нуклеотидную цепь, содержащий:
обеспечение проводящего канала, который содержит нанонить, имеющую диаметр от 10 нм до 100 нм и длину от 50 нм до 300 нм, при этом поверхность проводящего канала содержит множество модификаторов поверхности, и при этом множество линкеров присоединяет модификаторы поверхности к множеству комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты,
присоединение от одной до пяти молекул полимеразы к проводящему каналу, причем каждая молекула полимеразы содержит полигистидиновую метку, связанную с одним или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты, при этом
проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы.
10. Способ по п. 9, содержащий присоединение менее пяти молекул полимеразы к проводящему каналу.
11. Способ по п. 9, содержащий присоединение менее четырех молекул полимеразы к проводящему каналу.
12. Способ по п. 9, содержащий присоединение менее трех молекул полимеразы к проводящему каналу.
13. Способ по п. 9, содержащий присоединение одной молекулы полимеры к проводящему каналу.
14. Способ по любому из пп. 9-13, при этом комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты содержит девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
15. Способ по любому из пп. 9-14, при этом нанонить имеет диаметр 30 нм и длину между 100 нм и 150 нм.
16. Способ по любому из пп. 9-15, при этом линкер содержит множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
17. Способ по любому из пп. 9-16, дополнительно содержащий элюирование полимеразы из упомянутых от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты, при этом элюирование содержит хелатирование никеля этилендиаминтетрауксусной кислотой или имидазолом.
18. Способ по любому из пп. 9-17, дополнительно содержащий повторную загрузку фрагментов нитрилотриуксусной кислоты никелем с повторным образованием комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты и связывание полимеразы с повторно образовавшимися комплексами никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
19. Способ обнаружения встраивания нуклеотида в образующуюся нуклеотидную цепь, содержащий:
обнаружение встраивания, с использованием от одной до пяти молекул полимеразы, одного или более нуклеотидов в одну или более образующихся полинуклеотидных цепей, комплементарных одной или более матричным полинуклеотидным цепям, при этом
от одной до пяти молекул полимеразы присоединены к проводящему каналу, проводящий канал содержит нанонить, имеющую диаметр от 10 нм до 100 нм и длину от 50 нм до 300 нм, при этом поверхность проводящего канала содержит множество модификаторов поверхности, и при этом множество линкеров присоединяет модификаторы поверхности к множеству комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты,
один или более из упомянутых одного или более нуклеотидов содержит зарядовую метку, и проводящий канал предназначен обнаруживать зарядовую метку во время встраивания, при этом
каждая из упомянутых молекул полимеразы содержит полигистидиновую метку, и полигистидиновая метка связана с одним или более из множества комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
20. Способ по п. 19, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к проводящему каналу, составляет менее пяти.
21. Способ по п. 19, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к проводящему каналу, составляет менее четырех.
22. Способ по п. 19, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к проводящему каналу, составляет менее трех.
23. Способ по п. 19, при этом число молекул полимеразы, присоединенных к проводящему каналу, равно одной.
24. Способ по любому из пп. 19-23, при этом комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты содержит девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
25. Способ по любому из пп. 19-24, при этом нанонить имеет диаметр 30 нм и длину между 100 нм и 150 нм.
26. Способ по любому из пп. 19-25, при этом линкер содержит множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/862,767 | 2019-06-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020142080A RU2020142080A (ru) | 2022-06-22 |
RU2781299C2 true RU2781299C2 (ru) | 2022-10-11 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2017100434A (ru) * | 2014-06-13 | 2018-07-18 | Торэй Индастриз, Инк. | Набор или устройство для обнаружения рака молочной железы и способ обнаружения |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2017100434A (ru) * | 2014-06-13 | 2018-07-18 | Торэй Индастриз, Инк. | Набор или устройство для обнаружения рака молочной железы и способ обнаружения |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
STRANGES, P. B., PALLA, M., KALASHNIKOV, S., NIVALA, J., DORWAT M. ET AL. Design and characterization of a nanopore-coupled polymerase for single-molecule DNA sequencing by synthesis on an electrode array. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(44), 01.11.2016. ZHEN G., FALCONNET D., KUENNEMANN E., VOROS J., SPENCER N. D., TEXTOR M., & ZURCHER S. Nitrilotriacetic acid functionalized graft copolymers: A polymeric interface for selective and reversible binding of histidine-tagged proteins. Advanced Functional Materials, 16(2), 243-251. 29.09.2005. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200348257A1 (en) | Biochemically activated electronic device | |
WO2018100370A1 (en) | Methods and systems for characterizing analytes using nanopores | |
AU2020365352A1 (en) | Systems and methods for detecting multiple analytes | |
RU2781299C2 (ru) | Присоединение полимеразы к проводящему каналу | |
AU2019221691B2 (en) | Charge-tagged nucleotides and methods of use thereof | |
US20210318265A1 (en) | Polymerase attachment to a conductive channel | |
NZ771208A (en) | Polymerase Attachment To A Conductive Channel | |
US20220090193A1 (en) | Attaching nucleotides to a polynucleotide with a polymerase |