JP2001136972A - 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法 - Google Patents
核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法Info
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- JP2001136972A JP2001136972A JP32419499A JP32419499A JP2001136972A JP 2001136972 A JP2001136972 A JP 2001136972A JP 32419499 A JP32419499 A JP 32419499A JP 32419499 A JP32419499 A JP 32419499A JP 2001136972 A JP2001136972 A JP 2001136972A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸固定化高分子ゲル及びその製造法の提供。
【解決手段】高分子表面及びその内部にグリシジル基を
介して核酸を固定化し、過剰のグリシジル基を多価アミ
ンで架橋することによって、核酸を効率的に強固に高分
子ゲルに固定化でき、さらにこのゲルを用いて検体中の
核酸を安定に、しかも高感度で検出できる。
介して核酸を固定化し、過剰のグリシジル基を多価アミ
ンで架橋することによって、核酸を効率的に強固に高分
子ゲルに固定化でき、さらにこのゲルを用いて検体中の
核酸を安定に、しかも高感度で検出できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸固定化高分子
ゲル及びその製造方法に関する。
ゲル及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つ
として、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子
発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸間
ハイブリダイゼーション反応や各種のＰＣＲ反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。これらの
方法では適用し得る遺伝子の数に制限があるが、今日の
ゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるよう
な、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・
系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を
可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）
と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発されてき
た。
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つ
として、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子
発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸間
ハイブリダイゼーション反応や各種のＰＣＲ反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。これらの
方法では適用し得る遺伝子の数に制限があるが、今日の
ゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるよう
な、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・
系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を
可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）
と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発されてき
た。
【０００３】本発明者らの一部は、先にマイクロアレイ
の新規な製造法を開発し、出願している。（特願平１１
−８４１００号明細書参照）該発明は、核酸固定化ゲル
をその中に保持する核酸固定化ゲル保持中空繊維配列体
を作製し、配列体の繊維軸と交差する方向に切断するこ
とにより薄片を得るものである。この薄片は固定化核酸
二次元高密度配列体、すなわちマイクロアレイである。
の新規な製造法を開発し、出願している。（特願平１１
−８４１００号明細書参照）該発明は、核酸固定化ゲル
をその中に保持する核酸固定化ゲル保持中空繊維配列体
を作製し、配列体の繊維軸と交差する方向に切断するこ
とにより薄片を得るものである。この薄片は固定化核酸
二次元高密度配列体、すなわちマイクロアレイである。
【０００４】核酸をゲルに固定化する試みはなされてお
り、例えば、ヒドロキシスクシンイミドを脱離基として
もつ共重合体ゲルにアミノ化ＤＮＡを固定化する方法
（Ｐｏｌｙｍ．Ｇｅｌ．Ｎｅｔｗ．，４，（２），１１
１（１９９６））、アルデヒド基を導入したポリアクリ
ルアミドゲルにアミノ化ＤＮＡを結合させる方法（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２４，３１４２（１
９９６））、メシル基を導入したポリアクリルアミドゲ
ルにアミノ化ＤＮＡを結合させる方法（ｉｂｉｄ．）、
ヒドラジド基を導入したポリアクリルアミドゲルにアル
デヒド化したＤＮＡを結合させる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，４９１３（１９９
６））等が知られている。しかしながら、操作性と実用
性の問題から、より優れた方法が求められていた。
り、例えば、ヒドロキシスクシンイミドを脱離基として
もつ共重合体ゲルにアミノ化ＤＮＡを固定化する方法
（Ｐｏｌｙｍ．Ｇｅｌ．Ｎｅｔｗ．，４，（２），１１
１（１９９６））、アルデヒド基を導入したポリアクリ
ルアミドゲルにアミノ化ＤＮＡを結合させる方法（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２４，３１４２（１
９９６））、メシル基を導入したポリアクリルアミドゲ
ルにアミノ化ＤＮＡを結合させる方法（ｉｂｉｄ．）、
ヒドラジド基を導入したポリアクリルアミドゲルにアル
デヒド化したＤＮＡを結合させる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，４９１３（１９９
６））等が知られている。しかしながら、操作性と実用
性の問題から、より優れた方法が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、操作性と実
用性の改良された核酸固定化高分子ゲル及びその製造法
を提供することを目的とする。
用性の改良された核酸固定化高分子ゲル及びその製造法
を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の問題
点を解決するために鋭意検討した結果、高分子ゲル表面
及びその内部にグリシジル基を介して核酸を固定化し、
過剰のグリシジル基を多価アミンで架橋することによっ
て、核酸を効率的に強固に高分子ゲルに固定化でき、さ
らにこのゲルを用いて検体中の核酸を安定に、しかも高
感度で検出できることを見出し本発明に到達した。
点を解決するために鋭意検討した結果、高分子ゲル表面
及びその内部にグリシジル基を介して核酸を固定化し、
過剰のグリシジル基を多価アミンで架橋することによっ
て、核酸を効率的に強固に高分子ゲルに固定化でき、さ
らにこのゲルを用いて検体中の核酸を安定に、しかも高
感度で検出できることを見出し本発明に到達した。
【０００７】すなわち、本発明は、核酸が高分子ゲル表
面及びその内部に結合、固定化された、核酸固定化高分
子ゲルの製造法に関する。
面及びその内部に結合、固定化された、核酸固定化高分
子ゲルの製造法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において、ゲルに固定化す
る対象となる核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。本発明に用い
る核酸は、市販品又は生細胞等から得られた核酸でもよ
い。
る対象となる核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。本発明に用い
る核酸は、市販品又は生細胞等から得られた核酸でもよ
い。
【０００９】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎ
らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３．
２３０３（１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出
については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８（１９８０））等に
より行うことができる。
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎ
らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３．
２３０３（１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出
については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８（１９８０））等に
より行うことができる。
【００１０】固定化する核酸としては、鎖状若しくは環
状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡが用いられる。
これらのＤＮＡは、制限酵素若しくは化学的に切断した
ＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮ
Ａ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等でも構わな
い。
状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡが用いられる。
これらのＤＮＡは、制限酵素若しくは化学的に切断した
ＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮ
Ａ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等でも構わな
い。
【００１１】本発明に用いることができる重合性モノマ
ーや多価アミンの種類は特に制限されない。グリシジル
基を有する重合性モノマーとしては、例えばグリシジル
（メタ）アクリレート等が挙げられる。他の重合性モノ
マーとしては、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、
Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アク
リロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリル
アミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタ
クリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン
等が挙げられる。多価アミンとしては、例えばエチレン
ジアミン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミ
ノペンタン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリ
アミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペン
タミン、ペンタエチレンヘキサミン、ジエチルアミノプ
ロピルアミン等が挙げられる。
ーや多価アミンの種類は特に制限されない。グリシジル
基を有する重合性モノマーとしては、例えばグリシジル
（メタ）アクリレート等が挙げられる。他の重合性モノ
マーとしては、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、
Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アク
リロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリル
アミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタ
クリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン
等が挙げられる。多価アミンとしては、例えばエチレン
ジアミン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミ
ノペンタン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリ
アミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペン
タミン、ペンタエチレンヘキサミン、ジエチルアミノプ
ロピルアミン等が挙げられる。
【００１２】核酸をグリシジル基を介して共有結合によ
りゲルに固定化する場合、あらかじめ核酸を修飾してお
く必要がある。修飾に際しては、グリシジル基と反応す
るものであれば特に制限を受けない。例えば、アミノ基
が導入されたものを用いることができる。
りゲルに固定化する場合、あらかじめ核酸を修飾してお
く必要がある。修飾に際しては、グリシジル基と反応す
るものであれば特に制限を受けない。例えば、アミノ基
が導入されたものを用いることができる。
【００１３】以下、核酸へのアミノ基の導入法に関して
説明する。アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本鎖
核酸との結合位置は、特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端又は３’末端のみならず核酸の鎖中、例え
ば、リン酸ジエステル結合部位又は塩基部位であっても
よい。
説明する。アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本鎖
核酸との結合位置は、特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端又は３’末端のみならず核酸の鎖中、例え
ば、リン酸ジエステル結合部位又は塩基部位であっても
よい。
【００１４】この一本鎖核酸誘導体は、特公平３−７４
２３９号、米国特許４，６６７，０２５号、米国特許
４，７８９，７３７号等明細書記載の方法に従い調製す
ることができる。
２３９号、米国特許４，６６７，０２５号、米国特許
４，７８９，７３７号等明細書記載の方法に従い調製す
ることができる。
【００１５】これらの方法以外にも、例えば、市販のア
ミノ基導入用試薬、例えば、アミノリンクＩＩ（ＰＥバ
イオシステムズジャパン社製）、Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｒｓ（クロンテック社製）などを用いて、又はＤ
ＮＡの５’末端のリン酸に、アミノ基を有する脂肪族炭
化水素鎖を導入する周知の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（１８），６５１３−（１９８
３））に従い調製することができる。
ミノ基導入用試薬、例えば、アミノリンクＩＩ（ＰＥバ
イオシステムズジャパン社製）、Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｒｓ（クロンテック社製）などを用いて、又はＤ
ＮＡの５’末端のリン酸に、アミノ基を有する脂肪族炭
化水素鎖を導入する周知の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（１８），６５１３−（１９８
３））に従い調製することができる。
【００１６】核酸の高分子ゲルへの固定化は、高分子ゲ
ルと核酸を混合することによって行うことができる。反
応率あるいは反応速度を考慮し、塩基などの触媒を用い
ることも可能である。
ルと核酸を混合することによって行うことができる。反
応率あるいは反応速度を考慮し、塩基などの触媒を用い
ることも可能である。
【００１７】固定化温度は、０〜１００℃が好ましく、
さらには、２０〜８０℃が好ましい。
さらには、２０〜８０℃が好ましい。
【００１８】核酸固定化高分子ゲルは、固定化された核
酸をプローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼ
ーションを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を
有する核酸の検出に用いることができる。
酸をプローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼ
ーションを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を
有する核酸の検出に用いることができる。
【００１９】本発明で言うプローブとは、狭義には検出
すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核
酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化高分子ゲルを検体
と反応させてハイブリダイゼーションを行い、プローブ
と相補的な検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形
成させ、このハイブリッドを検出することにより、目的
とする塩基配列を有する検体中の核酸を検出することが
できる。また、広義には、検体中に存在するタンパク質
や低分子化合物等と特異的に結合することができる核酸
を指す。
すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核
酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化高分子ゲルを検体
と反応させてハイブリダイゼーションを行い、プローブ
と相補的な検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形
成させ、このハイブリッドを検出することにより、目的
とする塩基配列を有する検体中の核酸を検出することが
できる。また、広義には、検体中に存在するタンパク質
や低分子化合物等と特異的に結合することができる核酸
を指す。
【００２０】したがって、核酸固定化高分子ゲルは、固
定化された核酸（プローブ）とハイブリッドを形成する
核酸を検出するための利用に限定されず、固定化された
核酸と特異的に結合するタンパク質や低分子化合物等の
各種試料、例えば生体成分等を検出するために利用する
ことも可能である。
定化された核酸（プローブ）とハイブリッドを形成する
核酸を検出するための利用に限定されず、固定化された
核酸と特異的に結合するタンパク質や低分子化合物等の
各種試料、例えば生体成分等を検出するために利用する
ことも可能である。
【００２１】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定さ
れるものではない。
説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定さ
れるものではない。
【００２３】実施例１ （１） ５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチ
ドの作製 以下に示したオリゴヌクレオチド（プローブＡ、プロー
ブＢ）を合成した。 プローブＡ：ＧＣＧＡＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴ
ＡＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣ（配列番号１） プローブＢ：ＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧ
ＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号２）
ドの作製 以下に示したオリゴヌクレオチド（プローブＡ、プロー
ブＢ）を合成した。 プローブＡ：ＧＣＧＡＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴ
ＡＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣ（配列番号１） プローブＢ：ＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧ
ＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号２）
【００２４】オリゴヌクレオチドの合成は、自動合成機
ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ｍｏｄｅｌ
３９４）（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて行い、
ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノリンクＩＩ（アプ
ライドバイオシステム社製）を用いてそれぞれのオリゴ
ヌクレオチドの５′末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入
しアミノ化したプローブを調製した。これらは、一般的
手法により脱保護及び精製して使用した。
ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ｍｏｄｅｌ
３９４）（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて行い、
ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノリンクＩＩ（アプ
ライドバイオシステム社製）を用いてそれぞれのオリゴ
ヌクレオチドの５′末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入
しアミノ化したプローブを調製した。これらは、一般的
手法により脱保護及び精製して使用した。
【００２５】（２）核酸固定化高分子ゲルの作製 （１）で得られたプローブＡ又はＢ（５００ｎｍｏｌ／
ｍｌ）５μｌ、及びグリシジルメタクリレート５μｌを
混合し、７０℃で２時間反応させた。そこへ５０％アク
リルアミド水溶液 ５０μｌ、１０％エチレンジアミン
水溶液 １０μｌおよび水 ４５０μｌ、１０％のアゾ
ビスイソブチロニトリル水溶液 ５μｌを加え、７０℃
で２時間重合反応を行い、核酸固定化高分子ゲルを作製
した。。作製した核酸固定化高分子ゲルは、５ｍｍの厚
さに切り出し、検出操作を行った。
ｍｌ）５μｌ、及びグリシジルメタクリレート５μｌを
混合し、７０℃で２時間反応させた。そこへ５０％アク
リルアミド水溶液 ５０μｌ、１０％エチレンジアミン
水溶液 １０μｌおよび水 ４５０μｌ、１０％のアゾ
ビスイソブチロニトリル水溶液 ５μｌを加え、７０℃
で２時間重合反応を行い、核酸固定化高分子ゲルを作製
した。。作製した核酸固定化高分子ゲルは、５ｍｍの厚
さに切り出し、検出操作を行った。
【００２６】（３） 試料核酸の標識 試料核酸のモデルとして、（１）で作製したオリゴヌク
レオチド（プローブＡ、プローブＢ）の配列の一部に相
補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチド Ｃ：ＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧ
ＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号３） オリゴヌクレオチド Ｄ：ＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣ（配列番号４）
レオチド（プローブＡ、プローブＢ）の配列の一部に相
補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチド Ｃ：ＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧ
ＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号３） オリゴヌクレオチド Ｄ：ＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣ（配列番号４）
【００２７】これらのオリゴヌクレオチドの５’末端
に、（１）と同様にしてアミノリンクＩＩ（ＰＥバイオ
システムズジャパン社製）を用いて、ＮＨ２（ＣＨ２）
６−を導入した後、以下のようにしてディゴキシゲニン
（ＤＩＧ：Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、ロシュ・ダイアグ
ノスティックス社製）で標識した。
に、（１）と同様にしてアミノリンクＩＩ（ＰＥバイオ
システムズジャパン社製）を用いて、ＮＨ２（ＣＨ２）
６−を導入した後、以下のようにしてディゴキシゲニン
（ＤＩＧ：Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、ロシュ・ダイアグ
ノスティックス社製）で標識した。
【００２８】末端アミノ化されたオリゴヌクレオチド
を、それぞれ終濃度２ｍＭとなるように１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した。等量のＤｉｇｏｘ
ｉｇｅｎｉｎ−３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ
−ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ−Ｎ−ｈ
ｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ
（２６ｍｇ／ｍｌ ジメチルホルムアミド溶液）を加
え、室温にて一晩静置した。
を、それぞれ終濃度２ｍＭとなるように１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した。等量のＤｉｇｏｘ
ｉｇｅｎｉｎ−３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ
−ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ−Ｎ−ｈ
ｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ
（２６ｍｇ／ｍｌ ジメチルホルムアミド溶液）を加
え、室温にて一晩静置した。
【００２９】容量を１００μｌに調整し、２μｌのグリ
コーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、１
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、３００μ
ｌの冷エタノールを加え、１５，０００ｒｐｍ、１５分
間、遠心分離を行い、沈殿を回収した。さらに、沈殿に
５００μｌの７０％エタノールを加え、１５，０００ｒ
ｐｍ ５分間、遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿
を風乾し、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。こうし
て得られたＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを試料核酸の
モデルとして用いた。
コーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、１
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、３００μ
ｌの冷エタノールを加え、１５，０００ｒｐｍ、１５分
間、遠心分離を行い、沈殿を回収した。さらに、沈殿に
５００μｌの７０％エタノールを加え、１５，０００ｒ
ｐｍ ５分間、遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿
を風乾し、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。こうし
て得られたＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを試料核酸の
モデルとして用いた。
【００３０】（４） ハイブリダイゼーション （２）で作製した核酸固定化高分子ゲル切片をハイブリ
ダイゼーション用のバッグに入れ、表１の組成からなる
ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、４５℃で３０
分間、プレハイブリダイゼーションを行い、（３）で得
られたＤＩＧ標識ＤＮＡを加え、４５℃で１５時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。 （ハイブリダイゼーション溶液組成） ５ＸＳＳＣ ５％ ブロッキング試薬（ＤＩＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
キット中の試薬） ０．０１％ Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム） ５０％ ホルムアミド
ダイゼーション用のバッグに入れ、表１の組成からなる
ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、４５℃で３０
分間、プレハイブリダイゼーションを行い、（３）で得
られたＤＩＧ標識ＤＮＡを加え、４５℃で１５時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。 （ハイブリダイゼーション溶液組成） ５ＸＳＳＣ ５％ ブロッキング試薬（ＤＩＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
キット中の試薬） ０．０１％ Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム） ５０％ ホルムアミド
【００３１】（５） 検出 ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定化高分子ゲル
切片を、あらかじめ保温しておいた５０ｍｌの０．１Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液に移し、振盪しながら４５
℃、２０分間、洗浄を３回行った。
切片を、あらかじめ保温しておいた５０ｍｌの０．１Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液に移し、振盪しながら４５
℃、２０分間、洗浄を３回行った。
【００３２】次に、ＤＩＧ緩衝液１（０．１Ｍ マレイ
ン酸、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））を
加え、室温で振盪しながらＳＤＳの除去を行った。これ
を再度繰り返した後、ＤＩＧ緩衝液２（ＤＩＧ緩衝液に
０．５％濃度でブロッキング試薬を添加したもの）を加
え１時間振盪した。緩衝液を除いた後、１０−４量の抗
ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ＤＩＧ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎキットの試薬）を含むＤＩＧ緩衝液２
１０ｍｌを加え、３０分間ゆっくり振盪させることに
より抗原抗体反応を行わせた。次に０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＤＩＧ緩衝液１で１５分間、２回振盪するこ
とにより洗浄し、引き続きＤＩＧ緩衝液３（０．１Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ 塩化ナトリウ
ム、０．０５Ｍ 塩化マグネシウム）に３分間浸した。
ＤＩＧ緩衝液３を除いた後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ
・ダイアグノスティックス社製）を含むＤＩＧ緩衝液３
ｍｌを加えた。
ン酸、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））を
加え、室温で振盪しながらＳＤＳの除去を行った。これ
を再度繰り返した後、ＤＩＧ緩衝液２（ＤＩＧ緩衝液に
０．５％濃度でブロッキング試薬を添加したもの）を加
え１時間振盪した。緩衝液を除いた後、１０−４量の抗
ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ＤＩＧ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎキットの試薬）を含むＤＩＧ緩衝液２
１０ｍｌを加え、３０分間ゆっくり振盪させることに
より抗原抗体反応を行わせた。次に０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＤＩＧ緩衝液１で１５分間、２回振盪するこ
とにより洗浄し、引き続きＤＩＧ緩衝液３（０．１Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ 塩化ナトリウ
ム、０．０５Ｍ 塩化マグネシウム）に３分間浸した。
ＤＩＧ緩衝液３を除いた後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ
・ダイアグノスティックス社製）を含むＤＩＧ緩衝液３
ｍｌを加えた。
【００３３】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、Ｘ線フィルム用のバインダーにＸ線
フィルムとともに挟みフィルムを感光させた。
ン用バッグに移し、Ｘ線フィルム用のバインダーにＸ線
フィルムとともに挟みフィルムを感光させた。
【００３４】その結果、プローブＡのゲル切片には、オ
リゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢのゲル切片に
は、オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認さ
れた。
リゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢのゲル切片に
は、オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認さ
れた。
【００３５】実施例２ （１）グリシジル基含有高分子ゲルの作成 アクリルアミド ４．８８重量部、エチレンジアミン
０．０２重量部、グリシジルメタクリレート ０．１重
量部からなる水溶液にアゾビスイソブチロニトリルを
０．１％濃度になるように加え、７０℃で２時間反応さ
せ、高分子ゲルを作成した。
０．０２重量部、グリシジルメタクリレート ０．１重
量部からなる水溶液にアゾビスイソブチロニトリルを
０．１％濃度になるように加え、７０℃で２時間反応さ
せ、高分子ゲルを作成した。
【００３６】（２）核酸高分子ゲルの作製 高分子ゲルを１０ｍｍ角の厚さに切り出し、実施例１
（１）の方法で作製したプローブＡ又はＢ（５００ｎｍ
ｏｌ／ｍｌ）１００μｌを混合し、７０℃で２時間反応
させ、核酸固定化高分子ゲルを作製した。また、プロー
ブＢについても同様に操作を行い核酸固定化高分子ゲル
を作製した。作製した核酸固定化高分子ゲルは５ｍｍの
厚さに切り出し、実施例１の（３）〜（５）と同様の操
作で検出を行った。
（１）の方法で作製したプローブＡ又はＢ（５００ｎｍ
ｏｌ／ｍｌ）１００μｌを混合し、７０℃で２時間反応
させ、核酸固定化高分子ゲルを作製した。また、プロー
ブＢについても同様に操作を行い核酸固定化高分子ゲル
を作製した。作製した核酸固定化高分子ゲルは５ｍｍの
厚さに切り出し、実施例１の（３）〜（５）と同様の操
作で検出を行った。
【００３７】その結果、プローブＡのゲル切片にはオリ
ゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢのゲル切片には
オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認され
た。
ゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢのゲル切片には
オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認され
た。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、核酸を効率的にかつ強
固に固定化させた核酸固定化ゲルを得ることができ、ま
た、この材料を用いて検体中の核酸を検出する際、洗浄
操作中などに生じる核酸の脱離に伴う感度の低下などの
問題点を克服することがでる。
固に固定化させた核酸固定化ゲルを得ることができ、ま
た、この材料を用いて検体中の核酸を検出する際、洗浄
操作中などに生じる核酸の脱離に伴う感度の低下などの
問題点を克服することがでる。
【００３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120>Nucleic acid-fixed polymer and the method of production <130> P110582000 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27
【００４０】
【配列表のフリーテキスト】配列番号１：合成ＤＮＡ 配列番号２：合成ＤＮＡ 配列番号３：合成ＤＮＡ 配列番号４：合成ＤＮＡ
フロントページの続き (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化成品開発研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB10 BB14 BB29 BB51 DA12 FB01 FB02 FB03 FB09 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR84 QS28 QS35 QS39 QX02 4J036 AK11 FB06 JA15
Claims (6)
- 【請求項１】 核酸成分、多価アミン成分及び少なくと
も２種類以上の重合性モノマー成分を含む核酸固定化高
分子ゲル。 - 【請求項２】 重合性モノマー成分の少なくとも１種類
が、グリシジル基を有する重合性モノマーである請求項
１記載の核酸固定化高分子ゲル。 - 【請求項３】 グリシジル基を有する重合性モノマーが
グリシジル（メタ）アクリレートである請求項２記載の
核酸固定化高分子ゲル。 - 【請求項４】 核酸成分が、末端アミノ化された核酸で
ある請求項１〜３いずれか１項記載の核酸固定化高分子
ゲル。 - 【請求項５】 核酸成分、多価アミン成分及び少なくと
も２種類以上の重合性モノマー成分を含む溶液を重合す
ることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の核
酸固定化高分子ゲルの製造法。 - 【請求項６】 核酸成分及び少なくとも２種類以上の重
合性モノマー成分を含む溶液を重合した後、該ポリマー
を多価アミン成分により架橋した請求項１〜４いずれか
１項記載の核酸固定化高分子ゲルの製造法。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32419499A JP2001136972A (ja) | 1999-11-15 | 1999-11-15 | 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法 |
| CA2365780A CA2365780C (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Carriers having biological substance |
| EP00906733A EP1158047B1 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Microarrays having biological substance |
| PCT/JP2000/001353 WO2000053736A1 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Carriers having biological substance |
| CN 00806694 CN1226409C (zh) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | 带有生物物质的载体 |
| CN 200510104049 CN1763171B (zh) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | 带有生物物质的载体的制备方法 |
| AU28304/00A AU2830400A (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Carriers having biological substance |
| KR10-2001-7011243A KR100538502B1 (ko) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | 생체 관련 물질 함유 담체 |
| EP04026721A EP1595948A3 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Carriers having biological substance |
| AT00906733T ATE431848T1 (de) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Microarray mit einer biologischen substanz |
| US09/914,782 US7122378B1 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-06 | Carriers having biological substance |
| NO20014319A NO20014319L (no) | 1999-03-05 | 2001-09-05 | B¶rere som har biologisk forbindelse |
| US11/514,162 US9080285B2 (en) | 1999-03-05 | 2006-09-01 | Carriers having biological substance |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32419499A JP2001136972A (ja) | 1999-11-15 | 1999-11-15 | 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001136972A true JP2001136972A (ja) | 2001-05-22 |
Family
ID=18163127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32419499A Pending JP2001136972A (ja) | 1999-03-05 | 1999-11-15 | 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001136972A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005014899A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 蛋白質結晶化装置、蛋白質結晶化方法、蛋白質結晶化剤、及びその調製方法 |
| CN100355949C (zh) * | 2003-08-11 | 2007-12-19 | 三菱丽阳株式会社 | 蛋白质结晶装置、蛋白质结晶方法、蛋白质结晶剂及其制备方法 |
| US7695910B2 (en) | 2001-09-01 | 2010-04-13 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method for manufacturing hydrogel biochip by using star-like polyethylene glycol derivative having epoxy group |
-
1999
- 1999-11-15 JP JP32419499A patent/JP2001136972A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7695910B2 (en) | 2001-09-01 | 2010-04-13 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method for manufacturing hydrogel biochip by using star-like polyethylene glycol derivative having epoxy group |
| WO2005014899A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 蛋白質結晶化装置、蛋白質結晶化方法、蛋白質結晶化剤、及びその調製方法 |
| CN100355949C (zh) * | 2003-08-11 | 2007-12-19 | 三菱丽阳株式会社 | 蛋白质结晶装置、蛋白质结晶方法、蛋白质结晶剂及其制备方法 |
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